Titre : PROCÉDÉ DE PREPARATION DE POLYGLUCOSIDES D’ALKYLE ET POLYGLUCOSIDES D’ALKYLE OBTENUS SELON LE PROCÉDÉ

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se rapporte au domaine de la préparation par voie enzymatique de polyglucosides d’alkyle. La présente invention se rapporte également aux polyglucosides d’alkyle susceptibles d’être obtenus par ledit procédé.

ARRIÈRE PLAN TECHNOLOGIQUE

Les surfactants sont utilisés depuis très longtemps dans un grand nombre de domaines tels que la pharmaceutique, cosmétique, les produits d’hygiène et d’entretien ou des formulations industrielles du fait de leurs propriétés variées : moussantes, émulsifiantes, dispersantes, détergentes, etc.

Les surfactants sont structurellement constitués d’une partie hydrophobe et d’une partie hydrophile, cette dernière pouvant être chargée positivement ou négativement ou encore être non chargée.

Les polyglucosides d’alkyle (en anglais « alkyl polyglucosides », abrégé APGs) sont des tensioactifs glucolipidiques dont la tête polaire est constituée de résidus glucosyle et d’une chaîne carbonée plus ou moins longue ayant typiquement 1 à 18 atomes de carbone.

Les APGs présentent des propriétés de surface intéressantes, une biodégradabilité et une innocuité vis à vis de la peau et des muqueuses ce qui leur confère un intérêt certain pour de nombreuses applications industrielles.

Les APGs sont synthétisés classiquement via des voies chimiques. Les procédures les plus communes de synthèse d’APGs incluent la méthode de Fischer, de Koenig-Knorr ou celles de Schmidt.

La méthode de Fischer est la plus simple à mettre en oeuvre et est classiquement utilisée industriellement lorsque la sélectivité de synthèse n’est pas un critère recherché. Selon la nature du carbohydrate et de l’alcool gras, la réaction de Fischer peut être conduite en une ou deux étapes. Le carbohydrate est solubilisé dans un excès d’alcool en présence d’un catalyseur acide et à température élevée.

L’obtention d’APGs dont la chaîne carbonée est de grande taille nécessite une étape dans laquelle un alkyle de petite taille, typiquement butyl-, est échangé avec un alcool dont la chaîne carbonée est de plus grande taille permettant ainsi de contourner les problèmes de solubilité des réactifs. La synthèse de Fischer conduit à l’obtention d’un mélange pouvant être extrêmement complexe de mono-, di-, tri- et oligoglucosides d’alkyle.

Les unités glucosyle constituant l’APG peuvent être présentes sous la forme d’anomères a ou b, et d’isomères pyranosides et furanosides.

Pour des raisons de cinétiques réactionnelles et d’incompatibilités des produits de réaction (faible solubilité des carbohydrates dans les alcools gras), le degré de polymérisation moyen de la partie glucidique des APGs commerciaux reste actuellement inférieur à 2 (Ulvenlund ét al., 2016), et est typiquement compris entre 1 ,3 et 1 ,6.

Or, pour certaines applications, des APGs dont la partie glucidique est particulièrement longue sont requis et demandés par les acteurs industriels.

Au vu de ce qui précède, le développement de voies de synthèse efficaces permettant d'accéder à des APGs dont la partie glucidique est particulièrement longue est un enjeu majeur.

Ces dernières années, des efforts notables ont été consacrés au développement de voies enzymatiques de synthèse d’APGs.

Les enzymes les plus étudiées dans cette optique sont des enzymes appartenant à la famille des glycoside hydrolases et plus particulièrement celles de la famille des b- glycosidases. Ces dernières sont des enzymes sans co-facteurs qui hydrolysent naturellement des liaisons osidiques de type b présentes dans les polysaccharides pour produire des mono- ou des oligosacharides. In vitro, ces enzymes sont capables d’utiliser un donneur de glycosylé et de catalyser le transfert du glycosylé sur l’hydroxyle libre d’une molécule acceptrice.

La synthèse des alkyl-polyglucosides catalysée par les b-glycosidases conserve en général une liaison de configuration b entre les sucres et la partie alkyle (on parlera de b- alkyl-polyglucosides). Cette synthèse est possible soit par inversion d’hydrolyse (où le donneur de glucosyle peut être la cellulose ou des b-glucanes), soit par transglycosylation (où les donneurs de glycosylé sont des polysaccharides naturels ou des carbohydrates activés tels que le méthyl^-D-glucopyranoside, le rNR-b-D- glucopyranoside ou autres aryl-glucosides).

D’autres familles d’enzymes ont permis l’obtention d’alkyl-polyglucosides.

Bousquet et al. ont montré la possibilité d’obtenir des a-alkyl-polyglucosides en utilisant une a-transglucosylase à partir de maltodextrines sur du butanol (Bousquet et al., 1998 ; Bousquet ét al., 1999).

Dahiya et collaborateurs ont réussi à produire des 1-O-hexyl-a-D-mono, di- et tri- a- glucopyranosides à partir d’hexanol ou d’octanol et de saccharose en utilisant une souche de Microbacterium paraoxydans présentant une activité de transglucosylation membranaire de type amylo-saccharase (Dahiya ét al., 2015).

Ochs et collaborateurs ont produit des pentyl- et octyl-polyxylosides (alkyl-polyxylosides) par réaction de transglycosylation entre du pentanol, de l’octanol et des xylanes catalysée par différentes xylanases (Ochs et al., 2011 ; Rémond et al., 2012).

Dans chaque cas, la différence de nature chimique des réactants (carbohydrates et alcools gras) ainsi que le caractère très hydrophile des sucres et, en contraste, très hydrophobe des acides gras ne permettent pas l’obtention de concentrations suffisantes des deux substrats dans la même phase, ce qui limite grandement les rendements de production et les tailles des têtes glycosidiques à quelques unités.

Une voie alternative est d’utiliser des APGs commerciaux présentant une partie glucidique de taille modérée (typiquement degré de polymérisation inférieur à 3) et de rallonger la partie glucidique par voie enzymatique.

Dans cette optique, les cyclodextrine glucano-transferases (CGTases) ont largement été décrites pour leur capacité de production d’APGs de faible DP par réaction de transglucosylation.

Les CGTases appartiennent aux familles des glycoside hydrolases GH 13 et GH57 et sont spécifiques de la formation de liaisons a-1 ,4 glucosidiques. Ces enzymes catalysent quatre types de réaction à partir d’amidon ou d’amylose : la cyclisation, le couplage, la disproportionation et l’hydrolyse. Dans le cas où une molécule non glucidique porteuse d’un ou plusieurs résidus glucosyle est introduite dans le milieu, les CGTases sont susceptibles d’orienter leur activité vers une réaction de couplage et/ou disproportionation sur cet accepteur.

Okada et collaborateurs furent les premiers à utiliser les capacités de couplage de telles enzymes pour l’élongation de glycolipides (sucro-esters). Ils ont obtenu l’addition de 1 à 3 unités glucosyle sur du laurate de saccharose (Okada ét al., 2007).

La capacité des CGTases à rallonger des maltosides de butanol, d’octanol et de dodécanol a été montrée par Zhao et collaborateurs en 2008 (Zhao et al., 2008).

Les APGs utilisés n’ont pu être rallongés que de 2 à 3 unités glucosyle par la CGTase de Bacillus stearothermophilus à partir de dextrines de 10 à 15 unités glucosyle.

Svensson et collaborateurs ont comparé les activités de couplage et de disproportionation des CGTases de Bacillus macerans et de Thermoanaerobacter (Toruzyme 3.0L, Novozymes A S, Danemark) sur du dodécyl-maltoside (C12G2, c’est à dire un APG composé d’un alkyle en C12 et d’une partie glucidique comprenant deux unités glucosyle) à partir d’a-cyclodextrines (Svensson et al., 2009). Il a pu être mis en évidence que les différences de spécificités réactionnelles couplage/disproportionation des deux CGTases, permettaient la modulation des produits de réaction. Ainsi, des mélanges de produits porteurs de 1 à 20 unités glucosyle ont été obtenus avec des profils variant selon les CGTases (C12G8 et C12G14 pour la CGTase de B. macerans, enzyme peu disproportionante et une distribution +/- homogène de C12G1 à C12G20 pour la CGTase de Thermoanaerobacter, enzyme très disproportionante).

L’obtention des différents produits est contrôlée par la cinétique de réaction (Svensson et al., 2011 ), les réactions de couplage étant plus rapides que celles de disproportionation. Ainsi, il a été possible de réguler le profil de produits en APGs rallongés en contrôlant le débit traversant un réacteur à lit fixe contenant la CGTase de B. macerans immobilisée sur Eupergit C : un débit rapide favorise le produit de couplage (C12G8) tandis qu’un débit lent défavorise le C12G8 et favorise les produits de couplage double ou triple et les produits de disproportionation (C12G14, C12G20).

Paul et collaborateurs ont utilisé une glucanotransférase de la famille GH57 pour allonger du dodécanol maltoside à partir d’amidon. Des APGs porteurs de 24 à 26 unités glucosyle (C12G24 à C12G26) ont été identifiés par analyse MS (Paul, ét al., 2015).

Des glucane-saccharases (GS) des familles GH 13 et GH70 peuvent aussi être utilisées pour de telles réactions de glucosylation.

À partir de saccharose, les glucane-saccharases catalysent la synthèse de glucanes présentant généralement de très hautes masses molaires et des structures variées en raison de la présence de différents types de liaisons osidiques (a-1 ,2, a-1 ,3, a-1 ,4 et/ou a- 1 ,6) ainsi qu’à leur localisation dans le polymère. Des isomères du saccharose ainsi que du glucose sont aussi produits à partir de saccharose mais généralement en beaucoup plus faible quantité que le polymère.

Quelques glucane-saccharases des familles GH13 et GH70 ont été utilisées dans des réactions d’accepteurs dans le but d’allonger la partie glucidique d’alkyl monoglucosides à groupe alkyle courts (1 à 8 atomes de carbone) à partir de saccharose.

Ainsi, les dextrane-saccharases extracellulaires de Leuconostoc mesenteroides NRRL- B512F ont permis dès 1966 le transfert de 1 à 4 unités glucosyle sur le 1-O-méthyl-a-D- glucoside.

L’alternane saccharase de L. mesenteroides NRRL B-1355 a catalysé le transfert d’une seule unité glucosyle sur les 1-O-méthyl-a- et b-D-glucosides (Côté et al., 1982).

Plus récemment, Richard et collaborateurs ont étudié l’effet de la longueur de la chaîne alkyle sur la capacité des dextrane-saccharases à glucosyler les alkyl-monoglucosides et ont montré que, si des glucane-saccharases de L. mesenteroides B-512F, B-1299, B-1355 et B-23192 sont capables de glucolyser le 1-O-butyl-a-glucoside (en ajoutant 1 à 3 unités glucosyle supplémentaires selon des liaisons a-1 ,6 glucosidiques), seules les alternane- saccharases de L. mesenteroides B-1355 et B-23192 ont allongé le 1-O-octyl-a-glucoside (Richard et al., 2003).

Les procédés connus sont donc limités notamment en ce qu’ils ne permettent pas de moduler aisément à la fois le nombre et la nature des liaisons reliant les unités glucosyle au sein des polyglucosides d’alkyle obtenus.

Par ailleurs, la plupart des procédés connus ne peuvent avoir comme substrat des glucosides d’alkyle ayant de longues chaînes d’alkyle, typiquement supérieur à 8 atomes de carbone.

Il existe donc un besoin pour un procédé de préparation de glucosides d’alkyle permettant d'accéder à une grande diversité d'architectures moléculaires en utilisant un substrat renouvelable et bon marché tel que le saccharose.

En particulier, il existe également un besoin pour un procédé permettant de moduler à la fois le nombre d’unités glucosyle au sein de la partie glucidique, mais aussi la nature des liaisons osidiques reliant lesdites unités glucosyle, tout en rendant possible l’obtention de polyglucosides d’alkyle à longue chaîne glucosidique, et ce même si le glucoside d’alkyle utilisé comme substrat a un groupe alkyle de grande taille.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

[Fig. 1] La Figure 1 illustre le schéma de la réaction d’élongation enzymatique de la partie glucosidique d’un monoglucoside d’alkyle mettant en oeuvre des a-transglucosylases de la famille GH70 actives sur le saccharose.

Les Figures [Fig. 2A] 2A et [Fig. 2B] 2B montre les profils d’élongation pour le substrat C8G1 obtenus avec les a-transglucosylases de la famille GH70 qui utilisent le saccharose comme donneur de glucosyle. [Fig. 2A] La Figure 2A montre les profils obtenus avec les glucane saccharases à partir de [C8G1] = 30 mM et de [saccharose] = 585 mM pour les glucane-saccharases DSR-M D1 (SEQ ID NO : 1 ), DSR-M D5 (SEQ ID NO : 2), DSR-M D5 W624A (SEQ ID NO : 3), GS-B (SEQ ID NO : 5), GS-C (SEQ ID NO : 6), GS-D (SEQ ID NO : 9) et GS-FS D1 (SEQ ID NO : 10) et 1170 mM de saccharose pour les enzymes GS- A SEQ ID NO :4, GS-D (SEQ ID NO :7), DSR-G (SEQ ID NO :11 ), DSR-G CD1 (SEQ ID NO :12). Les glucane saccharases sont utilisées en réaction à 1 U.mL ¹ . [Fig. 2B] La Figure 2B montre les profils obtenus avec les enzymes de branchement BRS-A (SEQ ID NO : 17), BRS-B D1 (SEQ ID NO : 18), BRS-C (SEQ ID NO : 19), BRS-D D1 (SEQ ID NO : 20), BRS- E D1 (SEQ ID NO : 21 ), BRS-F (SEQ ID NO : 22), DSR-G CD2 (SEQ ID NO : 23), GBD- CD2 (SEQ ID NO : 16), à partir de [C8G1] = 20 mM et de [saccharose] = 585 mM. Les enzymes de branchement sont utilisées en réaction à 1 U.mL ¹

[Fig. 3] La Figure 3 compare le profil de la réaction d’élongation du C8G1 catalysée par GS-C (SEQ ID NO : 6) en présence de 200 g.L ¹ de saccharose et de 200 g.L ¹ d’a- cyclodextrines et de la cyclodextrine glucanotransferases (CGTase) de Bacillus macerans (enzyme non conforme à l’invention) en présence de 200 g.L ¹ d’a-cyclodextrines (substrat non conforme à l’invention).

[Fig. 4] La Figure 4 compare les profils de la réaction d’élongation du C8G1 catalysée par la glucane-saccharase DSR-M D1 seule (SEQ ID NO : 1 ) et catalysées par la glucane- saccharase DSR-M D1 et les enzymes de branchement BRS-A (SEQ ID NO :17) ou BRS- B D1 (SEQ ID NO :18) utilisées de manière séquentielle.

[Fig. 5] La Figure 5 montre le profil d’élongation d’alkyle glucosides de tailles croissantes obtenu avec la glucane-saccharase DSR-M D1 (SEQ ID NO : 1 ) avec des concentrations initiales en saccharose de 200 g.L ¹ . Encart A : [C8G1]=30mM ; Encart B : [C10G1]=10mM ; Encart C : Triton CG110 (Dow Chemicals, USA) à 15 g.L ¹ ; Encart D : [C12G1]=5 mM ; Encart E : [C12G2]=10mM, Encart F : [C16G2]=5mM.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Le but de la présente invention est de pallier les inconvénients de l’art antérieur et de fournir un procédé de préparation d’un polyglucoside d’alkyle par catalyse enzymatique, ledit procédé étant économique car utilisant du saccharose ou l’un de ses analogues comme substrat et permettant d’obtenir une grande diversité de polyglucosides d’alkyle en termes de taille et de structure de leur partie glucosidique.

Ainsi, le procédé de l’invention rend possible d’obtenir un polyglucoside d’alkyle avec un nombre d’unités glucosyle modulable de 2 à 200 unités glucosyle.

Le procédé permet également de moduler la structure linéaire ou ramifiée de la partie glucidique du polyglucoside d’alkyle obtenu, ainsi que la nature des liaisons osidiques alpha-1 ,2 ; alpha-1 ,3 ; alpha-1 ,4 ou alpha-1 ,6 reliant les résidus glucosyle au sein de la partie glucidique.

De manière importante, le procédé de l’invention permet de préparer des polyglucosides d’alkyle ayant un groupe alkyle de taille importante, par exemple supérieure à 8 atomes de carbone.

Cette diversité est très avantageuse pour produire de nouveaux polyglucosides d’alkyle d'intérêt dans le secteur des détergents et des cosmétiques. Un autre but de l’invention est de fournir des alkyle polyglucosides d’une grande diversité en termes de taille et de structure de la partie glucosidique, et en particulier des polyglucosides d’alkyle dont la taille du groupe alkyle est importante, par exemple supérieure à 8 atomes de carbone.

Ces buts sont atteints par l’invention qui va être décrite ci-après.

La présente invention a pour premier objet un procédé de préparation d’un polyglucoside d’alkyle de formule (I)

[Glc] _m -[Glc] _n (-0-R) (I) dans laquelle :

R représente un groupe alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant entre 8 et 20 atomes de carbone,

[Glc] _m -[Glc] _n représente une partie glucidique linéaire ou ramifiée comprenant n+m unités glucosyle, n+m étant compris entre 3 et 200 ; ledit procédé comprenant au moins une étape i) d’élongation de la chaîne glucosidique d’un glucoside d’alkyle de formule (II)

[Glc] _n (-0-R) (II) dans laquelle :

R est tel que défini dans la formule (I),

[Glcj _n représente une partie glucidique comprenant n unités glucosyle n étant compris entre 1 et 15. ladite étape comprenant la mise en contact dudit glucoside d’alkyle de formule (II) avec au moins une a-transglucosylase de la famille GH70 en présence de saccharose ou d’un analogue de saccharose.

Grâce au procédé conforme à l’invention, il est maintenant possible de préparer une grande diversité de polyglucosides d’alkyle.

De manière importante, le procédé permet de contrôler la taille, la structure ramifiée ou non et la nature des liaisons osidiques au sein de la partie glucidique du polyglucoside d’alkyle obtenu, et ce même lorsque le groupe alkyle du glucoside d’alkyle utilisé comme substrat est de grande taille.

Les a-transglucosylases de la famille GH70 sont des enzymes hydrosolubles catalysant naturellement des substances hydrophiles, et dont l’activité est a priori fortement limitée en présence de matière grasse.

Les inventeurs ont découvert que, de manière surprenante, des a-transglucosylases de la famille GH70 sont capables d’accepter comme substrat un glucosyle d’alkyle en C8-C20, c’est-à-dire un composé peu soluble comprenant une partie hydrophobe défavorable à l’action de ce type d’enzyme, et de catalyser efficacement l’élongation de sa partie glucidique.

Partie glucidique

Selon l’invention, l’expression « partie glucidique », désigne un polymère linéaire ou ramifié constitué d’unités glucosyle liées entre elles par des liaisons osidiques.

Selon l’invention, les termes « liaison glycosidique » ou « liaison glucosidique » ou « liaison osidique » peuvent être utilisés indifféremment et désignent le lien covalent qui lie un glucosyle à un autre glucosyle adjacent.

La partie glucidique [Glc] _m -[Glc] _n du polyglucoside d’alkyle de formule (I) comprend deux fractions glucidiques [Glc] _m et [Glc] _n.

La fraction glucidique [Glc] _n correspond aux n unités glucosyle de la partie glucidique du glucoside d’alkyle de formule (II) utilisé comme substrat dans le procédé de l’invention.

La fraction glucidique [Glc] _m correspond aux m unités glucosyle ajoutées sur la partie glucidique [Glc] _n du glucoside d’alkyle de formule (II) lors de l’étape d’élongation glucosidique du procédé de l’invention. n+m, c’est-à-dire le nombre d'unités glucosyle dans la partie glucidique [Glc] _m -[Glc] _n du polyglucoside d’alkyle de formule (I) est avantageusement compris entre 3 et 150, de préférence entre 3 et 100, de préférence encore entre 3 et 30, de préférence encore entre 3 et 25. De manière préférée, n+m est compris entre 5 et 50, et peut notamment être compris entre 5 et 40, notamment encore entre 5 et 30, en particulier entre 5 et 25. Avantageusement, n+m est compris entre 7 et 200, de préférence entre 8 et 200, de préférence entre 9 et 200, de préférence entre 10 et 200. m, c’est-à-dire le nombre d'unités glucosyle dans la fraction glucidique [Glc] _m de la partie glucidique [Glc] _m -[Glc] _n du polyglucoside d’alkyle de formule (I), ou autrement dit le nombre d’unités glucosyle ajoutés sur la partie glucidique [Glc] _n du glucoside d’alkyle de formule (II) lors de la mise en oeuvre du procédé de l’invention, est avantageusement supérieur à 3. De manière préférée, m est compris entre 3 et 150, de préférence compris entre 3 et 100, de préférence encore compris entre 3 et 30. n, c’est-à-dire le nombre d'unités glucosyle dans la fraction glucidique [Glc] _n de la partie glucidique [Glc] _m -[Glc] _n du polyglucoside d’alkyle de formule (I), ou autrement dit le nombre d'unités glucosyle de la partie glucidique [Glc] _n du glucoside d’alkyle de formule (II), est avantageusement compris entre 1 et 8, de préférence entre 1 et 5, de préférence encore entre 1 et 3. De manière préférée, n est égal à 1 ou 2. Type de liaisons

Selon l’invention, l’expression « liaison a » désigne un lien covalent qui lie l’atome de carbone 1 d’une unité glucosyle dans sa configuration a ; et l’expression « liaison b » désigne un lien covalent qui lie l’atome de carbone 1 d’une unité glucosyle dans sa configuration b.

Au sein de la fraction glucidique [Glc] _n du polyglucoside d’alkyle de formule (I) ou de la partie glucidique [Glc] _n glucoside d’alkyle de formule (II), l’unité glucosyle adjacente au groupe alkyle est liée au groupe alkyl par une liaison a ou par une liaison b, de préférence par une liaison b.

En d’autres termes, dans le polyglucoside d’alkyle de formule (I) et le glucoside d’alkyle de formule (II), l’unité glucosyle adjacente au groupe alkyle est en configuration a ou b, de préférence en configuration b.

Les autres unités glucosyle de la fraction glucidique [Glc] _n du polyglucoside d’alkyle de formule (I) ou de la partie glucidique [Glc] _n glucoside d’alkyle de formule (II) sont liés entres elles par des liaisons glucosidiques a et/ou b, de préférence par des liaisons glucosidiques a.

Les m unités glucosyles adjacentes au sein de [Glc] _m sont liés entres elles par des liaisons glucosidiques a.

Dans le présent document, le terme « liaison a-1,3 » désigne le lien covalent qui lie l’atome de carbone 1 d’une unité glucosyle dans sa configuration a et le carbone 3 d’une autre unité glucosyle adjacente. Le terme « liaison a-1 ,2 » désigne le lien covalent qui lie l’atome de carbone 1 d’une unité glucosyle dans sa configuration a et le carbone 2 d’une autre unité glucosyle adjacente. Le terme « liaison alpha-1,6 » désigne le lien covalent qui lie l’atome de carbone 1 d’une unité glucosyle dans sa configuration alpha et le carbone 6 d’une autre unité glucosyle adjacente.

Les unités alpha-glucosyle sont de préférence des unités alpha-D-glucosyle.

L’analyse des liaisons glycosidiques d’un polyglucoside d’alkyl peut être réalisée grâce à n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier.

Par exemple, les liaisons glucosidiques peuvent être analysées par résonance magnétique nucléaire (RMN).

L’étape i) peut être conduite avec un glucoside d’alkyle de formule (II) essentiellement constitué de molécules de monoglucoside d’alkyle, de molécules de diglucloside d’alkyle, ou d’un mélange de celles-ci, ledit mélange présentant avantageusement un degré de polymérisation moyen compris entre 1 et 2, de préférence compris entre 1,3 et 1,6. Le mélange est essentiellement constitué de molécules de monoglucoside d’alkyle et de molécules de diglucloside d’alkyle, c’est-à-dire qu’il est constitué d’au moins 90% en poids de molécules de monoglucoside d’alkyle et de diglucloside d’alkyle, de préférence d’au moins 95% en poids de molécules de monoglucoside d’alkyle et de diglucloside d’alkyle, de préférence encore d’au moins 97% en poids de molécules de monoglucoside d’alkyle et de diglucloside d’alkyle.

Le reste peut avantageusement être constitué de molécules de d’oligoglucosides d’alkyle, i.e. de glucosides d’alkyle dont le glucoside comprend de 3 à 8 unités glucosyle, de préférence 3 à 5 unités glucosyle.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle de formule (I) est constitué essentiellement d’un mélange de molécules de polyglucosides d’alkyle de formule (I), ledit mélange présentant avantageusement un degré de polymérisation moyen compris entre 3 et 25, de préférence compris entre 5 et 25, de préférence compris entre 6 et 25, de préférence entre 7 et 25, de préférence encore entre 8 et 25.

Le mélange est essentiellement constitué de molécules de polyglucoside d’alkyle de formule (I), c’est-à-dire qu’il est de préférence constitué d’au moins 90% en poids desdites molécules de polyglucosides d’alkyle, de préférence d’au moins 95% en poids desdites molécules de polyglucosides d’alkyle, de préférence encore d’au moins 97% en poids desdites molécules de polyglucosides d’alkyle.

Dans la présente invention, le « degré de polymérisation moyen » rend compte de la distribution moyenne du nombre d'unités glucosyle par molécule de polyglucoside d’alkyle de formule (I) ou de glucoside d’alkyle de formule (II) au sein d’un mélange de molécules de polyglucoside d’alkyle de formule (I) ou d’un mélange de molécules de glucoside d’alkyle de formule (II).

Dans l’invention, ce degré de polymérisation moyen est déterminé à partir de mesures réalisées par résonance magnétique nucléaire (RMN).

Pour un mélange de molécules de polyglucoside d’alkyle de formule (I), le degré de polymérisation moyen est déterminé en calculant le ratio (masse molaire moyenne du mélange de molécules polyglucoside d’alkyle de formule (I) - masse molaire de la chaîne alkyle correspondante) : (masse molaire d’une unité glucosyle).

Pour un mélange de molécules de glucoside d’alkyle de formule (II), le degré de polymérisation moyen est déterminé en calculant le ratio (masse molaire moyenne du mélange de molécules de glucoside d’alkyle de formule (II) - masse molaire de la chaîne alkyle correspondante) : (masse molaire d’une unité glucosyle).

Groupe alkyle De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que des a-transglucosylases de la famille GH70 permettent de glucosyler efficacement des glucosides d’alkyle de formule (II) ayant un groupe alkyle de taille importante.

Le groupe alkyl comprend de préférence au moins 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 atomes de carbone et au plus 20 atomes de carbone.

Dans un mode de réalisation, le groupe alkyle R comprend avantageusement entre 8 et 16 atomes de carbone, de préférence encore comprend 8 et 12 atomes de carbone.

Dans un mode de réalisation, le groupe alkyle R comprend entre 9 et 20 atomes de carbone, de préférence comprend entre 9 et 16 atomes de carbone, de préférence encore comprend entre 9 et 12 atomes de carbone.

Dans un mode de réalisation, le groupe alkyle R comprend entre 10 et 20 atomes de carbone, de préférence comprend entre 10 et 16 atomes de carbone, de préférence encore comprend entre 10 et 12 atomes de carbone.

Dans un mode de réalisation, le groupe alkyle R comprend entre 13 et 20 atomes de carbone, de préférence comprend entre 16 et 20 atomes de carbone.

Plus particulièrement, les inventeurs ont montré que des a-transglucosylases de la famille GH70 sont capables de catalyser l’élongation de la partie glucosidique d’un glucoside d’alkyle de formule (II) présentant un groupe alkyle R comprenant entre 8 et 20 atomes de carbone, c’est-à-dire un substrat accepteur présentant un pôle alkyl beaucoup plus hydrophobe que des glucosides d’alkyl présentant un groupe alkyl tel qu’un groupe méthyle, éthyle, propyle ou butyle.

Autrement dit, le procédé de l’invention est particulièrement avantageux en ce qu’il permet d’obtenir un polyglucoside d’alkyle de formule (I) ayant un groupe alkyle R compris entre 8 et 20 atomes de carbone et une partie glucidique [Glc] _m -[Glc] _n ayant un n+m tel que défini ci-dessus.

Dans un mode de réalisation, R représente un groupe alkyle comprenant de 8 à 12 atomes de carbone, et n+m est compris entre 7 et 200, de préférence entre 8 et 200, de préférence entre 9 et 200, de préférence encore entre 10 et 200. Dans ce mode de réalisation, n+m peut avantageusement être compris entre 7 et 50, de préférence entre 8 et 50, de préférence entre 9 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50.

Dans un mode de réalisation, R représente un groupe alkyle comprenant de 12 à 20 atomes de carbone, et n+m est compris entre 3 et 200, de préférence entre 4 et 200, de préférence entre 5 et 200, et de préférence encore entre 10 et 200. Dans ce mode de réalisation, n+m peut avantageusement être compris entre 3 et 50, de préférence entre 4 et 50, de préférence entre 5 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50. Dans un mode de réalisation, lorsque R représente un groupe alkyle comprenant de 8 à 12 atomes de carbone, n+m est compris entre 7 et 200, de préférence entre 8 et 200, de préférence entre 9 et 200, de préférence encore entre 10 et 200 et peut notamment être compris entre 7 et 50, de préférence entre 8 et 50, de préférence entre 9 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50 ; et lorsque R représente un groupe alkyle comprenant de 12 à 20 atomes de carbone, n+m est compris entre 3 et 200, de préférence entre 4 et 200, de préférence entre 5 et 200, et de préférence encore entre 10 et 200 et peut notamment être compris entre 3 et 50, de préférence entre 4 et 50, de préférence entre 5 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50. a-transalucosylase

Selon l’invention, le terme « a-transglucosylase » désigne une enzyme capable de polymériser des unités glucosyle selon des liaisons a, en catalysant le transfert d'une unité glucosyle depuis un sucre donneur de glucosyle vers un composé accepteur.

Selon l’invention, l’expression « de la famille GH70 », relatif à l’otransglucosylase, signifie que Ga-transglucosylase selon l’invention appartient à la famille 70 des glycoside- hydrolases selon la classification CAZy (www.cazy.orq). CAZy, de l'anglais « Carbohydrate-Active enZYmes » (abrégé « CAZy »), est une base de données bio informatique de classification des enzymes actives sur les sucres i.e. capables de catalyser leur dissociation ou leur synthèse selon des homologies de séquences ou de structure, en particulier de leurs modules catalytiques et de liaison aux glucides. Dans la classification CAZy, le groupe des glycoside-hydrolases (GH) compte 167 familles composées d’enzymes actives sur les sucres capables de catalyser des réactions d’hydrolyse de liaisons glycosidique ou de transglucosylation.

Les a-transglucosylases de la famille GH70 sont typiquement produites de façon naturelles par des bactéries lactiques des genres Streptococcus, Leuconostoc (abrégé « L »), Weisella ou Lactobacillus (abrégé « Lb. »).

Les a-transglucosylases de la famille GH70 selon l’invention sont actives sur le saccharose, ce qui signifie que les a-transglucosylases selon l’invention utilisent spécifiquement le saccharose ou un de ses analogues comme donneur de glucosyle.

Les analogues de saccharose peuvent notamment être choisis dans le groupe comprenant le fluorure d’a D-glucopyranosyle (en anglais « a-D-Glucopyranosyl fluoride »), le 0-3-D-galactopyranosyl-(1 4)-3-D-fructofuranosyl-a-D-glucopyranoside (en anglais « Lactulosucrose »), le p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside, le a-D-glucopyranosyl a-L- sorbofuranoside et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation, Ga-transglucosylase de la famille GH70 est sélectionnée parmi l’une des a-transglucosylases décrites ci-dessous.

L’enzyme DSR-M D1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 42 à l’acide aminé à la position 1433 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme DSR-M (issue de la souche L. citreum NRRL B-1299) ayant pour référence GenBank CDX668951.1.

L’enzyme DSR-M D5 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 2 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 421 à l’acide aminé à la position 1315 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme DSR-M (issue de la souche L. citreum NRRL B-1299) ayant pour référence GenBank CDX668951.1.

L’enzyme DSR-M D5 W624A de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 3 est un mutant en position 624 du fragment de séquence d’acides aminés SEQ ID NO :2.

L’enzyme GS-A de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 4 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. kunkeei MP2 ayant pour référence GenBank ALJ31412.

L’enzyme GS-B de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 5 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. animalis DSM 20602 ayant pour référence GenBank KRM57462.1.

L’enzyme GS-C de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 6 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. Apodemi ayant pour référence GenBank WP_056957205.

L’enzyme GS-D de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 7 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. animalis DSM 20602 ayant pour référence GenBank KRM57463.

L’enzyme GS-E de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 8 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. capillatus DSM 19910 ayant pour référence GenBank KRL03580.

L’enzyme GS-F D1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 9 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 166 à l’acide aminé à la position 1874 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. fallax KCTC 3537 ayant pour référence GenBank WP_010006777.1.

L’enzyme GS-FS de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 10 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la Streptococcus salivarus HSISS4 ayant pour référence GenBank ALR80278. L’enzyme DSR-G de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 11 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la Lb. kunkeei DSM 12361 ayant pour référence GenBank KRK22577.1.

L’enzyme DSR-G CD1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 12 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 1 à l’acide aminé à la position 1407 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. kunkeei DSM 12361 ayant pour référence GenBank KRK22577.

L’enzyme ASR D1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 13 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 1 à l’acide aminé à la position 1425 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. mesenteroides NRRL B-1355 ayant pour référence GenBank CAB65910.2.

L’enzyme GTF-SI de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 14 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Streptococcus mutans ayant pour référence GenBank BAA26114.1 .

L’enzyme GTF-J de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 15 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Streptococcus mutans ayant pour référence GenBank AAA26896.1 .

L’enzyme GBDCD2 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 16 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 1758 à l’acide aminé à la position 2862 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. citreum NRRL B- 1299 ayant pour référence GenBank CDX66820.1 .

L’enzyme BRS-A de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 17 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. citreum NRRL B-1299 ayant pour référence GenBank CDX66896.1.

L’enzyme BRS-B D1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 18 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 39 à l’acide aminé à la position 1313 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. citreum NRRL B- 742 ayant pour référence GenBank CDX65123.1.

L’enzyme BRS-C de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 19 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. fallax KCTC 3537 ayant pour référence GenBank ZP_08312597.1 .

L’enzyme BRS-D D1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 20 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 88 à l’acide aminé à la position 1453 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. kunkei EFB6 ayant pour référence GenBank WP_051592287. L’enzyme BRS-E D1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 21 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 32 à l’acide aminé à la position 1264 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. mesenteroides KFRI-MG ayant pour référence GenBank AHF19404.1 .

L’enzyme BRS-F de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 22 correspond à la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Fructobacillus tropaeoli ayant pour référence GenBank GAP05007.1 .

L’enzyme DSR-G CD2 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 23 est un fragment allant de l’acide aminé à la position 928 à l’acide aminé à la position 2621 de la séquence d’acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. kunkeei DSM 12361 ayant pour référence GenBank KRK22577.1.

Les a-transglucosylases de la famille GH70 selon l'invention peuvent être obtenues selon des méthodes connues de l’homme du métier, notamment par la méthode consistant à cultiver une cellule exprimant naturellement Ga-transglucosylase ou une cellule hôte comprenant un transgène codant pour Ga-transglucosylase et exprimant ladite a- transglucosylase, et à extraire ladite a-transglucosylase à partir de ces cellules ou du milieu de culture dans lequel Ga-transglucosylase a été sécrétée.

Des souches de bactéries recombinantes, par exemple des souches de bacillus subtillis ou de lactobacillus, sécrétant lesdites a-transglucosylases de la famille GH70 peuvent être utilisées.

On peut également obtenir les a-transglucosylases de la famille GH70 par l’intermédiaire de systèmes d’expression acellulaire (en anglais « cell free protein expression Systems).

Dans le procédé de l’invention, Ga-transglucosylase de la famille GH70 est de préférence une glucane-saccharase de la famille GH70, une saccharase de branchement de la famille GH70, ou un mélange de celles-ci.

Dans le présent document, l’expression « glucane-saccharase de la famille GH70 » parfois abrégée « GS » se réfère à une a-transglucosylase de la famille GH70 capable de catalyser la synthèse d’a-glucanes i.e. de polysaccharides composés exclusivement d’unités glucosyle liées entre elles par des liaisons alpha. Parmi les glucane-saccharases, on peut citer les dextrane-saccharases (parfois abrégé DSR), qui synthétisent des dextranes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaîne principale sont liés majoritairement en alpha-1 ,6 ; les reuterane-saccharases, qui synthétisent des reuteranes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaîne principale sont liés en alpha-1 ,4 et alpha- 1 ,6 ; les mutanes-saccharases, qui synthétisent des mutanes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaîne principale sont liés majoritairement en alpha-1 ,3 ; des alternanes- saccharase, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaîne principale sont liés alternativement en alpha-1 ,3 et alpha-1 ,6. De préférence, G a-transglucosylase de la famille GH70 n’est pas une alternane-saccharase.

Dans le présent document, les termes « saccharase de branchement de la famille GH70 » (en anglais « branching sucrase », parfois abrégé BRS) ou « a-transglucosylase de la famille GH70 à activité de branchement » ou « enzyme de branchement de la famille GH70 » sont utilisées indifféremment et se réfèrent à une a-transglucosylase de la famille GH70 capable de catalyser l’ajout d’unités glucosyle dans la chaîne principale d’un glucane de type dextrane pré-existant formant des branchements (ou autrement dit des ramifications). La nature de la liaison de branchement (liaisons alpha-1 ,2 ; alpha-1 ,3 ; alpha-1 ,4 ou alpha-1 ,6) et la longueur des chaînes d’unités glucosyle constituant les branchements varient selon la spécificité de la saccharase de branchement considérée.

De manière préférée, les saccharases de branchement de la famille GH70 selon l’invention catalysent des ramifications comprenant de préférence 1 à 3 unités glucosyle, de préférence 1 ou 2 unités glucosyle selon des liaisons alpha-1 ,2 et/ou des liaisons alpha-

1.3.

Ainsi, dans un mode de réalisation, la partie glucidique du polyglucoside d’alkyle de formule (I) se présente sous la forme d’une chaîne linéaire comprenant des ramifications comportant de 1 à 3 unités glucosyle, de préférence 1 ou 2 unités glucosyle, lesdites ramifications étant liées à la chaîne linéaire selon des liaisons alpha-1 ,2 et/ou des liaisons alpha-1 ,3.

Les inventeurs ont démontré que, de manière surprenante, certaines a- transglucosylases de la famille GH70 sont aptes à transférer des unités glucosyle sur la partie glucidique d’un glucoside d’alkyle de formule (II) tel que décrit ci-avant via un mécanisme d’élongation glucosidique.

Selon un mode de réalisation, Ga-transglucosylase de la famille GH70 est une glucane- saccharase de la famille GH70.

Lorsque Ga-transglucosylase de la famille GH70 est une glucane-saccharase de la famille GH70, on obtient avantageusement un polyglucoside d’alkyle dont la partie glucidique comprend au moins 50%, de préférence 60%, de préférence encore 80% de liaisons choisies dans le groupe comprenant des liaisons alpha-1 ,6 et des liaisons alpha-

1 .3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,4. En outre, les glucane-saccharases de la famille GH70 selon l’invention rendent possible l’obtention d’un polyglucoside d’alkyle ayant une longue chaîne glucosidique, avec n+m tel que défini ci-dessus.

La glucane-saccharase de la famille GH70 de l’invention a de préférence pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, , SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 et SEQ ID NO : 15.

Les inventeurs ont pour la première fois montré que les glucane-saccharases de la famille GH70 de l’invention sont capables de rallonger des glucosides d’alkyle de formule (II) de plus de 3 unités glucosyle à partir de saccharose.

Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon l’invention a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 12, on obtient un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 80% de liaisons alpha-1 ,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,3.

Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon l’invention a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, et SEQ ID NO : 12, on obtient un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 90%, de préférence au moins 95% de liaisons alpha-1 ,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,3.

Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon l’invention a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 14, et SEQ ID NO : 15 on obtient un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 90% de liaisons alpha-1 ,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,6.

Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon l’invention a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO :9, on obtient un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont le la partie glucidique comprend au moins 70% de liaisons alpha-1 ,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,3.

Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon l’invention a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 4 on obtient un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 50% de liaisons alpha-1 ,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,4.

Selon un autre mode de réalisation, Ga-transglucosylase de la famille GH70 selon l’invention est une saccharase de branchement GH70.

Lorsque Ga-transglucosylase de la famille GH70 est une saccharase de branchement, on obtient avantageusement un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 50%, de préférence 60%, de préférence encore 80% de liaisons dans le groupe comprenant alpha-1 ,2, alpha-1 ,3 et leurs mélanges ; le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,6.

La saccharase de branchement de la famille GH70 selon l’invention a de préférence pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, et SEQ ID NO : 23.

Avantageusement, lorsque la saccharase de branchement de la famille GH70 a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 20, et SEQ ID NO : 22 on obtient un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 80% de liaisons alpha-1 ,2, de préférence 100% de liaisons alpha-1 ,2.

Avantageusement, lorsque la saccharase de branchement GH70 a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, et SEQ ID NO : 23 on obtient un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 80%, de préférence 90%, de préférence encore 95%, de préférence encore 98%, de liaisons alpha-1 ,3, de préférence encore 100% de liaisons alpha-1 ,3.

Avantageusement, lorsque la saccharase de branchement GH70 a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 21 on obtient un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 60% de liaisons alpha-1 ,2, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha- 1 ,6.

Mise en œuyre du procédé

L’étape i) peut être conduite en mettant en contact simultanément ou successivement le glucoside d’alkyle de formule (II) avec plusieurs a-transglucosylases de la famille GH70. Dans un mode de réalisation, l’étape i) comprend une sous-étape io) de mise en contact du glucoside d’alkyle de formule (II) avec un mélange d’une ou plusieurs glucane- saccharase(s) GH70 et d’une ou plusieurs enzyme(s) de branchement GH70.

Dans cette sous-étape io), on utilise de préférence un ratio (glucane-saccharase) : (saccharase de branchement), exprimé en unité d’activité enzymatique, compris entre 0,01 et 10, les activités de chacune des enzymes utilisées variant avantageusement entre 0,2 et 2 U. ml ¹ .

Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs pensent que la mise en contact d’un glucoside d’alkyle de formule (II) avec un mélange de glucane- saccharase^) et de saccharase(s) de branchement selon l’invention lors de l’étape io) favorise l’amorçage de la réaction d’élongation.

Dans un mode de réalisation, l’étape i) comprend une étape h) de mise en contact du glucoside d’alkyle de formule (II) avec une ou plusieurs glucane-saccharase(s) de la famille GH70.

Sans vouloir être liés par une théorie, les inventeurs pensent que ce mode de réalisation permet dans un premier temps de favoriser l’élongation de la partie glucidique sous forme d’une longue chaîne linéaire.

Dans un mode de réalisation, l’étape i) comprend la mise en contact du glucoside d’alkyle de formule (II) avec une ou plusieurs glucane-saccharase(s) de la famille GH70 puis une étape b) de mise en contact du glucoside d’alkyle obtenu à l’issue de l’étape h) avec une ou plusieurs saccharase(s) de branchement de la famille GH70.

Sans vouloir être liés par une théorie, les inventeurs pensent que ce mode de réalisation permet dans un premier temps de favoriser l’élongation de la partie glucidique sous forme d’une longue chaîne linéaire, puis dans un second temps de favoriser l’élongation de la partie glucidique sous forme de ramifications.

Ce mode de réalisation a également pour avantage d’augmenter la diversité de structures chimiques obtenues.

L’utilisation de saccharases de branchement de la famille GH70 selon l’invention permet en effet de contrôler le nombre de branchements introduits, en fonction des conditions réactionnelles, de sorte à obtenir un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 50% de liaisons alpha-1 ,6, le reste des liaisons glucosidique étant des liaisons alpha-1 ,3 et/ou des liaisons alpha-1 ,2, la somme des pourcentages de liaisons alpha-1 ,6, des pourcentages de liaisons alpha-1 ,3 et de pourcentages de liaisons alpha-1 ,2 étant égale à 100%. On peut par exemple obtenir un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 60% de liaisons alpha-1 ,6, au moins 2% de liaisons alpha- 1 ,3 et au moins 2% de liaisons alpha-1 ,6, de préférence entre 2% et 35% de liaisons alpha- 1 ,3 et au moins 1 % de liaisons alpha-1 ,2, de préférence entre 2% et 35% de liaisons alpha- 1 ,2, la somme des pourcentages de liaisons alpha-1 ,6, des pourcentages de liaisons alpha- 1 ,3 et de pourcentages de liaisons alpha-1 ,2 étant égale à 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, l’étape i) est effectuée en solution à un pH contrôlé, en particulier par l’emploi d’une solution tampon.

L’étape i) est avantageusement conduite à une valeur de pH comprise entre 5 et 8.

L’étape i) est avantageusement conduite avec une concentration initiale de saccharose ou d’un analogue de saccharose comprise entre 20 et 660 g.L ¹ .

L’étape i) est de préférence réalisée avec un rapport molaire polyglucoside d’alkyle de formule (II) : saccharose ou analogue de saccharose compris entre 0,001 et 10, de préférence entre 0,001 et 5, de préférence 0,001 et 0,3, de préférence entre 0,002 et 0,006.

De manière importante, les inventeurs ont montré que l’élongation de la chaîne peut être modulée en fonction du rapport molaire polyglucoside d’alkyle de formule (II) : saccharose ou analogue de saccharose. Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs considèrent que plus le rapport molaire polyglucosides d’alkyle de formule (II) : saccharose ou analogue de saccharose est grand, moins le saccharose est disponible pour être donneur et donc moins l’accepteur est rallongé.

De manière avantageuse, l’étape i) est réalisée avec un rapport molaire polyglucosides d’alkyle de formule (II) : saccharose ou analogue de saccharose compris entre 0,05 et 5. L’étape i) est de préférence mise en oeuvre à une température comprise entre 10°C et 80°C.

De préférence, l’étape i) est conduite avec Ga-transglucosylase de la famille GH70 sous forme solide, en solution, en suspension, ou immobilisée.

Le procédé peut comprendre en outre avantageusement une étape ii) de purification du polyglucoside d’alkyle de formule (I) obtenu à l’issue de l’étape i).

Polyglucosides d’alkyle susceptibles d’être obtenus selon le procédé de l’invention

Le polyglucoside d’alkyle de formule (I) obtenu par la mise en oeuvre du procédé tel que défini selon le premier objet de l’invention, en particulier à l’issue de l’étape i) constitue un deuxième objet de l’invention. L’invention a donc pour deuxième objet un polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention, ledit polyglucoside d’alkyle étant caractérisé en ce qu’il est de formule (I) :

[Glc] _m -[Glc] _n (-0-R) (I) dans laquelle :

R représente un groupe alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant entre 8 et 20 atomes de carbone,

[Glc] _m -[Glc] _n représente une partie glucidique linéaire ou ramifiée comprenant n+m unités glucosyle, n+m étant compris entre 3 et 200.

Le polyglucoside d’alkyle de formule (I) susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention peut présenter une grande diversité structurale, notamment au niveau de sa partie glucidique, en particulier en termes de taille, de structure (ramifiée ou non) et de nature des liaisons osidiques.

Ainsi, le polyglucoside d’alkyle de formule (I) du deuxième objet de l’invention est tel que défini de manière détaillée dans le premier objet de l’invention, en particulier, le nombre d’atomes de carbone du groupe alkyle R, le nombre n+m d’unités glucosyle au sein de la partie glucidique [Glc] _m -[Glc] _n , ainsi que la nature des liaison au sein des fractions de la partie glucidique [Glc] _m -[Glc] _n et celle de la liaison entre le groupe alkyle R et la fraction glucidique [Glc] _n sont tels que précédemment mentionnés.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle de formule (I) susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention, est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dans lequel R représente un groupe alkyle comprenant de 8 à 12 atomes de carbone et dans lequel le nombre n+m est compris entre 7 et 200, de préférence entre 8 et 200, de préférence entre 9 et 200, de préférence encore entre 10 et 200. Dans ce mode de réalisation, n+m peut notamment être compris entre 7 et 50, de préférence entre 8 et 50, de préférence entre 9 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle de formule (I) susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention, est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dans lequel R représente un groupe alkyle comprenant de 12 à 20 atomes de carbone et dans lequel n+m est compris entre 3 et 200, de préférence entre 4 et 200, de préférence entre 5 et 200, et de préférence encore entre 10 et 200. Dans ce mode de réalisation, n+m peut notamment être compris entre 3 et 50, de préférence entre 4 et 50, de préférence entre 5 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50. Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle de formule (I) susceptible d’être obtenu par du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dans lequel :

- lorsque R représente un groupe alkyle comprenant de 8 à 12 atomes de carbone, n+m est compris entre 7 et 200, de préférence entre 8 et 200, de préférence entre 9 et 200, de préférence encore entre 10 et 200 et n+m peut notamment être compris entre 7 et 50, de préférence entre 8 et 50, de préférence entre 9 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50 ; et

- lorsque R représente un groupe alkyle comprenant de 12 à 20 atomes de carbone, n+m est compris entre 3 et 200, de préférence entre 4 et 200, de préférence entre 5 et 200, et de préférence encore entre 10 et 200 et peut notamment être compris entre 3 et 50, de préférence entre 4 et 50, de préférence entre 5 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) constitué essentiellement d’un mélange de molécules de polyglucoside d’alkyle de formule (I), ledit mélange présentant un degré de polymérisation moyen compris entre 3 et 25, de préférence compris entre 5 et 25, de préférence compris entre 6 et 25, de préférence entre 7 et 25, de préférence encore entre 8 et 25. Ce mélange est essentiellement constitué de molécules de polyglucoside d’alkyle de formule (I), c’est-à-dire qu’il est constitué d’au moins 90% en poids desdits polyglucosides d’alkyle, de préférence d’au moins 95% en poids desdits polyglucosides d’alkyle, de préférence encore d’au moins 97% en poids desdits polyglucosides d’alkyle.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 50%, de préférence 60%, de préférence encore 80% de liaisons alpha-1 ,6 ou de liaisons alpha-1 ,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,4 et/ou de liaison alpha- 1 ,2.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 50%, de préférence au moins 70% de liaisons alpha-1 ,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,3. Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 60% de liaisons alpha-1 ,6, au moins 2% de liaisons alpha-1 ,3 et au moins 2% de liaisons alpha- 1 ,6, de préférence entre 2% et 35% de liaisons alpha-1 ,3 et au moins 1 % de liaisons alpha-

1.2, de préférence entre 2% et 35% de liaisons alpha-1 ,2, la somme des pourcentages de liaisons alpha-1 ,6, des pourcentages de liaisons alpha-1 ,3 et de pourcentages de liaisons alpha-1 ,2 étant égale à 100%.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 90% de liaisons alpha-1 ,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,6.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 50% de liaisons alpha-1 ,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,4.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 70% de liaisons alpha-1 ,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,3.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 80% de liaisons alpha-1 ,2, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,3.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 80%, de préférence 90%, de préférence encore 95%, de préférence encore 98%, de liaisons alpha-

1 .3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,2.

Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 80%, de préférence 90%, de préférence encore 95%, de préférence encore 98%, de liaisons alpha-

1 ,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,2. Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l’invention est un polyglucoside d’alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 60% de liaisons alpha-1 ,2, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1 ,6.

Utilisation du polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention

L’invention a pour troisième objet l’utilisation d’un polyglucoside d’alkyle susceptible d’être obtenu selon le procédé conforme à l’invention ou tel que défini dans le deuxième objet de l’invention, à titre de surfactant.

Utilisation des a-transglucosylases selon l’invention pour l’élongation glucosidigue d’un glucoside d’alkyle.

L’invention a pour quatrième objet l’utilisation d’une a-transglucosylase de la famille GH70 telle que définie au premier objet de l’invention, en particulier d’une glucane-saccharase de la famille GH70 ou d’une saccharase de branchement de la famille GH70 telle que définie au premier objet de l’invention, pour l’élongation glucosidique d’un glucoside d’alkyle, en particulier d’un glucoside d’alkyle de formule (II) tel que défini au premier objet de l’invention.

La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants, auxquels elle n’est cependant pas limitée.

EXEMPLES

Exemple 1 : Enzymes, organismes d’origine et spécificité

Les enzymes utilisées sont listées dans le Tableau 1.

La séquence SEQ ID NO :3 correspond au mutant de l’enzyme DSR-M D5 sur la position 624 où le tryptophane sauvage est remplacé par une alanine.

Tableau 1: a-transglucosylases GH70 et spécificités de liaisons lors de la synthèse du polymère naturel. P :polymerase i.e. glucane-saccharase GH70 ; B : saccharase de branchement GH70 (« Branching sucrase » en anglais) ; Bif : Bifonctionnelle (enzyme ayant deux domaines catalytiques) ; nd= non déterminé.

[Table 1]

Exemple 2 : Expression hétérologue des enzymes chez Escherichia coli

Les gènes codant pour les enzymes citées ci-dessus sont clonés dans des vecteurs permettant l’expression recombinante chez E. coli, sous le contrôle de promoteurs pBad ou pET.

Les enzymes recombinantes sont produites à partir des cellules d’E. coli BL21 DE3 Al ou BL21 DE3 Star transformées avec le plasmide contenant le gène des enzymes ciblées (voir Tableau 2).

[Table 2]

Tableau 2 : plasmides des enzymes utilisées et systèmes d’expression adaptés aux différentes enzymes. (Gly : Glycérol ; Glu : Glucose ; a-Lac : a-Lactose ; L-Ara : L- Arabinose) Trois cents microlitres du mélange de transformation permettent d’ensemencer un volume de 30 ml_ de préculture en milieu LB (abrégé de l’anglais « Lysogeny Broth »), supplémenté avec 100 pg.mL ¹ d’ampicilline. Chaque préculture est incubée à 37°C pendant 10 heures sous une agitation de 150 rpm. Des cultures d’1L en milieu ZYM5052 modifié dont les caractéristiques sont présentées dans le Tableau 2 sont ensemencées à une densité optique (DO) DO _A = ₆ oo _nm initiale de 0,05 à partir de la préculture de la veille, puis mises à incuber 26 heures à 21 °C et à 150 rpm.

En fin de fermentation, les milieux de culture sont centrifugés pendant 15 min à 6500 rpm et à une température de 4°C. Les culots cellulaires sont concentrés à une DO de 80 dans du tampon d’activité (voir Tableau 2). Les cellules sont ensuite cassées aux ultrasons selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30% de la puissance maximale de la sonde, à froid (bain de glace), espacés de 4 minutes de repos dans la glace. Les surnageants de sonication contenant les enzymes d’intérêt solubles sont ensuite récupérés après 30 minutes de centrifugation (10000 rpm, 10°C) et conservés à 4°C.

Exemple 3 : Détermination de l’activité enzymatique par dosage des sucres réducteurs au DNS.

L’activité enzymatique des glucane-saccharases et des saccharases de branchement est déterminée en mesurant la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide dinitrosalicilique (DNS) (Miller, 1959).

Une unité enzymatique représente la quantité d’enzyme qui libère une pmole de fructose par minute, à 30 °C, pour une concentration initiale de saccharose de 100 g.L ¹ dans les conditions de tampon d’activité adéquate.

Au cours d’une cinétique d’1 mL de volume, 100 pL de milieu réactionnel sont prélevés et la réaction est stoppée par ajout d’un volume équivalent de DNS. Les échantillons sont ensuite chauffés 5 min à 95 °C, refroidis dans la glace, dilués au demi dans de l’eau, et l’absorbance est lue à 540 nm. Une gamme étalon de 0 à 2 g.L ¹ de fructose permet d’établir le lien entre la valeur d’absorbance et la concentration en sucres réducteurs.

Réactions d’accepteur

Les réactions d’accepteurs sont réalisées dans un volume compris entre 1 mL et 15 mL et pour une concentration finale en saccharose comprise entre 146 et 730 mM. Les concentrations en alkylpoly-glucosides sont dépendantes de leur solubilité et varient entre : 20 et 50 mM pour l’octyl-monoglucoside,

10 et 30 mM pour le décyl-monoglucoside,

1 et 5 mM pour le dodécyl-monoglucoside,

10 et 20 mM pour le dodecyl diglucoside.

Dans le cas du triton CG110 (mélange commercial d’APGs en C8 et C10), la réaction a été réalisée en présence de 2 mg à 10 mg de Triton CG110 par mL de réaction.

La réaction est initiée par l’addition d’un volume de lysat cellulaire suffisant pour obtenir une activité enzymatique en réaction de 1 U.mL ¹ . Les réactions sont incubées à 37°C et agitées à 800 rpm. Au bout de 24h, les enzymes sont dénaturées à 95°C pendant 5 min. Les réactions sont conservées à -18°C avant analyse des produits de la réaction par chromatographie liquide haute performance (CLHP).

Purification des produits de réaction Une étape de prépurification des hydroxy-lipides glucosylés issus de l’acide 11-hydroxy- undécanoïque est réalisée par flash chromatographie grâce à un système REVELERIS® X2 Flash Chromatography System (GRACE, USA) équipé d’une colonne C18 de 80 g. Les produits de glucosylation sont séparés des sucres libres résiduels dans les conditions suivantes :

-débit de 60 ml. min ¹ , détection ELSD -0,5 volumes de colonne (VC) à 100% H2O

-gradient passant de 0% H2O ultra-pure à 50% acétonitrile en 8,5 volumes de colonne (VC)

-1 VC à 50% acétonitrile

-retour à 100% H2O ultra pure en 0,2 VC

-équilibration à 100% H2O ultra pure pendant 1 ,5 VC

Les fractions contenant les produits de réactions élués entre 4 et 10 VC sont collectées, partiellement évaporés à l’évaporateur rotatif puis lyophilisés. Les échantillons sont stockés à température ambiante et à l’abri de l’humidité.

Techniques analytiques

Pour l’analyse en CLHP, les milieux réactionnels sont dilués au demi dans de l’éthanol absolu. Cette dilution permet entre autres l’élimination des potentiels polymères de haute masse molaire par précipitation.

La séparation des accepteurs lipidiques et de leurs formes glucosylées est effectuée par chromatographie en phase inverse avec une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). Cette colonne est maintenue à 30°C sur un système CLHP Thermo U3000 couplé à un détecteur Corona CAD Véo (Charged Aérosol Detector) (Thermo Scientific, USA). La température de nébulisation est fixée à 50°C et le filtre réglé à 3,2 secondes.

La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité CLHP (solvant B) tous deux contenant 0,05% (v/v) d’acide formique. L’élution est réalisée à un débit de 1 mL.min ¹ selon le gradient suivant :

- Entre 0 min et 5 min, une première phase d’élution avec 0% (v/v) de la voie B permet l’élimination des sucres simples résiduels (fructose, glucose, leucrose, saccharose résiduels ou éventuels oligosaccharides courts) ;

- Une seconde phase de gradient allant de 0% est réalisée à 100% de la voie B pendant 25 minutes permet de séparer les différents composés lipidiques glucosylés ; - Une dernière phase de 5 minutes à 100% de la voie B permet la régénération de la colonne.

Analyse par RMN

La caractérisation des produits de glucosylation des différents APG est réalisée par RMN. Les produits sont dilués dans D2O et en présence de triméthylsilylpropanoate de sodium deutéré (TSP-d4) utilisé comme référence interne. Les spectres 1 H ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500MHz à 298K avec une sonde 5 mm z-gradient TBI. Les données ont été acquises et traitées avec le logiciel TopSpin 3.

Exemple 4 : Synthèse d’alkyle glucosides

4.1 . Protocole général

26 a-transglucosylases de la famille GH70 ont été testées pour leur aptitude à rallonger des alkyl-glycosides de structures et de tailles différentes :

- Octyl-3-D-glucoside, CsGi

- Decyl- b -D-Glucoside, C10G1,

- Dodecyl- b -D-Glucoside, C12G1

- Dodécyl- b -D-maltoside, C12G2,

- Hexadecyl maltoside, C16G2

- Triton CG110 (DuPont, USA), mélange contenant majoritairement du CsGi, du C10G1 et minoritairement des APGs de degré de polymérisation supérieur.

Les enzymes testées sont répertoriées dans le Tableau 3. Elles ont toutes été produites sous forme recombinante et exprimées chez Escherichia coli.

Les extraits enzymatiques obtenus par fermentation sont utilisés bruts après cassage des cellules et centrifugation des débris cellulaires .

Les réactions d’accepteurs mettant en jeu des GSs ont été réalisées dans un volume de 1 à 10 mL à des concentrations variables en APG dépendantes de leur solubilité dans l’eau (entre 5mM pour C12G1 et 30 mM pour CsGi) et des concentrations de saccharose variant entre 146 mM (50 g.L ¹ ) et 1316 mM (450 g.L· ¹ ).

Toutes les réactions ont été réalisées en présence d’1 U.mL ¹ d’enzyme, d’un tampon Acétate Na 50mM pH=5,75, incubées à 37°C et sous une agitation de 800 rpm. Au bout de 24 heures les enzymes sont dénaturées par incubation à 95°C pendant 5 minutes. En vue de leurs analyses par CLHP-CAD, les milieux réactionnels sont dilués au 1/2 dans de l’éthanol et centrifugés 5 min à 11 000 g afin d’éliminer les glucanes co-produits de réaction et les protéines floculées.

La séparation des différents produits de réaction est effectuée par chromatographie en phase inverse avec une colonne Synergi™ Fusion-RP 250 mm x 2 mm (porosité : 80 Â, granulométrie : 4 pm, Phenomenex, USA). Cette colonne est maintenue à 30°C sur un système CLHP Thermo Ultimate 3000 équipé d’un détecteur Corona Véo. La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité LC-MS (solvant B) contenant chacun 0,05% (v/v) d’acide formique. La séparation est assurée en 35 min par un gradient linéaire, en solvant B, défini comme suit : 0 min, 0% (v/v) ; 5 min, 0% ; 35 min, 100%.

4.2. Résultats

Les résultats obtenus lors de la glucosylation du CsGi par les a-transglucosylases de la famille GH70 utilisatrice de saccharose sont présentés dans les [Fig. 2A] Figures 2A et [Fig. 2B] 2B.

Les [Fig. 2A] Figures 2A et [Fig. 2B] 2B montre les profils d’élongation du substrat C8G1 obtenus avec les a-transglucosylases de la famille GH70 qui utilisent le saccharose comme substrat.,

[Fig. 2A] La Figure 2A montre les profils obtenus avec les glucane saccharases dans le Chromatogramme A : réactions avec [C8G1] = 30 mM, [saccharose] = 585 mM pour les glucane-saccharases DSR-M D1 (SEQ ID NO : 1), DSR-M D5 (SEQ ID NO : 2), DSR-M D5 W624A (SEQ ID NO : 3), GS-B (SEQ ID NO : 5), GS-C (SEQ ID NO : 6), GS-D (SEQ ID NO : 9) et GS-FS D1 (SEQ ID NO : 10) et 1170 mM de saccharose pour les enzymes GS- A SEQ ID NO :4, GS-D (SEQ ID NO :7), DSR-G (SEQ ID NO :11), DSR-G CD1 (SEQ ID NO :12). La [Fig. 2B] Figure 2B montre les profils obtenus avec les saccharases de branchement BRS-A (SEQ ID NO : 17), BRS-B D1 (SEQ ID NO : 18), BRS-C (SEQ ID NO : 19), BRS-D D1 (SEQ ID NO : 20), BRS-E D1 (SEQ ID NO : 21 ), BRS-F (SEQ ID NO : 22), DSR-G CD2 (SEQ ID NO : 23), GBD-CD2 (SEQ ID NO : 16) illustrés dans le chromatogramme B, à partir de [C8G1] = 20 mM et de [saccharose] = 585 mM. L’ensemble des enzymes testées a permis l’élongation de l’APG substrat.

On observe que les profils de produits obtenus sont différents selon la classe d’enzymes utilisées (glucane saccharases GH70 et/ou saccharases de branchement GH70).

Les enzymes de branchement [Fig. 2B] (Figure 2B) permettent l’ajout de 1 à 7 unités glucosyle sur le CsGi selon les enzymes considérées, avec des taux de conversion variant de 20% à 60% dans les conditions testées. Avec les glucane-saccharases [Fig. 2A] (Figure 2A), les tailles des APG obtenus sont beaucoup plus étendues, les produits portant un nombre important d’unités glucosyle.

À titre de comparaison, [Fig. 3] la Figure 3 présente les profils d’élongation de CsGi obtenu avec i) la glucane-saccharase GS-C (SEQ ID NO :6) en présence de saccharose et d’a- cyclodextrines, et ii) la CGTase de Bacillus macerans (non conforme à l’invention) en présence d’a-cyclodextrines dans des conditions similaires aux travaux de Svenson et collaborateurs (Svenson et al., 2009). Les profils montrent clairement le caractère polymérique de la tête glucosidique synthétisée par la glucane-saccharase DSR-M D1 (SEQ ID NO :1 ) (et l’ensemble des glucane saccharases testées), en contraste avec le profil oligomérique des APG obtenus avec la CGTase.

Saccharases de branchement

Par ailleurs, les APG produits par les glucane-saccharases peuvent eux-mêmes être utilisés en tant que substrats par les saccharases de branchement.

Ces dernières permettent alors de « décorer » les têtes glucidiques par des unités glucosyle liées en a-1 ,2 ou a-1 ,3.

Ceci est illustré par [Fig. 4] la Figure 4 où l’on observe une modification du profil de produits obtenus avec la glucane-saccharase DSR-M D1 (SEQ ID NO :1 ) seule par rapport au profil de produits obtenus avec les enzymes de branchement BRS-A (SEQ ID NO :17) et BRS- B D1 (SEQ ID NO :18) utilisées dans une seconde étape après ajout de saccharose supplémentaire.

Les APG produits par l’ensemble des enzymes de type polymérase ont été purifiés et caractérisés par RMN ¹ H, enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500MHz à 298K avec une sonde 5 mm z-gradient TBI. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin3. Le pourcentage de chaque liaison est calculé grâce aux intensités relatives des protons anomériques des unités glucosyle engagées dans une liaison avec l’APG par intégration de l’aire des pics. Le DP moyen est déterminé par la somme de l’intensité relative de ces mêmes protons anomériques en prenant le proton H1 du premier sucre lié à la chaîne alkyle en conformation beta (d = 4,5 ppm) comme référence.

Les résultats obtenus présentés en Tableau 3 montrent la possibilité de moduler le DP moyen par le choix des concentrations initiales en substrats et le ratio molaire (saccharose/APG) et l’enzyme utilisée. Tableau 3 : caractéristiques structurales des APG à très longues têtes glucidiques. Conditions de synthèse [CsGi] = 30 mM, [saccharose] = 585 mM pour les enzymes SEQ ID 1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10 et 1170 mM pour les enzymes SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :11 , SEQ ID NO :12.

[Table 3]

[Fig. 5] La Figure 5 montre les profils d’élongation obtenus avec l’enzyme DSR-M D1 (SEQ ID NO :1 ) avec des substrats de géométries différentes en termes de taille de chaîne alkyle (C8 à C16) et de tête glucidique (mono, diglucoside ou oligoglucosides).

La glucane saccharase a permis l’élongation de l’ensemble de ces accepteurs.

Les résultats montrent également l’influence de la taille des accepteurs. Plus la chaîne alkyle est longue (/.e. moins sa solubilité est grande) moins la glucosylation est efficace dans les conditions réactionnelles testées. Cet effet est contrebalancé par l’augmentation de la taille de la tête glucosidique (différence de glucosylation de C12G1 et de C12G2). Cela montre l’importance de la maîtrise des conditions de synthèse pour une élongation efficace des APG à chaîne alkyle longue.

Exemple 5 : Contrôle du profil d’élongation

5.1 . Etude de l’influence du rapport molaire glucoside d’alkyle accepteur : saccharose sur le profil d’élongation

5.1.1 Matériel et méthodes

Dans une première série d’expériences, on étudie l’influence du rapport molaire glucoside d’alkyle accepteur (i.e. glucoside d’alkyle de formule (II)) : saccharose ou analogue de saccharose sur le profil d’élongation du glucoside d’alkyle accepteur CsGi ou C12G2 par l’enzyme DSR-M D1 (SEQ ID NO : 1 ).

Dans cette première série d’expérience, les concentrations en CsGi ou C12G2 sont fixées à 10 g/L (respectivement 34,3 mM et 19,6 mM) et la concentration en saccharose est modulée entre 233,4 g/L (684 mM) et 2,3 g/L (6,8 mM) de telle manière que le ratio molaire glucosides d’alkyle accepteur : saccharose soit de 0,05 ; de 0,1 ; de 0,25 ; de 0,5 ; de 1 ; de 2 ; ou bien de 5.

Témoin : les réactions témoin représentent les mélanges de C8G1 ou C12G2 à une concentration de 10 g/L et de 233.4g/L de saccharose sans ajout d’enzyme

5.1.2. Résultats

Les résultats de cette première série d’expériences sont présentés en Figure 6 et confirment la possibilité de moduler le profil d’élongation en fonction du rapport molaire glucoside d’alkyle accepteur : saccharose entre 0.05 et 5.

[Fig. 6] La Figure 6 montre les profils d’élongation obtenus avec l’enzyme DSR-M D1 (SEQ ID NO : 1 ) avec des ratios molaires décroissants entre CsGi et Saccharose (Figure 6A) et entre C12G2 et saccharose (Figure 6B). Les résultats montrent l’effet du ratio glucoside d’alkyl accepteur : saccharose sur l’élongation du glucoside d’alkyl accepteur : plus le rapport molaire est élevé, moins le glucoside d’alkyle accepteur est rallongé. Les résultats montrent donc que le DP moyen du polyglucoside d’alkyle obtenu est inversement proportionnel au rapport molaire glucoside d’alkyl accepteur : saccharose. Par ailleurs, la Figure 6A montre que pour le CsGi, le profil d’élongation varie significativement pour des rapports molaires compris entre 0,05 et 2, tandis que les rapports molaires supérieurs à 2 ont peu d’influence sur le profil d’élongation/

La Figure 6B montre que pour le C12G2, le profil d’élongation varie significativement pour des rapports molaires compris entre 0,05 et 5.

5.2. Etude de l’influence du ratio d’activité glucane-saccharase: saccharase de branchement sur le profil d’élongation

5.2.1. Matériel et méthodes

Dans une deuxième série d’expériences, on étudie l’influence du ratio d’activité glucane- saccharase : saccharase de branchement sur le profil d’élongation du glucoside d’alkyle accepteur CsGi _.

Dans cette seconde série d’expérience, la glucane-saccharase est DSR-M D1 (SEQ ID NO : 1 ) et la saccharase de branchement BRS-A (SEQ ID NO : 18) ou BRS-B D1 (SEQ ID NO : 19). La concentration de CsGi est fixée à 10 g/L et la concentration de saccharose à 10Og/L. Les quantités de DSR-M D1 et de BRS-A ou de BSR-B sont modulés de sorte que les ratio DSR-M D1 : BRS-A et DSR-M D1 : BRS-B D1 exprimé en unité d’activité enzymatique soit de de 0,1 ; de 0,25 ; de 0,5 ; de 1 ; de 2 ; de 5 ou bien de 10, en respectant une activité totale (DSR-M D1 + BRS-A ou BRS-B D1 ) de 1 U/mL.

Témoin : les réactions témoin représentent le mélange de C8G1 à une concentration de 10 g/L et de 100 g/L de saccharose sans ajout d’enzyme

5.2.2. Résultats

Les résultats de cette seconde série d’expériences sont présntés en Figure 7 et confirment la possibilité de moduler le profil d’élongation en fonction du ratio d’activité enzyme d’élongation : enzyme de branchement.

[Fig. 7] La Figure 7 montre les profils d’élongation obtenus avec l’enzyme DSR-M D1 (SEQ ID NO : 1 ) en co-catalyse avec l’enzyme de branchement BRS-A (SEQ ID NO : 18) (Figure 7A) ou avec l’enzyme de branchement BRS-B D1 (SEQ ID NO : 19) (Figure 7B). Les résultats montrent l’effet du ratio d’activité glucane-saccharase : saccharase de branchement : plus ce ratio d’activité est élevé, plus le glucoside d’alkyle accepteur est rallongé. Les résultats montrent donc que le DP moyen du polyglucoside d’alkyle obtenu est proportionnel au ratio d’activité glucane-saccharase : saccharase de branchement.

REFERENCES

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