AINSI OBTENUES

La présente invention est relative à un procé- dé de préparation d' émoprotéines et de protéines à partir d'une levure ; elle concerne également les hémo-r protéines et notamment le cytochrome C et les protéines obtenus à l'aide de ce procédé,et leur application dans le domaine de la nutrition et de la pharmacie. Selon l'invention, on se propose, par un même et seul procédé, de préparer à partir d'une levure, une substance proteinigue d'une part, et le cytochrome C d'autre part.

On sait que pour pallier la pénurie de viande, notamment dans les pays en voie de développement, on a envisagé de faire appel à des sources de protéines dif¬ férentes des sources animales. On a ainsi préconisé d'utiliser des sources végétales (comme le soja et la luzerne, par exemple) , et des sources biologiques comme l'extraction à partir de levure (cf., par exemple, le

Brevet français N°2 113 190 de HITACHI LTD.), ou à par¬ tir de champignons ou par culture de certaines souches microbiennes sur des hydrocarbures. On a également préco¬ nisé de nombreux procédés pour isoler le cytochrome C (hémoprotéine qui est directement liée aux réactions d'oxydo-réduction et qui est un élément essentiel dans la chaîne des transporteurs d'électrons), notamment à partir de la levure de boulangerie cf. KEILIN, Proc.Roy.

Soc. (Londres) Ser . B 106 , 418 ( 1930 ) et HAGIKARA et Co Nature 178, 629 ( 195 du coeur de boeuf cf . KIRBY et Coll . , Acta Che . Scand. , 10 , 148 ( 1956J_7 et du coeu de cheval /cf . NOZAKI et Coll . , J . Biochem. (Tokyo) j 4_,

La présente invention s'est proposé comme but de pourvoir à un procédé qui aboutit à la préparation la fois de protéines et de cytochrome C d'excellente qualité et ceci avec des rendements pratiquement doubl des meilleurs rendements obtenus jusqu'à maintenant. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'hémoprotéines, et notamment de cyto¬ chrome C,et de protéines à partir de levure, caractéris en ce que, successivement : a) on soumet la levure à une lyse cellulaire en milieu liquide, sous pression, b) on purifie le milieu liquide résultant par traiteme par un agent précipitant les acides nucléiques, tel le chlorure de manganèse et par un agent de relargag des débris de cellules bactériennes, tel que le sulf d'ammonium, c) on ajuste la phase liquide purifiée à un pH compris entre 8 et 8,5, puis on passe sur résines échangeuses d'ions qui fixent le cytochrome tandis que l'effluen est ajusté à un pH compris entre 3,3 et 4 (pH proche du point isoêlectrique) et les protéines précipitées au moyen de sulfate d'ammonium, d) on lave la résine sur laquelle le cytochrome a été fixé, à l'aide d'une solution aqueuse alcaline à pH 8-8,25, puis on élue le cytochrome au moyen d'une sol tion aqueuse de sulfate d'ammonium.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'o jet de l'invention, on procède au dessalage de la solu¬ tion contenant le cytochrome, lequel est ensuite isolé par les techniques usuelles, comme l'évaporation à sec, 1' atomisation ou la lyophilisation.

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Si on le désire, le cytochrome peut être obtenu sous une forme particulièrement pure en complétant le procédé par les étapes suivantes : e) on précipite le cytochrome contenu dans l'éluat des résines échangeuses d'ions au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de 4,5 M à 6 M ; on lais¬ se décanter 12 heures environ à une température infé¬ rieure à 10°C, puis on filtre, f) on redissout le cytochrome ainsi précipité, dans l'eau puis on le précipite à l'aide d'acide trichloracétique, g) on redissout le précipité de cytochrome dans l'eau et on reprécipite au moyen d'un alcool, tel que l'alcool éthylique, de préférence.

La succession d'opérations qui vient d'être dé- crite permet l'obtention de produits de qualité excellen¬ te avec un rendement qui dépasse 250 g de cytochrome C ëlectrophorètiquement pur et 340 kg de protéines pures par tonne de levure.

Ainsi, c'est gr ce à la lyse cellulaire par voie mécanique sous pression, à l'exclusion des procédés classiques utilisant les acides, les sels ou les solvants (comme, par exemple, l'acétate d'ëthyle) que l'on peut ob¬ tenir une lyse très poussée des cellules : on a pu dénom¬ brer (par la néphélométrie par exemple) au moins 80 % de cellules lysées par le processus préconisé conformément à la présente invention. Le pourcentage des cellules lysées ne dépasse guère 45 % par les voies classiques et, de plus, en prolongeant le traitement acide par exemple, on risque de dénaturer les protéines et d'altérer ainsi la qualité des produits obtenus. C'est grâce également aux différentes étapes de purification préconisées conformément à l'invention (traitement au MnCl ₂ pour éliminer les acides nucléiques, traitement au sulfate d'ammonium pour éliminer les débris cellulaires dans l'étape b) , double précipita - tion du cytochrome aux stades f) et g)) que l'on a pu

non seulement obtenir les produits recherchés avec un excellent rendement et une excellente qualité, mais que l'on a également rendu ce procédé praticable à l'échell industrielle sur de grandes quantités de matière premiè Parmi les levures qui conviennent selon l'inve tion, on peut notamment citer les souches de Saccharo- yces et de Torula, en particulier, le Saccharomyces cerivisiae, le Kluyveromyces fragilis, le Saccharomyces carlsbergensis et le Saccharomyces uvarum. La levure pr férée du point de vue du rendement est le Kluyveromyces fragilis qui offre la particularité de présenter une re piration cellulaire très importante et, par suite, une croissance rapide (en particulier, sa respiration cellu laire est 5 fois plus importante que celle du Saccharo- myces cerevisiae) . Convient notamment la souche N°CBS-

397 du catalogue de la collection du Centraal Bureau vo Schimmelculture de Baarn.

Le stade a) est avantageusement mis en oeuvre dans le milieu de culture de la levure. En pratique, le stade a) débute sur des jus de culture renfermant de 10 à 400 g de levure exprimés en matière sèche pour 1 litr de jus. Si on veut standardiser, on effectuera la lyse cellulaire par voie mécanique sur un jus de culture ren fermant 10 et de préférence 10 germes/cm , de l'eau des éléments nutritifs (une source de carbone, une sour ce d'azote et, le cas échéant, des oligoéléments) .

La lyse cellulaire est réalisée par voie mécani que sous une pression comprise entre 300 et 760 bars et de préférence, entre 300 et 500 bars, et est poursuivie jusqu'à ce qu * au moins 80 % des cellules aient leur membrane rompue. La lyse cellulaire est effectuée en milieu légèrement acide ou neutre à un pH compris avan¬ tageusement entre 6,5 et 7.

Pour la purification pratiquée au stade b) , le chlorure de manganèse et le sulfate d'ammonium peuvent

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être utilisés en même temps ou l'un après l'autre, par exemple MnCl ₂ avant (NH ₄ ) ₂ SO.. De façon avantageuse, la précipitation du stade b) est mise en oeuvre avec 0,1 volume d'une solution aqueuse de MnCl^ 1 M pour 1 vo- lu e de milieu liquide résultant du stade a) , puis une solution aqueuse dé sulfate d'ammonium à 100-250 g/ litre.

Le milieu liquide purifié obtenu au stade b) renferme le cytochrome C et d'autres protéines. Ces dernières seront séparées au stade c) , car elles ne se fixent pas sur les résines échangeuses d'ions.

La résine échangeuse d'ions du stade c) est une résine anionique, de préférence une résine du type polystyrène réticulé présentant des groupes acides CO_H, par exemple une résine Amberlite IRC 50. On uti¬ lisera un volume de 10 à 15 litres de résine pour fixer 250 g de cytochrome C. Avant usage, la résine sera mise sous forme Na .

L'effluent liquide recueilli après passage sur résines, lequel contient les protéines, est ajusté à un" pH compris entre 3,3 et 4, puis les protéines sont pré¬ cipitées au moyen de (NH.) _ SO. : 4,5 à 6 M.

Suivant un mode de réalisation avantageux de l'objet de la présente invention, les protéines préci- pitëes sont redissoutes dans l'eau et l'on procède à un dessalage, notamment au moyen d'une résine constituée par un gel de dextrane polymérisé (par exemple la rési¬ ne Séphadex G 25). Lors de ce traitement, les protéines ne se fixent pas sur la résine mais restent en solution dans l'eau. Les protéines ainsi obtenues ont une pureté de l'ordre de 95 à 100 %.

Les protéines obtenues conformément au procédé sont utiles dans le domaine de la nutrition tant humaine qu'animale. Elles sont électrophorètiquement pures : l'électrophorèse ne montre que 5 bandes, correspondant à

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5 protéines.

Le lavage des résines du stade d) est réalisé de façon avantageuse avec une solution aqueuse a moniaquée (un volume de NH.OH pour un volume de phase liquide du stade b) ; l'élution est mise en oeuvre avec une solutio aqueuse renfermant (NH,) ₂ SO à environ 150 g/litre et à un pH compris entre 8 et 8,50 (le pH étant ajusté au moyen de H ₃ ) .

L'invention sera mieux comprise à l'aide du com- plément de description qui va suivre, qui se rapporte à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention.

Il doit δtre bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'obje de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLES EXEMPLE_1 - Obtention_du_cγtochrome_C_à_partir_de

Un jus de culture de Kluyveromyces fragilis ren- fermant 10 12 germes/cm3 (soit environ 120 g de levure en poids sec par litre de jus' de culture) est soumis à une lyse cellulaire au moyen d'un homogèneisateur (de type MANTON-GAULIN ; cet appareil commercialisé par la

Société britannique APV opère e tant que presse en lami nant les cellules en milieu aqueux en soumettant ces cel lules à un choc de 450 à 500 bars) . Après deux passages dans cet appareil à 450-500 bars, la lyse cellulaire est de 90 I.

On obtient un liquide visqueux qui est alors sou mis à une précipitation au moyen de deux agents utilisés en même temps : MnCl ₂ 1M et (NH,) ₂ S0, en solution aqueu se à 100 g/litre. Après une durée de contact de 30 minu- tes à 1 heure à 4-10°C, on procède à une centrifugation.

Le précipité, qui contient des débris cellulaires, des acides nucléiques et des polysaccharides est éliminé. Le surnageant que l'on recueille est amené à pH 8,25 au moyen d'une solution aqueuse de NH OH à 10P g/litre. On fixe le surnageant qui contient le cytochrome

C à extraire, sur une résine êchangeuse de cations Amber- lite IRC 50 sous forme Na ⁺ , la fixation s'effectuant jusqu'à saturation des deux tiers de la capacité de la résine. (L'extraction des protéines à partir de l'ef- fluent sera décrite dans l'Exemple 2).

On lave avec 0,1 volume de NH.OH (à pH 8,25) pour 1 volume de surnageant initial, puis on élue avec une solution aqueuse de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ diluée (150 g/litre, pH réglé à 8,5 au moyen de NH. . Si l'on désire pousser la purification à fond, on précipite l'éluat pbtenu avec une solution aqueuse de (NH.) ₂ S0 ₄ 4,5 M. On laisse une nuit à une température comprise entre 0 et 10°C (de préférence à 4°C), on filtre pour récupérer le cytochrome précipité et on le redissout dans l'eau.

La solution aqueuse ainsi obtenue est précipitée au moyen d'acide trichloracétique jusqu'à pH 3. Après centrifugation, le culot de centrifugation est repris à l'eau puis à nouveau précipité au moyen de C ₂ H,-OH. On centrifuge à nouveau, on reprend le précipité avec de l'eau à pH faiblement alcalin (pH 7,5 environ), puis on lyophilise.

Le cytochrome C ainsi obtenu présente des pics d'absorption en milieu oxydé à 420, 520 et 550 n , et en milieu réduit à 360, 410 et 530 nm. Son activité biolo¬ gique est vérifiée sur la cytochrome C oxydase d'une part, et sur un tissu cellulaire en état d'hypoxie selon les techniques usuelles. Le rendement en cytochrome C est de 250 g de produit électrophorètiquement pur pour une tonne (en poids sec) de levure.

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EXEMPLE_2 - Obtention_de_p_rotéines_à_gartir_de

5iïï ë£2îB E§S_f-£ 2i-Li La solution purifiée renfermant les protéines la sortie des colonnes d'Amberlite IRC 50 (obtenue co me décrit dans l'Exemple 1) est ajustée à l'aide d'aci chlorhydrique 5N à un pH voisin de celui du point iso¬ électrique, c'est-à-dire,dans le cas présent, 3,5 à 4. On procède ensuite à une précipitation au moyen d'une lution aqueuse de sulfate d'ammonium 4,5 M - 6 M. Le précipité est recueilli puis repris par de l'eau et soumis à une opération de dessalage sur un gel de dext ne réticulé (Sephadex G 25), avec un volume de gel de dextrane pour 0,3 volume de protéines. On obtient 40 m d'une solution contenant 1 g de protéinespar ml,soit u rendement de 66 % par rapport à la quantité de protéin présente dans la levure de départ. La substance protéi nique obtenue, electrophoretiquement pure, est constit principalement de cinq protéines différentes dont les poids moléculaires vont de 50 000 (pour la première) à 120 000 (pour la cinquième) .

Ce mélange de protéines qui est obtenu en mili aqueux, peut être : i) soumis à une cuisson-extrusion selon une techniqu connue en soi pour des protéines à structure linéaire et sous forme expansée ; et si nécessaire,par broyage, on obtient une farine de protéines directement assimi¬ lable par l'homme et l'animal : ii) séché par nébulisation (séchage par projection) afin d'obtenir un mélange de protéines sous forme pul- vérulente.

EXEMPLE_3 - Obtention du_c tochrome Ç_et_des_p_rotéines à_partir_de_Saccharom çes_cerevisiae. On procède comme indiqué aux Exemples 1 et 2, remplaçant le Kluyveromyces fragilis par le Saccharomy cerevisiae. On obtient des produits finaux ayant les

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9 mêmes caractéristiques que ceux des Exemples 1 et 2.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'in¬ vention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peu¬ vent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente in¬ vention.

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