Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren der allgemeinen Formel I

R _T -CH-COOH (I) ¹ I NH„

wann

R _τ einen gegebenenfalls durch Hydroxygruppen, Mercaptogruppen, ^• Halαgenatome, Aminogruppen, Carbonylgruppen oder Guanidino- gruppen substituierter und/oder durch Sauerstoffatome, Stick¬ stoffatome oder Schwefelatome unterbrochener Alkylrest mit maximal 12 Kohlenstoffato en bedeutet, und im Falle der Mercaptoverbindungen der Formel I auch deren Dithioverbindungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Mikroorganismus Nocardia spec. DSM 3306 oder Enzyme desselben auf ein D,L-Imida- zolidindion-Derivat der allgemeinen Formel II

R.-CH C=0

¹ I I HN^ NH (II), _.

C0^ ^• worin

R, die obengenannte Bedeutung besitzt oder im Falle der Mercaptoverbindungen der Formel II auch auf deren Dithio¬ verbindungen einwirken läßt.

Die D,L-Imidazolidindion-Derivate der allgemeinen Formel II und demzufolge auch die daraus hergestellten L-Aminosäuren der allgemeinen Formel I können als Substituenten .. bei¬ spielsweise die Methylgruppe, die Ethylgruppe, die Propyl-

gruppe, die 1-Methylethylgruppe, die Butylgruppe, die 1- Methylpropylgruppe, die 2-Methylprαpylgruppe, die 1,1-Di- methylethylgruppe, die Pentylgruppe, die 1-Methylbutylgruppe die 3-Methylbutylgruppe oder die Hexylgruppe tragen. Besonders bevorzugte Alkylgruppen R, sind solche mit maximal 6 Kohlen- sfcαffatomen, wie die Methylgruppe des Verfahreπsprodukts ÄZsnin, die I-Methylethylgruppe des Valins, die 2-Methyl- p;ιrα:pylgruppe des Leucins, die 1-Methylpropylgruppe des Iso- Leuicins oder die Ethylgruppe der α-Aminobuttersäure.

Die Alkylgruppen R, können gegebenenf lls durch Hydroxygruppen, Mercaptogruppen, Halogenatome, Aminogruppen, Carbonylgruppen oder Guanidinogruppen substituiert sein, wobei einfach sub¬ stituierte Alkylgruppen bevorzugt sind, oder durch Sauer- stoffatome (vorzugsweise eins), Stickstoffatome (vorzugsweise eins oder zwei) oder Schwefelatα e (vorzugsweise eins) unter¬ brochen sein. Als Alkylgruppen, die durch Hydroxygruppen oder Mercaptogruppen substituiert sind, seien besonders hervorgehoben die Hydroxymethylgruppe des Serins, die 1- Hydroxyethylgruppe des Threoniπs, die Mercaptomethylgruppe des Cysteins, die 2-Mercaptoethylgruppe des Homocysteins und die 1-Mercapto-l-methyl-ethylgruppe des ß-Thiovalins. Als eine durch ein Schwefelatom unterbrochene Alkylgruppe R _τ sei die 2-Methylthioethylgruppe des Methionins hervorgehoben, Alkylgruppen R, , die als Substituenten R, eine Aminogruppe αder eine Guanidinαgruppe tragen sind beispielsweise die 2-Aminoethylgruppe der α,γ-Diaminobuttersäure, die 3-Amino- propylgruppe des Ornithins, die 3-Guanidinopropylgruppe des Arginins und die 4-Aminobutylgruppe des Lysins. Als Oxoalkylgruppen R, kommen vorzugsweise solche in Betracht,

die zusätzlich noch durch eine Hydroxygruppe, Aminogruppe oder Guanidinogruppe substituiert und/oder durch ein Sauer¬ stoffatom oder ein Stickstoffatom - genauer eine Iminogruppe - unterbrochen sind; derartige Gruppen sind beispielsweise die Acetoxymethylgruppe des O-Acetylserins , die 1-Acetoxy- βthylgruppe des O-Acetylthreonins , die Carboxymethylgruppe eher Asparaginsäure, die 2-Carboxyethylgruppe der Glutaminsäure, die 2-Methoxy-2-oxoethylgruppe des ω -Asparaginsäuremono- meethylesters, die 3-Ureidopropylgruppe des Citrulins oder die 3-Guanidino-3-oxo-propylgruppe des Canavanins.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Verwendung des Mikroorganismus Nocardia spec. DSM 3306 durchgeführt. Dieser Mikroorganismus wurde aus Erdproben isoliert, indem man diese mit einem Mineralsalzmedium, welches 5-(2-Methylpro- pyl)-hydantoin als einzige Stickstoffquelle enthielt, versetzte, ineubierte und die gewachsenen Kulturen auf Agarplatten, die ebenfalls 5-(2-Methylpropyl)-hydantoin als einzige Stick¬ stoffquelle enthielten, ausplattete.

De?r erhaltene Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen hinterlegt und erhielt dort die Nummer DSM 3306. Er steht der Fachwelt unwiderruflich zur Verfügung.

Er besitzt taxonomisch folgende Eigenschaften:

Koloniemorphologie rund, unregelmäßiger Rand, nicht durchscheinend,

∑ellmorphαlogie in jungen Kulturen Stäbchen j.,2 μm dick, 8-20 μm lang, f agmentieren zu Stäbchen von 2-5 μm Länge, unverzweigt, unbeweglich

Gram-Färbuπg gram-positiv Säurefestigkeit negativ Endosporen negativ

SauerstoffVerh ltnis obligat aerob Katalase . positiv Qxidase positiv

Temperaturopti um 30-37°C Citratv rwertung negativ Nitrit aus Mitrat positiv Indolbilduπg negativ Methylrot negativ Voges-Prosicauer negativ "Urease negativ

H^S-Bildung ^■ negativ Gelatineverflüssigung positiv Stärkehydrolyse positiv Zuckerverwertung Säure aus Saccharose, Glucose, Fructose,

Arabinose, keine Gasbildung

NaCl-Toleranz bis 5%.

Aufgrund seiner morphologischen und physiologischen Eigen¬ schaften wurde der Stamm nach "Bergey's Manual of Deter i- ^' πative Bacteriology", 8. Auflage (1974), vorläufig der Gattung Nocardia zugeordnet.

Dieser Mikroorganismus wird unter den üblicherweise ver¬ wendeten Kulturbedingungen in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man der Kultur das Substrat (vorzugsweise in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst) zu und fermentiert, bis eine maximale S±ι.bstratumwandlung erreicht ist.

GTeeάgnete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Wasser, Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Di ethylsulfoxyd.

Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art der verwendeten Fermentationsbedingungen abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Sterαidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden. Während der Fermentation wird der pH-Wert der Fermentationsbrühe vorzugsweise auf einen pH-Wert von 7,5-10 eingestellt.

Andererseits ist es aber auch möglich, den angezüchteten Mikroorganismus beispielsweise durch Filtration oder Zentri- f g.ieren vom Kulturmedium abzutrennen, ihn gewünschtenfalls πrit.tels einer der bekannten Methoden zu immobilisieren und die Fermentation der Substrate mit der isolierten Zellmasse im resting cell Verfahren oder mittels der Immobilisate durchzuführen.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

B eis p ie l 1

Ein 500 ml Erlenmeyerkolbeπ mit 100 ml sterilem Nährmedium enthaltend 0,5 g Fleischextrakt, 0,5 g Peptαn, 0,5 g Hefe¬ extrakt und 0,2 g Natriumchlorid wird mit Nocardia spec. DSM 3306 beimpft und 20 Stunden lang bei 30° C mit 180 Umdrehungen/Minute geschüttelt. Dann trennt man die Zellmasse durch Zentrifugieren ab und wäscht sie mit physiologischer Kochsalzlösung.

400 mg der feuchten Zellmasse werden in 10 ml 0,1 M Tris/HCl- Puffer vom pH 8,5 suspendiert, mit 10 mg 5-(2-Methylpropyl)- hydantoin versetzt und 24 Stunden lang bei 30° C incubiert. Durch Bestimmung mit L-Aminαsäure-Oxidase wird ermittelt, daß 7,9 mg L-Leucin gebildet werden.

Beispiel 2

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden aus 10 mg 5-(l-Methylpropyl)-hydantoin 3,5 mg L-Isoleucin gebildet.

Beispiel 3

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden aus 10 mg 5-(l-Methylethyl)-hydantoin 2,5 mg L-Valin gebildet.

Beispiel 4

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden aus 10 mg

5,5 '-Dithiobismethyleπ-bis-hydantoin 2,1 mg Cystin gebildet.

Beispiel 5

Ein 2 1 Erlenmeyerkolben mit 500 ml sterilem Nährmedium enthaltend 2,5 g Fleischextrakt, 2,5 g Pepton, 2,5 g Hefe-

extrakt und 1 g Natriumchlorid wird mit 50 ml einer 20 Stunden alten Kultur von Nocardia spec. DSM 3306 - hergestellt nach Beispiel 1 - beimpft und 20 Stunden lang bei 30° C mit 180 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Die Zellmasse wird abzentrifugiert und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.

8b g der feuchten Zellmasse werden in 200 ml 0,1 M Tris/HCl- Fuffer vom pH 8,5 suspendiert mit 1,0 g 5-(2-Methylpropyl)- hydantoin versetzt und 24 Stunden lang bei 30° C incubiert. Man zentrifugiert die Zellmasse dann ab und isoliert aus dem Filtrat 660 mg L-Leucin vom Zersetzungspunkt 291° C (aus wäßrigem Ethanol) [α] = + 15,6° (20 ?όige wäßrige Salzsaure) .

Beispiel 6

a) 3,5 g feuchte Zellmasse von Nocardia spec. DSM 3306 - hergestellt nach Beispiel 5 - werden in 31,5 g einer 2 ?όigen wässrigen Lösung von Natriumalginat suspendiert und in 500 ml einer 0,1 M wässerigen Lösung von Cal- ziumchlorid-Dihydrat getropft.

Er) 1,5 g des so erhaltenen Immobilisats werden in 10 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer vom pH 8,5 suspendiert mit 10 mg 5(2-Methylpropyl)-hydantoiπ versetzt und 18 Stunden lang bei 30° C incubiert. Durch Bestimmung mit L-Amino- säure-Oxidase wird ermittelt, daß 7,8 mg L-Leucin gebildet werden .

B ejspiel 7

Unter den Bedingungen des Beispiels ^' 6 b werden aus 10 mg 5-(l-Methylpropyl)-hydantoin 3,2 mg L-Isoleucin gebildet.

Beispiel 8

Unter den Bedingungen des Beispiels 6 b werden aus 10 mg 5-(l-Methyl-ethyl)-hydantoin 2,1 mg L-Valin gebildet.

Beispiel 9

Unter den Bedingungen des Beispiels 6 b werden aus 10 mg 5,5'-Dithiobismethylen-bis-hydantoin 4,1 mg Cystin gebildet,