Verfahren zur Herstellung von Wirkstoffhaltigen wässrigen Liposomensuspeπsioπen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Wirkstoffhaltigen wässrigen Liposomensuspensioπen aus einer Lösung einer (eines) Liposome bildenden Substanz( emische ) (nachfolgend auch als L p d oder Lipidge- misch bezeichnet) in einem niederen Alkohol mit maximal 3 Kohlenstoff¬ atomen und einer wässrigen Phase wobei der Wirkstoff oder das Wirkstoff¬ gemisch in der Lipidlösung und/oder der wässrigen Phase gelöst oder suspendiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die wässπge Phase unter Homogenisieren in die alkoholische Lösung einträgt und den niederen Alkohol mittels Vakuumdestillation entfernt.

Bekanntlich sind Liposomen in sich geschlossene sphärische oder ellip¬ tische Lipidvesikel, die e ne wassπge Phase einschließen. Je nach Anzahl der vorhandenen Lipiddoppelschi hten unterscheidet man große und kleine unilamellare Liposomen (LUV und SUV) von multila ellaren Liposomen (MLV).

Die erster* Liposomen wurden durch Dispersion von Lipidfilmen in wässrigen Phasen hergestellt. Die so erhaltenen MLV-Dispersionen können durch Anwen¬ dung geeigneter Ho ogenisationsverfahren, wie z.B. Ultrabeschallung oder Hochdruckhomogenisatioπ, in SUV überführt werden. MLV und SUV weisen je¬ doch nur ein geringe*-: Einschlu volumen (Vrlumeπ eingeschlossene wä ^' ssrige Phase [Liter ol Lipid] auf, so daß sie zum effektiven Einschluß hydro¬ philer Substanzen nicht geeignet sind.

LUV weisen demgegenüber ein deutlich vergrößertes Einschlußvolumen und damit eine erhöhte Eiπschlußkapazität (7. des eingesetzten Arzneistoffs) auf.

Die bis zum heutigen Tage gängigsten Methoden zur Herstellung von LUV können unter dem Oberbegriff der "solvent evaporation" Methoden zusammen¬ gefaßt werden.

Die wohl bekannteste und im Hinblick auf die erhaltenen Einschlüsse beste Methode ist die REV (reverse phase evaporation) Methode von Papahad^o-

poulos (U. Patent No. 4,235,871. Hierbei wird das Lipid beziehungsweise Lipidgemisch zunächst in einem mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmittel (in der Regel Diethylether oder Ch.oroform) gelost. Nach Zugabe zur arzneistoffhaltigen wässrigen Phase wird das Gemisch dann durch Ultrabeschallung in eine W/0-Emulsion überführt. Aus dieser wird an¬ schließend das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt, wobei sich zunächst ein Gel ausbildet, welches durch Erhöhung des Vakuums oder Zugabe von Wasser in eine Liposomensuspension umgewandelt wird.

Im Gegensatz hierzu wird bei der von Dea er und Bangham eingeführten "ether injection" Methode [Biochim. Biophys. Acta, 443 (1976) 629-634], daß ebenfalls in Diethylether gelöste Lipid in eine warme wässrige Lösung (50-60° C) bei Unterdrück injiziert. Die nach Filtration über ein 1,2 μ Filter erhaltenen Liposomen s nd heterogen und weisen Großen zwischen 150-250 nm auf.

Die bei diesen Methoden verwendeten Lösungsmittel sind aus toxikologischen und sicherheitstechnischen Gründen kritisch zu beurteilen.

Verwendet man bei einem der "ether injection" Methode vorangegangenem Ver¬ fahren jedoch Ethanol als Lösungsmittel, so resultieren stark verdünnte SUV-Dispersioneπ , die durch Ultrafiltration aufkonzentriert werden [Biochim. Biophys. Acta, 298 (1973) 1015-1019]. Die mittlere Größe der so erhaltenen Liposomen liegt deutlich unter 50 nm und der MLV Anteil wird mit 6 X angegeben.

Eine Ausgestaltung dieses Verfahrens ist in der EP-A 0 253 619 beschrie¬ ben. Bei diesem Verfahren wird beispielsweise eine ethanolische Lipid- und Arzneimittel-Lösung, die insgesamt 10 7. der Gesamtformulierung ausmachen unter Druck von 1 000 - 3 000 000 hPa in eine wässrige Phase, die durch einen Homogenisatσr agitiert wird, injiziert. Nach diesem Verfahren, daß sehr aufwendig ist, entstehen kleine unilammelare Liposomen. Zur Herstel¬ lung von Liposomensuspensionen, die hydrophile Wirkstoffe enthalten, ist dieses Verfahren ungeeignet.

Erwähnenswert ist auch eine Methode zur Herstellung von Liposomen mit wasserlöslichen Losungsmitteln, welche die Herstellung einer "monophase" beinhaltet (WO 85/00751). Diese einphasige Mischung wird in der Regel aus 5 ml des lip dhaltigen Lösungsmittels (z.B. Ethanol) und 0,2 ml der wässrigen Komponente hergestellt. Das Losungsmittel wird anschließend durch Einleiten eines Inertgases bei gleichzeitiger Beschallung der Mischung entfernt wobei ein Film entsteht. Dieser wird anschließend mit einer wässrigen Phase resuspendiert. Hierbei entstehen sogenannte MPV (monophasic vesicles), die mehrere Lipiddoppelschichten aufweisen. Gegen¬ über klassischen MLV sollen diese eine erhöhte Stabilität in Puffer sowie erhöhte Einschlüsse aufweisen.

Zu erwähnen ist letztlich auch das in der EP-A 0 349 429 beschriebene Ver¬ fahren, bei dem eine gegebenenfalls den Wirkstoff enthaltende ethanolische Lipidlosung unter leichtem Rühren in eine wässrige Phase eingetragen wird. Wie eigene Versuche zeigen, erzielt man bei diesem vorbekannten Verfahren wesentlich geringere Einschlußkapazitäten als mittels des erfindungsge- maßen Verfahrens. Zudem hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorzug, daß mit seiner Hilfe auch bei Lipidkoπ∑entration von über 10 7. bezogen auf die ethanolische Phase hohe Einschlußkapa∑itäten oder sogar eine weitere Steigerung der Eiπschlußkapazitäten erzielen kann.

Im Vergleich zu diesen vorbekannten Methoden hat das erfindungsgemaße Verfahren den Vorzug, daß es auch in großem Maßstabe in einfacher Weise technisch durchfuhrbar ist. Die Verwendung stark toxischer oder sehr leicht entflammbarer Lösungsmittel wird vermieden. Hervorzuheben ist auch die sehr gute Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens bezüg¬ lich der erhaltenen Wirkstoffemschlüsse und Liposomengrößen , sowie die sehr hohen Wirkstoffemschlüsse in den Liposomen bis zu über 50 7. in den Liposomen und die mittels des erfinduπgsgemäßen Verfahrens erhaltenen ungewöhnlich hohen Wirkstoffkoπzentrationeπ in den Liposomensuspensionen (bis zu 800 mg/ml). Darüberhinaus ist erwähnenswert, daß es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gelingt Liposomensuspensionen herzustellen, die nur einen sehr geringen Restlosungsmittelgehalt besitzen, und die eine gute Lagerf higkeit besitzen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch problemlos unter aseptischen Bedingungen durchfuhrbar.

Zur Durchfuhrung des erfiπdungsgemaßen Verfahren, können die gleichen Liposomen bildende Substanzen verwendet weiden wie bei den vorbekannten Ver ahren.

Geeignete Liposomen bildende Substanzen sind üblicherweise amphiphatische Lipide oder Lipidgemische wie beispielsweise Phospholipide, Sphingo- myeline oder Etherphospholipide. Diese Lipide können geradkettig oder ver¬ zweigte, gesattigte oder ungesättigte, gleichartige oder verschiedene Acylseitenketten tragen. Geeignete Phospholipide sind beispielsweise die Phosphatidylcholine, die Phosphatidylethanola in , die Phosphatidylseππe, die Phosphatidyliπosite, die Phosphatidylglyceiole oder die Phosphatid- saureπ. Geeignete Etherphospholipide sind beispielsweise die Plasmalogene , (Dr. Otto-Albert Neumuller: Rompps Chemie-Lexikon; Fran k sehe Verlags¬ handlung, Stuttgart(DE) 2665, 3159, 3920 und 4045).

Zur Herstellung der Liposomen kann man auch Gemische dieser Lipide und insbesondere auch Gemische dieser Lipide mit Cholesterol Cholesterolhemi- succinat, oc-Tocopherol, u-Tocopherolhemisuccinat und/oder Ladungsträgern wie zum Beispiel Steaiylamm, Stearinsaure, Diethylphosphat , Olsaure, Palmitinsaure, Gallensaure wie zum Beispiel Cholsaure, Glykocholsaure ver¬ wenden. Geeignete Gemische können etwa bis zu 60 Molprozent Cholesteπn und bis zu 20 Molprozent Ladungsträger enthalten.. Als Losungsmittel für die Phospholipide oder Gemische verwendet man vorzugsweise Isopropanol oder insbesondere Ethanol.

Grundsatzlich sollte das ei indungsgemaße Verfahren auch mit anderen wasserlöslichen niedrig siedenden Losungsmitteln als niederen Alkoholen durchfuhrbar sein; geeignet ist beispielsweise Tetrahydrofuran. Die Durch¬ führung des Verfahrens ist aber wesentlich aufwendiger als das erfindungs¬ gemäße Verfahren.

Zur Durchführung des erfinduπgsgemäßen Verfahrens weiden vorzugsweise alkoholische Losungen verwendet, die 0,2 g bis 30 g Liposomenbildende ( s ) Substanz(gemisch ) pro 100 ml Losungsmittel enthalten. Erforderlichenfalls werden diese Losungen durch Erwarmen der Komponenten dargestellt.

Das erfindungsgemaße Verfahren wird, wie bereits erwähnt wurde in der Weise durchgeführt, daß man die wässrige Phase unter Veimischen (wie zum Beispiel kräftigem Rühren) in die alkoholische Losung einträgt und den niederen Alkohol beispielsweise mittels Vakuumdestillation oder durch Ein¬ leiten von Stickstoff entfernt.

Gegebenenfalls ist die nach der Vereinigung erhaltene Dispersion einige Zeit (ca. 10 bis 180 Minuten) bei einer Temperatur von etwa 20 bis 90° C zu mischen, ehe man das Lösungsmittel ganz oder teilweise abtrennt.

Die für das erfindungsgemaße Verfahren geeigneten Temperaturen sind von der Lόslichkeit der Liposomeπbildenden Substanzen sowie deren Phasenuber- gangstemperatur (tc), der Hitzestabilität des Wirkstoffs oder Wirkstoff¬ gemisches und dem Dampfdruck des abzutrennenden Alkohols abhängig, sie liegt vorzugsweise zwischen 20° C und 90° C und insbesondere zwischen 40° C und 70° C. Im allgemeinen wird es ausreichend sein, mit einem Vakuum von 10 h Pa bis 100 h Pa zu arbeiten.

Die für das erfindungsgem ße Verfahren verwendete wässrige Phase kann gewünschtenfalls Puffersubstanzen und/oder isotoπisierende Zusätze enthalten. Geeignete Zusätze sind beispielsweise anorganische oder organi¬ sche Salze oder Puffersubstanzen, wie Natriumchloπd , TRIS-Puffer, Phosphat-Puffer, Citrat-Puffer, Glycin-Puffer, Citrat-Phosphat-Puffer, Maleat-Puffer, etc. Mono- oder Disacchaπde, wie Glucose, Lactose, Saccharose oder Trehalose, Zuckeralkohole, wie Mannit, Sorbit, Xylit oder Glycerin oder wasserlösliche Polymere, wie Dextran oder Polyethylenglykol.

Da die Lipide und auch einige Wirkstoffe oxidationsemp indlich sind, kann die wässrige Phase mit Antioxidantien , wie Natπumascorbat , Tocopherol oder Natriu hydiogensulfit versetzt weiden.

Die nach dem erfinduπgsgemaßen Verfahren hergestellten wässrigen Liposomensuspensionen dienen vorzugsweise zur Verkapselung wasserlöslicher Wirkstoffe.

Solche wasserlöslichen Wirkstoffe sind beispielsweise Diagnostika, wie die Röπtgeπkontrastmittel Iotrolan, Iopromid, Iohexol, losimid, Metrizamid, Salze von Amidoessigsä ^' ure, Iotroxinsä'ure, Iopamidol, 5-Hydroxyacetamido- 2,4,6-triiod-isophtalsäure-(2, 3-dihydroxy-N-methylpropyl)-(2-hydroxy- ethyD-diamid (= ZK 119095) und 3-Carbamoyl-5-[N- [2-hydroxyethyl) -acet- amido]-2,4,6-triiod-benzoesä ^" ure-[(1RS,2SR)-2,3-dihydroxy-1-hydroxymethyl- propyl]-amid (= ZK 139129) oder NMR-Kontrastmittel, wie das Gadolinium- DTPA, das Gadoliπium-DOTA und den Gadoliniumkomplex des 10-[ 1 -Hydroxy- methyl-2,3-dihydroxypropyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl1-1,4,7 , 10-tetraaza- cyclodecans] .

Geeignete therapeutische Wirkstoffe sind unter anderen Antibiotika, wie Gentamycin oder Kana yciπ, Cytostatica, wie Doxσrubicin-Hydrochlorid oder Cyclophosphamid und Virustatica, wie Vidarabin oder Wirkstoffe, wie das Mitoxaπtron-Hydrochloiid.

Diese wasserlöslichen Wirkstoffe werden voi Durchfuhrung des erfindungsge- maßen Verfahren in dei wässrigen Phase gelost.

Darüberhinaus können die wässrigen Liposomensuspensionen auch zur Ver¬ kapselung von in Wasser schwer löslichen Wirkstoffe verwendet werden.

Solche Wirkstoffe sind beispielsweise Pflanzenschutzmittel, wie schwel lösliche Insektizide oder Herbizide und insbesondere schwer lösliche pharmazeutische Wirkstoffe.

In Wasser schwer lösliche oder unloslichp pharmazeutische Wirkstoffe folgender Wirkstoffgruppeπ eignen sich beispielsweise zur Herstellung wassπger Suspensionen nach dem erflπdungsgemaßen Verfahren.

Gestagen wirksame Steroidhormone wie beispielsweise das 13-Ethyl- 17ß-hy- droxy- 18 , 19-dιnor- 17α-pιegn-4-eπ-20yl-3-on ( =Levonoιgestιel) , das 13-- Ethyl-17ß-hy roxy-18, 19-dιnor-17u-pregna-4, 15-dιen-20yn-3-on (=Gestoden) oder das 13-Ethyl170-hydιoxy-11-methylen-18, 19-dιnor-17 -pιegn-4-en-20yn

( Desorgestiel ) , Estrogen wirksame Steroidhormone wie 3-Hydroxy- 1 , 3 , 5- ( 10 ) -estratrien- 1 -on (=0stron) oder 1 , 9-Nor- 17α-pregπa- 1 , 3 , 5 ( 10 ) -trien- 20-yn-3,17ß-dιol (Ethinylostradiol).

Androgen wirksame Steroidhormone wie zum Beispiel 17ß-Hydroxy-4-androsten- 3-on (--Testosteron) und dessen Estei oder 1 ß-Hydroxy- 1α-methyl-5α-andro- sten-3-on ( -Mesterolon ) .

Antiandrogen wirksame Steroidhormone wie zum Beispiel das 17α-Acetoxy-6- chlor-1ß,2ß-dιhydro-3 H-cyclopropa[1 ,2]-pregna-1 ,4,6-trιen-3,20-dιon ( Cypoteronacetat ) .

Kortikoide wie zum Beispiel das 11ß , 17 , 21 -Trιhydroxy-4-pregnen-3 , 20-dιon das 11ß,17α,21-Tπhydroxy-1,4-pregnadιeπ-3,20-dιon (=Prednιsσloπ), das 11ß,17u-21-Trιhydroxy-6α-methyl-1 ,4-pregnatrιen-3,20- dion ( =Methylpredπιsolon ) und das 6 -Fluor- 11 , 21 -dihydroxy- 16 -methyl- 1 , 4-pregnadιen-3 , 20-dιoπ ( --Difluocortolon ) und deien Ester.

Ergoline wie zum Beispiel der 3- ( 9 , 10-Dιhydro-6-methyl-8 -ergolιnyl)-1 , 1 - diethylharnstoff (=Ergolιn), der 3- ( 2-Brom-9 , 10-dιhydro-6-methyl-8α-ergo- linyl) - 1 , 1-diethylharnstoff (=Bromergolιn ) oder der 3- ( 6-Methyl-8α-ergo- lιnyl)-1 , 1-dιethylharnstoff (-Terguπd) .

Antihypertomka wie zum Beispiel das 7α-Acetylthιo- 17α-hydroxy-3-oxo-4- pregnen-21 -carbonsaure-γ-lacton ( =Spιronolacton ) oder das 7 -Acetylthιo- 15ß,16ß-methylen-3-oxo17 -pregna-1 ,4-diPn-21 , 17-carbolacton (=Mespιrenon) .

Antikoagulantia , wie zum Beispiel die 5- [Hexahydro-5-hydroκy-4- ( 3-hydroxy- 4-methyl-1-octen-6-ynyl)-2(1H)-pentalenylιden)]-peπtansaur e (=Iloprost) .

Psychopharmaka, wie zum Beispiel das 4- ( 3-Cyclopentyloxy-A-methoxy-phenyl- 2-pyrrolιdon (=Rolιpram) und das 7-Chlor- 1 , -dιhydro- 1-methyl-5-phenyl- 2H-1 ,4-benzodιazepιn-2-on (=Dιazepam) .

Carotinσide, wie zum Beispiel das α-Carotin und das ß-Carotin.

Fettlosliche Vitamine, wie zum Beispiel Vitamine der Vitamin A- , Vitamin D-, Vitamin E-und Vitamin K-Gruppe.

Eine weitere Gruppe sind ß-Carboline, wie sie beispielsweise in den Europäischen Patentanmeldungen 234,173 und 239,667 beschrieben sind. Als ß-Carboline seien beispielsweise genannte der 6-Benzoyloxy-4-methoxy- methyl-ßcarbolιn-3-carboπsäure-ιsopropylester (-Becarnil) und der 5-(4- Chlorphenoxy)4-methoxymethyl-ß-carbolιn-3- arbonsäure-ιsopropylester (=C1-PH0CIP) .

Erwähnenswert sind auch schwerlösliche oder unlösliche Kontrastmittel, wie das Röntgenkontrastmittel Iodipamidethylester oder NMR-Kontrast ittel wie die Eisen- oder Manganporphyπnchelate oder auch die Magnetite.

Als geeignete Wirkstoffe seien ferner die Salizylsäure, die Retinolsäure und die Azalainsaure erwähnt. Des weiteren können Aπtimycotine wie das Amphotericm-B , Iconacol oder Meconazol verwendet werden.

Diese Wirkstoffe werden vor Durchführung des eifinduπgsgemäßen Verfahrens in der alkoholischen Lösung gelöst oder in ihr und/oder der wässrigen Phase suspendiert.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden pro g Liposomen bildender Substanztmischung) im allgemeinen 0,05 bis 10 g und vorzugsweise 1 bis 3 g Wirkstoff eingesetzt. Mittels des erfindungsgemaßen Verfahrens kann man in einfacher Weise sterile Liposomensuspensionen herstellen indem man beide

Losungen vor der Durchfuhrung des Verfahrens steπlflltπert und alle an¬ schließenden Prozeßschritte unter aseptischen Bedingungen durchfuhrt.

Die in den Liposomensuspensionen erzielbaren Einschlüsse sind naturgemäß von der Art des Wirkstoffs und der (des) Liposomen bildenden Substanzlge- misches) sowie deren Verhältnis zueinander abhängig. Gewunschteπfalls kann der unverkapselte Wirkstoff beispielsweise mittels Ultraflltration , Dialyse, Mikroflltration oder Zentπfugieren entfernt werden.

Die erhaltene Liposo ensuspension kann direkt aufbewahrt werden. Alterna¬ tiv kann die Liposomensuspension durch Lyophilisation in eine stabile Lagerform überfuhrt werden. Vor der Lyophilisation können dem zu lyophili- sierenden Gut, wenn notig, unter anderem beispielsweise Zusätze wie Manni- tol oder Sorbitol und/oder Elektrolyte und Viskositätsbeeiπflussende Agentieπ wie Natπumchlorid zugesetzt werden.

Die Lyophilisate können mit bidestilliertem Wasser oder wässrigen Phasen, welche die gleichen Zusätze wie die zur Liposomenherstelluπg verwendeten wässrigen Phasen enthalten können, resuspeπdiert werden.

Die Menge des Resuspeπsionsmediυms kann dabei 0,5 bis 20, vorzugsweise jedoch 1 bis 6 ml pro g Lyophilisat betragen. Die erhaltenen Suspensionen können direkt oder nach Filtration über Filter geeigneter Porengroße ver¬ wendet werden.

Die mittels des erfindungsgemaßen Verfahrens hergestellten Liposomen können beispielsweise wenn sie Kontrastmittel für NMR oder Roπtgendia- gnostik enthalten bei verschiedenen diagnostischen Verfahren eingesetzt werden. Hierzu zahlen beispielsweise die Tumordiagnostik in Organen des retikuloendothelialen Systems (zum Beispiel Leber und Milz) oder anderen

- 1 0 -

mtravasal zugänglichen Geweben sowie auch die Arthiogi aphi . Die extra- vasale Applikation solcher Liposomensuspensionen (wie zum Beispiel subcutan, intramuscular oder intraperitoneal) kann ebenfalls für kann ebenfalls für diagnostische Zwecke wie etwa die indirekte und direkte Lymphographie oder therapeutische Zwecke (wie l. . Depotpräparate) ver¬ wendet werden. Selbstveistandlich ist es auch möglich die Zubereitungen oral zu applizieren, wobei man die Präparate gegebenenf lls in Magensaft resistenten Kapseln abfüllen kann.

Ferner können mittels des erfindungsgemaßen Verfahrens hergestellte wirk- stoffhaltige Liposomensuspensionen bei geeigneter Lipidzusammensetzung auch als blood pool agents oder als zielgerichtete Arzneistofftrager angewendet werden.

Die nachfolgenden Ausfuhiungsbeispiele dienen zur näheren Erläuterung der

Erfindung. In diesen Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:

PC = Phophatidylcholin S 100 der Firma Lipoid KG

CH Cholesterol gepulvert (JP) der Firma Merck AG

SS -- Stearinsäure punsc der Firma Fluka AG

DPPG = Dipalmitoylphosphatidylglycerol DPPG dei Firma Lipoid KG

HSPC = hydriertes Sojalecitin (Phospholipon 90H) der Firma Nattermann AG

DCP = Dicetylphbosphat der Firma Sigma

Beispiel 1

9,25 g Lipidge isch (PC/CH/SS - 4:5:1 rnol :mol : ol) werden bei 70° C in 100 ml ml Ethanol gelost und sterilfiltπert . Dann überfuhrt man die Losung in ein auf 55° C temperiertes Reaktionsgefäß und mischt diese unter Rühren (300 Umdrehungen pro Minute) mit einer sterilfiltrierteri Wirkstoff¬ losung (enthaltend 27,75 g Iopromid ad 200 ml wassπgem 20 mM Tns-HCl- Puffer ; pH 7,5).

Anschließend destilliert man den Alkohol bei 55° C im Vakuum von 5000 Pa ab und untersucht die entstandene Liposomensuspension auf ihre Eigen¬ schaften.

Dann wird die Liposomensuspension direkt in Portionen von 20 g in 50 ml Glasinfusionsflaschen abgefüllt und diese lyophilisiert . Die erhaltenen Lyophilisate werden dergestalt resuspendiert, daß eine Wirkstoffkonzeπtra- tion von ca. 200 mg/ml entsteht und ebenfalls untersucht.

Beispiel 2

Die Durchführung des Versuchs erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben, je¬ doch werden 18,5 g Iopromid verwendet.

Beispiel 3

Die Durchführung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch werden 13,9 g Lipidgemisch verwendet.

Beispiel 4

Die Durchführung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wrden 18,5 g Lipidgemisch verwendet.

B e i s p i eJ 5

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird Iotrolan anstelle von Iopromid verwendet.

Beispiel 6

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird lopamidol anstelle von Iopromid verwendet.

Beispiel 7

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird Iohexal anstelle von Iopromid verwendet.

Beispiel 8

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird das πichionische kontrast ittel 5-Hydroxyacetamιd~2 , , 6-trι- ιod-ιsophthalsaure-(2,3-dιhydroxy-N-methylpropyl)-(2-hydr oxyethyl)-dιamιd anstelle von Iopromid verwendet.

Beispiel 9

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird ein Lipidgemisch PC/CH/SS - 4:4:2 mol:mol:mol eingesetzt.

Beispiel 10

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird ein Lipidgemisch PC/CH/PG 4:5:1 mol:mol:mol eingesetzt.

Beispiel 11

Die Durchführung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird ein Lipidgemisch PC/CH/SS 6:3:1 mol:mσl:mol eingesetzt.

B e i s pi e l 1 2

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgt wie in Be.spiel 2 beschrieben, jedoch wird ein Lipidgemisch PC/CH/DCP 4:5:1 eingesetzt.

Beispiel 13

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird ej π Lipidgemisch PC/CH 1:1 eingesetzt.

Beispiel 14

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wird ein Lipidgemisch PC/HSPC/ H/SS 2:2:5:1 eingesetzt.

Beispiel 15

Die Durchfuhrung des Versuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch wurde die Ansatzgroße verzehnfacht.

Beispiel 16

Die Durchfuhrung des Veisuches erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch in einem einhundertfunfzigfach größeren Ansatz.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die in den Beispielen 1 bis 16 erzielten Ergebnisse.

T a e l l e

Beispiel Lipidzusammeri- Wirkstoff Lipo omen uspension Resuspendiertes Versuchs¬ zusam ensetzuπg Lyophilisat anzahl

Größe Einschluß Größe Einschluß [πml+SD [5U + SD [nm]+SD [ U+SD

Bei spiel 17

Der Restethanolgehalt von gemäß Beispiel 2 hergestellten Liposomensuspen¬ sionen vor und nach Lyophilisation wird an 8 Chargen mittels Gaschromato¬ graphie bestimmt. In dei ursprünglichen Liposomensuspension werden die Ethanolgehalte mit 0,59 + 0,010 7. (m/V) bestimmt.

Beispiel 18

Gemäß Beispiel 2 hergestellte Liposomensuspensionen und Lyophilisate weiden bei 4, 25 und 40° C eingelagert. Zur Beurteilung der Stabilität werden Aussehen, Große Einschluß und pH-Wert -im Falle der Lyophilisate nach Resuspeπsion - zum jeweiligen Zeitpunkt bestimmt.

Nach mehrmonatiger Lagerung zeigten die resuspendierten Lyophilisate hinsichtlich der untersuchten Großen keine signifikanten Abweichungen.

Die so hergestellten Liposomensuspensionen zeigen in pharmakolαgischen Tests folgende Eigenschaften:

Test A

Gemäß Beispiel 2 hergestellte resuspendierte Lyophilisate werden hinsicht¬ lich ihrer akuten Toxizitat nach einmaliger Applikation an Maus und Ratte untersucht .

Die jeweilige LD50 wnd zu:

2,8 g I/kg KGW Maus (Gesamtiodf bzw.

3,0 g I/Kg KGW Ratte bestimmt.

Te s t B

Für gemäß Beispiel 2 hergestellte resuspendier e Lyophilisate wird die subkakute Toκizitat an Ratten (n = 6) bestimmt.

Nach 6-malιger Gabe von jeweils 1 g I/kg KGW (Gesamtiod) im Abstand von jeweils 3 Tagen werden keine Veränderungen histo-pathologischer bzw. klinischer Parametei f stgestellt.

Test C

Gemäß Beispiel 2 erhaltene resuspendierte Lyophilisate werden hinsichtlich ihrer Organverbiπdung nach i.vb. Gabe an Ratten untersucht.

1 Stunde nach Gabe von 100 mg I/kg KGW (Gesamtiod) werden in der Lebei 0,54 I/g Feuchtgewicht entsprechend 24 7. der applizierten Dosis nachgewiesen .

Test D

Gemäß Beispiel 2 erhaltene resuspendieite Lyophilisate werden Lebertumor- tragenden Kaninchen mit einer Dosis von 100 mg Gesamtiod/kg KGW l.v. appliziert. Der sich ergebenede Dichteunterschied Leber/Tumor betragt nach einer Stunde 35 Hounsfied units (HU).

Test E

Gemäß Beispiel 2 erhaltene resuspendierte Lyophilisate werden hinsichtlich ihrer Eignung zur indirekten CT-Lymphographie am Hund untersucht.

3 Stunden nach inteidigitaler Gabe von 200 mg Gesamtiod (in 3 ml Lipo¬ somensuspension) werden am CT maximal 200 HU Dichteanhebung in den poplietalen und lliakalen Lymphknoten gemessen.