Verfahren zur Herstellung von Isoursodesoxycholsäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Isoursodesoxycholsäure. Isoursodesoxycholsäure ist ein Hauptstoffwechselprodukt/Metabolit der Ursodesoxycholsäure, das in der humanen Leber entsteht [Beuerε, Ul., et al. "Formation of iso-ursodeoxycholic acid during administration of ursodeoxycholic acid in man", Hepatol. 13, 91 bis 103 (1994); Marschall, H.-U., et al.: "Isoursodeoxycholsäure-N- Acetylglucosamid: Ein Hauptmetabolit oral verabreichter Ursodeoxycholsäure", Ztsch. Gastroenterologie 30, 656 (1992); Marschall, H.-U., et al. "N-Acetylglucosaminides are major urinary metabolites of orally given ursodeoxycholic acid in healthy humans", Hepatology 16, Nr. 4, Teil 2, S. 257 A, Abstr. Nr. 850 (1992); Marschall, H.-U., et al. "The major metabolites of ursodeoxycholic acid in human urine are conjugated ith N-acetylglucosamine", Hepatology 20, 845 bis 853 (1994)]. Inwieweit dieser Metabolit zur therapeutischen Wirkung der Ursodesoxycholsäure in der Leber selbst zur Behandlung von (cholestatischen) Lebererkrankungen beiträgt, ist derzeit unbekannt [Marschall, H.-U., et al. "Isourso- deoxycholsäure-N-Acetylglucosamid: Ein Hauptmetabolit oral verabreichter Ursodeoxycholsäure", Ztsch. Gastroenterologie 30, 656 (1992); Marschall, H.-U., et al. "N-Acetylglu¬ cosaminides are major urinary metabolites of orally given ursodeoxycholic acid in healthy humans", Hepatology 16, Nr. 4, Teil 2, S. 257 A, Abstr. Nr. 850 (1992)].

Die im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung der isoursodesoxycholsäure sind nur sehr schlecht realisier¬ bar und liefern das gewünschte Produkt allenfalls in gerin¬ gen Ausbeuten und Mengen.

So beschreiben T. Iida, F.C. Chang in J. Org. Chem. 1982, 47, 1966-72, die Herstellung von Isoursodesoxycholsäure auf einem Weg, der ein in 3- und 7-Stellung unterschiedlich aktiviertes Derivat der Isochenodesoxycholsäure (3ß, 7α) durch K0 ₂ -Kronenether-Invertierung der OH-Gruppe in 7-Stel- lung in die gewünschte Säure überführt.

Auch mit Chenodesoxycholsäure wird ein Edukt gewählt, das mit K0 ₂ -Kronenether-Invertierung nur nach ausgeklügelter Schutzgruppentechnik in Isoursodesoxycholsäure umzuwandeln ist. Die Mengen, die jeweils erhalten werden, werden nach mg berechnet.

A.K. Batta, S.K. Aggar, G.Sälen., S.Shefer beschreiben in Journal of Lipid Research 32./ ⁹⁷⁷ (1991) ein Herstellungs¬ verfahren für Isoursodesoxycholsäure, bei dem Chenodesoxy¬ cholsäure (I) als Ausgangsmaterial eingesetzt wird. Dieses wird zunächst mit Bernsteinsäureanhydrid zum Hemisuccinat (II) umgesetzt, mit Jones-Reagens oxidiert und anschließend verseift, wodurch die Schutzgruppe abgespalten und die 7- Oxolithocholsäure (III) erhalten wird. In einer weiteren Stufe wird die 3α-0H-Gruppe der 7-0xolithocholsäure (III) zur 3ß-0H-Gruppe der 7-Oxoisolithocholsäure (IV) durch Mitsunobu-Reaktion invertiert. In der letzten Stufe soll sich dann gemäß dieser Literaturstelle die 7—Oxoisolitho- cholsäure (IV) mit Kalium-tert.-amylalkohol zur Isourso¬ desoxycholsäure (V) reduzieren lassen, wobei eine Neben¬ produktbildung von lediglich 6 % erwähnt wird.

(«V) (v)

Die Nacharbeitung des von A.K. Batta et al. beschriebenen Verfahrens zeigte jedoch, daß dieses Verfahren mit den folgenden Nachteilen behaftet ist:

(a) Bei der Bildung des Hemisuccinats II geht bei größeren Ansätzen (d.h. bei Ansätzen, in denen mehr als 50 g Ausgangsmaterial eingesetzt werden) die Hälfte des Aus¬ gangsmaterials als nicht mehr verwertbares Nebenprodukt verloren.

(b) Damit die Jones-Oxidation und die Abspaltung der Schutzgruppe unter Bildung der 7-Oxolithocholsäure (III) durchführbar ist, muß das Hemisuccinat (II) eine sehr hohe Reinheit aufweisen. Dazu sind aufwendige Reinigungsverfahren erforderlich.

c) Unterwirft man die 7-Oxolithocholsäure (III) nach den Angaben von A.K.Batta der Mitsunobu-Reaktion, erhält man die Oxoisolithocholsäure (IV) in mit Triphenylphosphinoxid verunreinigter Form. Diese Form besitzt einen Schmelzpunkt von 174°C, der erheblich von dem von A.K. Batta berichteten (> 240°C) abweicht.

d) Die Reduktion der Oxoisolithocholsäure (IV) mit Kalium-tert.-amylalkohol bewirkt eine Umwandlung der Oxo- gruppe in 7-Position der 7-Oxoisolithocholsäure (IV) in eine α-ständige Hydroxygruppe und nicht - wie angegeben - in eine ß-ständige Hydroxygruppe. Die Reduktion der 7-Oxoisolitho- cholsäure mit NaBH. _» oder LiAlH. _* führt ebenfalls nur zum 7α- Alkohol.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfah¬ ren zur Herstellung von Isoursodesoxycholsäure bereitzustel¬ len, das in wenigen Stufen einfach durchgeführt werden kann

und die Isoursodesoxycholsäure in guten Ausbeuten und Mengen und mit hoher Reinheit liefert.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Isoursodesoxycholsäure gelöst, das ge¬ kennzeichnet ist durch die Stufen:

(i) Veresterung von Ursodesoxycholsäure zum Ursodesoxycholsäureester der folgenden Formel (VII):

worin R für C _x -C_,-Alkyl steht,

(ii) Umsetzung des Ursodesoxycholsäureesters (VII) zum Isoursodesoxycholsäureester der folgenden Formel (VIII):

worin R wie oben definiert ist, durch Mitsunobu-Reaktion und

(iii) Verseifen des Isoursodesoxycholsäureesters (VIII) zur Isoursodesoxycholsäure (V).

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren den Vorteil, daß es lediglich drei Stufen aufweist, nämlich eine Veresterung, eine Invertierung und eine Verseifung, wie es in dem For¬ melschema nachstehend gezeigt ist:

Aufgrund der geringen Anzahl seiner Stufen liefert das er¬ findungsgemäße Verfahren die Isoursodesoxycholsäure in we¬ sentlich besseren Ausbeuten (_> 50 %) und mit höherer Rein¬ heit als die im Stand der Technik bekannten Verfahren.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterial eingesetzte Ursodesoxycholsäure (VI) ist eine handelsübliche Chemikalie und kann zum Beispiel von den Firmen Aldrich, Steinheim, sowie den Herstellerfirmen von Ursodesoxychol¬ säure PCA-Prodotti Chimici Alimentari S.P.A., Basaluzzo/ Italien und Tokyo Tanabe Co., Ltd., Tokyo/Japan, bezogen werden. Die Herstellung der Ursodesoxycholsäure ist auch in der japanischen Patentanmeldung JP-A-92/165867 beschrieben.

Die Stufe (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens, d.h. die Veresterung von Ursodesoxycholsäure zum Ursodesoxycholsäure- ester (VII), wird nach dem Fachmann geläufigen Methoden durchgeführt. Als Alkohole, die bei der Veresterung der Ur¬ sodesoxycholsäure eingesetzt werden können, sind beispiels¬ weise niederaliphatische Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol oder Butanol, geeignet. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Stufe (i) in methanolischer HC1 durchgeführt.

Gemäß Stufe (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Urso- desoxycholsäureester (VII) zum Isoursodesoxycholsäureester (VIII) umgesetzt. Diese Umsetzung ist in der Literatur als "Mitsunobu-Reaktion" bekannt und bewirkt, daß die Hydroxy¬ gruppe in 3-Position des Ursodesoxycholsäureesters (VII) invertiert wird, wodurch der Isoursodeoxycholsäureester (VIII) erhalten wird.

Die Mitsunobu-Reaktion ist seit mehr als 10 Jahren litera¬ turbekannt (vgl. Mitsunobu, O., Synthesis, 1981, 1). Bei der klassischen Mitsunobu-Reaktion wird eine Kombination von Triphenylphosphin und Azodicarbonsäuredialkylester einge¬ setzt, um Alkohole für nukleophile Substitutionsreaktionen zu aktivieren. Neuere Untersuchungen von D. Camp und I.D. Jenkins (vgl. "The Mechanism of the Mitsunobu Reaction. The Use of Tributylphosphine", Aust. J. Chem. , 1992, 45_,

47-55) zeigen jedoch, daß auch andere Phosphine, wie Tri- butylphosphin, mit Erfolg in der Mitsunobu-Reaktion einge¬ setzt werden können.

Genäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens wird der Ursodesoxycholsäureester (VII) mit Triphenylphosphin und Azodicarbonsäurediethylester-Lösung in Gegenwart einer organischen Carbonsäure, wie Ameisensäure oder Benzoesäure, zur Reaktion gebracht.

Diese Invertierungsreaktion wird vorzugsweise in Toluol durchgeführt, jedoch sind auch andere Lösungsmittel, wie Benzol, als Medium zur Durchführung der Mitsunobu-Reaktion geeignet. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen 70 bis 110°C, vorzugsweise 80 bis 90°C und am meisten bevorzugt 80°C. Die Reaktionsdauer ist nicht kritisch und beträgt im allgemeinen 20 Stunden bis 60 Stunden, vorzugsweise 30 Stun¬ den bis 55 Stunden und am meisten bevorzugt 48 Stunden.

Die Molverhältnisse sind bei der Mitsunobu-Reaktion nicht kritisch und betragen im allgemeinen 1:2:2:2 bis 1:4:4:4,5 in Bezug auf das Verhältnis von eingesetztem Alkohol/Phos- phin/Azodicarbonsäuredialkylester/organischer Carbonsäure.

Nach Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, worauf das bei der Reaktion ge¬ bildete Phosphinoxid ausfällt, das anschließend abfiltriert wird. Eine weitere Reinigung des erhaltenen Isoursodesoxy- cholsäureesters (VII) ist nicht erforderlich.

Die Stufe der Verseifung [Stufe (iii)] des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach dem Fachmann geläufigen Methoden durch¬ geführt werden. Entsprechende Verseifungsverfahren sind in jedem Praktikumsbuch der organisch-chemischen Labortechnik, zum Beispiel in Hünig, Märkl, Sauer, Integriertes Organi¬ sches Praktikum, Verlag Chemie Weinheim, beschrieben. Gemäß

einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens wird der Isoursodesoxycholsäureester (VIII) zunächst mit methanolischer KOH umgesetzt und anschließend die Iso¬ ursodesoxycholsäure (V) aus ihrem Kaliumsalz durch Ansäuern mit verdünnter HC1 freigesetzt.

Vorzugsweise wird die Isoursodesoxycholsäure (V) durch Um- kristallisation oder chromatographisch gereinigt. Hierzu wird die Isoursodesoxycholsäure in einem inerten, wenig po¬ laren Lösungsmittel, wie Chloroform, aufgeschlämmt und auf eine Chromatographiesäule aufgetragen. Anschließend eluiert man die Säule mit dem gleichen Lösungsmittel, wodurch die noch in der Isoursodesoxycholsäure enthaltenen Verunreini¬ gungen entfernt werden. Sobald keine Verunreinigungen mehr eluiert werden können, was daran erkennbar ist, daß in einem letzten Eluat beim Abdestiliieren des Chloroforms kein Rück¬ stand mehr bleibt, eluiert man anschließend mit einem pola¬ ren Lösungsmittel, wie Aceton, um die gereinigte Isoursodes¬ oxycholsäure zurückzugewinnen. Nach Filtration der Lösung wird das Lösungsmittel abdestilliert und das Reaktionspro¬ dukt von Lösungsmittelresten durch Wasserdampf-Destillation befreit. Das Reaktionsprodukt, die Isoursodesoxycholsäure, wird dabei in einer Ausbeute von 50% erhalten.

Eine andere, noch bevorzugtere Form der Aufarbeitung besteht darin, daß die als Rohprodukt erhaltene Isoursodesoxychol¬ säure umkristallisiert wird. Als Lösungsmittel für die Um- kristallisation sind beispielsweise Essigester und Mischun¬ gen von Essigester mit anderen Lösungsmitteln, wie bei¬ spielsweise Methanol, geeignet. Vorzugsweise wird Essigester zur Umkristallisation eingesetzt. Lösungsmittelreste können auch bei diesem Reinigungsverfahren durch Austreiben mit Wasserdampf (Wasserdampf-Destillation) entfernt werden. Diese Form der Aufarbeitung bietet den Vorteil, daß die Isoursodesoxycholsäure mit höherer Ausbeute (58%) und mit höherer Reinheit erhalten werden kann, was durch den höheren

Schmelzpunkt des Reaktionsprodukts (161 bis 163°C im Ver¬ gleich zu 158 bis 160°C bei der durch Chromatographie gerei¬ nigten Isoursodesoxycholsäure) angezeigt wird.

Die Erfindung wird durch das nachstehende Beispiel näher er¬ läutert.

B e i s p i e l

1. Herstellung des Ursodesoxycholsäuremethylesters

10 g Ursodesoxycholsäure (VI) werden 3 Stunden lang in 50 ml 3%iger methanolischer HC1 unter Rückfluß erhitzt. Das Reak¬ tionsgemisch wird über Nacht stehengelassen. Anschließend werden die flüchtigen Bestandteile am Rotationsverdampfer bis zur Trockene des Reaktionsprodukts abgezogen. Der Rück¬ stand wird in 100 ml Chloroform aufgenommen und mit 30 ml Wasser, 30 ml gesättigter Natriumcarbonat-Lösung und erneut mit 30 ml Wasser gewaschen. Die Lösung wird über Magnesium¬ sulfat getrocknet und nach Abfiltration des Trockenmittels am Rotationsverdampfer eingedampft. Es werden 9,8 g Ursodes- oxycholsäuremethylester (Ausbeute = 95% d.Th.) erhalten, der einen Schmelzpunkt von 153-155°C (nicht korrigiert) auf¬ weist.

2. Herstellung der Isoursodesoxycholsäure (V)

10 g Ursodesoxycholsäuremethylester werden in 120 ml abso¬ lutem Toluol gelöst und mit 20 g Triphenylphosphin und 4 ml 98%iger Ameisensäure versetzt. Zu diesem Gemisch werden 40 ml Azodicarbonsäurediethylester-Lösung (38 - 40% in To¬ luol) unter Rühren zugetropft. Die Reaktion verläuft leicht exotherm. Nachdem das Reaktionsgemisch noch 48 Stunden lang bei 80°C gehalten wird, wird auf Raumtemperatur abgekühlt. Dabei fällt das bei der Reaktion gebildete Triphenylphos- phinoxid aus, das abfiltriert und verworfen wird. Das Fil-

trat wird einrotiert und der Rückstand mit 200 ml 5%iger me¬ thanolischer KOH 3 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen werden 200 ml Wasser zugesetzt, und das Reakti¬ onsgemisch wird im Vakuum bei 40°C auf die Hälfte eingeengt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat unter Eiskühlung mit verdünnter HC1 angesäuert. Es werden 8,3 g mit Triphenylphosphinoxid verunreinigter Isoursodesoxychol¬ säure (V) erhalten.

Anschließend wird das Rohprodukt an der Luft getrocknet und darauf in etwa 50 ml Chloroform aufgenommen, wobei der größte Teil der Verunreinigung in Lösung geht. Nach dem Ab¬ saugen werden 6,8 g Isoursödesoycholsäure (V) erhalten.

Eine Chromatographiesäule (Länge 40 cm, Durchmesser 3 cm) wird mit 30 g in Chloroform aufgeschlämmtem Kieselgel ge¬ füllt und die in 150 ml aufgeschlämmte Isoursodesoxychol¬ säure aufgetragen. Anschließend wäscht man mit 500 ml Chlo¬ roform oder mehr, bis alle Verunreinigungen entfernt sind, was daran erkennbar ist, daß in einem letzten Eluat beim Ab- destillieren des Chloroforms kein Rückstand mehr bleibt. Die Säure wird durch Spülen der Säule mit 500 ml Aceton zurück¬ gewonnen. Die so erhaltene Aceton-Lösung ist trübe und muß filtriert werden. Nach Entfernung des Acetons am Rotations- verdampfer wird der Rückstand durch Wasserdampf-Destillation von Lösungsmittelresten befreit. Es werden 4,8 g Isoursodes¬ oxycholsäure (Ausbeute = 50% d.Th.) mit einem Schmelzpunkt von 158-160°C (nicht korrigiert) erhalten.

Eine andere Form der Aufarbeitung besteht darin, daß man das Rohprodukt aus Essigester umkristallisiert (für je 10 g Roh¬ säure 100 ml Essigester). Man erhält so 5,6 g Säure (V) mit einem Schmelzpunkt von 161 bis 163°C. Lösungsmittelreste können auch hier nur durch Austreiben mit Wasserdampf (Was¬ serdampf-Destillation) entfernt werden.

Analytische Daten:

3ß , 7ß-Dihydroxy-5ß-cholansäure ( Isoursodesoxycholsäure )

Schmelzpunkt: 158 bis 160°C ^X H-NMR ([D ₆ ]DMSO, 300 MHz): δ - 0,62 (s, 3H); 0,85-1,5 (m, 23H) ;

1,6-2,3 (m, 9H); 3,35 (s, 1H);

3,82 (s, 2H); 4,17 (s, 1H) ;

12,0 (s, 1H, COOH).

^X3 C-NMR ([D ₆ ]DMSO, 75 MHz): δ = 11,95; 18,21; 21,11; 23,77; 26,60; 27,35; 28,08; 29,42; 30,65; 34,11; 34,22; 34,75; 36,71; 37,28; 37,96; 42,76; 43,00; 54,62; 55,74; 64,33 (C-3); 69,37 (C-7); 174,79 (COOH)

(V)