PROCESO DE PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS DERIVADOS DE LA HEMICELULOSA

Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del campo de estudio e investigación de la producción de derivados de hemicelulosa a partir de materiales lignocelulósicos.

Estado de la técnica

La biomasa vegetal está compuesta por tres fracciones: celulosa, hemicelulosa y lignina. Debido a la presencia de estos compuestos, también es empleado el término lignocelulósico para definir a aquellos materiales que comprenden estas fracciones. Cada una de estas fracciones puede ser aprovechada de forma individual para la obtención de variedad de productos.

La amplia disponibilidad de estos materiales que, en muchos casos, son subproductos resultantes de actividades productivas agrícolas y forestales, su consideración como materias primas renovables, y la diversidad de derivados que pueden obtenerse a partir de cada una de las fracciones antes indicadas ha dado lugar a un creciente interés en la extracción de estas fracciones y su transformación en otros compuestos en los últimos años.

De manera específica, la hemicelulosa es un conjunto heterogéneo de polisacáridos distintos de la celulosa. Como hemos mencionado, estos compuestos están, de forma natural, en las paredes celulares de la mayoría de las plantas, junto con la celulosa. A diferencia de la celulosa, formada por glucosa, la hemicelulosa está formada por distintos monosacáridos, tales como xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, glucosa y por ácidos carboxílicos como ácido glucurónico, galacturónico y acético.

En el caso particular de los residuos agrarios procedentes del cultivo y transformación de cereales, la fracción hemicelulósica está compuesta mayoritariamente por arabinoxilano (polímero de xilosa con un número variable de ramificaciones de arabinosa), que presenta una estructura química según la Fórmula I.

Fórmula I

El arabinoxilano es de gran interés industrial, ya que a partir de él es posible obtener compuestos alimentarios funcionales de alto interés comercial y tecnológico como son los xilooligosacáridos (XOS) o arabinoxilooligosacáridos (AXOS) con propiedades prebióticas, o los polímeros derivados del arabinoxilano (ADPs) con propiedades como agentes texturizantes, entre otras.

Se entiende por xilooligosacáridos (XOS) a aquel conjunto de compuestos formados por una cadena lineal de un número variable de monómeros de D-xilopiranosa (entre 2 y 10), unidos por enlaces glicosídicos p-(1 ,4). Los xilooligosacáridos pueden presentar estructuras diversas debido a la presencia de ramificaciones variables, dependientes del material de origen y el tratamiento de obtención de los xilooligosacáridos, constituidas por unidades de L- arabinofuranosil, D-glucuronopiranosil, 4-O-metil D-glucuronopiranosil y acetilo. Se denomina arabinoxilooligosacáridos (AXOS) a aquellos XOS que contienen una o varias ramificaciones de arabinosa. El principal interés de los XOS y AXOS radica en sus efectos beneficiosos para la salud, validados por distintos ensayos in vitro e in vivo, y en su utilidad como ingrediente funcional prebiótico. Como se menciona en Ríos-Ríos, K. L., Dejonghe, W., Vanbroekhoven, K., Rakotoarivonina, H., & Rémond, C. (2021). Enzymatic Production of Xylo-oligosaccharides from Destarched Wheat Bran and the Impact of Their Degree of Polymerization and Substituents on Their Utilization as a Carbon Source by Probiotic Bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 69(44), 13217-13226., el efecto prebiótico es mayor a medida que disminuye el grado de polimerización de los XOS. En este sentido, en esta invención se consideran XOS-AXOS a aquellos oligosacáridos con grado de polimerización entre 2 y 6 (X2-X6).

Por su parte, los polímeros derivados de arabinoxilano (ADPs) son aquel conjunto de compuestos químicamente semejantes a los xilooligosacáridos, que presentan más de 6 unidades de xilosa, los cuales presentan baja actividad prebiótica. Las tres fracciones presentes en la biomasa vegetal (celulosa, hemicelulosa y lignina) suelen formar una estructura muy compacta por lo que, para su uso de forma individual, deben ser tratados para disminuir la interacción existente entre estas fracciones.

Actualmente, existen diferentes procesos de tratamiento para el fraccionamiento, extracción de la hemicelulosa y producción de sus derivados (XOS y ADPs).

De manera general, los procesos más eficientes y más empleados para el fraccionamiento son aquellos que emplean altas temperaturas, altas presiones o compuestos orgánicos.

Ejemplos de este tipo de procesos son pretratamientos hidrotérmicos, procesos de explosión de vapor, pretratamientos ácidos, como se describen, por ejemplo, en las siguientes patentes:

- W02015107413A1 , donde se describe un proceso secuencial químico-enzimático continuo, para el fraccionamiento de la holocelulosa en arabinoxilooligosacáridos, xilooligosacáridos y celooligosacáridos a partir de desechos agrícolas;

ES2364307A1 , donde se describe un procedimiento de obtención de xilooligosacáridos sustituidos procedentes del salvado de trigo, consistente en el tratamiento de esta materia prima con agua a temperatura suficientemente alta para permitir la extracción de al menos parte de las hemicelulosas;

EP3299394A1 , donde se describe un método para producir un xilooligosacárido modificado con un tratamiento hidrotérmico a alta presión y una temperatura de 160°C o superior, seguida de una hidrólisis enzimática; y

CN1680415A, donde se describe la producción de xilooligosacáridos a partir de la mezcla de carozos de maíz en polvo y agua, empleando un tratamiento ácido a alta temperatura seguida de una hidrólisis enzimática de la fracción soluble extraída.

Estos procesos pueden conseguir extraer hasta un 98% de la hemicelulosa existente en el material lignocelulósico por lo que el rendimiento total de estos procesos es elevado.

Sin embargo, las condiciones requeridas por estos tratamientos hacen que dichos procesos sean considerados poco sostenibles desde el punto de vista medioambiental. Además, a pesar de los buenos rendimientos en la extracción de la hemicelulosa, estos procedimientos suelen conllevar la generación de compuestos indeseados que actúan como contaminantes de los productos finales obtenidos. Para el empleo de derivados de fracción hemicelulósica como ingredientes alimentarios funcionales, las impurezas en el producto final son especialmente indeseables por el carácter tóxico (algunas de ellas como el furfural e 5- hidroximetilfurfural), y deben eliminarse incorporando etapas adicionales de purificación complejas y costosas.

En este sentido, existen numerosas limitaciones en el empleo de estos compuestos como aditivos alimentarios. A modo de ejemplo, el Reglamento (UE) No 231/2012 fija el límite de furfural en aditivos, y específicamente en Goma guar, en máximo un 1 mg/kg. También se ha informado de efectos tóxicos de 5-Hidroximetilfurfural (HMF) con dosis de más de 75 mg/Kg de peso corporal (Ulbricht, R.J.; Northup, S.J.; Thomas, J.A. A Review of 5- Hydroxymethylfurfural (HMF) in ParenteralSolutions. Toxicol. Sci. 1984, 4, 843-853).

La generación de xilosa es también un efecto indeseado durante la producción de XOS por no considerase un compuesto prebiótico. De acuerdo con ello, el Reglamento 2018/1648 de la Comisión, por el que se autoriza la comercialización de xilooligosacáridos como Nuevo Alimento define como contenidos máximos de xilosa un 1 , 5 o 15% en función de la calidad del ingrediente.

Por todo ello estas metodologías de fraccionamiento resultan poco adecuadas para este tipo de aplicaciones, donde el grado de impurezas presentes en el producto final es relevante.

Alternativamente se han desarrollado metodologías más suaves que obtienen rendimientos más bajos de extracción de la hemicelulosa. Estos procesos se caracterizan por presentar un factor de severidad inferior, que puede ser calculado como sigue:

(1) SF = log donde t es el tiempo de incubación (en minutos) y T es la temperatura (en °C).

Así, se puede definir un proceso suave como aquel llevado a cabo a temperaturas ¡guales o inferiores a 100°C y que presenta un factor de severidad inferior a SF < 2. De manera comparativa, los procesos que emplean un pretratamiento con elevada temperatura presentan un SF > 2,7.

De acuerdo con estas metodologías, se logra una extracción inferior al 50% de la hemicelulosa del material. Sin embargo, la mejor calidad de los productos (en términos de pureza debido al menor contenido porcentual de productos de degradación, como el furfural e 5- hidroximetilfurfural, y monosacáridos, como la xilosa) hace de estos procesos una alternativa interesante frente a los empleados comúnmente para la producción de derivados de hemicelulosa.

En estos casos, al igual que en los tratamientos más intensos, se puede añadir una etapa posterior a la extracción de la hemicelulosa para la reducción del tamaño del polímero (aquí denominados ADPs - arabinoxylan derived polymers) a XOS con efecto prebiótico.

Prueba de ello es la patente W02007128025A1 , donde se describe la producción de XOS a través de un tratamiento hidrotérmico o a través de un tratamiento enzimático a partir de un xilano extraído por hidrólisis alcalina en frío (del inglés Cold Alcaline Extraction - CAE). De acuerdo con esta segunda opción, se alcanzó una producción de XOS de 780 mg XOS por gramo de xilano extraído a través del tratamiento enzimático, aunque con rendimientos bajos de extracción del xilano desde el material de partida.

Otro ejemplo de este tipo de proceso se puede encontrar en el artículo Chapla, D., Pandit, P., & Shah, A. (2012). Production of xylooligosaccharides from corncob xylan by fungal xylanase and their utilization by probiotics. Bioresource Technology, 115, 215-221. En este documento, se describe el proceso de producción selectiva de xilooligosacaráricos (XOS), usando xilanasa parcialmente purificada de Aspergilus foetidus MTCC 4898, tras un pretratamiento de extracción alcalina. De acuerdo con este documento, la temperatura óptima para la producción de estos xilooligosacáridos fue 45°C, dado que un aumento en la temperatura suponía una reducción en la actividad de la enzima, lo que se traduce en una importante limitación del proceso.

Como alternativa, existen procedimientos basados en la aplicación de enzimas sobre el sólido a temperaturas moderadas, si bien estos procesos presentan un rendimiento bajo en comparación con los primeros. De echo, Yegin, S. (2022). Microbial xylanases in xylooligosaccharide production from lignocellulosic feedstocks. Biomass Conversion and Biorefinery), afirman que la hidrólisis enzimática directa sobre residuos agroindustriales está aún en una fase de desarrollo.

En esta línea se encuentra, sin embargo, el proceso descrito en el artículo Rodríguez-Sanz, A., Fuciños, C., Torrado, A. M., & Rúa, M. L. (2022). Extraction of the wheat straw hemicellulose fraction assisted by commercial endo-xylanases. Role of the accessory enzyme activities. Industrial Crops and Products, 179, 114655. En este artículo se describe un procedimiento que comprende un pretratamiento de extracción alcalina en frío (CAE). En este sentido, el procedimiento comprende un pretratamiento con NaOH (10 y 100 g/L) durante 90 minutos a 40°C y 340 rpm en una incubadora orbital, con una relación de 1 :14 paja de trigo: líquido. Posteriormente, se llevó a cabo una neutralización con HCI al 37% con un pH de 5,5 - 7,0 de la parte sólida resultante del tratamiento con NaOH y un lavado con agua destilada hasta que la conductividad fuese inferior a 25 pS/cm. Por último, se secaron las muestras en un horno a 70°C. Tras una esterilización inicial de 1h a 100°C, se realizó la hidrólisis enzimática de la parte sólida pretratada, empleando tres tipos de cócteles enzimáticos (Ultraflo L, Shearzyme 500 L, y Pentopan® Mono Concentrate) a una temperatura de 40°C y un pH de 5,0 en una mezcla de reacción constituida por 1 g de la fracción sólida pretratada, resuspendida en 42 mi de una disolución amortiguadora y 200 U de actividad de endo- xilanasa. El mejor resultado se logró con Ultraflo, que permitió la extracción de cerca del 60% de la hemicelulosa del sólido, pero generó una cantidad relevante de monómeros de xilosa y arabinosa indeseables para la generación de XOS y AXOS para aplicaciones como prebióticos.

A modo de resumen de todo lo expuesto puede decirse que las distintas soluciones descritas hasta el momento para la extracción de hemicelulosa y producción de sus derivados (XOS y ADPs) presentan múltiples inconvenientes.

En primer lugar, existen soluciones que emplean un tratamiento hidrotérmico, con un elevado factor de severidad debido a la elevada temperatura que se requiere en este tipo de tratamientos, por lo que son procesos poco sostenibles con el medioambiente. Adicionalmente, estos procesos generan una mayor presencia de impurezas en los productos resultantes, lo que limita su empleo en algunos sectores, como el alimentario. También se emplean métodos de extracción alcalina a temperaturas moderadas para la solubilización de la hemicelulosa sin compuestos de degradación, que generan bajos rendimientos de extracción, como también ocurre con los procesos basados en el empleo de enzimas directamente sobre los materiales sólidos, aún en fases incipientes de desarrollo.

De manera general, además, los procesos enzimáticos actuales están diseñados para la generación de XOS y AXOS como productos finales, no habiendo sido descrito ningún proceso basado en el empleo de enzimas que permita producir polímeros derivados de arabinoxilano (ADPs) y/o xilooligosacáridos de bajo peso molecular (XOS y AXOS) de forma dirigida . Con el objeto de superar de forma conjunta las limitaciones reportadas en el estado del arte con respecto a los rendimientos de extracción de la hemicelulosa y la generación de compuestos tóxicos, y permitir la obtención dirigida de dos productos diferenciados derivados de la hemicelulosa (XOS-AXOS y ADPs), se propone un nuevo proceso para la producción de derivados de hemicelulosa.

Descripción de la invención

La presente invención describe un nuevo proceso para la producción de productos derivados de la hemicelulosa.

Se trata de un proceso sostenible y eficiente, con baja demanda energética, basado en el empleo de enzimas, que permite dirigir la generación de productos derivados de la hemicelulosa hacia la obtención de compuestos de bajo peso molecular (XOS-AXOS) o de medio-alto peso molecular (ADPs) en función de la temperatura del proceso mejorando, además, los rendimientos de extracción de la hemicelulosa obtenidos por los tratamientos suaves actuales.

El proceso comprende dos etapas: a) un pretratamiento alcalino del material lignocelulósico para generar un sólido hidrolizable, y b) una hidrólisis enzimática del sólido resultante de la etapa a) para la extracción de la hemicelulosa y la producción dirigida de productos derivados de la hemicelulosa de bajo (XOS-AXOS) y medio-alto peso molecular (ADPs).

Gracias al proceso descrito en la presente invención, se logra la producción dirigida de xilooligosacáridos y arabinoxilooligosacáridos (XOS y AXOS) y de polímeros derivados del arabinoxilano (ADPs, del inglés arabinoxylan-derived polymers), a partir de materiales lignocelulósicos, (preferiblemente de cereales debido a su composición), de una manera sostenible y eficiente, por lo que su aplicación puede ser de gran interés para el sector dedicado al aprovechamiento de estos materiales lignocelulósicos y a la producción de estos compuestos.

El pretratamiento alcalino a baja temperatura propuesto en la etapa a) de la presente invención se lleva a cabo para obtener un sólido hidrolizable por las endo-xilanasas, evitando la extracción de la fracción de la hemicelulosa y la generación de compuestos tóxicos de degradación de carbohidratos. A diferencia de los procedimientos hidrotérmicos existentes, la etapa a) del proceso de producción de productos derivados de hemicelulosa según la presente invención presenta un factor de severidad inferior a 2, preferiblemente en el intervalo entre - 0,5 y 2. En este sentido, el tratamiento alcalino, por ejemplo, empleando 10g/L NaOH, durante 90 min a 40°C presenta un factor de SF = 0,2. Al incluir el tratamiento de autoclave previo a la hidrólisis enzimática, el factor de severidad máximo conseguido en todo el proceso puede alcanzar un valor en torno a SF = 1 ,7.

En una realización preferente del pretratamiento, el pretratamiento alcalino se puede iniciar con una etapa previa de acondicionado del material sólido mediante secado a temperaturas moderadas (preferiblemente inferiores a 70°C) para reducir la humedad a valores en el intervalo 3 - 10 %, y/o mediante triturado o molienda para reducir el tamaño de partícula a una longitud o diámetro inferiores, preferiblemente entre 0,5 - 5 cm.

A continuación, se lleva a cabo un tratamiento alcalino del material sólido lignocelulósico a temperatura moderada diseñado para reducir el contenido en lignina, romper los entrecruzamientos entre polímeros de xilano debidos a puentes diferulato y eliminar los restos acetilo del arabinoxilano. Para ello, se trata dicho material lignocelulósico con 2-20 g/L de sosa cáustica (NaOH) durante un tiempo no superior a 90 min y a una temperatura en el intervalo 30 - 50°C, preferiblemente en 35 - 45°C, y más preferiblemente a 40°C, en proporción de 30 - 75 g de paja/L de NaOH.

El sólido resultante de este tratamiento mantiene, preferiblemente, entre un 70-100% del contenido inicial de la hemicelulosa. Este sólido se somete a un tratamiento de ajuste del pH, preferiblemente en el intervalo 4-10, que se selecciona en función del pH óptimo de la enzima que se empleará en la etapa b) de la hidrólisis enzimática según la presente invención. Para ello se adiciona la cantidad necesaria de una disolución concentrada de ácido apto para uso alimentario, tal como el HCI.

Una vez alcanzado el pH deseado, se elimina el sobrenadante por filtración o centrifugación y se lava el sólido pretratado con agua para eliminar el exceso de sales generado como resultado de la etapa de ajuste de pH. Adicionalmente, el sólido húmedo resultante puede someterse a un proceso de secado, por ejemplo, en una estufa con aireación a una temperatura entre 60 - 70°C para su almacenamiento y posterior uso. Esta fracción sólida será destinada a la hidrólisis enzimática de la etapa b) de la presente invención. Por último, se aplica al sólido pretratado un tratamiento térmico a temperatura no superior a 100°C por 1h con el objetivo de asegurar la máxima hidratación del material y de abrir la matriz lignocelulósica a fin de facilitar el acceso de las enzimas a las zonas más internas de las partículas del sólido. Además, este tratamiento térmico permite esterilizar el material y reducir la posibilidad de contaminación posterior del material.

Para llevar a cabo este tratamiento térmico el sólido pretratado se suspende nuevamente en el medio liquido seleccionado (agua o tampón) para llevar a cabo la hidrólisis enzimática en una proporción sólidoJíquido de 1 :40-1 :100.

Una vez que se ha pretratado la materia prima sólida lignocelulósica, la etapa b) del proceso propuesto en la presente invención para la producción dirigida de productos derivados de hemicelulosa es la hidrólisis enzimática de dicha fracción sólida resultante.

Respecto al tratamiento de hidrólisis enzimática, el estado de la técnica establece que 45°C es la temperatura máxima y óptima para llevar a cabo la hidrólisis enzimática sobre hemicelulosas solubles cuando se emplean xilanasas mesófilas, ya que a partir de esa temperatura se produce la inactivación enzimática a causa del incremento de la temperatura.

En contraposición, la presente invención establece que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo sobre la parte sólida de la materia prima pretratada a temperaturas entre 55-80°C.

El resultado de esta hidrólisis enzimática es la generación de un sobrenadante líquido compuesto por una mezcla de composición variable de: xilooligosacáridos y arabinoxilooligosacáridos (XOS y AXOS) de bajo peso molecular con grado de polimerización comprendido entre 2 y 6 unidades de xilosa con efecto prebiótico, polímeros derivados de arabinoxilano (ADPs) de alto peso molecular con grado de polimerización superior a 6 con propiedades tecnológicas, y un sólido remanente rico en celulosa.

Al trabajar en estas condiciones se logra evitar la formación de compuestos de degradación térmica de carbohidratos (furfural e HMF), o reducir su generación a concentraciones inferiores a 5 mg/L, los cuales actúan como contaminantes del producto final, especialmente en productos destinados al sector alimenticio. Por tanto, al no presentar este tipo de contaminantes, los productos derivados de la hemicelulosa obtenidos mediante el proceso descrito en la presente invención presentan unas características adecuadas para un uso como ingredientes alimentarios. Como se conoce del estado de la técnica, la hidrólisis enzimática en intervalos de temperatura de 35-45°C (preferentemente a 40°C) sobre el sólido pretratado permite la obtención de un sobrenadante líquido compuesto por XOS y AXOS y una baja proporción de monómeros.

Sin embargo, el incremento de la temperatura de la hidrólisis de intervalos de 35-45°C a 55- 80°C permite modificar el perfil de pesos moleculares de los productos derivados de la hemicelulosa, dando lugar a polímeros derivados de arabinoxilano (ADPs), además de XOS- AXOS y una baja proporción de monómeros. Así, la presente invención establece preferentemente una hidrólisis a temperaturas más altas para la obtención simultánea de XOS-AXOS y ADPs, empleando endo-xilanasas termófilas o mesófilas termoestables. Así, en una realización preferente para la obtención de estos productos, la hidrólisis enzimática se lleva a cabo con 200-500 ll/g solido pretratado con enzimas mesófilas durante 2-50 h.

Además de este efecto modulador de la temperatura de la etapa de hidrólisis enzimática sobre el perfil de pesos moleculares de los productos finales (no descrito hasta el momento), este aumento de la temperatura de la etapa enzimática ofrece dos ventajas.

Por un lado, el incremento de la temperatura favorece la actividad de las endo-xilanasas activas en un rango amplio de temperaturas, es decir, la actividad es más elevada a una temperatura superior. En otras palabras, considerando dos procesos de hidrólisis, uno a 40°C y otro a 65°C con las mismas unidades de enzima, se requiere un menor aporte de enzimas, en peso, en el proceso a 65°C a las necesarias en el proceso a 40°C para lograr una misma actividad enzimática. Del mismo modo, el aumento de la actividad enzimática con la temperatura reduce considerablemente los tiempos de operación, lo que supone una ventaja importante en los procesos industriales.

Por otro lado, el incremento de la temperatura de la hidrólisis enzimática a un intervalo entre 55-80°C, supone un mayor acceso a la hemicelulosa presente en el material lignocelulósico a tratar. Es decir, el empleo de una temperatura alta tal y como se describe en la presente invención genera una mayor apertura en la estructura de la lignocelulosa y las endo-xilanasas pueden acceder mejor a los enlaces del xilano resultando en un mayor rendimiento de extracción de hemicelulosa con respecto a los resultados descritos en el estado de la técnica.

Por tanto, el efecto obtenido por el incremento de la temperatura aplicada durante el tratamiento enzimático con endo-xilanasas sobre las características de los productos finales con altos rendimientos de extracción supone un nuevo concepto para los procesos de obtención de productos derivados de la hemicelulosa, tales como XOS, AXOS y/o ADPs.

La obtención de XOS-AXOS a baja temperatura y la aparición ADPs a alta temperatura se puede apreciar desde el inicio de la reacción, si bien el bajo rendimiento de la extracción en las etapas tempranas del proceso puede suponer un menor interés en la reducción del tiempo de operación.

El efecto de modulación del perfil de pesos moleculares de los productos derivados de la hemicelulosa se produce desde el inicio de la reacción independientemente del tiempo de hidrólisis, de tal manera que en el intervalo de temperaturas de 35-45°C no se detecta la generación de ADPs en ningún momento, mientras que en el intervalo de temperaturas de 55- 80°C se detectan ADPs a todos los tiempos, incluidos tiempos largos de reacción, si bien el bajo rendimiento de la extracción en las etapas tempranas del proceso puede suponer un menor interés en la reducción del tiempo de operación.

En una realización preferente de la presente invención para la producción de mezclas de XOS- AXOS y ADPs, la etapa enzimática se lleva a cabo con enzimas termófilas a 55-80°C, y en una realización alternativa y se lleva a cabo con enzimas mesófilas termoestables dentro del intervalo 55-65°C. Para la realización alternativa, las enzimas mesófilas termoestables serán añadidas de forma sucesiva cada 2-5 h de hidrólisis, con un número total de 2-10 adiciones para paliar los efectos de pérdida de actividad alta temperatura.

Las enzimas mesófilas son aquellas que poseen óptimos de actividad a temperaturas en el intervalo 25-45°C, mientras que las enzimas termófilas son aquellas que trabajan a temperaturas mayores de 45°C y suelen presentar óptimos de actividad a temperaturas entre 60-80°C. En este sentido, es destacable que, en algunos casos, las enzimas mesófilas son también aceptables para llevar a cabo el proceso según la presente invención a temperaturas en el intervalo 55-65°C debido a que presentan una termoestabilidad parcial suficiente para permitir que sean activas durante un cierto intervalo de tiempo.

Inicialmente, se puede considerar que una mayor cantidad de enzima acelera el proceso de obtención de derivados de hemicelulosa. Sin embargo, se debe tener en cuenta también que una mayor cantidad de enzima a un mismo tiempo de hidrólisis produce una mayor cantidad de monómeros, que pueden ser indeseables para posteriores usos. Así, en una realización preferente de la presente invención, se establece una dosis de enzima en un intervalo de 200- 500 ll/g de sólido pretratado, siendo las unidades de actividad enzimática medidas a la temperatura empleada en el proceso. La selección de las unidades enzimáticas de trabajo conlleva la variación del tiempo hidrólisis, siendo variables importantes a controlar para evitar la generación exhaustiva de xilosa (contaminantes),

De este modo, en una realización preferente de la presente invención, la hidrólisis enzimática se lleva a cabo durante un tiempo de 2 a 50 horas. El tiempo de hidrólisis se ve influenciado por las unidades enzimáticas adicionadas, siendo que, a más unidades enzimáticas, menos tiempo total de hidrólisis. El control de estas variables es necesario para evitar la generación de monómeros a tiempo largos de reacción.

Independientemente de la enzima y dosis empleadas, y en paralelo al efecto de la temperatura sobre el perfil de productos mayoritarios generados en cada caso, el incremento de temperatura provoca de forma general un incremento significativo del rendimiento global de extracción de xilano. Esto se traduce en rendimientos globales del proceso más bajos cuando este se dirige hacia la producción mayoritaria de XOS y AXOS dado que en estas condiciones se aplican temperaturas bajas entre 35-45°C.

Para conseguir satisfacer ambos fines: altos rendimientos globales de utilización del xilano y altos porcentajes de XOS y AXOS en el producto final, en una realización alternativa, el proceso de acuerdo con la presente invención comprende una hidrólisis enzimática en dos etapas.

Así, en un primer paso (B1), la hidrólisis enzimática se lleva a cabo a una temperatura entre 55-80°C con endo-xilanasas termófilas o una endo-xilanasa mesófila termoestable con múltiples adiciones con el objetivo de extraer la mayor cantidad posible de hemicelulosa en forma de ADPs. En la realización alternativa empleando una endo-xilanasa mesófila termoestable es preferible emplear una temperatura comprendida ente 55 y 65°C.

El segundo paso (B2) de la hidrólisis enzimática se realiza a una temperatura inferior, entre 35-45°C, y preferentemente en torno 40°C, empleando endo-xilanasas mesófilas que actuarán preferentemente sobre los ADPs previamente generados para producir finalmente XOS y AXOS como productos mayoritarios finales. En una realización aún más preferente, de manera independiente, cada una de las etapas, B1 y/o B2, se puede llevar a cabo con dosis de enzima de 200-500 ll/g sólido pretratado y por tiempos de 2-50 h.

En una realización aún más preferente, la dosis de enzima será de 200-500 ll/g de sólido pretratado con adiciones sucesivas cada 2-5 h de hidrólisis con un número total de 2-10 adiciones. Esta alternativa es especialmente relevante para un proceso donde se emplea una endo-xilanasa mesófila termoestable a una temperatura entre 55-65°C.

En resumen, a diferencia de las soluciones descritas en el estado de la técnica basadas en tratamientos enzimáticos sobre hemicelulosa soluble para la obtención de derivados del xilano, las cuales emplean una única temperatura moderada que conduce a la generación de xilooligosacáridos y arabinoxilooligosacáridos (XOS y AXOS), bien con bajos rendimientos globales de extracción de la hemicelulosa en ausencia de impurezas o bien con altos rendimientos en presencia de impurezas, el empleo de un proceso según lo descrito en la presente invención, que incluye una etapa de hidrólisis enzimática sobre el sólido pretratado en el intervalo 55-80°C como etapa posterior a un pretratamiento alcalino a baja temperatura, logra dirigir la producción de los productos derivados de la hemicelulosa hacia la generación de ADPs simultáneamente con XOS y AXOS, o bien de XOS y AXOS en ausencia de ADP, con altos rendimientos de extracción y sin generación de co-productos indeseables, lo que supone una ventaja, por ejemplo, para la elaboración de ingredientes para la industria alimentaria con distintas aplicaciones como prebióticos en el caso de XOS y AXOS, o como ingredientes con propiedades texturales en el caso de los ADPs.

Estos ingredientes alimentarios (XOS-AXOS y ADPs) presentes en la fracción liquida serán finalmente separados de la fracción sólida previo a su aplicación según la etapa c) de la presente invención. Así, en una realización preferente, la inactivación enzimática se llevará a cabo con la modificación del pH de la fracción líquida a valores alejados de los óptimos de actividad y estabilidad de la enzima, seguida de un tratamiento físico de filtración o centrifugación para la eliminación del residuo sólido.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una gráfica comparativa de la generación de monómeros (Monom.) de xilosa y arabinosa a partir de la hemicelulosa de la paja de trigo, expresada en mg/g de material pretratado, y su porcentaje respecto al total de la hemicelulosa extraída, para cada una de las condiciones de operación recogidas en la Tabla 1.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de describir la presente invención, se presenta el siguiente ejemplo para la producción de productos derivados de hemicelulosa a partir de un material lignocelulósico, preferiblemente, de cereales.

Específicamente, se empleó paja de trigo de tamaños variables (menores de 3 cm de longitud) como material lignocelulósico. De este modo, 300 g de paja se pretrataron con sosa caustica 10 g/L en una relación sólido líquido 1 :14 en un biorreactor de 5 L. El tratamiento se llevó a cabo durante 90 min a 40°C con agitación y aireación para mantener la paja en suspensión.

A continuación, la parte sólida resultante fue neutralizada con HCI 37% hasta un pH de 6,8, y lavado hasta que la conductividad fue menor a 25 pS/cm. Específicamente, resultó una conductividad de 22 pS/cm. Por último, se llevó a cabo un secado en una estufa a 70°C durante toda la noche.

Una vez lavada la fracción sólida, se aplicó un tratamiento térmico a una temperatura de 100°C durante una hora mientras se suspendía en tampón citrato-fosfato 25 mM pH 5 (para la enzima mesófila comercial Pentopan® Mono Concentrate -PMC-) o pH 6,5 (para la enzima termófila XynA3), medios seleccionados para llevar a cabo la hidrólisis enzimática en una proporción sólidolíquido de 1 :42.

A partir de la fracción sólida pretratada se llevaron a cabo 7 experimentos (E1 - E7) de hidrólisis enzimática cuyas condiciones operativas fueron modificadas: temperatura (40°C- 65°C), enzima empleada (XynA3 y Pentopan® Mono Concentrate -PMC-) y las unidades enzimáticas (200, 400 y 2000 U/g sólido pretratado).

Los resultados de la hidrólisis enzimática se pueden expresar en función del rendimiento de extracción de la hemicelulosa (Rto extr.) y del porcentaje de productos finales (monómeros, XOS-AXOS y ADPs) en la fracción líquida respecto al total de la hemicelulosa extraída.

La hemicelulosa extraída se determinó sometiendo la fracción líquida recogida tras la hidrólisis enzimática a un proceso de hidrólisis con H2SO4 al 4% a 121 °C durante 1 h. Este tratamiento de hidrólisis ácida permite hidrolizar los polímeros complejos de xilano a sus unidades más básicas que lo conforman: xilosa y arabinosa, principalmente. Los monómeros liberados se separaron y cuantificaron mediante cromatografía líquida (Agilent 1200 HPLC system, Waldbronn, Alemania) utilizando una columna Transgenomic ICSep ION-300 column (300 x 7.8 mm) (Chromtech, San Jose, CA, USA), como se encuentra descrito en Rodríguez-Sanz, A., Fuciños, C., Torrado, A. M., & Rúa, M. L. (2022). Extraction of the wheat straw hemicellulose fraction assisted by commercial endo-xylanases. Role of the accessory enzyme activities. Industrial Crops and Products, 179, 114655. La concentración total de monosacáridos obtenida permite cuantificar los mg de hemicelulosa extraída por gramo de paja pretratada, siguiendo la ecuación 2. El porcentaje de hemicelulosa extraída con respecto a la composición total del material pretratado se calculó según la ecuación 3.

[X]AT es la concentración de xilosa cuantificada después de la hidrólisis ácida aplicada al liquido obtenido tras el tratamiento enzimático (expresado en mg / mL)

[A]AT es la concentración de arabinosa cuantificada después de la hidrólisis ácida aplicada al liquido obtenido tras el tratamiento enzimático (expresado en mg / mL)

[F]AT es la concentración de furfural (expresado en mg / mL). Este producto se genera como resultado del tratamiento de hidrólisis ácida necesario para la cuantificación de la hemicelulosa extraída

1 ,56 es el factor de conversión que permite cuantificar la xilosa que se ha transformado en furfural

V se refiere al volumen de reacción (expresado en mL)

W se refiere al peso de materia prima pre-tratada (expresado en g)

292,9 mg xilano por gramo de solido es la composición total en hemicelulosa del material pretratado empleado para la hidrólisis enzimática

Las impurezas (monómeros de xilosa y arabinosa) se cuantificaron analizando directamente la fracción líquida recogida tras la hidrólisis enzimática con el mismo método cromatográfico anteriormente descrito. Los mg de impurezas por gramo de paja pretratada ([Monom.]), y su porcentaje (% Monom,) respecto a la hemicelulosa extraída se calcularon según la ecuación 4 y 5, respectivamente.

[M]EH es la suma de las concentraciones de xilosa o arabinosa (expresados en mg I mL) presentes en el líquido resultante tras la hidrólisis enzimática

V se refiere al volumen de reacción (expresado en mL)

W se refiere al peso de materia prima pre-tratada (expresado en g)

Finalmente, los xilooligosacáridos (XOS) y arabinoxilooligosacáridos (AXOS) se analizaron directamente tras la hidrólisis enzimática con la columna Rezex RNO-Oligosaccharide Na+ (4%) (200 x 10 mm) (Phenomenex, Alcobendas, España), con un detector de índice de refracción. Específicamente se identificaron y cuantificaron: (xilobiosa (X2), xilotriosa (X3), 3 ² - a-L-arabinofuranosil-xilobiosa (A ³ X), xilotetraosa (X4), 2 ³ -a-L-arabinofuranos¡l-x¡lothosa (A ² XX), xilopentosa (X5), 2 ³ ,3 ³ -di-a-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A ^Z3 XX) y xilohexosa (Xe). A través de esta metodología se cuantificaron los mg de XOS-AXOS obtenidos por gramo de solido pretratado y el porcentaje de XOS-AXOS obtenidos con respecto al xilano total extraído (ecuación 6 y 7, respectivamente). Los ADPs se determinaron por diferencia entre el total de hemicelulosa extraída y la composición con respecto a monómeros y XOS-AXOS, siguiendo la ecuación 8.

[X _n ]EH es la concentración de cada XOS o AXOS determinado (en mg/mL) al final de la hidrólisis enzimática y antes del tratamiento ácido.

CFn es el factor de conversión a xilosa para cada XOS cuantificado teniendo en cuenta la liberación de agua en la formación del enlace glucosídico: CFx2= 1 ,06; CFX3, A3X= 1 ,09; CFx4, A2XX= 1 , 10; CFx5 y X6, A2.3XX = 1 , 1 1

W se refiere al peso de materia prima pre-tratada (expresado en g) y

V se refiere al volumen de reacción (expresado en mL).

Los resultados del tratamiento de la hidrólisis enzimática se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Resultados de los distintos experimentos de hidrólisis enzimática de la paga de trigo pretratada

¹ Las unidades enzimáticas se cuantifican a a temperatura del proceso.

² Se consideran impurezas los monómeros de xilosa y arabinosa.

³ PMC: Pentopan® Mono concentrate. Endo-xilanasa comercial mesófila termoestable

⁴ XynA3. Endo-xilanasa termófila.

Con respecto a los resultados del tratamiento de hidrólisis, cabe destacar, además, que en ninguno de los 7 ejemplos considerados en la Tabla 1 se detectaron concentraciones de los dos compuestos de degradación de carbohidratos (furfural y HMF) que se generan en los procesos térmicos.

El empleo de endo-xilanasas puras evita además la generación de otros monómeros como puede ser la glucosa a partir de la degradación de la celulosa. Estos resultados se pueden apreciar gráficamente en la Figura 1 , donde se muestra una gráfica comparativa de la generación de monómeros ([Monom.]) de xilosa y arabinosa a partir de la hemicelulosa de la paja de trigo (expresada en mg/g de material pretratado y en porcentajes respecto al total de la hemicelulosa extraída).

En primer lugar, se muestran los experimentos E1 y E2, que reflejan el proceso descrito en el intervalo de temperatura 35-45°C, específicamente en una realización preferente a 40°C. Estos procesos emplean una enzima mesófila, (Pentopan® Mono Concentrate - PMC), y alcanzan un rendimiento de extracción de hemicelulosa en torno al 50% tras 24 horas, siendo el producto resultante principalmente xilooligosacáridos, con una composición por encima del 85% del producto, y el resto impurezas constituidas por una mezcla de monómeros de xilosa y arabinosa. Este resultado se observa con mayor claridad en el experimento E2, donde la cantidad de unidades de enzima se multiplicó por 10 (de 200 a 2000 ll/g paja), mejorándose ligeramente el rendimiento de extracción, pero desplazando el proceso de producción de xilooligosacáridos a la generación de monómeros de xilosa y arabinosa. En este experimento E2 se aprecia cómo se incrementa la cantidad de impurezas del producto, entendiéndose estas impurezas como los monómeros de xilosa y arabinosa. En ninguno de estos dos experimentos (E1 y E2) se detecta la generación de ADPs.

Cuando se comparan los experimentos a 40°C (experimentos E1 y E2) con aquellos llevados a cabo en una única etapa en el intervalo de 55-80°C, específicamente a 65°C, e independientemente de la enzima (experimentos E3 a E6) de acuerdo con la presente invención, se observa la generación de ADPs, lo que conlleva una disminución del % de XOS generados. Así, la representación de los XOS en el líquido resultante de la hidrólisis enzimática disminuye de un 87-94% a un 52-66% con el aumento de la temperatura, independientemente del resto de condiciones y rendimientos de extracción alcanzados.

Adicionalmente, se puede apreciar cómo, independientemente de las demás condiciones de operación, aquellos procedimientos según la presente invención, que comprenden una etapa de hidrólisis a una temperatura de trabajo de 65°C, generan menos cantidad de monosacáridos, en relación porcentual a los productos totales generados (Figura 1). Esto se traduce en productos finales de mejor calidad tanto en el caso de producción de XOS-AXOS como de ADPs, dado que los monómeros no se consideran prebióticos ni presentan las propiedades tecnológicas.

Cuando se compara el efecto de la dosis de enzima, se observa también como la temperatura es un factor determinante en la mejora del rendimiento de extracción de la hemicelulosa. Así, mientras en los experimentos E1 y E2 correspondientes a la operación a 40°C el incremento de 10 veces de la dosis de enzima (de 200 a 2.000 II) produce una mejora del rendimiento de extracción del 16%, duplicar la dosis de enzima de 200 a 400 U a 65°C con la misma enzima mesófila termoestable (experimentos E3 y E4) provoca una mejoría del rendimiento del 56%. Del mismo modo, los experimentos E5 y E6, correspondientes al trabajo a 65°C con una enzima termófila, el aumento de la dosis de enzima al doble permite mejorar el rendimiento un 38%.

En cualquier caso, de acuerdo a los experimentos realizados, se muestra que el tratamiento enzimático en el intervalo descrito en la presente invención, específicamente ejemplarizado a 65°C con la xilanasa mesofila termoestable, se generan ADPs, aunque con un bajo rendimiento de extracción de la hemicelulosa. Por tanto, en una realización preferente del proceso de obtención de derivados de hemicelulosa en una etapa según la presente invención se emplea una xilanasa termófila. Este tipo de xilanasa ¡guala el rendimiento obtenido con la xilanasa mesófila a 40°C y 2.000U, con una dosis de enzima 10 veces menor.

Aunque el incremento de la cantidad de unidades de enzima empleadas en cada caso obtiene el máximo rendimiento de extracción posible, este parámetro no es el único factor del proceso a tener en cuenta. El incremento de la cantidad de unidades de enzima supone un aumento en la generación de monómeros, los cuales son considerados como impurezas para ciertas aplicaciones. De este modo, en una realización preferente, el proceso según la presente invención se lleva a cabo con una unidad enzimática superior a 200 ll/g de material lignocelulósico, preferentemente en el intervalo 200-500 ll/g sólido pretratado, teniendo en cuenta el tiempo total de hidrólisis.

De la misma forma influye el tiempo de hidrólisis, donde mientras más avanzada está la hidrólisis, mayor es el rendimiento de extracción (a excepción de E3 y E4), pero también lo es la producción de monómeros. Así, en una realización preferente, independientemente de la endo-xilanasa empleada, y teniendo en cuenta las unidades enzimáticas adicionadas, el tiempo de la etapa de hidrólisis enzimática está comprendido entre 2 y 50 horas.

En el caso de los experimentos con la enzima mesófila termoestable a 65°C (experimentos E3 y E4) el tiempo no permite mejorar el rendimiento de extracción debido a la pérdida de actividad enzimática a esa temperatura tras 2 h de hidrólisis. Por ello, en la presente invención se establece como una realización alternativa el empleo de enzimas mesófilas termoestables en el intervalo de 55-65°C con sucesivas adiciones enzimáticas cada 2-5 h que permitan corregir la inactivación enzimática y continuar con la hidrólisis hasta resultados similares a los obtenidos con la enzima termófila, en términos de extracción de la hemicelulosa y composición de XOS-AXOS y ADPs.

El efecto de la adición consecutiva puede apreciarse en el experimento E7, donde además de añadir dos dosis de la enzima mesófila termoestable PMC, se ha vahado la temperatura de hidrólisis. Así, se realiza una primera etapa a 65°C durante 7 h y una segunda a 40°C por 17 h. Como se aprecia en la Tabla 1 , el empleo de la hidrólisis en dos etapas con una temperatura alta y una baja logra un importante incremento del rendimiento de extracción alcanzado con la enzima mesófila en tan solo una etapa a 65°C (experimento E3), además de generar un perfil de productos intermedio entre las dos situaciones definidas (experimentos de una etapa a 40°C -E1 a E2- y 65°C -E3 a E6-), generando tanto XOS como ADPs.

En este caso, la incorporación adicional de la segunda etapa logra compensar la limitación en la extracción de las enzimas mesófilas a 65°C (Experimentos E3 y E4) y eleva el rendimiento de extracción por encima del 50%, manteniendo la modulación de los productos generados, al obtener una producción de ADPs en torno al 25%, un valor muy superior a los obtenidos en los procesos actuales con una única etapa de 40°C. Por tanto, como se refleja en estos ejemplos, cuando la hidrólisis se realiza a alta temperatura, independientemente de la enzima, dosis o tiempo empleados, se obtiene una modulación de la composición desplazada a la producción de ADPs en detrimento de la generación de XOS prebióticos, poniendo de manifiesto de nuevo la ventaja que supone el trabajo a altas temperaturas frente a los procesos divulgados en la actualidad.