Verfahren zur Herstellung eines Cumarin-caged Forskolinderivats, Forskolinderivat und

Verwendung des Forskolinderivats

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Cumarin-caged Forskolin- derivats, ein entsprechendes Forskolinderivat und die Verwendung des Forskolinderivats.

Stand der Technik

Forskolin ist ein Diterpen vom Labdan-Typ aus Coleus forskohlii (syn. Plectranthus bar- batus), aus der Familie der Lamiaceae.

Es ist bekannt, dass Forskolin direkt, aber unspezifisch, Adenylat-Cyclasen aktiviert. Es fuhrt darüber zu einer Erhöhung der intrazellulären cAMP -Konzentration. Über diesen Angriffs punkt können verschiedene cAMP-abhängige Signaltransduktionswege beeinflusst werden. Forskolin wird daher als Werkzeug in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt (König, Gabriele M.. Forskolin. letzte Aktualisierung: Mai 2012. In: Römpp [online]: Georg Thieme Verlag KG [Zugriff am: 17.06.2019] verfügbar unter:

https://roemp _D .thieme.de/roempp4.0/do/data/RD-06-016921.

Zu diesem Zweck werden unter anderem die sogenannten Caged- Verbindungen genutzt. Caged- Verbindungen („caged compounds“) sind chemisch modifizierte Verbindungen, die bei Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlängen eine definierte Substanz freisetzen. Ihr Hauptanwendungsgebiet ist die biochemische und zellbiologische Forschung. ¹ · ² Biologisch aktive Verbindungen werden mit einer photolabilen Schutzgruppe ("cage") ausgestattet und sind somit temporär biologisch inaktiv. Mittels einer Lichteinstrahlung wird die photolabile Schutzgruppe irreversibel abgespalten, und die zuvor inaktive Verbindung weist wieder ihre spezifische biologische Aktivität auf. Caged- Verbindungen werden dazu verwendet, Effektoren zu einer bestimmten Zeit an einem bestimmten Ort freizusetzen, wenn deren direkte Applikation schwierig oder zu langsam ist, um die gewünschte Konzentration am Wirkort direkt zu erreichen, wie z. B. im Innern einer Zelle. Die inaktive Caged- Verbindung kann sich dagegen auch durch langsame Diffusion am Ziel anreichem und bei anschließender Belichtung eine genügende Menge Effektor in kurzer Zeit freisetzen.

Durch die Verwendung von geeigneten Blitzlampen oder Lasern ist es möglich, einen biochemischen Prozess, z.B. eine enzymatisch katalysierte Reaktion oder eine Signalübertra- gung, sehr schnell zu starten (Piko- bis Millisekunden).

Um die Zeitabhängigkeit von G-Protein gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signalkaskaden zu untersuchen, im vorliegenden Fall um eine detaillierte Untersuchung eines Ade- nylylzyklase-vermittelten Signalwegs durchzufuhren, könnten Caged- Verbindungen eingesetzt werden. Cumarin ist eine etablierte Cage-Gruppe, bisher z. B. von caged mRNA und DNA. ³ G- Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie membrangebundener Rezeptoren und regulieren eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Die Aktivierung von GPCRs induziert intrazelluläre Konzentrationsänderungen von sekundären Botenstoffen, wie z. B. von zyklischem Adenosin-3‘,5‘-monophosphat (cAMP) und Calcium (Ca ²⁺ ). Diese sekundä- ren Effekte werden durch spezifische Signalkaskaden induziert. Die Aktivierung membrangebundener Adenylatzyklasen (ACs) fuhrt zur Produktion von cAMP.

Das natürlich vorkommende Diterpen Forskolin wird als direkter Stimulator der Adenylat- Cyclase experimentell in der Biochemie und Pharmakologie genutzt. ^4,5 Als Folge der Enzymaktivierung wird in der Zelle die Umwandlung von Adenosintriphosphat (ATP) zum Signal- Stoff cAMP katalysiert. Auf diese Weise greift Forskolin zentral in die Signaltransduktionswege vieler G-Protein-gekoppelter Rezeptoren ein.

Forskolin wird somit experimentell als direkter Stimulator von Adenylylzyklasen (ACs) genutzt. Wasserlösliche Forskolinderivate, wie z. B. das käufliche Colforsin (NKH 477, siehe Figur 1, Stand der Technik), ⁶ sind typischerweise an C-6 oder C-7 mit einem polaren aliphati- sehen Amin acyliert. ^7,8 Diese Derivate sind in der Regel noch selektiver für Adenylylzyklasen und weisen dabei geringere Off-Target-Aktivitäten auf. ⁹

Nachteilig gibt es jedoch keine wasserlöslichen Forskolinderivate, die lichtgesteuert freisetz- bar sind. Es gibt somit keine„inaktive“ caged- Verbindung des Forskolins, die sich durch Diffusion am Ziel anreichert und durch anschließende Photolyse gezielt direkt am Wirkort in sehr kurzer Zeit freigesetzt werden kann. Die Hauptschwierigkeit ist die Komplexität eines Syntheseweges.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zur Herstellung von„Cumarin-caged Forskolinde- rivaten“ bereitzustellen. Ferner ist es eine Aufgabe der Erfindung die entsprechenden Cuma rin-caged Forskolinderivate bereitzustellen, um damit zell- oder gewebebasierte Untersuchungen durchfuhren zu können.

Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe wird gelöst mit dem Verfahren nach Patentanspruch 1, sowie den Cumarin- caged Forskolinderivaten und dessen Verwendungen gemäß den Nebenansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentan sprüchen.

Beschreibung der Erfindung

Ein Verfahren zur Herstellung eines speziellen Cumarin-caged Forskolinderivats JCF 1 mit der Formel

ist gekennzeichnet durch die Schritte: a. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl me- thyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 mit der Formel

4 durch eine erste Carbamoylierung von 2,2,2-Trifluor-N-(2-methylamino-ethyl)-acetamid 5 und 6-Brom-7-methoxymethoxy cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat 6 (Figur 3), b. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- aminoethyl)(methyI)carbamat 3 mit der Formel

durch eine erste Entschützung von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 (Figur 4), c. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- (((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 11 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy-2,4al , 10, 10, 12a- pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2': 1 ,2]naphtho[l ,8-de] [1 ,3]dioxin-l 1 - yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 gemäß der Formel durch eine zweite Carbamoylierung von 7-Desacetylforskolin-6,7-carbonat 1,9- dimethylformamid dimethyl acetal 2 und (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen- 4-yl)methyl (2-aminoethyl)(methyl)carbamat 3 (Figur 5), d. Synthese von (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l lS,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6-(di methylamino)-

2,4al ,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3 ',2': 1 ,2]naphtho[l ,8- de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 gemäß der Formel durch eine Acetylierung von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2-(((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 1 1 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy- 2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2' : 1 ,2]naphtho[ 1 ,8- de][l,3]dioxin-l l-yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 (Figur 6), e. Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 1 Ob-dihydroxy-3 ,4a, 7, 7, 1 Oa- pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f]chromen-5-yl -acetat 9 gemäß der Formel

durch eine zweite Entschützung von (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l lS,12S,12aR)-l l-(((2-((((6- Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6-(di methylamino)- 2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2' ; l ,2]naphtho[ 1 ,8- de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 (Figur 7), f. Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-hydroxy -2- oxo-2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(niethyl)amino)ethyl)ca rbamoyl)oxy)- 10, 1 Ob- dihydroxy-3,4a,7,7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3-vinyldodecahydro- 1 H-benzo[f]chromen-5-yl acetat (JCF 1) gemäß der Formel durch eine drite Entschützung von (3R,4aR,5S,6S,6aS,I0S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 10b-dihydroxy-3 ,4a, 7, 7, 10a- pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f]chromen-5-yl acetat 9 (Figur 8).

Die übrigen Hilfsstoffe der Schrite a. bis f. können vorteilhaft denen des Ausführungsbei- spiels entsprechen.

In einer Ausgestaltung der Erfindung kann die erste Carbamoylierung gemäß Schrit a (Figur 3) mit einem polar-aprotischen Lösemitel, z.B. Dimethylformamid (DMF), N- Methylformamid (NMF), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril (ACN), Dimethylpropylenhamstoff (DMPU), Pyrinin, Aceton zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt werden.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann die erste Entschützung gemäß Schrit b. (Figur 4) mit einer mineralischen Base und einem wässrig-alkanolischen Lösemitel zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt werden.

Die zweite Carbamoylierung gemäß Schrit c. (Figur 5) kann vorteilhaft mit einem polar- aprotischen Lösemitel, z.B. Dimethylformamid (DMF), N-Methylformamid (NMF), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril (ACN), Dimethylpropylenhamstoff (DMPU), Pyrinin, Aceton und einer Hilfsbase, z.B. Diazabicycloundecen (DBU), Triethylamin (Et3N) Diisopropylethylamin (DIEA), N-Methylmorpholin (NMM), Tributyla- min und beispielsweise einem Katalysator, z.B. Py*HCl unter Ausschluss von Licht zwischen etwa 0 °C bis 10 °C durchgeführt werden.

Die Acetylierung gemäß Schritt d. (Figur 6) kann mit einem polar-aprotischen Lösemittel, z.B. Dimethylformamid (DMF), N-Methylformamid (NMF), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril (ACN), Dimethylpropylenhamstoff (DMPU), Pyrinin, Aceton und einem Acetylierungsreagenz, z.B. Acetylchlorid, Acetanhydrid, und unter Ausschluss von Licht zwischen etwa 0 °C bis 10 °C durchgeführt werden.

Die zweite Entschützung gemäß Schritt e. (Figur 7) kann mit einer organischen Säure, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und so weiter und einem beliebigen Alkanol, z. B. Methanol, Ethanol und so weiter zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt werden.

Die dritte Entschützung gemäß Schritt f. (Figur 8) kann z.B. mit einem milden Katalysator, wie z. B. NaHS0 ₄ *SiC> ₂ in einem unpolar-aprotischen Lösemittel, z.B. CH2CI2, Benzol, Ether und so weiter und zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt werden.

Erfindungsgemäß wird das Cumarin-caged Forskolinderivat

(3R,4aR,5 S,6S,6aS, 1 OS, 1 OaR, 10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 10b-dihydroxy-3 ,4a, 7, 7, 10a- pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f]chromen-5-yl acetat (JCF 1) gemäß der Formel:

beansprucht. Die nachfolgenden Zwischenprodukte werden vorteilhaft während des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmalig bereitgestellt und beansprucht und sind entsprechend in der Literatur bisher unserer Kenntnis nach noch nicht beschrieben worden:

(6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- aminoethyl)(methyl)carbamat 3 gemäß der Formel

sowie (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2- trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 gemäß der Formel

sowie (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- (((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 1 1 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy-2,4al , 10, 10,12a- pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2': 1 ,2]naphtho[ 1 ,8-de] [ 1 ,3]dioxin- 1 1- yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 gemäß der Formel

sowie außerdem (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l lS,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6-(di methylamino)- 2,4al,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyr ano[3',2': l,2]naphtho[l,8- de][l ,3]dioxin-12-yl acetat 8 gemäß der Formel

und auch (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-(methox ymethoxy)-2-oxo- 2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamo yl)oxy)-l 0,10b- dihydroxy-3,4a,7,7, 1 Oa-pentamethyl-1 -oxo-3-vinyldodecahydro- 1 H-benzo[f]chromen-5-yl acetat 9 gemäß der Formel

Allgemeine Synthesebeschreibung Caged-Forskolinderivate zur Photolyse in Zellen und Geweben mit resultierender Erhöhung der cAMP-Konzentration werden erfindungsgemäß in sechs Schritten a. bis f. synthetisiert.

Vor der Kopplung des geschützten Forskolins 2 (Figur 2 und Figur 5) mit dem Cumarin-Cage 3 bzw. dessen Analogen (siehe Figur 5) wird eine erste Carbamoylierung eines (Pseudo- )Halogensubstituierten, geschützten Cumarins durchgefuhrt (analog der Figur 3), um dort eine N-Methylalkylendiaminfunktion einzufügen. Dazu wird ein Nitrophenylcarbonat des geschützten, (Pseudo-)Halogensubstituierten 4-Hydroxymethylcumarins 6 bzw. dessen Analogen mit Trifluor-N-(2-(methylamino)alkyl)acetamid 5 bzw. dessen Analogen umgesetzt. Anschließend wird die Trifluoracetylgruppe abgespalten (erste Entschützung, analog der Figur 4). Das hierbei entstandene Amin 3 (bzw. dessen Analoge) wird im nächsten Schritt durch eine zweite Carbamoylierung an das vollständig geschützte Forskolincarbonat 2 gekoppelt (analog Figur 5). Das gekoppelte Produkt 7 (bzw. dessen Analoge) wird am Forskolin acetyliert (Ace- tylierung analog Figur 6) und in zwei weiteren Schritten vollständig zum Caged-Forskolin JCF 1 bzw. dessen Analogen entschützt (zweite und dritte Entschützung, analog Figuren 7 und 8).

Besonders vorteilhaft werden durch die genannten erfmdungsgemäßen Verfahrensschritte die erfmdungsgemäßen Cumarin-caged Forskolinderivate gemäß der allgemeinen Formel

n = 1-5; R ¹ = OH; R ² = F, CI, Br, I, CN, -N3, -OCN, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -SeCN bereitgestellt. Diese sind für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet.

Es versteht sich, dass hierfür die Edukte zur Herstellung von JCF 1 Analogen, wie beschrieben, bis auf das vollständig geschützte Forskolin 2 entsprechend angepasst werden müssen.

An Stelle des spezifischen Edukts 4 mit der Formel wird hierzu das allgemeine Edukt (Pseudo)halogen-(methoxymethoxy-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)alkyl)carbamat mit der Formel

n = 1-5; R'= OH; R ² = F, CI, Br, I, CN, -N ₃ , -OCN, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -SeCN in Schritt a. (analog Figur 3) von Anspruch 1 aus 2,2,2-Trifluor-N-(2-methylamino-alkyl)- acetamid und (Pseudohalogen)-methoxymethoxy cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat synthetisiert, um die Cumarin-caged Forskolinderivate gemäß der allgemeinen Formel bereit zu stellen.

Schritt a. von Anspruch 1 lautet dann für das allgemeine Syntheseverfahren: 2,2,2-T rifluor-N-(2-methylamino- G

alkyl)-acetamid O

(Pseudohalogen)-methoxymethoxy

cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat

(Pseudo)halogen-(methoxymethoxy-2-oxo-2H- chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2- trifluoroacetamido)alkyl)carbamate

Der weitere Syntheseweg dieser Derivate entspricht hierzu in Hinblick auf die Verfahrensparameter dem des Verfahrens zur Herstellung von JCF 1.

JCF 1 (bzw. dessen erfindungsgemäß bereit gestellte Analoge) wird nach einer Bestrahlung mit Licht in einer Photolyse zu Forskolin-(2-(methylamino)ethyl)carbamat 10 (bzw. dessen Homologe), CO2 und dem entsprechenden Methylcumarinderivat gespalten (Figur 9). Die übrigen erfindungsgemäßen Cumarin-caged Forskolinderivate werden analog zu den homologen Forskolincarbamaten, CO2 und den entsprechenden Methylcumarinderivaten gespalten.

Dies erschließt vorteilhaft eine Verwendung der erfindungsgemäßen Cumarin-caged Forskolinderivate zur Erhöhung der cAMP Konzentration in allen zell- und gewebebasierten Proben. Hierzu kann vorteilhaft das Cumarin-caged Forskolinderivat in eine Zelle eingebracht werden, und nach der Bestrahlung die Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration, die durch Bindung des biologisch aktiven Forskolincarbamat 10 an endogen in den Zellen vorhandenen, membranständigen Adenylylzyklasen erfolgt, mit einem fluoreszenzbasierten sensitiven Nachweisverfahren gemessen wird.

Ausfuhrungsbeispiel

Im Weiteren wird die Erfindung an Hand eines Syntheseweges fiir das Cumarin-caged Forskolinderivat 1 und der beigefiigten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung kommen soll.

Es zeigen:

Figur 1 : Forskolin und NKH 477 (Stand der Technik).

Figur 2: Syntheseübersicht von JCF 1 aus geschütztem Forskolin 2 und einem mit N- Methylethylendiamin funktionalisierten Cumarinderivat 3.

Figur 3: Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 (Schritt a.).

Figur 4: Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl

(2-aminoethyl)(methyl)carbamat 3 (Schritt b.).

Figur 5: Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl

(2-(((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 11 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy- 2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano [3 ',2' : 1 ,2]naphtho [ 1 ,8-de] [ 1 ,3]dioxin- 11- yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 (Schritt c.).

Figur 6: Synthese von (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l l S,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7-

(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6- (dimethylamino)-2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro- 2H,8H-pyrano[3',2': l,2]naphtho[l,8-de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 (Schritt d.).

Figur 7: Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS, 1 OS, lOaR, 1 ObS)-6-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-l 0, 1 Ob-dihydroxy- 3 ,4a, 7, 7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3 -vinyldodecahydro- 1 Fl-benzo [f] chromen-5- yl acetat 9 (Schritt e.).

Figur 8: Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7- hydroxy-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10,1 Ob-dihydroxy- 3,4a,7,7,10a-pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f ]chromen-5- yl acetat, (JCF 1) (Schritt f.).

Figur 9: Photolyse von JCF 1 Figur 10: Bestrahlung von JCF 1 und Spaltung zu Forskolincarbamat 10 Figur 11 : Relative Fluoreszenz bei Beladung mit 10 mM JCF 1; die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen.

Figur 12: Relative Fluoreszenz bei Beladung mit 30 mM JCF 1; die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen.

Figur 13: Relative Fluoreszenz bei Beladung mit 10 mM NHK 477; die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen.

Figur 14: Relative Fluoreszenz bei Beladung mit 30 mM NHK 477; die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen.

Figur 15: Relative Fluoreszenz ohne Beladung (Negativkontrolle); die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen. Figur 1 zeigt den Stand der Technik, Forskolin und NKH 477.

JCF 1 als Cumarin-caged Forskolinderivat wird in einer 6-stufigen Synthese ausgehend von geschütztem Forskolin 2 und einem mit N-Methylethylendiamin funktionalisierten Cumarinderivat 3 synthetisiert (Figur 2). Die sechs Synthesestufen (Figur 3 bis Figur 8) und die darin genannten Syntheseprodukte mit den Bezugszeichen 1, 3, 4, 7, 8, 9 sind bisher nicht literatur bekannt. Ihre Gesamtausbeute beträgt 5% bezogen auf das Carbonat 6.

Synthese

(6-Brom-7-( ^' methoxymethoxyV2-oxo-2H-chromen-4-vnmethyl methyl( ^' 2-( ^' 2.2.2- trifluoroacetamidolethvDcarbamat 4 (Figur 3).

2,2,2-Trifluor-N-(2-methylamino-ethyl)-acetamid ^{10,1 1} 5 (536 mg, 3,15 mmol) und 6-Brom-7- methoxymethoxy cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat ¹² 6 (1000 mg, 2,09 mmol) werden bei Raumtemperatur (RT) für 16h in 15 mL DMF gerührt. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird säulenchroma tographisch (Laufmittel EErnHex = 7:3) aufgereinigt.

Man erhält (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2- trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 (850 mg, 1,67 mmol, 80%) als farblose Kristalle.

MS (ESI+) m/z: [M + H] ⁺ theor. 51 1,0; exp. 510,9.

( ^' 6-Brom-7-( ^' methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- methyl (2-

aminoethviymethvBcarbamat 3 (Figur 4).

Trifluorcarbamat 4 (200 mg, 0,39 mmol) wird bei Raumtemperatur für 2 h mit 25 mL MeOH und 25 mL NaOH _aq (0,1 mol/L) im Ultraschallbad behandelt. Die Lösung wird mit HCl _aq (0,1 mol/L) neutralisiert und anschließend mit CH2CI2 extrahiert (3 x 50 mL). Die vereinigten organischen Phasen werden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CFLChMeOH = 9: 1) aufgereinigt. Man erhält (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- aminoethyl)(methyl)carbamat 3 (91 mg, 0,22 mmol, 58%) als farblose Kristalle.

MS (ESI+) m/z: [M + H] ⁺ theor. 417,0; exp. 417,0.

(6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-vnmethyl (2-

(Yttt2R.4aR.4al R.6S.1 OaS.11 S.12S.12aRV6-tdimethylaminoV 12-hvdroxy-2,4al .10.10.12a- pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahvdro-2H.8H-pyranor3 ^, .2 ^, :1.21naphthori.8-deiri .31dioxin-l l- vnoxy)carbonyl ^' )amino ^' )ethyl)(methyl ^' )carbamat 7 tFigur 51

Zu einer Lösung von 7-Desacetylforskolin-6,7-carbonat 1 ,9-dimethylformamid dimethyl acetal 2 (148 mg, 0,33 mmol) und Carbamat 3 (296 mg, 0,72 mmol) in 8 mL Pyridin wird bei 0 °C Pyridinhydrochlorid gegeben (8,4 mg, 0,073 mmol) und anschließend Diazabicycloun- decen (DBU, 1 ,386 mL, 8,9 pmol) zugetropft. Die Reaktionslösung wird 5 d bei 4 °C unter Ausschluss von Tageslicht im Kühlschrank gerührt. Es werden 50 mL CH2CI2 und 10 mL HCla _q (0,1 mol/L) zugefügt. Die organische Phase wird abgetrennt und am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CH2Ch:MeOH = 9: 1) aufgereinigt.

Man erhält (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- (((((2R,4aR,4a 1 R,6S , 1 OaS, 11 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy-2,4al ,10,10,12a- pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2': l,2]naphtho[l ,8-de][l,3]dioxin-l 1- yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 (250 mg, 0,29 mmol, 88%) als farblose Kristalle.

MS (ESI+) m/z: [M + H] ⁺ theor. 866,3; exp. 866,3. t 2R,4aR,4a 1 R.6S .1 OaS .11 S„ 12S.12aRV 1 1 -(((!-((( t6-Brom-7-( methoxymethoxy V2-oxo-2H- chromen-4-vnmethoxylcarbonvn( ^' methvBaminolethvBcarbamovBoxyV6-(dimethylaminoV

2.4al.l0.10.12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahvdro-2H.8H- pyranor3 ^l .2': 1.21naphtho[T,8- deirL31dioxin-12-yl acetat 8 /Figur 6)

Eine Lösung des Alkohols 7 (150 mg, 170 pmol) in 1,5 mL Pyridin und 1,5 mL Essigsäureanhydrid wird 2 d bei 4 °C unter Ausschluss von Tageslicht im Kühlschrank gerührt. Nach der Zugabe von 20 mL H2O wird mit CH2CI2 extrahiert (3 x 20 mL). Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und mit Na2SC>4 getrocknet. Die organische Phase wird abgetrennt und am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CH2Ck:MeOH = 9:1) aufgereinigt.

Man erhält (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l l S,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7-(methoxymethoxy)- 2-oxo-2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)c arbamoyl)oxy)-6- (dimethylamino)-2,4al ,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano[3',2': l,2]naphtho[l ,8-de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 (61 mg, 67,4 pmol, 40%) als farblosen Schaum.

MS (ESI+) m/z: [M + H] ⁺ theor. 908,3; exp. 908,3.

Eine Lösung des Acetals 8 (208 mg, 0,23 mmol) in 3,6 mL MeOH und 2,4 mL Eisessig wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. 5 mL gesättigte Na2C03-Lösung werden zugegeben und die wässrige Phase mit CH2CI2 (3 x 10 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CHCl3:EE = 1 : 1) aufgereinigt.

Man erhält (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-(methox ymethoxy)-2- oxo-2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)car bamoyl)oxy)- 10,10b- dihydroxy-3,4a,7,7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3-vinyldodecahydro- 1 H-benzo[f]chromen-5-yl acetat 9 (95 mg, 0,11 mmol, 48%) als farblose Kristalle.

MS (ESI+) m/z: [M + H] ⁺ theor. 853,3; exp. 853,2. ( ^, 3R.4aR.5S.6S.6aS.10S.10aR.10bS 6-Brom-7-hvdroxy-2-oxo-2H-chromen-4-

yl)methoxyJcarbonvB(methyOaminoJethyl)carbamoyl)oxy ^' )- 10, 10b-dihvdroxy-3.4a.7,7.10a- pentamethyl-1 -oxo-3 -vinyldodecahvdro-lH-benzorflchromen-5-yl acetat (JCF 1. Figur 81

Zu einer Lösung des MOM-ethers 9 (45 mg, 55 pmol) in 5 mL CH2CI2 wird aktiviertes, heißes NaHS04*SiC>2 ¹³ (100 mg, 0,56 mmol) gegeben. Der Katalysator wird vor der Benutzung 48 h bei 120 °C aktiviert. Die Mischung wird 16 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Das Filtrat wird mit CH2CI2 (2 x 5 mL) gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CHCl3:EE = 1 : 1) aufgereinigt.

Man erhält (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-hydroxy -2-oxo-2H- chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl) oxy)- 10,10b-dihydroxy- 3,4a,7,7,10a-pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f ]chromen-5-yl acetat (JCF 1) (29 mg, 36 pmol, 66%) als farblose Kristalle.

MS (ESI+) m/z: [M + H] ⁺ theor. 809,2; exp. 809,2.

Photolvse

JCF 1 (bzw. dessen Analoge) lässt sich unter Bestrahlung mit Licht zum gewünschten Forsko- lincarbamat 10 spalten (Figur 9 und Figur 10) und qualifiziert sich somit für die unter die oben genannte biologische Anwendung.

Die Photolyse von JCF 1 wird unter kontrollierten Bedingungen durchgef hrt, um die Freiset zung von Forskolincarbamat 10 als Funktion der absorbierten Lichtmenge quantitativ nachzuweisen: 0,16 ml einer 100 mM Lösung von JCF 1 in MeOH werden in eine Quartzglas- küvette (Breite: 4 mm; Tiefe (optischer Weg): 10 mm -> Füllhöhe 4 mm) gegeben. Als Anregungsquelle wird die "Intensilight"-Lichtquelle (Anregungslampe eines Nikon TI Eclipse Fluoreszenzmikroskops) genutzt, deren Licht durch einen Gellichtleiter (aktiver Durchmesser: 4 mm) und einen schmalbandigen Bandpassfilter (368,8 nm ± 5 nm) auf die Flüssigkeitssäule in der Küvette geleitet wird. Als Anregungsleistung wurde 1,58 mW gewählt (Stellung 32 (32-fache Abschwächung)) am Steuergerät der Anregungslampe). Damit ergibt sich eine Bestrahlungsstärke von ca. 12,5 mW/cm ² . Die Bestrahlung erfolgte in Zeitintervallen von 1 bis 500 Sekunden durch manuelles Öffnen und Schließen des Verschlusses.

Die bestrahlten Proben werden anschließend massenspektrometrisch (Massenspektrometer: MSQ Plus von ThermoScientific; Ionisation: ESI-Interface mit einer Cone-Spannung von 50 V, Eluent: Methanol, Wasser, Eisessig, / 50, 50, 0,02 / vol, vol, vol; Fließgeschwindigkeit 0,2 ml / min; Direktinjektionen von 20 mΐ der jeweiligen bestrahlten Proben über ein Rheodyne- Injektionsventil (7725i)) untersucht. Es werden die Massenspur m/z 51 1 und der Massenbereich m/z 807-811 aufgezeichnet. Ausgewertet werden die Integrale der Peaks des Chromato gramms der Massenspur m/z 51 1 (siehe Figur 10). Bei einer Belichtungszeit von 320 Sekunden sind im Massenbereich m/z 807-811 (Ausgangsverbindung) keine Signale mehr detek- tierbar, so dass unter den oben beschriebenen Bedingungen nach dieser Zeit von einer vollständigen Umsetzung auszugehen ist.

Es versteht sich, dass die Reaktion in analoger Weise auch mit den erfindungsgemäß bereit gestellten Analogen des JCF-1 durchgeführt werden kann.

Validierung

Wir haben die erfindungsgemäß beschriebene Substanz JCF 1 an eukaryotischen Zellkulturen validiert, in denen die Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration, die durch Bindung des biologisch aktiven Forskolincarbamats 10 (Figur 9) an endogen in den Zellen vorhandenen, membranständigen Adenylylzyklasen erfolgt, mit einem fluoreszenzbasierten sensitiven Nach weis verfahren gemessen. ¹⁴ Hierzu haben wir eine Zelllinie verwendet, in der ein zyklisch Nukleotid-gesteuerter (CNG) Ionenkanal konstitutiv exprimiert wird. Diese Kanäle sind typischerweise in olfaktorisch sensorischen Neuronen des Riechepithels exprimiert und öffnen, wenn die intrazelluläre cAMP Konzentration steigt. Durch den Kanal fließen Kationen, u.a. Ca ²⁺ -Ionen in die Zelle. Der Einstrom von Ca ²⁺ kann mit Ca ²⁺ -sensitiven Farbstoffen oder genetisch-kodierten Ca ²⁺ Indikatoren, wie z.B. GCaMP-Sensoren, in einem Fluoreszenzlese gerät oder mit einem Fluoreszenzmikroskop erfasst werden. Zur Detektion der Ca ²⁺ Signale haben wir eine Zelllinie hergestellt, die neben dem o.g. CNG-Kanal zusätzlich den genetisch kodierten Ca ²⁺ Indikator GCaMP3.0 (Tian et al., 2009) konstitutiv exprimiert. ¹⁵ Das GCaMP3.0 Protein besteht aus einem zirkulär permutierten EGFP (Enhanced Green Flu- orescent Protein), an das N-terminal ein Bindepeptid für Calmodulin aus der Myosin Leichte Ketten Kinase (Ml 3 -Peptid) und C-terminal ein Calmodulin fusioniert sind. Bei niedrigen intrazellulären Ca ²⁺ Konzentrationen emittiert GCaMP3.0 keine Fluoreszenz. Wenn die intrazelluläre Ca ²⁺ Konzentration steigt, binden Ca ²⁺ -Ionen an das Calmodulin. Dieses interagiert dann mit dem M13-Peptid und es resultiert eine Konformationsänderung des Gesamtproteins. In dieser Form fluoresziert GCaMP3.0 nach Belichtung mit einer Wellenlänge von 480 nm bei 510 nm. Die Ca ²⁺ -abhängige Änderung der Fluoreszenzänderung kann mit den oben genannten Verfahren erfasst und quantifiziert werden.

Zellen der beschriebenen Zelllinie wurden in 96er Multiwellplatten (MWP) ausgesät und bis zu einer Dichte von ca. 25.000 vermehrt. Das Medium wurde abgenommen und gegen Extrazellulärlösung, die 100 mM IBMX (Isobutylmethylxanthin) zur Inhibierung zelleigener Phos- phodiesterasen enthielt, ausgetauscht. Anschließend wurde die Basalfluoreszenz in den Vertiefungen der 96er MWP mit einem Fluoreszenzlesegerät gemessen. Zellen in je vier Vertiefungen wurden mit JCF 1 (10 mM und 30 mM) für 30 Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln beladen. Anschließend wurde nochmals die Basalfluoreszenz in den Vertiefungen gemessen, bevor mit einer UV-Lampeneinrichtung die 96er MWP Schale insgesamt belichtet wurde (Figur 11, Figur 12). Nach der Belichtung wurden 10 mM und 30 mM NKH 477 in je vier unabhängige Vertiefungen pipettiert und die Fluoreszenzänderungen im Fluoreszenzlesegerät gemessen (Figur 13, Figur 14). Als Negativkontrolle dienten Zellen, die nur mit der Extrazellulärlösung (mit IBMX) inkubiert worden waren (Figur 15). Es zeigte sich, dass die Freisetzung von Forskolincarbamat 10 aus der Cage- Verbindung JCF-1 durch UV-Belichtung zu einer deutlichen Erhöhung der Ca ²⁺ -abhängigen Fluoreszenzemission fuhrt. Die Fluoreszenzänderung erreichte unter diesen Bedingungen ca. 50% der Werte, die durch Zugabe des nicht-gecagten NKH 477 erreicht wurden. In Zellen, die weder mit JCF-1 noch mit NKH 477 (ohne Cage-Gruppe) inkubiert worden waren, wurde keine Änderung der Ca ²⁺ -abhängigen Fluoreszenzemission gemessen.

Die Verwendung des JCF 1 ist universell für alle zell- sowie gewebebasierten Proben geeignet, bei denen die intrazelluläre cAMP Konzentration erhöht werden soll. Die Möglichkeit, die biologisch aktive Verbindung zu definierten Zeitpunkten und innerhalb der Zelle durch z.B. lokale Freisetzung mittels punktförmiger Belichtung zu aktivieren, hat große Vorteile gegenüber konventionellen Strategien, bei denen eine Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration z.B. über GPCR Signalwege, über die Stimulierung der Adenylylzyklasen mit z.B. NKH 477, oder die Inhibition zelleigener Phosphodiesterasen, die das cAMP zu AMP hydrolysieren, z.B. durch IBMX erfolgt. Bei den letztgenannten Verfahren kommt es immer zu Änderungen der cAMP Konzentration in der gesamten Zelle bzw. innerhalb des Zell- oder Gewebeverbandes. Der Einsatz der biologisch inaktiven Verbindung 1 ermöglicht darüber- hinaus die Kinetik zellulärer Prozesse, die durch die Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration gesteuert werden, mit hoher Zeitauflösung im Sub-Sekundenbereich zu erfas sen.

Literatur

¹ Ellis-Davies GCR.; Not. Methods 2007, 4, 619-628.

² Adams SR., Tsien RY.; Annu. Rev. Physiol. 1993, 55, 755-784.

³ Chaulk SG., MacMillan AM.; Nucleic Acids Res. 1998, 26, 3173-3178.

⁴ Takeuchi K„ Takehara K„ Kato S„ Yagi K.; Am. J Physiol. 1997, 272, 646-653.

⁵ Kamenetsky M., Middelhaufe S., Bank EM., Levin LR., Buck J., Steegborn C.; J. Mol. Biol. 2006, 362, 623-639.

⁶ Mori M., Takeuchi M., Takaoka H., Hata K., Hayashi Y., Yokoyama M.; J. Cardiovasc. Pharmacol. 1994, 24, 310-316.

⁷ Laurenza A., Khandelwal Y., De Souza NJ., Rupp RH., Metzger H., Sea on KB.; Mol. Pharmacol. 1987, 32, 133-139.

⁸ Lai B., Gangopadhyay AK., Gidwani RM., Rajagopalan R., Ghate AV.; Indian J. Chem. 2006, 45B , 232-246.

⁹ Hartzell HC., Budnitz D., Mol. Pharmacol. 1992, 41, 880-888.

¹⁰ PHARMACOFORE, INC; Jenkins TE„ Seroogy JD., Wray JW.; Tong CC.; WO

2011/133178.

^{1 1} Shawe TT., Hepler LP., Chong AM., Fulmer JN., Hansen DB., Watkims JL; Synth. Com- mun. 1996, 26, 3633-3636.

¹² Fomina N., McFearin CL., Sermsakdi M., Morachis JM., Almutairi A.; Macromolecules 2011, 44, 8590-8597.

¹³ Ramesh C., Ravindranath N., Das B.; J. Org. Chem. 2003, 68, 7101-7103. ¹⁴ Balfanz S., Ehling P., Wachten S., Jordan N., Erber J., Mujagic S. and Baumann, A.; Insect Biochem. Mol. Biol. 2012, 42, 435-445.

¹⁵ Tian L., Hires S. A., Mao T., Huber D., Chiappe M. E., Chalasani S. H., Petreanu L., Aker- boom J., McKinney S. A., Schreiter E. R., Bargmann C. I., Jayaraman V., Svoboda K., and Looger L. L.; Nat. Meth. 2009, 6, 875-881.