Titre : Procédé de production d’enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques

Domaine technique

La présente invention concerne la production des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques, notamment dans le cadre de la production de sucres à partir de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques faisant intervenir une hydrolyse enzymatique de ces matériaux. Les sucres peuvent être utilisés/valorisés tels quels ou poursuivre leur conversion en alcool, notamment en éthanol, par fermentation.

Technique antérieure

Depuis les années 1970, la transformation de matériaux lignocellulosique en éthanol, après hydrolyse des polysaccharides constitutifs en sucres fermentescibles, a fait l'objet de très nombreux travaux. On peut citer par exemple les travaux de référence du National Renewable Energy Laboratory (Process Design and Economies for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, May 201 1 ).

Les matériaux lignocellulosiques sont des matériaux cellulosiques, c'est-à-dire constitués à plus de 90% poids de cellulose, et/ou lignocellulosiques, c'est-à-dire constitués de cellulose et d’hémicelluloses, qui sont des polysaccharides essentiellement constitués de pentoses et d'hexoses, ainsi que de lignine, qui est une macromolécule de structure complexe et de haut poids moléculaire, à base de composés phénoliques. Par soucis de concision, on pourra dans le présent texte les regrouper sous le terme générique de biomasse.

Le bois, les pailles, les rafles de maïs sont les matériaux lignocellulosiques les plus utilisés, mais d'autres ressources, cultures forestières dédiées, résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, produits et résidus de l'industrie papetière et des produits de transformation des matériaux lignocellulosiques sont utilisables. Ils sont constitués pour la plupart d'environ 35 à 50 % de cellulose, de 20 à 30 % d'hémicellulose et de 15 à 25 % de lignine.

Le procédé de transformation biochimiques des matériaux lignocellulosiques en sucres puis éventuellement en éthanol comprend une étape de prétraitement physico-chimique, suivie d'une étape d'hydrolyse enzymatique utilisant un cocktail enzymatique. Il peut se poursuivre par une étape de fermentation éthanolique des sucres libérés, la fermentation éthanolique et l’hydrolyse enzymatique pouvant être conduites simultanément, et d'une étape de purification de l'éthanol. Un exemple d’un tel procédé convertissant de la biomasse en éthanol est décrit dans le brevet EP 3 484 945, auquel on pourra se reporter pour plus de détails.

Le cocktail enzymatique utilisé pour l’hydrolyse est un mélange d’enzymes cellulolytiques (également appelées cellulases) et/ou hémicellulolytiques. Les enzymes cellulolytiques présentent trois grands types d'activités : endoglucanases, exoglucanases et cellobiases, ces dernières étant également appelées p glucosidases. Les enzymes hémicellulolytiques présentent notamment des activités xylanases.

L'hydrolyse enzymatique est efficace et s'effectue dans des conditions douces. En revanche, le coût de production des enzymes reste très élevé, pouvant représentant au moins 20 % du coût de conversion de la biomasse en éthanol par exemple. De ce fait, beaucoup de travaux ont été conduits pour réduire ce coût : l’optimisation de la production d'enzymes d'abord, en sélectionnant les microorganismes hyperproducteurs et en améliorant les procédés de production desdites enzymes, la diminution de la quantité d'enzymes en hydrolyse ensuite, en optimisant l’étape de prétraitement, en améliorant l'activité spécifique de ces enzymes, et en optimisant la mise en oeuvre de l’étape d’hydrolyse enzymatique.

Le microorganisme cellulolytique le plus utilisé pour la production industrielle du cocktail enzymatique est le champignon Trichoderma reesei. Les souches sauvages ont la faculté de sécréter, en présence d'un substrat carboné inducteur, la cellulose par exemple, le cocktail enzymatique considéré comme le mieux adapté à l'hydrolyse de la cellulose. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux lignocellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat carboné inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. La nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du cocktail enzymatique. C'est le cas du xylose, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'améliorer significativement l'activité dite xylanase.

Des souches recombinantes ont été obtenues à partir des souches de Trichoderma reesei Qm9414 (Mandels M. (1975). Microbial sources of cellulase. Biotechnol. Bioeng.5, 81 -105), RutC30 (Montenecourt, B. S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782), CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50) en clonant des gènes hétérologues, l'invertase d' Aspergillus niger par exemple, pour diversifier la source de carbone nécessaire à la production de cellulases et/ ou surexprimant la p-glucosidase afin d'améliorer le rendement d'hydrolyse enzymatique, les Pglucosidases étant considérées comme les enzymes limitantes dans la réaction. Ces souches ont conservé leur hyperproductivité et leur aptitude à être cultivées en fermenteur.

L’incorporation de l’invertase à Trichoderma lui confère la propriété de pouvoir consommer le saccharose, et donc des effluents comprenant des jus sucrés issus des lavages de betteraves ou de cannes à sucre, et/ou des mélasses de sucrerie, dont le coût est moindre et/ou la disponibilité plus grande. C’est ce qui a été vérifié, par exemple, dans le brevet EP 2 222 865.

Le lactose et le glucose restent, dans un procédé de production industriel de cocktail enzymatique, parmi les substrats carbonés les plus appropriés. Leur coût, notamment celui du glucose, est élevé et est susceptible de varier cependant de manière importante. Le procédé de production de cocktail enzymatique se trouve également dépendant de sources de carbone extérieures.

De ce fait, l'utilisation de substrats carbonés issus du procédé de conversion biochimique de matériaux lignocellulosiques est une voie intéressante, et il a été ainsi proposé dans le brevet WO 2013/190214 un procédé de production d’enzymes comprenant une phase de croissance des microorganismes en présence d’un substrat carboné de croissance, puis une phase de production des enzymes avec un substrat carboné inducteur sous forme d’un résidu liquide issu d’un prétraitement de matériau lignocellu losique comprenant des sucres en C5.

La logique économique actuelle veut que les sites de production de biocarburants de seconde génération puissent être les mêmes que ceux de production de première génération, l’ensemble constituant une "bioraffinerie" où l’intégralité du matériau végétal est valorisée. Ainsi, en partant d’une plante sucrière, on cherche à valoriser la canne à sucre et les résidus lignocellulosiques de canne, et des effluents contenant du saccharose peuvent être disponibles sur site.

Ce n’est cependant pas la seule voie d’amélioration possible dans la production d’enzymes, et elle peut présenter certains inconvénients, ou tout au moins des limitations dans son application. Ainsi, elle impose généralement, de fait, que la production d’enzymes ait lieu dans l’installation de conversion de biomasse, ce qui n’est pas toujours le cas rencontré/envisagé. Ensuite, elle prélève une partie des sucres, destinée, dans le procédé de conversion de la biomasse, à être valorisée/convertie par ailleurs. Enfin, ce liquide sucré peut ne pas suffire à assurer à lui seul à la fois la croissance du champignon et sa production en enzymes : ces sucres doivent être complémentés, notamment par un substrat inducteur comme le lactose, dans la phase de production des enzymes. Le but de l’invention est alors d’améliorer un procédé de production d’enzymes, notamment en remédiant aux inconvénients précités, en cherchant notamment à simplifier le procédé, à en réduite les coûts, à le rendre plus flexible dans sa mise en oeuvre industrielle.

Résumé de l’invention

L’invention a tout d’abord pour objet un procédé de production d’enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques par un microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique, ledit procédé comprenant au moins

- a) une phase de croissance du microorganisme en présence d’au moins un substrat carboné, puis

- b) une phase de production des enzymes en présence d’au moins un substrat inducteur, ledit procédé comprenant également :

- c) une phase de préparation d’un substrat carboné comprenant du glucose et/ou du fructose, substrat carboné qu’on utilise dans l’une et/ou l’autre des phases a) de croissance et b) de production, ladite phase de préparation comprenant une étape c1 ) d’hydrolyse en milieu aqueux acide de saccharose en glucose et fructose.

L’invention a cherché à exploiter une source de substrat carbonée, le saccharose, pour remplacer le glucose, car le saccharose est un composé moins onéreux et d’un prix plus stable que celui du glucose, et similaire dans ses propriétés sucrantes. En effet, le saccharose est un disaccharide composé de molécules de glucose et de fructose combinées via une liaison glycosidique Mais un simple remplacement du glucose par du saccharose ne suffit pas : en effet, le saccharose n’est pas assimilable tel quel par des microorganismes du type champignons filamenteux comme Trichoderma, car ces microorganismes ne sont naturellement pas dotés du gène de l’invertase.

Une première solution peut consister à modifier génétiquement les microorganismes pour les doter de ce gène. La publication de Lucas Miranda Fonseca and al. « Rational engineering of the Trichoderma reesei RUT-C30 strain into an industrially relevant platform for cellulase production” publiée dans la revue Biotechnology for biofuels (2020) propose ainsi d’apporter plusieurs modifications génétiques sur la souche RUT-C30 de T. reesei, permettant notamment l’expression du gène de l’invertase, et donc de pouvoir recourir au moins en partie à du saccharose comme substrat carboné dans le procédé de production d’enzymes à partir de cette souche modifiée. Si cette technique de modification génétique ciblée est efficace, elle est complexe à mettre en oeuvre, et doit être répétée dès que l’on veut changer de souche. L’invention a donc consisté non pas à modifier les souches, mais à modifier le saccharose pour le rendre assimilable. Cette modification est une hydrolyse acide, qui permet de couper la liaison glycosidique de la molécule pour qu’elle se décompose en glucose et fructose, tous deux assimilables par les microorganismes visés par l’invention.

Avantageusement, le microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique d’intérêt pour l’invention est choisi parmi les microorganismes dépourvus du gène de l’invertase et capables de consommer du glucose et/ou du fructose : on peut donc utiliser dans l’invention des souches non modifiées, ou, plus précisément, non modifiées pour les rendre capables d’assimiler le saccharose. Les microorganismes visés par l’invention sont de préférence des microorganismes de type champignon, notamment de type champignon filamenteux.

Le microorganisme cellulolytique et/ou hémicellulolytique peut être choisi pour mettre en oeuvre l’invention parmi les souches de champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Pénicillium ou Schizophyllum, et appartenant de préférence à l’espèce Trichoderma reesei.

Avantageusement, on obtient, à l’issue de la phase c) de préparation, une solution aqueuse comprenant du glucose et du fructose qui est utilisable directement ou après d’éventuelles opérations de type ajustement de concentration (ou autre traitement type filtration...) comme substrat carboné à l’étape a) de croissance et/ou b) de production.

L’hydrolyse peut être totale, ou partielle : dans ce cas, une quantité (faible) de saccharose peut être encore présente dans la solution obtenue en fin d’hydrolyse.

Selon un mode de réalisation, on peut ajouter au moins un substrat inducteur, notamment du lactose, à la solution aqueuse comprenant du glucose et du fructose obtenue à l’issue de la phase c) de préparation, pour utiliser ladite solution comme substrat à l’étape b) de production. On a ainsi une solution de substrat carboné prête à l’emploi pour l’étape b) de production, avec un mélange de substrats inducteurs et non inducteurs. Elle peut aussi être utilisée pour l’étape a), le lactose pouvant aussi être utilisé comme substrat carboné de croissance. Dans ce cas, on n’a plus qu’une seule solution venant alimenter le bioréacteur pour les deux étapes, ce qui simplifie sa préparation, son stockage et son mode d’introduction dans le bioréacteur.

A noter que le procédé selon l’invention peut mettre en oeuvre les étapes a) de croissance et b) de production dans un même bioréacteur. Alternativement, il peut être mis en oeuvre avec un premier bioréacteur dédié à l’étape a) de croissance, et un deuxième bioréacteur dédié à l’étape b) de production. Selon un autre mode de réalisation, on peut ajouter au moins un substrat inducteur, notamment du lactose, au milieu aqueux acide pendant l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose. L’intérêt est que le lactose est un disaccharide, comme le saccharose, mais qui est la combinaison d’un glucose et d’un galactose via une liaison glycosidique, qui est assimilable par les souches de champignon visées par l’invention. Or les inventeurs ont montré que le lactose est nettement plus difficile à hydrolyser en conditions acides que le saccharose. Quand bien même une faible part de lactose s’hydrolyserait, le glucose et le galactose résultant de son hydrolyse sont également assimilables par les souches.

Ce mode de réalisation peut se combiner au précédent, en ajoutant le substrat inducteur en partie pendant l’hydrolyse, en partie à la fin de l’hydrolyse.

A noter également qu’en fin d’hydrolyse, la solution aqueuse obtenue peut être utilisée immédiatement, dans l’installation de production d’enzymes. Elle peut aussi être stockée pour une utilisation ultérieure, et l’hydrolyse peut avantageusement se poursuivre pendant le stockage au besoin, généralement à température ambiante, la solution étant de préférence maintenue à un pH acide jusqu’à utilisation pour limiter les risques de contamination.

Selon une première variante, on peut réaliser l’étape d ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à pH inférieur ou égal à 5, notamment inférieur ou égal à 4, notamment inférieur ou égal à 3,5 ou 3, de préférence compris entre 1 et 3.

Pour obtenir un milieu d’hydrolyse à pH acide, on ajoute par exemple un acide fort, de type acide chlorhydrique ou acide sulfurique, à une solution aqueuse en quantité suffisante pour régler le pH de la solution à la valeur choisie.

Alternativement, on peut ajouter un acide faible de type acide organique.

Une autre alternative encore peut être d’acidifier la solution aqueuse en y introduisant du gaz carbonique CO2 sous forme gazeuse (bullage) : c’est en effet un acide (faible) et il est issu de la fermentation des sucres en alcool dans le processus de conversion de biomasse en alcool. Il est donc disponible si la production d’enzymes se fait sur le site de conversion de biomasse.

Il est également possible de cumuler entre elles deux au moins de ces différentes alternatives : ajout dans une solution aqueuse d’au moins un acide fort, d’au moins un acide faible, introduction de CO2.

Avantageusement, notamment avec cette première variante, on réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au moins 1 10°C, notamment compris entre 110 et 125°C, notamment entre 110 et 120°C, afin d’assurer également la stérilisation dudit milieu. En effet, l’hydrolyse est accélérée si l’on chauffe le milieu dans lequel on opère l’hydrolyse, mais pas nécessairement à de si hautes températures. Mais procéder à l’hydrolyse à au moins 110°C permet de réaliser en même temps la stérilisation de la solution, ce qui est nécessaire pour son introduction dans le procédé de production d’enzymes. Il est alors avantageux, comme évoqué plus haut, d’ajouter un ou plusieurs substrats inducteurs, comme le lactose, à ce milieu avant stérilisation, ce qui permet d’introduire la solution stérile comprenant tous les substrats nécessaires dans le bioréacteur (et ce qui évite donc de devoir opérer une stérilisation à part du ou des substrats inducteurs).

Dans une deuxième variante, on réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide comportant au moins pour partie, notamment seulement, un hydrolysat hémicellulosique acide.

Avantageusement, cet hydrolysat hémicellulosique est issu d’une étape de prétraitement acide d’une biomasse lignocellulosique, et il comporte des monomères et oligomères de sucres majoritairement en C5. Contrairement au brevet WO 2013/1900214 précité, cet hydrolysat n’est pas utilisé ici directement corne substrat carboné, mais d’abord comme offrant un milieu (fortement) acide pour l’hydrolyse préalable du saccharose. A noter que cet hydrolysat est acide, car le prétraitement de biomasse dont il est issu comprend de préférence une étape d’imprégnation acide, comme un exemple est décrit dans le brevet EP 3 484 945 précité.

On obtient ainsi en final une solution contenant les sucres en C5 de l’hydrolysat, qui sont assimilables par les souches (microorganismes), et du glucose et du fructose issus de l’hydrolyse du saccharose (et éventuellement aussi du saccharose non hydrolysé). Cette variante est très intéressante par sa flexibilité : on peut doser la proportion de sucres en C5 et la proportion de glucose/fructose de la solution obtenue en final, en dosant la quantité d’hydrolysat et la quantité de saccharose ajoutée à celui-ci, en fonction de la disponibilité de l’un et de l’autre des sources de carbone.

Il y a un autre avantage à utiliser un hydrolysat comme milieu acide d’hydrolyse du saccharose : on peut réaliser l’hydrolyse en chauffant la solution, pour l’accélérer/l’amplifier, mais jusqu’à des températures moindres que dans le cas de la première variante : ainsi, on peut réaliser l’étape c1 ) d’hydrolyse à une température inférieure ou égale à 100°C, notamment inférieure ou égale à 80°C, notamment entre 30 et 60°C, car il n’est plus nécessaire de procéder à la stérilisation de la solution obtenue avant de l’utiliser. En effet, les hydrolysats hémicellulosiques sont des milieux acides, qui contiennent des sucres, mais aussi des inhibiteurs générés lors du prétraitement acide de la biomasse, tels que l’acide acétique, le furfural, le 5-HMF ou encore des composés phénoliques, ce qui limite fortement les risques de contamination.

On peut aussi combiner les deux variantes, en utilisant comme milieu d’hydrolyse acide un hydrolysat hémicellulosique éventuellement dilué, concentré, ... et en y ajoutant un acide ou du CO2.

On voit qu’on peut ajuster au mieux le taux d’hydrolyse du saccharose pendant l’étape d ) en jouant sur les conditions opératoires, à savoir en ajustant le pH du milieu à un pH plus ou moins acide (par ajout d’acide et/ou d’hydrolysat à concentration variable) et/ou en ajustant la température à laquelle est opérée l’hydrolyse et/ou en ajustant la durée de l’hydrolyse.

Selon l’invention, on peut sélectionner différentes conditions opératoires, notamment selon la variante choisie. La température à laquelle s’opère l’hydrolyse, ainsi que le pH du milieu dans laquelle elle s’opère et la durée de l’hydrolyse sont les conditions opératoires les plus significatives. De façon générale, on a constaté que l’hydrolyse s’opère d’autant plus rapidement que la température est élevée et que le pH est faible.

Selon un premier mode de réalisation, on peut réaliser l’étape d ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au moins 1 10°C, à un pH d’au plus 5 et pendant une durée de préférence comprise entre 10 minutes et 10 heures. Il est privilégié pour la mise en oeuvre de la première variante, où il est nécessaire de stériliser le milieu, ou quand une hydrolyse (très) rapide est souhaitée. Et on note que dans ce cas, où la température est élevée, on peut adopter un pH un peu moins acide qu’avec une température moins élevée (quand on ne cherche pas à stériliser).

Selon un deuxième mode de réalisation, on peut réaliser l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température d’au plus 100°C, notamment comprise entre 30 et 60°C, à un pH d’au plus 4, et pendant une durée de préférence comprise entre 1 heure et 24 heures. Il est privilégié pour la mise en oeuvre de la deuxième variante, notamment dans le cas où il est souhaité d’avoir une durée d’hydrolyse relativement rapide.

Selon un troisième mode de réalisation, on peut réaliser réalise l’étape c1 ) d’hydrolyse du saccharose dans un milieu aqueux acide à une température comprise entre 10 et 30°C, à un pH d’au plus 4 et pendant une durée de préférence de plus de 24 heures. Il est privilégié pour la mise en oeuvre de la deuxième variante, notamment dans le cas où l’hydrolyse peut être réalisée sur une durée longue. Ici, il n’est donc pas nécessaire de chauffer le milieu d’hydrolyse. C’est un mode de réalisation intéressant quand on a une cuve de stockage du saccharose dans lequel on peut laisser l’hydrolyse s’effectuer jusqu’à utilisation, à température ambiante (par alimentation du bioréacteur où s’effectue la production d’enzymes).

Liste des figures

[Fig 1]

La figure 1 représente l’évolution de la concentration en biomasse (dans les exemples suivants, ce sont les microorganismes sous forme de champignons) au cours du temps dans un procédé de production d’enzymes avec différentes solutions de substrat carboné, (en abscisse, la durée en heure, en ordonnée la quantité de biomasse en g/l).

[Fig 2]

La figure 2 représente l’évolution de la concentration en enzymes au cours du temps dans un procédé de production d’enzymes avec différentes solutions de substrat carboné (en abscisse, la durée en heure, en ordonnée la quantité d’enzymes en g/l).

[Fig 3]

La figure 3 représente l’évolution de la concentration en saccharose au cours du temps : en abscisse, la durée en heure, en ordonnée à gauche du graphe l’estimation de la quantité de saccharose dans la solution de fed-batch en g/l, et en ordonnée à droite du graphe l’estimation de la quantité de saccharose dans le bioréacteur où sont opérées à la fois l’étape de croissance des microorganismes et l’étape de production des enzymes, en g/l.

Description des modes de réalisation

Tests d’hydrolyse de saccharose en milieu acide

Il a d’abord été procédé à des tests d’hydrolyse préliminaires de saccharose et de lactose (à titre de comparaison), dans des solutions aqueuses d’acide sulfurique à différents pH et différentes températures, selon la première variante de l’invention.

Le mode opératoire est le suivant :

3 solutions à environ 220 g/L sont préparées avec :

- 100% saccharose : solution appelée « pur saccharose » dans les tableaux suivants

- 100% lactose : solution appelée « pur lactose » dans les tableaux suivants

- 75% saccharose + 25% poids lactose : solution appelée « en mélange » dans les tableaux suivants

Les solutions sont séparées en quatre, et le pH est ajusté avec de l'acide sulfurique, en visant les quatre pH suivants : 1 ,5 ; 2,0 ; 2,5- ; 3,0. On prend un aliquot puis on sépare en deux chacune des 4 solutions pour tester deux conditions de stérilisation : (la stérilisation ici se fait en même temps que l’hydrolyse des disaccharides).

- conditions (1 ) : 1 10°C pendant 35 minutes - conditions (2) :121 °C pendant 20 minutes

Les résultats sont les suivants :

Après stérilisation, on observe visuellement une coloration des solutions pour des pH inférieurs à 2,0, que ce soit avec le saccharose ou avec le lactose, et quelles que soient les conditions (1 ) ou (2) choisies. On dose les sucres résiduels après stérilisation/hydrolyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC selon l’acronyme anglo-saxon)

Ces résultats sont détaillés dans les deux tableaux ci-dessous :

- le tableau 1 indique le pourcentage d’hydrolyse du saccharose pour les différentes solutions, selon qu’elles ont été stérilisées selon les conditions (1 ) ou (2) - le tableau 2 indique le pourcentage d’hydrolyse du lactose, de façon analogue au tableau 1

[Table 1]

[Table 2]

On constate que :

- à 121 °C, avec les conditions (2), le saccharose est totalement hydrolysé en glucose + fructose, quel que soit le pH parmi les quatre valeurs de pH testées,

- à 110°C, avec les conditions (1 ), le saccharose est totalement hydrolysé, dès que le pH est inférieur ou égal à 2,5.

Ces tests démontrent donc qu’on peut hydrolyser en totalité ou en quasi-totalité du saccharose en milieu acide, en choisissant un pH fortement acide (au plus 5, de préférence au plus 4, de préférence au plus 3,5 ou 3), une température élevée permettant de réaliser la stérilisation en même temps, et cela dans une durée de 20 minutes, donc de façon rapide.

On constate aussi que l’hydrolyse du lactose ne se fait pas, ou peu, sauf à adopter un pH très acide, d’au plus 2.

Exemples

On décrit tout d’abord le procédé de production d’enzymes utilisé pour illustrer l’invention à l’aide des exemples qui vont suivre.

Ces exemples concernent la deuxième variante de l’invention avec hydrolyse du saccharose par un hydrolysat hémicellulosique (appelé aussi « jus de sucres en C5 » ou « jus de C5 »).

La souche

La souche de champignon utilisée dans les exemples suivants est décrite dans le brevet WO2015/193587 : c’est le variant référencé 130G9 (SEQ ID No. 7 en acide nucléique, SEQ ID No. 8 en polypeptide dans le tableau 1 de ce brevet) de Trichoderma reesei. Elle sera désignée par la suite par le terme « la souche ». Elle ne possède pas le gène de l’invertase et n’a pas la capacité d’assimiler le saccharose.

La phase de préculture La phase de préculture de la souche est réalisée de la façon suivante : La souche est mise en préculture dans un Fernbach pendant 72 h à 30°C et sous agitation à une vitesse d’agitation de 150 rpm.

Composition du milieu de préculture :

Dans un Fernbach :

- 62, 5mL de milieu 4N (composition donnée ci-dessous)

- 1 ,25g de phtalate de dipotassium

- 1 g de « cornsteep » (protéines de maïs), disponible commercialement auprès de la société Roquette sous la dénomination commerciale Solulys.

- quantité suffisante : 200 mL d’eau distillée

Le milieu minéral (dit « milieu 4N ») a la composition suivante : KOH 1 ,66 g/L, H3PO4 85 % 2 mL/L, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 2,8 g/L, MgSO ₄ , 7 H ₂ O 0,6 g/L, CaCI ₂ 0,6 g/L, MnSO ₄ 3,2 mg/L, ZnSO ₄ , 7 H ₂ O 2,8 mg/L, CoCI ₂ 10 H ₂ O 4,0 mg/L, FeSO ₄ , 7 H ₂ O 10 mg/L

Le pH est ajusté à 5 avec de la soude avant stérilisation.

Dans une fiole séparée :

- 8,5 g de glucose dans 50 mL d’eau distillée

Les cultures en bioréacteurs :

La phase de croissance

La préculture est transférée dans 4 bioréacteurs de 1 ,5 L agités mécaniquement de type CSTR (acronyme anglo-saxon pour « continuous stirred-tank reactor », c’est-à-dire un réacteur à cuve agitée continue), avec un volume d’ensemencement de 10% (v/v).

Composition du milieu de culture :

- 400 mL de milieu 4N

- 320 mL de glucose à 37,5 g/L soit une concentration initiale en glucose de 15g/L

- 1 g de cornsteep Roquette

- 80 mL issus de la préculture en Fernbach

Le pH est maintenu à 4,4 par l’ajout d’une solution d'ammoniaque à 5,5 N. La pO ₂ (concentration en O ₂ dissous exprimée par rapport à la concentration à saturation) est régulée à 40% par l’agitation. La température est stabilisée à 27°C.

La phase de production Après consommation du glucose, la phase de production démarre par l’induction avec l’ajout en continu d’une solution de sucre à environ 400 g/kg, à un débit de 1 ,25 mL/h. Le pH est régulé à 4 et la température à 25°C.

Les solutions de fed-batch sont préparées en dissolvant du lactose et du saccharose ou du glucose dans une solution d’hydrolysat hémicellulosique issu d’une paille prétraitée par explosion à la vapeur en conditions acides. Cet hydrolysat hémicellulosique, dit jus « BHS 7.3 », est obtenu après lavage à l’eau d’une paille prétraitée à 185°C pendant 5 minutes après imprégnation à l’acide sulfurique (acidité de 1 ,8%).

La composition du jus BHS 7.3 est donnée dans le tableau 3 ci-dessous.

L’acronyme MS pour Matière Sèche correspond à la partie solide d’un mélange liquide/solide qui est soluble dans le liquide + la partie solide insoluble dans le liquide en question

L’acronyme MSI, pour Matière Sèche Insoluble, ne comprend que la partie solide insoluble dans le mélange liquide/solide.

[Table 3]

Les compositions des solutions sont détaillées ci-dessous :

Exemple 1 : Témoin avec glucose + lactose (non stérilisé)

On a préparé une solution de 1 kg en dissolvant, dans 450 g de jus BHS 7.3, 330 g de glucose monohydrate, 120 g d’eau et 100 g de lactose (le lactose en tant que substrat inducteur). La dissolution se fait dans un bêcher à température ambiante à l’aide d’un barreau aimanté. La solution obtenue n’est pas stérilisée. Il s’agit du témoin positif.

On comprend par « température ambiante » dans tout le présent texte une température comprise usuellement entre 10 et 30°C, généralement entre 15 et 25°C, et dans le cas présent vers 20°C.

Exemple 2 : Utilisation du saccharose + lactose (sans stérilisation) On a préparé une solution de 1 kg en dissolvant, dans 450 g de jus BHS 7.3, 300 g de saccharose, 150 g d’eau et 100 g de lactose. Il n’y a pas d’étape de chauffage pour hydrolyser le saccharose à pH acide. La solution de fed-batch est maintenue à température ambiante. Celui-ci va s’hydrolyser partiellement et lentement tout au long des 215 heures d’expérience.

Exemple 3 : Chauffage saccharose+ jus de C5 pour l’ hydrolyser puis ajout lactose à la solution (sans stérilisation)

On a préparé une solution de 900 g en dissolvant, dans 450 g de jus BHS 7.3, 300 g de saccharose + 150 g d’eau, puis on chauffe la solution à 1 10°C pendant 20 minutes, puis on ajoute en condition non stérile 100 g de lactose.

Exemple 4 : Utilisation du Saccharose et du lactose avec stérilisation

On a préparé une solution de 1 kg en dissolvant, dans 450 g de jus BHS 7.3, 300 g de saccharose + 150 g d’eau-i- 100 g de lactose, puis on procède à un chauffage (autoclavage) à 120°C et 20 minutes de la solution. La solution est stérile (limite les risques de contaminations) et le saccharose est hydrolysé en glucose et fructose.

Exemple 5 (comparatif) : Utilisation du saccharose + lactose sans hydrolyse acide du saccharose

On a préparé une solution de 1 kg en dissolvant, dans 450 g d’eau, 300 g de saccharose, 150 g d’eau et 100 g de lactose, puis on procède à un chauffage (autoclavage) à 120°C et 20 minutes de la solution. La solution est stérile. Il n’y a donc pas ici de mise en contact du saccharose avec un milieu acide préalablement à son introduction dans le bioréacteur. La solution de fed-batch est maintenue à température ambiante.

Le suivi

Sur les prélèvements effectués quotidiennement, les mesures suivantes ont été réalisées :

- Détermination de la biomasse par filtration sur membrane

- Dosage du sucre résiduel par HPLC

- Dosage des enzymes extracellulaires par la méthode de Lowry après précipitation au TCA et standard BSA, après séparation du microorganisme par filtration ou centrifugation

Les activités cellulolytiques sont déterminées par :

- L'activité papier filtre (UPF : unité papier filtre), qui permet de doser l'activité globale du cocktail enzymatique : endoglucanases et exoglucanases

- L'activité aryl p-glucosidase, pour les activités spécifiques.

L'activité UPF est mesurée sur papier Whatman n° 1 (Procédure recommandée par la commission biotechnologique IUPAC) à la concentration initiale de 50 g/L : on détermine la prise d'essai de la solution enzymatique à analyser qui libère l'équivalent de 2 g/L de glucose (dosage colorimétrique) en 60 minutes. Le principe de l'activité papier filtre est de déterminer par dosage au DNS (acide dinitrosalicylique) la quantité de sucres réduits issue d'un papier Whatman N°1 .

Le substrat utilisé pour déterminer l'activité aryl p-glucosidase est le p-nitrophenyl-B-D- glucopyranoside (PNPG). Il est clivé par la B-glucosidase qui libère le p-nitrophenol. Une unité d'activité aryl p-glucosidase est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour produire 1 pmol de p-nitrophenol à partir de PNPG par minute et est exprimé en lU/mL.

Les activités spécifiques sont obtenues en divisant les activités exprimées en lU/mL par la concentration en protéines. Elles sont exprimées en lU/mg. Les cultures se sont bien déroulées jusqu’au terme des expérimentations.

La figure 1 représente le suivi de la concentration en g / 1 en champignons dans le bioréacteur en fonction du temps en heure. Le temps t=0 correspondant au démarrage du procédé, comprenant une première phase de croissance des champignons de 24 heures, avec une alimentation du bioréacteur en substrat carboné (que du glucose comme mentionné plus haut) en une fois, dite alimentation batch, puis une deuxième phase de production des enzymes, avec une alimentation du réacteur en substrat carboné dite alimentation n fed-batch, selon les compositions définies plus haut (alimentation progressive selon une fréquence d’ajouts donnée). La courbe avec les losanges correspond à l’exemple 1 (témoin), la courbe avec des carrés à l’exemple 2, la courbe avec les triangles correspond à l’exemple 3, la courbe avec des ronds pleins à l’exemple 4, et la courbe avec des ronds vides à l’exemple 5 (comparatif). La figure 2 représente le suivi de la concentration en g / 1 en enzymes, dans le bioréacteur en fonction du temps en heure, le temps t=0 correspondant au démarrage du procédé, avec les mêmes conventions que pour la figure 1 (24 heures de croissance, puis production) pour les exemples 1 à 5.

Pour les cinq fermentations, comme on le voit des figures 1 et 2, la production d’enzymes des exemples 3 et 4 avec saccharose hydrolysé avant l’expérience est identique à celle de l’exemple 1 qui est le témoin (avec glucose). Quant à l’exemple 5, on voit qu’il conduit à une production de champignons et d’enzymes bien moindres que les autres exemples, ce qui démontre que, dans ce cas, le saccharose non hydrolysé n’est pas assimilé par les champignons, et que la croissance des champignons et la production d’enzymes n’est due qu’à la présence de lactose dans la solution de fed-batch.

En ce qui concerne l’exemple 2, avec le saccharose hydrolysé sans chauffage: il produit moins d’enzymes que les autres exemples, mais cependant en quantité comparables avec eux, ce qui est surprenant. En regardant les dosages finaux du sucre résiduel, on constate qu’il y a une accumulation de saccharose au cours du temps non consommé, qui explique la moindre performance de production. Toutefois, si le saccharose n’était pas du tout hydrolysé dans la solution de fed-batch, la concentration finale en saccharose aurait été théoriquement égale à 86 g/L (au lieu de 27 g/L), car la souche testée ne possède pas l’invertase et n’est donc pas en mesure de consommer le saccharose. Le dosage final de sucres de la solution de fed-batch maintenue à température ambiante tout au long de l’expérience après 215 heures contient finalement très peu de saccharose : 50 g/L au lieu des 350 g/L ajoutés initialement.

Le pH acide de la solution de fed-batch a permis l’hydrolyse du saccharose, tout comme lorsqu’on procède à l’hydrolyse avec chauffage (stérilisation), mais à une vitesse plus lente.

La figure 3 représente, pour cet exemple 2, un graphe, avec en abscisse la durée en heure, en ordonné la concentration du saccharose dans la solution de fed-batch (à gauche du graphe) en g/l, et dans le bioréacteur (à droite du graphe) en g/l également, le temps t=0 correspondant au démarrage du procédé, avec les mêmes conventions que pour es figures 1 et 2 (24 heures de croissance, puis production)

La courbe avec des ronds correspond à l’évolution de la concentration en saccharose dans la solution de fed-batch mesurée dans sa cuve de stockage (en connexion fluidique avec le bioréacteur afin de l’alimenter).

La courbe avec des carrés correspond à l’accumulation de saccharose théorique dans le bioréacteur. La courbe avec des triangles correspond à l’accumulation de saccharose mesurée dans le bioréacteur.

En supposant que le saccharose ne s’hydrolyse que dans la cuve où est la solution de fed- batch, et non dans le bioréacteur qui est à pH 4, et en utilisant la mesure de l’accumulation de saccharose au cours du temps dans le bioréacteur, on peut ainsi estimer la cinétique d’hydrolyse du saccharose dans la solution de fed-batch.

On voit ainsi que, dans ces conditions, il a fallu environ une semaine pour hydrolyser totalement le saccharose dans sa cuve de stockage à température ambiante.

Les activités p-glucosidase et UFP spécifiques sont indiquées dans le tableau 4 ci-dessous pour les exemples 1 à 5. Elles sont toutes du même ordre, quelle que soit la fermentation, ce qui indique que les enzymes produites sont de qualité équivalente.

[Table 4]

Le tableau 5 ci-dessous regroupe pour les exemples 1 à 5 les vitesses spécifiques de production d’enzymes q _p . Celle -ci est calculée en divisant la vitesse de production de protéines exprimée en g/L/h par la concentration en microorganisme (comme cela est connu de l’homme de l’art). Elles sont du même ordre pour les fermentations des exemples 1 à 4, mais environ 2 fois plus faible pour l’exemple 5, ce qui indique que le manque de sucre assimilable n’a pas permis d’obtenir de bonnes performances de production.

[Table 5]

L’analyse HPLC des solutions de fed-batch en fin de fermentation confirme que le lactose de l’exemple 4 n’a pas été dégradé (concentration « 100 g/L), après autoclavage ou sans autoclavage, et que le saccharose est totalement hydrolysé en glucose et fructose après autoclavage, grâce au pH fortement acide de la solution, égal à 2,9.

Une expérience complémentaire a été réalisée en préparant une solution de fed-batch analogue à celle de l’exemple 2. Cette solution a été divisée en deux parties : une partie incubée à 20°C pendant 215 heures, et une partie incubée à 50°C pendant 215 heures. Il apparaît qu’après 24 h à 50°C, tout le saccharose est hydrolysé, alors que 60% du saccharose est hydrolysé après 215 h à 20°C.

De ces différents exemples et résultats, on comprend que l’invention consistant à hydrolyser le saccharose en milieu acide permet de le rendre assimilable par la souche de champignon sans avoir à la modifier génétiquement pour lui adjoindre le gène de l’invertase. On comprend aussi que cette hydrolyse est favorisée/accélérée par un chauffage, soit à température modérée, soit à température plus élevée, notamment si on a également besoin de stériliser la solution de substrat avant de la mettre en contact avec la souche.

L’invention offre une grande flexibilité de mise en oeuvre,

- en utilisant deux types de milieu acide possible : fait par ajout d’acide, ou obtenu directement par un jus de sucres en C5 obtenu lors de la conversion de la biomasse, et qui est de fait au pH suffisamment acide pour cette hydrolyse,

- et en utilisant des conditions opératoires (notamment la température d’hydrolyse) différentes selon les besoins (haute température si stérilisation requise, température plus basse ou même à la température ambiante si on peut laisser l’hydrolyse se faire plus lentement, pH qui peut être choisi d’autant plus acide que la température est moins élevée...).