PROCEDE DE PRODUCTION DU 1,2,4-BUTANETRIOL A PARTIR D’UNE PLANTE

Domaine Technique

La présente invention se situe dans le domaine de la production du 1 , 2, 4-butanetriol, molécule d’intérêt industriel. La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de production du 1 ,2,4- butanetriol à partir de plante halophyte, en particulier Cakile maritima.

Art antérieur

Le 1 ,2,4-butanetriol est un produit chimique de base qui a une grande variété d’utilisations et dans différents domaines. En tant qu'important produit chimique, le butanetriol a des applications polyvalentes dans de nombreux domaines et a suscité un intérêt considérable ces dernières années. Par exemple, il peut être utilisé dans la production de solvants et dans la synthèse de divers produits pharmaceutiques, tels que des médicaments anti-viraux et hypocholestérolémiants, entre autres (Crestor® et Zetia®). Le butanetriol est également le précurseur direct de la fabrication du trinitrate de butanetriol, un excellent plastifiant énergétique pour remplacer la nitroglycérine, qui est moins volatile, thermiquement plus stable et offre de meilleures propriétés à basse température. Ainsi, le 1 , 2, 4-butanetriol est un composé utile dans l'industrie.

Les méthodes actuelles de production de 1 ,2,4-butanetriol utilisent des matières premières dérivées du pétrole et produisent des sous-produits nocifs pour l’environnement. Le moyen le plus courant de produire ce produit chimique consiste à utiliser du borohydrure de sodium (NaBH4) pour réduire chimiquement l’acide malique en 1 ,2,4-butanetriol. Cependant, le processus génère une grande quantité de sels de borate. L’élimination de ces sels provoque une pollution. La chromite et le rubidium peuvent également être utilisés comme catalyseurs pour la production de 1 ,2, 4-butanetriol, mais ces méthodes nécessitent des températures et des pressions élevées, ainsi que des sous-produits toxiques (Campbell, C. J. & Hinshaw, J. C. inventors; Thiokol Corporation, assignée. Making 1 ,2,4-butanetriol by hydroformylation of glycidol. United States patent US 4410744. 1983 Oct 18.).

Ces dernières années, l'utilisation de la biomasse pour la production de produits chimiques à valeur ajoutée a suscité un intérêt considérable. Le xylose est le deuxième sucre le plus abondant dans la nature et un constituant majeur de l'hémicellulose dans la biomasse lignocellulosique. Un certain nombre de souches microbiennes de type sauvage ou de souches obtenues par génie génétique ont été isolées ou construites pour fermenter le xylose en vue de la production d'éthanol, de xylitol, de succinate, de lactate et d'autres produits importants. L'utilisation du xylose issu de la biomasse pour produire des produits chimiques d'origine biologique présente de nombreux avantages par rapport aux procédés pétrochimiques traditionnels, car il est fabriqué à partir de ressources renouvelables, possède des conditions de transformation douces et réduit la pollution environnementale. Les chercheurs ont également exploré de nouvelles voies pour la production de butanetriol et ont finalement mis au point un nouveau procédé pour produire du butanetriol à partir du xylose par conversion microbienne.

Ainsi, la production de butanetriol est aujourd’hui réalisée principalement en fermenteurs par des cultures bactériennes d ’Escherichia coli modifiées génétiquement (Wang et al. 2018, Bioresource technology ; Zhang et al. 2016, Enzyme and microbial technology). Ces cultures sont en général optimisées pour synthétiser le plus possible de butanetriol à partir d’un précurseur, le xylose, jusqu’à des concentrations de 4g/L au bout de 72h de culture (Cao et al.2015, Scientific reports). Ces méthodes de production en bioréacteurs sont limitées par des effets secondaires, en particulier l’accumulation de composés toxiques (Zingaro et al. 2012, Metabolic engineering).

De façon surprenante, les inventeurs ont mis au point un nouveau procédé de production naturelle, dans des conditions contrôlées à partir de la plante halophyte Cakile maritima. Le procédé selon la présente invention offre une solution alternative naturelle au dépend des méthodes classiques de l’art antérieur reposant essentiellement sur des méthodes chimiques ou à partir de bactéries ou plantes génétiquement modifiées. Par ailleurs, il n'existe, à notre connaissance, aucun art antérieur décrivant une méthode de production du 1 ,2,4-butanetriol à partir de plante, en particulier Cakile maritima.

Brève description de l’invention

Un but de l’invention est de permettre d’une production naturelle, respectueuse de l’environnement et produite sur des terrains marginaux (salins) évitant ainsi la concurrence avec des cultures alimentaires. L’invention vise également à offrir, de fait, une valorisation à haute valeur ajoutée dans le cadre de culture de remédiation des sols.

L’invention permet donc de développer un procédé alternatif et naturel ayant pour ambition de limiter l’impact sur l’environnement tel que la pollution engendrée par la production et permettre une culture de remédiation des sols salins.

Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de production du 1 ,2,4- butanetriol à partir de plante Cakile maritima, caractérisé en ce que ladite plante est exposé à un stress salin lors de sa culture, de préférence pendant sa période de croissance pour augmenter la production du 1 ,2,4-butanetriol.

Selon un mode de réalisation préféré, l’exposition à un stress salin comporte l’ajout de sels dans le milieu de culture d’une plante Cakile maritima, de préférence sous la forme d’une solution saline concentrée, de façon à ce que le milieu de culture présente une concentration saline d'au moins 50mM, d’au moins 100mM, préférentiellement d’au moins 200mM, plus préférentiellement d’au moins 400mM et encore plus préférentiellement d’au moins 500mM.

En d’autres termes, l’exposition de la plante à un stress salin comprend l’ajout d'une solution saline aqueuse concentrée dans le milieu de culture d'au moins 50mM, d’au moins 100 mM, de préférence d’au moins 200mM, plus préférentiellement d’au moins 400mM et encore plus préférentiellement d’au moins 500mM.

Selon un autre mode de réalisation préféré, l’exposition à un stress salin comporte l’ajout de sels dans un milieu de culture tous les deux jours, de préférence une solution saline aqueuse concentrée est ajoutée dans le milieu de culture tous les deux jours. Préférentiellement, Cakile maritima est arrosé pendant au moins 10 jours, de préférence au moins 20 jours, à partir du début de la germination de ladite plante.

Par conséquent, l’exposition à un stress salin est maintenue dans le milieu de culture pendant au moins 10 jours, de préférence au moins 20 jours, de préférence la solution saline aqueuse concentrée est ajoutée dans le milieu de culture pendant au moins 10 jours, de préférence au moins 20 jours, à partir du début de la germination de ladite plante.

Selon un procédé de l'invention, la culture est réalisée sur plante entière ou en culture cellulaire. Selon un mode préféré, la culture sur plante entière est réalisée en serre. Selon un mode préféré, la culture cellulaire est réalisée dans un bioréacteur.

Lorsque la culture est réalisée sur plante entière, Cakile maritima est arrosé à partir du début de la germination avec la solution saline aqueuse concentrée, de préférence lorsque la plante a développé le premier stade foliaire, encore plus préférentiellement à partir du stade foliaire « 4 feuilles ».

Avantageusement, l’exposition au stress salin est initiée à partir de la germination, de préférence lorsque la plante a développé le premier stade foliaire, encore plus préférentiellement à partir du stade foliaire « 4 feuilles ».

Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production du butanetriol permettant, notamment, de dessaler ou de remédier au sel et/ou aux sols pollués. Ainsi, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la plante est cultivée dans des sols salés et/ou pollués. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la plante Cakile maritima est récoltée après la période de croissance, de préférence le butanetriol est extrait après la récolte de ladite plante. Avantageusement, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la plante Cakile maritima est récoltée après la période de croissance et le butanetriol est extrait.

L'invention est particulièrement adaptée à la production naturelle de 1 ,2,4-butanetriol tout en respectant les conditions environnementales notamment dans le cadre de culture de remédiation des sols (désalinisation, dépollution des sols). Description de l’invention

D’autres objectifs, caractéristiques et avantages sortiront de la description détaillée qui suit en référence aux dessins donnés à titre illustratif et non limitatif parmi lesquels :

[Fig.1 ] la figure 1 représente l’abondance relative (taux relatif) de butanetriol présente chez Cakile maritima après 10 jours de traitement selon un mode de réalisation possible de l’invention ;

[Fig. 2] la figure 2 représente l’abondance relative (taux relatif) de butanetriol présente chez Cakile maritima après 20 jours de traitement selon un mode de réalisation possible de l’invention ;

Il existe donc un besoin pour un procédé naturel permettant d’augmenter la production de 1 ,2,4-butanetriol à partir de plante, en particulier Cakile maritima.

Cakile maritima est une plante halophyte, capable de terminer son cycle de vie jusqu’à des concentrations de 500 mM NaCI. On trouve cette plante dans la nature sur les littoraux du monde entier et en particulier sur les côtes françaises et bordant la méditerranée. Dans le cadre de l’invention, les inventeurs ont plus particulièrement étudié un écotype provenant de la région de Raoued en Tunisie. Les inventeurs se sont afférés à récolter les graines dans cette région et de les semer afin de les reproduire et obtenir de plus grande quantité de graines.

Par « butanetriol », on entend au sens de l’invention le « 1 ,2,4-butanetriol » ou « 1 ,2,4- Trihydroxybutane » ou « 2-Deoxyerthritol » ou « Butane-1 ,2,4-Triol » (Numéro CAS : 3068- 00-6) de formule I :

Selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé de production du 1 ,2,4- butanetriol à partir de la plante Cakile maritima, caractérisé en ce que ladite plante est exposé à un stress salin pendant sa période de croissance pour augmenter la production du 1 ,2,4-butanetriol. Ainsi, un stress salin est induit sur ladite plante via une exposition prolongée ou non à une solution saline, pendant la période de croissance de ladite plante, pour augmenter la production du 1 ,2,4-butanetriol. Avantageusement, le procédé comprend une étape finale de récolte de Cakile maritima à la fin de la période de croissance en vue de collecter le 1 ,2,4-butanetriol d’intérêt produit et synthétisé naturellement par Cakile maritima sous des conditions de stress salin.

Plus particulièrement, après la récolte des graines d’intérêt et leur reproduction afin d’obtenir une grande quantité de graines de Cakile maritima, les graines de Cakile maritima ont été retirées de leurs gousses et plantées individuellement dans un sol humide composé à 90 % de compost et à 10 % de pierre de lave ou basalte. Les pots ont ensuite été transférés dans une serre et les plantes ont été maintenues dans des conditions de température ambiante et de luminosité pendant toute la durée de l'expérience. En particulier, une température moyenne élevée de 22 °C et une température moyenne basse de 17-21 °C, avec un cycle lumineux de 16L:8D et ce pendant la durée de croissance nécessaire à la plante. Les feuilles sont récoltées après au moins 10 jours de traitement, préférentiellement au moins 20 jours de traitement.

La présente invention concerne également un procédé de production du 1 ,2,4- butanetriol à partir de la plante Cakile maritima, ledit procédé comprenant les étapes de : a) ensemencement des graines de Cakile maritima, b) exposition à un stress salin à partir de la germination de la plante et pendant sa période de croissance pour augmenter la production du 1 ,2,4-butanetriol, et c) après au moins 10 jours de traitement, avantageusement au moins 20 jours de traitement, Cakile maritima est récolté afin d’obtenir le 1 ,2,4-butanetriol d’intérêt.

Au sens de l’invention, on entend par « stress salin » une condition dans laquelle on applique essentiellement un excès d’ions, mais pas exclusivement, aux ions Na ⁺ et Cl- dans la rhizosphère et dans l’eau. Le stress salin déclenche à la fois un stress osmotique et un stress ionique et est accompagné souvent d’une baisse importante du potentiel hydrique. Le stress salin peut directement ou indirectement affecter le statut physiologique des plantes en changeant le métabolisme, la croissance et le développement des plantes. La grande majorité des stress salins est provoquée par des sels de sodium, particulièrement le NaCI. De ce fait, les termes halophytes et glycophytes font essentiellement référence aux stress provoqués par un excès de Na ⁺ .

De façon surprenante, les inventeurs ont ainsi identifié que ce changement de métabolisme modifiait significativement la quantité de butanetriol produit par ladite plante.

On entend par stress salin, la condition dans laquelle est mise la plante avec l’ajout d’une solution saline aqueuse d’au moins 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM,

110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM, 200mM,

210mM, 220mM, 230mM, 240mM, 250mM, 260mM, 270mM, 280mM, 290mM, 300mM,

310mM, 320mM, 330mM, 340mM, 350mM, 360mM, 370mM, 380mM, 390mM, 400mM,

410mM, 420mM, 430mM, 440mM, 450mM, 460mM, 470mM, 480mM, 490mM, 500mM. Selon un mode de réalisation préféré, l’exposition à un stress salin comporte l’ajout de sels dans le milieu de culture d’une plante Cakile maritima, de préférence sous la forme d’une solution saline concentrée, de façon à ce que le milieu de culture présente une concentration saline d'au moins 50mM, d’au moins 100mM, préférentiellement d’au moins 200mM, plus préférentiellement d’au moins 400mM et encore plus préférentiellement d’au moins 500mM.

Par « milieu de culture » au sens de l’invention, on entend un milieu de culture adéquat et connu de l’homme du métier pour la culture cellulaire et notamment la culture en bioréacteur tel que le milieu Murashige et Skoog (MS, Murashige et al., 1962) ou un milieu de culture adéquat et connu de l’homme du métier pour la culture en serre ou en pleine terre. Par conséquent, l’ajout d’une solution saline aqueuse concentrée dans le milieu de culture peut par exemple être, une irrigation par une solution comprenant de l’eau et du sel, avantageusement NaCI, sur le système foliaire et/ou système racinaire des plantes cultivées en serre ou en pleine terre. Bien entendu, l’arrosage peut être automatique ou naturel. On entend par arrosage naturel un arrosage induit naturellement par le climat et la météo, par exemple un climat océanique en bord de mer qui est naturellement riche en NaCI. Pour la culture cellulaire, l’ajout d’une solution saline aqueuse concentrée dans le milieu de culture peut par exemple être le milieu de culture qui comprend une solution saline d’au moins 50mM, avantageusement le milieu de culture est enrichi d’une solution saline d’au moins 50mM pendant au moins 10 jours de traitement.

Dans le cadre de la présente invention, l’arrosage en présence de solution saline aqueuse commence à partir du stade de croissance « 4 feuilles ». Toutefois, selon un autre mode de réalisation, Cakile maritima est arrosée à partir de la germination, de préférence lorsque la plante a développé le premier stade foliaire, de façon encore plus préférentielle lorsque la plante a atteint le stade croissance « 4 feuilles ».

Ainsi, la solution saline aqueuse concentrée est ajoutée dans le milieu de culture à partir de la germination, de préférence lorsque la plante a développé le premier stade foliaire, encore plus préférentiellement à partir du stade foliaire « 4 feuilles ».

Par « stade de croissance 4 feuilles », ou « plantes à 4 feuilles » on entend au sens de l’invention le moment ou la plante comprend 4 feuilles. L’observation des stades de croissance sont peu nombreux et basés sur le nombre de feuilles. Ainsi, le stade principal permettant le développement foliaire comprend une 1 ^ère étape ou les cotylédons sont complètement étalés, une 2 ^ème étape ou la première paire de feuilles est étalées (stade 2 feuilles opposées), une 3 ^ème étape ou la deuxième paire de feuilles est étalées (stade 4 feuilles) et une 4 ^ème étape ou la première feuille alterne est étalée (stade 5 feuilles). Par conséquent, l’arrosage débute au sens de l’invention lorsque la deuxième paire de feuilles est étalées.

Une fois la croissance arrivée au stade « 4 feuilles », les plantes sont arrosées tous les 2 jours avec des concentrations variables de solution saline aqueuse, en particulier solution de NaCI. Le traitement des plantes dure au moins 10 jours, de préférence au moins 20 jours. On entend au sens de l’invention par « traitement d’au moins 10 jours », un traitement de 10 jours, 11 jours, 12 jours, 13 jours, 14 jours, 15 jours, 16 jours, 17 jours, 18 jours, 19 jours et 20 jours. En particulier, au sens de l’invention, on entend par durée de traitement des plantes de 10 jours, l’instant où la plante a atteint le stade de croissance « 4 feuilles », suivi d’un arrosage pendant 10 jours. Selon un mode opératoire similaire, le traitement dure au moins 20 jours à partir du stade de croissance 4 feuilles.

Des échantillons de feuilles sont prélevés à 10 jours et à 20 jours de traitement. Les feuilles 1 et 3 seront ensuite analysées à 10 jours et les feuilles 3 et 5 à 20 jours.

Ainsi, le procédé selon l’invention, comprend l’ajout d’une solution saline aqueuse concentrée dans le milieu de culture pendant au moins 10 jours, de préférence au moins 20 jours. Le procédé selon l’invention comprend également l’ajout d’une solution saline aqueuse concentrée dans le milieu de culture tous les deux jours. En particulier, les plantes à 4 feuilles sont irriguées pendant une période d'au moins 20 jours avec 100 ml_ de solutions de NaCI de 0 mM à 500 mM tous les deux jours.

Selon un autre mode particulièrement avantageux de l’invention, le procédé est caractérisé en ce que la culture est réalisée sur plante entière ou en culture cellulaire.

Avantageusement, la culture sur plante entière est réalisée en serre. Toutefois et de façon alternative, la culture peut être réalisée en pleine terre, notamment sur des sols marginaux ou inapte à la culture classique. La culture sur des terrains marginaux permet en outre d’éviter la concurrence avec des cultures alimentaires.

Par « terrains marginaux », on entend au sens de l’invention des terrains pollués, salins ou des terrains inaptes à la culture alimentaire.

Ainsi, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la plante est cultivée directement dans le milieu de culture, ledit milieu de culture peut être naturellement concentrée en solution saline et/ou ledit milieu de culture peut être concentrée par l’ajout d’une solution saline.

Selon un autre mode de réalisation la culture est réalisée en culture cellulaire, préférentiellement dans un bioréacteur. Ce mode est particulièrement avantageux afin de produire une grande quantité de 1 ,2,4-butanetriol dans des conditions contrôlées et un espace confiné relativement bon marché et prenant peu de place.

L'établissement d'une culture en suspension cellulaire de l'halophyte Cakile maritima a notamment été décrit par les inventeurs (Ben Hamed et al. 2014).

Les cultures de Cakile maritima ont été initiées à partir d'une partie aérienne de plantules légères de 14 jours. Les graines ont été immergées dans de l'éthanol à 70% pendant 1 min, puis rincées avec de l'eau distillée stérile, immergées dans un agent de blanchiment chloré pendant 10 min et après avoir été rincées trois fois (5 min chacune) avec de l'eau distillée stérile. Les graines ont été placées dans une boîte de Pétri contenant du milieu Murashige et du Skoog, y compris des vitamines (MS, Murashige et al., 1962), avec 30 g.L ¹ de saccharose et 8 g.L ¹ d'agar. Le pH a été ajusté à 5,8 avec du KOH. Les segments de tige ont été coupés finement et ensuite placés sur un milieu inducteur de callus solide (CIM), contenant 6,2 gL· ¹ de Gamborg B5 (Gamborg et al., 1968) complété avec 20 g de glucose, 8 gL· ¹ agar et des régulateurs de croissance, 9,06 mM de 2,4 D et 0,46 mM de kinétine. Le pH a été ajusté à 5,7 avec du KOH. Après 2-3 semaines, des callosités sont apparues sur les côtés des segments. Lorsque la taille des callosités dépasse 1 cm, ils ont été divisés et transférés sur le milieu inducteur de callus.

Les cultures en suspension de cellules d'établissement de Cakile maritima reposent sur environ 5 g de cals qui ont été transférés dans des fioles de 125 mL contenant du milieu MS frais additionné de 30 g.L ¹ de saccharose. Le pH a été ajusté à 5,7 avec du KOH. Les flacons ont été incubés sur un agitateur rotatif à 120 tr / min et maintenus à 22°C dans le noir. L'alimentation des cultures avec du milieu frais a été effectuée à des intervalles de 10 à 14 jours, au cours desquels les suspensions ont été laissées sous agitation (agitateur rotatif à 120 tours / minute). Cette procédure a été répétée pendant environ 8 semaines. Ensuite, la suspension a été repiquée tous les 7 jours en transférant 20 ml de culture dans 50 ml de milieu frais dans un erlen de 250 ml.

Enfin, le traitement au sel pour des cellules en culture reposent sur l’ajout de 10 mL de solutions de NaCI dans le milieu de culture pour atteindre la concentration souhaitée. Des cellules anciennes ont été repiquées dans le milieu complémenté et cultivées pendant 7 jours dans un bioréacteur.

En ce qui concerne les cultures en suspension cellulaire de Cakile maritima, les inventeurs ont déjà montré que les lignées cellulaires précédemment générées, conservaient les caractéristiques halophytes de la plante entière (Ben Hamed et al. 2014, Advances in Horticultural Science; 2016, Plant Science).

Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de production du butanetriol qui permet notamment, de dessaler ou de remédier au sel et/ou aux sols pollués. Avantageusement, ledit procédé comprend une étape dans laquelle la plante de Cakile maritima est récoltée après la période de croissance permettant l’export des polluants accumulés. Par conséquent, la valorisation de l'utilisation de Cakile maritima pour la désalinisation ou la remédiation des sols pollués en complément de celle d’autres métabolites d’intérêt économique est d’intérêt. D'autres aspects et avantages de l'invention seront divulgués dans les exemples suivants et doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

EXEMPLES :

Les inventeurs ont caractérisé la capacité de Cakile maritima à produire du butanetriol en condition de stress salin sur plantes entières cultivées sous serre. Par ailleurs, les inventeurs maîtrisent également, la culture en serre de la plante ainsi que les traitements salins. Les inventeurs ont par ailleurs développé une culture cellulaire de cette plante (Ben- Hamed et al. 2014).

Cakile maritima est une plante halophyte capable de compléter son cycle de vie dans un milieu contenant jusqu'à 500mM de NaCI. C. maritima vit sur les côtes du monde entier et notamment en France et tout autour de la Méditerranée.

Les inventeurs ont effectué dans le cadre de leurs travaux de recherche, une étude du métabolome afin de décoder les changements du métabolisme des feuilles de C. maritima dans des conditions salines au fil du temps. Les inventeurs ont appliqué des concentrations de sel de 0 à 500mM NaCI et analysé le contenu métabolique des feuilles du stade foliaire 1 à 5. Grâce au logiciel Mev, les inventeurs ont réalisé un test Wilcoxson et généré des cartes thermiques pour chaque test statistique. Les inventeurs ont calculé un changement de facteur pour les métabolites statistiquement pertinents. Les inventeurs ont également observé des changements d'abondance relative dans les métabolites primaires et secondaires, tels que les alcaloïdes et les antioxydants, parmi lesquels le 1 ,2,4-butanetriol (butanetriol).

De façon surprenante et inconnu à ce jour, les inventeurs ont découvert la présence du 1 ,2,4-butanetriol comme métabolite lorsque Cakile maritima est cultivé en présence de concentration de sel.

Ainsi, à 10 jours, les plantes traitées et non traitées produisent du butanetriol à un niveau de base (Fig. 1). En revanche et de façon complètement inattendue, après 20 jours, le traitement au sel augmente la production de butanetriol de manière dose-dépendante (Fig. 2). Ainsi, les résultats montrent une forte augmentation relative (de l’ordre de 20 fois) de la quantité de butanetriol en condition de stress salin.

À notre connaissance, la production naturelle de butanetriol a été jusqu'à présent détectée à un niveau basal uniquement chez 2 plantes : le blé (Tang et al. 2018, Plant Physiology and Biochemistry) et le maïs (Zhu et al. 2016, Applied Soil Ecology). Dans ce contexte, la présente invention présente un double intérêt : i) Cakile maritima offre une alternative à la production du butanetriol par OGM, et ii) la production de Cakile maritima peut être induite par le stress salin de manière dose-dépendante.

BIBLIOGRAPHIE

Cao Y, Niu W, Guo J, Xian M, Liu H. Biotechnological production of 1 ,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass. Sci Rep. 2015 Dec 16;5:18149.

Ben Hamed-Laouti I, Arbelet-Bonnin D, De Bont L, Biligui B, Gakière B, Abdelly C, Ben Hamed K, Bouteau F. Comparison of NaCI-induced programmed cell death in the obligate halophyte Cakile maritima and the glycophyte Arabidopsis thaliana. Plant Sci. 2016 Jun;247:49-59.

Hamed, I., Biligui, B., Arbelet-Bonnin, D., Abdelly, C., Hamed, K., & Bouteau, F. (2014). Establishment of a cell suspension culture of the halophyte Cakile maritima. Advances in Horticultural Science, 28(1 ), 43-48.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soyabean root cells Exp. Cell Res. 1968 ; 50 151-158.

Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum.1962 15;3:473-497

Tang H, Song Y, Guo J, Wang J, Zhang L, Niu N, Ma S, Zhang G, Zhao H. Physiological and metabolome changes during anther development in wheat (Triticum aestivum L.). Plant Physiol Biochem. 2018 Nov;132:18-32. doi: 10.1016/j.plaphy.2018.08.024. Epub 2018 Aug 23. PMID: 30172190. Wang X, Xu N, Hu S, Yang J, Gao Q, Xu S, Chen K, Ouyang P. d-1 ,2,4-Butanetriol production from renewable biomass with optimization of synthetic pathway in engineered Escherichia coli. Bioresour Technol. 2018 Feb;250:406-412.

Zhang N, Wang J, Zhang Y, Gao H. Metabolic pathway optimization for biosynthesis of 1 ,2,4-butanetriol from xylose by engineered Escherichia coli. Enzyme Microb Technol. 2016

Nov;93-94:51-58.

Zhu S, Vivanco JM, Manter DK. Nitrogen fertilizer rate affects root exudation, the rhizosphere microbiome and nitrogen-use-efficiency of maize. Applied Soil Ecology, 2016;107:324-333. Zingaro KA, Terry Papoutsakis E. GroESL overexpression imparts Escherichia coli tolérance to i-, n-, and 2-butanol, 1 ,2,4-butanetriol and éthanol with complex and unpredictable patterns. Metab Eng. 2013 Jan;15:196-205.