CAMPO DA INVENÇÃO

[ 1 ] A presente invenção refere-se a um processo integrado para produção de pectina e xilo-oligossacarideos a partir de residue de casca de laranj a . Os xilo- oligossacarideos produzidos se destacam pela sua capacidade pré-biótica e antioxidante e , ainda, são passíveis de serem aplicados na indústria de alimentos e/ou farmacêutica .

[ 2 ] A presente invenção se insere no campo da engenharia de alimentos , mais precisamente na área de biotecnologia .

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[ 3 ] Cascas de frutas citricas representam um dos residues mais subaproveitados do setor industrial . Após a extração do suco das frutas , o res idue de casca pode atingir mais de 50% do peso úmido da fruta . Cascas de laranj a são constituídas por 20% de matéria seca ( açúcar, celulose , hemicelulose , pectina e D-limoneno ) e 80% de água . O reaproveitamento deste residue tem sido focado principalmente na extração de D-limoneno e , em menor proporção , pectina . Tradicionalmente , estas cascas são secas e os compostos de interesse são extraídos com ácidos , e uma pequena porção de casca seca é aproveitada na alimentação animal . Entretanto , a maior parte deste material é descartada de forma inadequada no solo devido aos custos de secagem e uso de ácidos , gerando séria poluição orgânica por conta da elevada demanda de oxigênio biológico para sua decomposição (Balu et al . , 2012 ; Orti z-Sanchez et al . , 2021 ) . [ 4 ] Uma alternativa para se contornar o problema é o reaproveitamento das frações de pectina e lignocelulose . A pectina pode compor até 50% do peso seco deste residue , e em torno de 5% de xilana . Este teor mais baixo de xilana presente na casca de laranj a pode ser compensado pelo alto volume de residue gerado todos os anos nas indústrias de sucos . Além disso , ao se extrair a fração de pectina, o residue sólido remanescente pode conter até 50% do peso seco de xilana, tornando este residue sólido da extração de pectina uma fonte abundante para produção enzimática de xilo- oligossacarideos (XOS ) .

[ 5 ] Xilo-oligossacarideos são fibras alimentares parcialmente digeridas por humanos . As porções não digeridas servem de alimento para as bactérias intestinais , atuando como prebióticos , estimulando o crescimento e a atividade de bactérias benéficas do intestino , aumentando a produção de ácidos graxos voláteis antiulcerogênicos , inibindo o crescimento de bactérias nocivas e retardando a absorção de carboidratos no trato gastrointestinal , sendo relatado um efeito benéfico no diabetes mellitus tipo 2 . Os benefícios proporcionados aos sistemas digestivo e imunológico levam a potencial aplicação em alimentos funcionais . Uma vantagem do XOS é a possibilidade de produção a partir de residues agroindustriais por hidrólise de xilana .

[ 6 ] A produção industrial de pectina é custosa devido a grande quantidade de água, etanol e energia ( elétrica, vapor e refrigeração ) . A produção industrial de XOS também é um desafio devido aos custos relacionados com o uso de enzimas e álcalis (KOH ou NaOH) durante a etapa de pré-tratamento . Apesar disso , a indústria de alimentos demanda uma alta produção de pectina, devido ao seu uso como agente espessante em diversos produtos como geleias, iogurtes e manufatura de bioembalagens , e de XOS para a produção de alimentos funcionais (Amorim et al . , 2019; Tsouko et al . , 2020) . A literatura reporta o aproveitamento de cascas de laranja para a produção de óleo essencial, pectina, biogás e XOS (Ortiz-Sanchez et al . , 2021; Praveen et al . , 2017; Teigiserova et al . , 2022; Tsouko et al . , 2020) .

[7] Entretanto, informações relacionadas às combinações economicamente viáveis que possibilitem o aproveitamento simultâneo de várias frações deste residue são escassas, especialmente relacionadas à produção de XOS. O desenvolvimento de um processo integrado dentro do conceito de uma biorefinaria deve acessar a eficiência energética e de custos por meio da otimização das etapas sequenciais do processo, visando reduzir tempo e consumo de água e reagentes, mantendo a integridade do material residual de uma etapa para ser utilizado na etapa seguinte.

[8] Desta forma, devido à otimização dos métodos utilizados para a extração de pectina, extração de xilana e hidrólise enzimática de xilana, o principal diferencial da presente invenção é o rendimento em xilo-oligossacarideos e a pureza de pectina obtida.

[9] A presente invenção otimizou o método de extração com ácido citrico já aplicado na indústria para a produção de pectina, adaptando-o para o residue de casca de laranja. Esta otimização também rendeu um residue sólido mais rico em xilana passível de ser utilizado para produção enzimática de xilo-oligossacarideos. Além disso, durante o processo de extração de pectina, também foram produzidas quantidades consideráveis de xilo-oligossacarideos, que podem ser recuperados e purificados da fração liquida da extração de pectina.

[10] Alguns documentos do estado da técnica descrevem processos para produção de pectina e xilo-oligossacarideos, adicionalmente, alguns dos processos ocorrem a partir de resíduos de casca de laranja, tais como:

[11] O documento cientifico intitulado "VALUE ADDITION OF ORANGE FRUIT WASTES IN THE ENZYMATIC PRODUCTION OF XYLOOLIGOSACCHARIDES" refere-se ao uso de biomassa de laranja no processo de preparo de xilo-oligossacarideos (XOS) . Adicionalmente, são reveladas as mesmas condições de processo e o uso de enzimas endo-xilanases comerciais.

[12] Todavia, a presente proposta aproveita a fração de pectina para a produção de uma xilana mais pura, enquanto o documento utiliza o residue integral de casca de laranja para a extração de xilana e produção de XOS. Além disso, o referido documento analisa a produção de XOS para um curto tempo (6h) , o que não representa um rendimento industrial. O presente processo otimiza as condições coerentes com uma aplicação industrial, a maior pureza da xilana extraída rende mais de 9g/L XOS. Além disso, XOS foram liberados durante o processo de extração de pectina, no total, produziu-se aproximadamente 10g/L de XOS. Foi utilizada uma menor concentração de etanol e álcali, 2,5% hidróxido de potássio (KOH) , apresentando menor impacto ambiental e garante uma maior recuperação da xilana extraída de casca de laranja, por outro lado o referido documento utiliza hidróxido de sódio (NaOH) , ao invés de KOH, que não é o melhor álcali para extrair xilana de casca e bagaço de laranja (uma vez que cada biomassa requer um tratamento diferente) .

[13] 0 referido documento cientifico não deixa claro como foi realizado o planejamento experimental, não foi construída uma superfície resposta estatisticamente significativa para ser considerada uma otimização do processo. A melhor condição apresentada pelo documento produziu 0, 630g/L de XOS . Ainda, não foi apresentada a caracterização quimica do material utilizado e a pureza obtida para a xilana extraída, a fim de se calcular o balanço de massa e eficiência do processo. É apresentada uma curva de calibração de xilose, mas o documento não deixa claro qual a concentração de enzima (massa de proteína) e a concentração de substrato (xilana extraída) foi utilizada para os ensaios de hidrólise.

[14] O documento cientifico intitulado "PRODUÇÃO DE XILO-OLIGOSSACARÍ DEOS POR HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE XILANAS" refere-se o uso de enzimas comerciais, como a Shearzyme , para avaliar a atividade de endo-p-xilanases . Ainda, o referido documento revela que endo-p-1 , 4-xilanases foram utilizadas na hidrólise da xilana em xilo-oligossacarideos . O estudo aponta que endo-p-xilanases da Shearzyme tem um baixo valor de Km e é capaz de hidrolisar de forma mais eficiente a xilana.

[15] Contudo, o referido documento analisa a cinética de produção de XOS a partir de substratos comerciais, variando-se pH e temperatura. A caracterização e os parâmetros cinéticos das enzimas comerciais foram determinados utilizando xilana de faia (substrato comercial, não um residue agroindustrial) , não sendo utilizada a casca de laranja. O melhor rendimento em XOS foi obtido com xilana extraída de casca de arroz, 5, 67 g/L XOS .

[16] No referido documento, o método 2 para extração de xilana utiliza maior concentração de álcali e maiores tempos (12h a 60°C + 3h a 100°C) . Para a acidif icação, foi utilizado ácido clorídrico (HC1) , que reage com NaOH e precipita grande quantidade de cloreto de sódio (NaCl) , o que pode inibir a atividade enzimática, exige etapas adicionais de lavagem de xilana para a remoção do excesso de sal, além de ser mais caro ($0,l/kg) . Já o método 1 não apresenta potencial para aplicação industrial. Não fica clara a pureza da xilana extraída. Não fica claro o volume de enzima adicionado às reações.

[17] Ressalta-se que a presente proposta utiliza um resíduo agroindustrial abundante e de custo baixo. A quantidade de enzima usada é a menor concentração necessária para atingir a saturação enzimática. 0 método de extração de xilana requer menores tempo e concentração de álcali, e utiliza ácido acético na acidif icação, apresentando baixa toxicidade e menor impacto ambiental, não forma NaCl e é mais barato ($0, 045/kg) . Na presente invenção apresenta ainda quantidades de XOS obtidas são superiores ao do documento, além de haver o duplo aproveitamento do resíduo, para produção de pectina e XOS.

[18] 0 documento científico intitulado "PRODUÇÃO DE XILOOLIGOSSACARÍ DEOS A PARTIR DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓS ICOS E FUNGOS FILAMENTOSOS" refere-se ao uso de resíduos de materiais lignocelulósicos para obtenção de xilo- oligossacarideos como ingredientes prebióticos . Ainda, descreve sobre a hidrólise enzimática e o uso de p-1,4- endoxilanase no processo. [19] No referido documento é aplicada fermentação em estado sólido utilizando casca de arroz como substrato na primeira etapa e posteriormente é aplicada a enzima produzida em uma etapa de hidrólise. Não há extração da xilana, o substrato é usado sem pré-tratamento . A maior concentração de XOS atingida foi 75 mg/g de substrato.

[20] Em relação ao referido documento, quando se trata da produção de oligossacarideos , um dos pontos mais custosos é o downstream para purificação. Na fermentação em estado sólido, o substrato é adicionado ao meio de crescimento do fungo, que secreta diversas enzimas e pigmentos. Ao final do processo, não apenas XOS, mas diversos outros açúcares estarão presentes no meio, além de proteínas do fungo. Em relação à etapa de hidrólise realizada com a enzima produzida por A. brasílíensís, pela análise da composição de XOS ao longo do tempo de hidrólise, a maior produção de XOS aconteceu nas primeiras 3h. A partir deste ponto, houve intensa queda na quantidade de oligossacarideos e produção de xilose, indicativo de atividade de p- xilosidases .

[21] Por outro lado, a presente invenção realiza a etapa de hidrólise enzimática separadamente ao processo de produção da enzima e utilizando um substrato pré-tratado, o que resulta em uma hidrólise mais eficiente, com pouca ou nenhuma presença de contaminantes , sem pigmentos e com alta concentração de XOS. Não há necessidade de uma etapa de purificação, uma vez que o hidrolisado, por ser apenas concentrado por evaporação gera um produto com mais de 80% de pureza em oligossacarideos prebióticos. Ainda, a etapa de pré-tratamento reduz a recalcitrância do material e aumenta a eficiência de hidrólise e facilita a etapa downstream. A maior concentração de XOS atingida por 255 mg/g de substrato.

[22] 0 documento cientifico intitulado "OBTAINING XYLO-OLIGOSACCHARIDES FROM SUGARCANE STRAW USING RECOMBINANT ENDOXYLANASE" refere-se, particularmente, aos xilo- oligossacarideos como uma das classes de prebióticos que pode ser obtida a partir da biomassa lignocelulósica, pela reação de hidrólise dos resíduos agroindustriais .

[23] No referido documento a xilana de cana é extraida com borohidreto de sódio e 24% KOH, ocorre a aplicação de endoxilanase recombinante produzida por Píchía pastoris e a hidrólise é realizada a 1% de sólidos, 65°C. 0 uso de borohidreto de sódio eleva custos de produção e de tratamento dos resíduos. É um produto de uso controlado e tóxico e 24% KOH é uma concentração de álcali elevada que pode inviabilizar economicamente o processo. 0 documento possui as condições de hidrólise ainda não otimizadas e baixa variedade dos XOS produzidos.

[24] Em contrapartida, na presente invenção foi eliminado o uso de borohidreto de sódio, pois o material é pobre em lignina, e reduziu-se o tempo de reação e concentração de álcali para a extração da xilana. As condições de hidrólise foram otimizadas e o melhor resultado foi utilizando a concentração de substrato 2%. 0 material lignocelulósico é mais bem aproveitado, para produção de açúcar f ermentescivel , pectina e XOS.

[25] 0 documento cientifico intitulado "ESTUDO CINÉTICO ENZIMÁTICO DA HIDRÓLISE DE BAGAÇO DE LARANJA" refere-se a hidrólise enzimática (com enzima comercial xilanase da Novozymes) do bagaço de laranja para obtenção de bioprodutos e destaca 0 resíduo do processamento de frutos cítricos possui alto valor agregado devido à sua composição . Esse subproduto é de grande interesse industrial apresentando grande potencial para ser utili zado na obtenção de uma gama produtos através da hidrólise enzimática .

[ 26 ] 0 foco do referido documento é a produção de açúcares f ermentescíveis a partir da hidrólise total de resíduo cítrico , empregando concentrados enzimáticos com diversas atividades ( arabinase, pectidase , xilanase , celulase e glucanase ) . Foram gerados 7 , 34 g/L de açúcares ( concentração medida indireta de absorbância ) . A falta de pré-tratamento da biomassa afeta a eficiência da hidrólise devido à recalcitrância e presença de lignina, diminuindo a quantidade de material acessível às enzimas . Não há discriminação do tipo de açúcar f ermentescível produzido (pentose ou hexose ) , o que impacta a potencial aplicação industrial . 0 produto obtido é de baixo valor agregado no mercado . Ainda, reitera-se que determinar a concentração de açúcar redutor por DNS pode gerar erros de superestimativa pois oligômeros ( também presentes no hidrolisado , uma vez que a degradação não foi completa ) apresentam maior intensidade de absorbância do que monômeros , causando uma medição acima da real .

[ 27 ] A presente proposta aproveita o resíduo cítrico para gerar dois produtos com alto valor agregado nas indústrias de alimentos : pectina e XOS , e como subproduto gera-se açúcar f ermentescível naturalmente presente no material . As etapas de lavagem da casca, extração de pectina com ácido cítrico e extração de xilana com KOH permitem melhor aproveitamento das frações e aumentam a eficiência de hidrólise . Gerou-se 9 g/L XOS ( quanti ficados por HPLC ) , além do aproveitamento da fração de pectina com alto teor de pureza e da produção de açúcar f ermentescivel durante a etapa de lavagem da casca de laranj a ( 24g por 100g de casca ) .

[ 28 ] 0 documento cienti fico intitulado "STRUCTURAL CONS IDERATIONS ON THE USE OF ENDO-XYLANASES FOR THE PRODUCTION OF PREBIOTIC XYLOOLIGOSACCHARIDES FROM BIOMASS" refere-se ao interesse em xi lo-oligossacarideos como prebióticos . Adicionalmente , é discutido que xilo- oligossacarideos podem ser obtidos a partir de grandes frações de biomassa, incluindo subprodutos agrícolas . 0 documento conclui que endoxilanases são enzimas chave e de alto valor para a produção de xilo-oligossacarideos a partir de xilana .

[ 29 ] 0 referido documento é um artigo de revisão que não apresenta resultados de experimentos próprios . 0 documento analisa a estrutura e a função de endoxilanases para a produção de XOS . Não há dados de aplicação , teor de pureza de xilana, concentração de sólidos , balanço de massa e carga enzimática, além de dados de concentração de XOS obtidos após a hidrólise dos residues agroindustriais mencionados . Não há análise das condições de hidrólise e extração de xilana .

[ 30 ] Por outro lado , a presente proposta otimi zou o processo de extração de xilana e etapa de hidrólise enzimática especi ficamente para o aproveitamento da fração hemicelulósica de residue de casca de laranj a, além da fração de pectina e açúcar f ermentescivel . Foram apresentados os devidos dados e balanços de massa para permitir o desenvolvimento de uma análise técnico-económica do processo .

[31] 0 documento cientifico intitulado "SYNERGIC RECOMBINANT ENZYME ASSOCIATION TO OPTIMIZE XYLOOLIGOSACCHARIDES PRODUCTION FROM AGRICULTURAL WASTE" refere- se a hidrólise enzimática da xilana da palha da cana-de- açúcar utilizando endoxilanase para produção de XOS com alta atividade prebiótica como uma possível forma sustentável de reduzir custos enzimáticos e de matéria-prima.

[32] 0 documento descreve uma análise de sinergia de duas enzimas, endoxilanase recombinante e arabinofuranosidase comercial, para otimizar a produção de XOS a partir de hemicelulose de palha de cana. A xilana é extraída com 24% KOH e borohidreto de sódio devido à elevada quantidade de lignina no material (20%) .

[33] A presente invenção, por sua vez, descreve que apenas a enzima endoxilanase é necessária para a produção de XOS a partir de casca de laranja uma vez que a fração hemicelulósica deste residue não é constituída por arabinoxilana, ao contrário da palha de cana, e sim xilana.

[34] A extração de xilana foi otimizada para reduzir a quantidade de KOH utilizado, e não houve o uso de borohidreto de sódio, visto que o teor de lignina da biomassa é baixo (~1%) , não havendo necessidade de potencializar a extração da lignina no processo. Além disso, há a valorização de duas frações do residue agroindustrial: pectina e XOS.

[35] O documento cientifico intitulado "ENDO- XYLANASES AS TOOLS FOR PRODUCTION OF SUBSTITUTED XYLOOLIGOSACCHARIDES WITH PREBIOTIC PROPERTIES" refere-se às endoxilanases . É descrito que as enzimas são capazes de clivar a cadeia de xilana em locais de clivagem determinados pelo padrão de substituição e , assim, produzem di ferentes padrões de produtos de oligossacarideos . Ainda, o referido documento apresenta que a capacidade dos xilo- oligossacarideos da dieta de funcionar como prebióticos em humanos é governada por seus padrões de substituição . As endoxilanases são , portanto , excelentes ferramentas para adaptar os oligossacarideos prebióticos para estimular vários tipos de bactérias intestinais e causar fermentação em di ferentes partes do trato gastrointestinal .

[ 36 ] 0 referido documento é um artigo de revisão de que não apresenta resultados de experimentos próprios . 0 documento analisa a estrutura e a função de endoxilanases para a produção de XOS . Não há dados de rendimento , teor de pureza de xilana, concentração de sólidos e carga enzimática, além de dados de concentração de XOS obtidos após a hidrólise de hemicelulose . A presente proposta, por outro lado , otimiza o processo de extração de xilana e etapa de hidrólise enzimática especi ficamente para o aproveitamento da fração hemicelulósica de residue de casca de laranj a, além de também haver o aproveitamento da fração de pectina . Foram apresentados os devidos dados e balanços de massa para permitir o desenvolvimento de uma análise técnico-económica do processo

[ 37 ] 0 documento cienti fico intitulado "METHOD FOR SEPARATING LIGNIN AND PRODUCING XYLOOLIGOSACCHARIDE FROM LIGNOCELLULOSE ALKALINE OXIDATION PRETREATMENT LIQUID" refere-se um método que utili za lignocelulose para obtenção de xilo-oligossacarideos com hidrólise de xilanases .

[ 38 ] 0 referido documento solubili za a fração hemicelulósica com peróxido de hidrogênio e conta com duas etapas de neutrali zação e hidról ise para produzir XOS . A concentração de XOS obtida é em torno de ~35% . Peróxido de hidrogênio pode não ser a melhor escolha de álcali dependendo da biomassa aproveitada . Neste caso , a xilana de casca de laranj a é mais bem extraída com KOH ao invés de H2O2 . São necessárias duas etapas de neutrali zação ( acidi f icação ) e hidrólise enzimática para a produção de XOS .

[ 39 ] Na presente invenção , é descrito que a biomassa utili zada é pobre em lignina, não havendo necessidade para sua remoção . Pode-se aproveitar a fração de pectina e xilana para gerar dois produtos de alto valor agregado . A eficiência de conversão de xilana em XOS foi maior que 70% . Além disso , há o potencial aproveitamento da fração de celulose remanescente da extração de xilana e dos açúcares f ermentesciveis separados na etapa de lavagem das cascas de laranj a .

[ 40 ] Os documentos cientí ficos , em conj unto , podem revelar um processo para produção de xilo-oligossacarideos a partir de residue de casca de laranj a e que utili za a enzima endoxilanase em reação de hidrólise enzimática, porém di ferem da presente proposta em relação às frações aproveitadas e pré-tratamento . A presente invenção descreve um processo com condições viáveis para aplicação industrial , considerando o uso de reagentes (principalmente KOH, etanol e enzima ) . Assim, o presente processo caracteri zou as frações de pectina extraída e residue sólido para alcançar a condição de melhor recuperação da xilana e aumentar o rendimento . I sso permitiu elevar a pureza da extração de pectina e a conservação da xilana presente no residue sólido . É o processo integrado da presente proposta que rende a elevada produção de XOS , a pureza de pectina, além dos açúcares f ermentesciveis . 0 uso da enzima endoxilanase para a hidrólise enzimática foi deduzido após a caracteri zação do residue sólido da extração de pectina, que indicou a presente de aproximadamente 30% de hemicelulose , o dobro do teor inicialmente presente na biomassa .

[ 41 ] Alguns dos documentos embasam o uso de resíduos agroindustriais para obtenção de xilo-oligossacarideos a partir da hidrólise enzimática empregando p- 1 , 4-endoxilanase para obter XOS , mas di ferem da presente proposta pelo pré- tratamento utili zado para a biomassa . A casca de laranj a apresenta baixo teor de lignina, não sendo necessária grande quantidade de álcali (KOH ou NaOH) e dispensa o uso de borohidreto de sódio para a quebra das ligações éster e remoção da lignina . O uso de KOH se mostrou a melhor opção para a recuperação da xilana de casca de laranj a e foi possivel reduzir a sua concentração para 2 , 5% , reduzindo também o volume de ácido para a neutrali zação (menor custos e descarte de substâncias quimicas ) . O uso de HC1 não é uma alternativa devido à grande quantidade de sal precipitado em conj unto com a xilana extraída, além de ser mais caro que o ácido acético . O sal gerado eleva os custos com as lavagens do material ( desperdício de água e perda de sólidos ) e pode resultar em redução da atividade enzimática na etapa de hidrólise .

[ 42 ] Além disso , o volume de etanol para a precipitação da xilana foi avaliado no presente processo para evitar a precipitação de outras frações de hemicelulose que reduziriam a pureza da xilana extraída, como arabinana e manana . Vale ressaltar que a hidrólise enzimática utili zando endoxilanase não é o único caminho para a produção de XOS . Existem outras metodologias como tratamentos hidrotérmicos e explosão a vapor para a produção de XOS , a depender da biomassa e da estratégia de trabalho . Por isso a caracteri zação da biomassa e de cada fração do processo é importante para a avaliação da viabilidade . A presente proposta aproveita todas as correntes do processo , desde a lavagem para a remoção de açúcares f ermentesciveis , até a extração de pectina e xilana com alto grau de pureza e produção de XOS com baixo teor de xilose .

[ 43 ] Os documentos concluem que endoxilanases são enzimas chave e de alto valor para a produção de xilo oligossacarideos a partir de xi lana, mas essa afirmação depende do tipo de hemicelulose trabalhada . Hemicelulose de grãos é constituída por arabinoxilana, por exemplo , e apenas a endoxilanase não garante bom rendimento em XOS . No caso da casca de laranj a, a fração hemicelulósica é composta por xilana, assim a endoxilanase é suficiente para degradar o material em XOS . Mas esta conclusão advém da caracteri zação quimica do material e do ensaio de saturação e cinética enzimática para se determinar a menor concentração de enzima necessária para este processo em especi fico .

[ 44 ] Além disso , a produção de XOS a partir de casca de laranj a só se mostrou viável após a eficiente extração da pectina, uma vez que a concentração de hemicelulose na casca de laranj a in natura é baixa . A grande quantidade de pectina atrapalha a extração da xilana e deve ser previamente extraida com ácido citrico para aumentar a disponibilidade de xilana . 0 eficiente pré-tratamento da xilana, com redução do uso de KOH e etanol , resulta em um hidrolisado mais limpo e rico em XOS , reduzindo custos na etapa downstream de puri ficação .

[ 45 ] Sendo assim, percebe-se que a produção de XOS a partir de casca de laranj a j á foi documentada no estado da técnica, contudo nenhum dos documentos é capaz de avaliar a extração dos açúcares f ermentesciveis e a pectina para aumentar a disponibilidade da fração hemicelulósica e garantir melhor rendimento na hidrólise enzimática . A concentração de xilana no material in natura é baixa e seria inviável a produção de XOS a partir deste residue em escala industrial sem estas prévias etapas de remoção de açúcar e pectina . Devido a isso , a presente proposta alcançou mais de 9g/L de XOS após a hidrólise de xilana, valor signi ficativamente maior que os demais documentos apontados . As otimi zações das etapas prévias garantem um hidrolisado limpo e livre de compostos inibidores , contribuindo para a redução dos custos com as etapas de puri ficação dos produtos .

[ 46 ] 0 uso de endoxilanase para a produção de XOS j á é de dominio do estado da técnica, mas os volumes e as misturas sinérgicas dependem do material utili zado . É necessária a caracteri zação da fração hemicelulósica e a avaliação das condições de precipitação para garantir um substrato enzimático com maior pureza e menos contaminantes . A presente proposta reduziu a concentração de KOH para a extração de xilana devido à baixa concentração de lignina no material e facilidade de solubili zação de hemicelulose presente no residue sólido . 0 volume de etanol utili zado para precipitar a xilana também foi reduzido para elevar a pureza do material e garantir melhor eficiência de conversão . A presente proposta, além de apresentar alto rendimento em XOS, reduziu o consumo de KOH, etanol e enzima.

[47] Nenhum dos documentos apontados caracterizaram ou aproveitaram todas as frações que a casca de laranja apresenta para avaliar a viabilidade do processo. A presente proposta busca a redução do uso de reagentes e a otimização das etapas de extração e hidrólise para aproveitar a biomassa de casca de laranja como um todo.

[48] Apontadas as diferenças e a relevância da presente proposta em relação ao estado da técnica, percebe- se que a presente proposta é um processo otimizado para o aproveitamento integral do residue de casca de laranja, o qual pode se tornar poluição orgânica caso não seja devidamente processado. As etapas de processamento eficientemente geram três produtos principais: açúcar f ermentescivel e celulose, com potencial aplicação na indústria energética; pectina para aplicação em indústrias de alimentos; e XOS, prebiótico com aplicações tanto nas indústrias de alimentos quanto farmacêuticas.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[49] A presente invenção refere-se a um processo integrado para produção de pectina e xilo-oligossacarideos a partir de residue de casca de laranja. Os xilos oligossacarideos produzidos se destacam pela sua capacidade prebiótica e antioxidante e, ainda, são passíveis de serem aplicados na indústria de alimentos e/ou farmacêutica.

[50] A presente invenção otimizou o método de extração com ácido citrico já aplicado na indústria para a produção de pectina, adaptando-o para o residue de casca de laranja. Esta otimização também rende um residue sólido mais rico em xilana passivel de ser utilizada para produção enzimática de xilo-oligossacarideos . Além disso, durante o processo de extração de pectina, também foram produzidas quantidades consideráveis de xilo-oligossacarideos, que podem ser recuperados e purificados da fração liquida da extração de pectina. 0 residue sólido desta extração foi então aproveitado para a extração da xilana. As condições de extração alcalina para possibilitar uma xilana mais pura para a hidrólise enzimática também foram otimizadas, com significativa redução na concentração de KOH e etanol. A hidrólise enzimática da xilana foi otimizada para a produção de xilo-oligossacarideos, avaliando a concentração de substrato e enzima utilizadas no processo.

[51] A presente invenção, além de produzir pectina com mais de 80% de pureza e 0,7 g/L de xilo-oligossacarideos no processo de extração de pectina, também rendeu mais de 9g/L de xilo-oligossacarideos após 48h de hidrólise de xilana a 50°C e 2% de sólidos, valor que representa mais de 70% de conversão da xilana em xilo-oligossacarideos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[52] Para obter uma total e completa visualização do objetivo desta invenção, são apresentadas as Figuras as quais se faz referências, conforme segue.

[53] A Figura 1 ilustra graficamente o rendimento de extração (barra cinza escura) e pureza da pectina extraída (barra cinza clara) utilizando as proporções 1:20, 1:40 e 1:50 m/v .

[54] A Figura 2 ilustra graficamente a superfície resposta de massa de pectina extraída (A) e recuperação da pectina presente originalmente na biomassa (B) , R 2 > 90%.

[55] A Figura 3 apresenta um fluxograma ilustrando o balanço de massa do processo de extração de pectina e produção de XOS a partir de resíduo de casca de laranja.

[56] A Figura 4 ilustra graficamente a superfície resposta das condições ótimas determinadas para o coquetel Shearzyme .

[57] A Figura 5 ilustra graficamente a curva de saturação enzimática para o coquetel Shearzyme diluído 1:50.

[58] A Figura 6 ilustra, através de um fluxograma, as etapas apresentadas pelo processo integrado para produção de pectina e xilo-oligossacarídeos .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[59] A presente invenção refere-se a um processo integrado para produção de pectina e xilo-oligossacarídeos a partir de resíduo de casca de laranja. Os xilos oligossacarídeos produzidos se destacam pela sua capacidade prebiótica e antioxidante e, ainda, são passíveis de serem aplicados na indústria de alimentos e/ou farmacêutica.

[60] O processo integrado, compreende as seguintes etapas conforme apresentadas pelo fluxograma da Figura 6:

I. Caracterização química;

II. Extração de pectina;

III. Extração de xilana;

IV. Hidrólise enzimática; e,

V. Quantificação de xilo-oligossacarídeos.

[61] Sendo assim, para demonstrar o potencial do referido processo, a presente invenção será mais detalhadamente descrita sob aspecto das etapas realizadas e os seus respectivos parâmetros.

Caracterização química

[62] Na primeira etapa O material foi lavado duas vezes a 40°C durante lh com agitação para remoção de açúcares livres remanescentes da polpa. Após as lavagens, o material foi seco em estufa a 50°C e triturado a partículas 60Mesh ou menores .

[63] A caracterização quimica analisou o teor de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas: 300 mg foram hidrolisados com ácido sulfúrico 72 % (0,3mL) a 30 °C por 1 h, diluidas até 4% (p/v) adicionando 84mL de água destilada e autoclavada a 121 °C por 1 h, arrefecida e filtrada em cadinho de fundo poroso (4-5pm) . A lignina insolúvel foi quantificada como quantidade de sólido insolúvel, obtido a partir da massa de cinzas insolúveis. A lignina solúvel foi medida em meio alcalino a 280nm. O teor de cinzas foi determinado pela queima de 1 g de amostra durante 6 h a 600 °C até peso constante.

[64] A caraterização de pectina seguiu o método colorimétrico utilizando o reagente m-hidroxidif enil e padrão de ácido galacturônico mono hidratado. 1 ml de amostra (ou 1 mg em Iml de água) foi adicionado em béquer de 20ml contendo 5mL de solução 0.0125M tetraborato de sódio em ácido sulfúrico. A solução foi aquecida a 80°C por 6 minutos e esfriada em gelo até temperatura ambiente. 0. ImL de solução 0,15% m-hidroxidif enil em 0,5% NaOH foi adicionado, homogeneizado em vórtex. A leitura foi feita a 520nm, aguardando o maior valor de absorbância.

Extração de pectina

[65] Na segunda etapa do processo, 2g de casca lavada e triturada foram adicionados a 80ml de solução de ácido citrico 2% (pH 2.2) . Um delineamento central composto rotacional (DCCR) avaliou as condições de temperatura e tempo de extração, de 70 a 130°C e 1 a 70 minutos. Após extração, as amostras foram centrifugadas a 9000g e 4°C por 10 minutos e filtradas a vácuo. Ao filtrado, adicionou-se 80mL de etanol, e as amostras foram mantidas a 4°C por 12 horas para precipitação da pectina. Após este periodo, a pectina foi recuperada por centrifugação e seca em estufa. Os sobrenadantes das extrações foram reservados para análise da concentração de xilo-oligossacarideos obtidos. 0 residue sólido da extração de pectina de cada ponto do DCCR foi caracterizado quanto ao teor de celulose e hemicelulose .

Extração de xilana

[66] Na terceira etapa do processo, o residue sólido da extração de pectina com maior teor de hemicelulose foi lavado com água destilada para remoção do excesso de ácido citrico e 2g adicionados a solução de KOH com concentrações variando de 2,5% a 24%. As extrações foram avaliadas variando também a temperatura de 30°C a 120°C, e o tempo de 30 minutos a 12 horas. Após extração, o pH foi ajustado com ácido acético até atingir o ponto isoelétrico da xilana extraída (pH ~5,5) . Etanol gelado foi adicionado na proporção de 10x o volume de ácido acético adicionado. As amostras foram mantidas a 4°C por 12 horas, centrifugadas, e os sólidos recuperados foram lavados com solução 50% etanol, centrifugados novamente e secos em estufa.

Hidrólise enzimática

[67] Na quarta etapa do processo, as condições ótimas de Endo-p-1 , 4-xilanase comercial (Shearzyme, NS50030 Novozymes) foram previamente determinadas por DCCR, avaliando temperatura e pH. A curva de saturação enzimática foi realizada nas condições ótimas determinadas de 50°C e pH 5. A concentração de saturação da enzima foi utilizada para as hidrólises enzimáticas da xilana extraída, variando a concentração de sólidos de 1 a 5%. Após 48h, as amostras foram aquecidas a 98°C para desativação da enzima, centrifugadas para remoção dos sólidos não hidrolisados e reservadas para quantificação de xilo-oligossacarideos . A Figura 4 apresenta as condições enzimáticas ótimas e a Figura 5 a curva de saturação enzimática previamente determinada para 50°C e pH 5.

[68] Desta forma, foram utilizados 1% (v/v) de enzima Shearzyme diluida 1:50 (concentração final de proteína 0,165mg/mL) . Hidrólise conduzida a 50°C, pH 5, 48h.

Quantificação de xilo-oligossacarideos

[69] A quinta etapa descreve que a quantificação dos sobrenadantes resultantes da hidrólise foi feita por cromatograf ia de troca iônica com detecção amperométrica pulsada (HPLC-PAD) , utilizando o cromatógrafo Dionex® (Sunnyvale, CA, Estados Unidos) equipado com coluna Carbopac PA-1 (4 x 250 mm) e coluna de proteção Carbopac PA-1 (4x50 mm) , bomba GP50, detector eletroquimico ED40 e detector de indice de refração gradiente A (NaOH lOOmM) e B (NaOAc 300 mM, NaOH lOOmM) , software PEAKNET, Áreas de pico integradas serão ajustadas com padrões Megazyme® xilobiose (X2) , xilotriose (X3) , xilotetraose (X4) , xilopentaose (X5) , xilohexaose (X6) .

[70] A seguir a presente invenção descreve os resultados obtidos

Resultados obtidos pela presente invenção

[71] Como resultados obtidos pelo processo empregado na presente invenção tem-se por etapa: i. Extração de pectina:

- 58,5% de resíduo sólido rico em xilana; e,

- 81,2% de pureza da pectina extraída (100°C 70min) ; e 0,7 g/L XOS . ii. Extração de xilana:

- 69% de pureza (oligômeros de xilose) (2,5% KOH, 120°C, 30min, 1 volume etanol) . ill. Hidrólise enzimática da xilana extraída:

- 9g/L XOS; (2% de sólidos, 48h, 50°C) ; e,

- 6,7g/L Xilotetraose .

[72] Para demonstrar o seu potencial a presente invenção também será mais detalhadamente descrita sob aspecto dos exemplos concretizados. Cabe ressaltar que a descrição a seguir tem apenas a finalidade de elucidar o entendimento da invenção proposta e revelar, de forma mais detalhada, a concretização da invenção sem limitá-la ao mesmo. Dessa forma, variáveis similares ao exemplo também estão dentro do escopo da invenção.

Exemplos de Concretização

Lavagem e caracterização química

[73] O resíduo de casca de laranja oriundo de indústria de suco de laranja foi fornecido por Vita Citrus (Ribeirão Preto, SP) . A primeira etapa deste processo consistiu na lavagem na casca de laranja oriunda de indústria de suco de laranja com água morna para remoção de açúcares da polpa. O material foi lavado duas vezes a 40°C durante lh com agitação para remoção de açúcares livres remanescentes da polpa, utilizando uma concentração de sólidos de 50 g/L. Após as lavagens, o material foi seco em estufa a 50°C e triturado a partículas 60Mesh ou menores. [74] A Tabela 1 apresenta a composição centesimal do residue de casca de laranja utilizado neste trabalho, assim como dos subsequentes resíduos e produtos de cada etapa.

Tabela 1: Composição centesimal de residue de casca de laranja e sólidos das extrações de pectina e xilana, valores com erro padrão de 5%

Extração de pectina

[75] 0 material lavado e seco foi utilizado para extração da pectina. Os pontos principais desta etapa são a pureza da pectina extraida e a integridade do residue sólido remanescente, utilizado na hidrólise enzimática para produção dos xilo-oligossacarideos . Além disso, produtos de degradação (furfural, HMF e ácido fórmico) , monossacarideos e xilo-oligossacarideos também foram quantificados e avaliados. A extração de pectina pode ser realizada com diversos ácidos como sulfúrico, clorídrico, nitrico e tartárico. No entanto, a extração de pectina com ácido citrico melhora a economia do processo e apresenta baixo impacto ambiental. Para as extrações, empregou-se solução de ácido citrico 2% (pH 2,2) .

[76] Inicialmente foram avaliados os rendimentos e as purezas da pectina extraída utilizando diferentes proporções de sólido e liquido para a extração, 1:20, 1:40 e 1:50 m/v (Figura 1) a 100°C durante 30 minutos. Embora a proporção 1:50 tenha apresentado maior rendimento de extração devido à menor viscosidade da solução, e não tenha havido diferença estatisticamente significativa em relação à pureza do material extraído, utilizar proporções mais altas de solventes pode levar a custos de processamento mais altos e auto-hidrólise da pectina devido à diluição excessiva.

[77] Desta forma, empregou-se a proporção 1:40 m/v no delineamento central composto rotacional (DCCR) para otimização das condições de extração de pectina e recuperação do residue sólido: 2g de biomassa foram adicionados a 80 mL de solução de ácido citrico 2% (pH 2,2) . O DCCR avaliou as condições de temperatura e tempo de extração, de 70 a 130°C e 1 a 70 minutos. Após extração, as amostras foram centrifugadas a 9000g e 4°C por 10 minutos e filtradas a vácuo. Ao filtrado, adicionou-se 80mL de etanol, e as amostras foram mantidas a 4°C por 12 horas para precipitação da pectina. Após este periodo, a pectina foi recuperada por centrifugação e seca em estufa. Os sobrenadantes das extrações foram reservados para análise da concentração de xilo-oligossacarideos obtidos. O residue sólido da extração de pectina de cada ponto do DCCR foi caracterizado quanto ao teor de celulose e hemicelulose . Tabela 2 : Resultados do DCCR de extração de pectina

Tabela 3: Resultados do DCCR de extração de pectina: oligossacarideos , monossacarideos e produtos de degradação (continuação da Tabela 2) . [78] A condição para extração de pectina que proveu melhor grau de pureza e menor degradação do material foi obtida a 100°C e 70 minutos (ensaio 8) . A pureza da pectina nesta condição foi de 81%. A caracterização detalhada desta pectina está apresentada na Tabela 1. Também foram produzidos ~0,7 mg/mL de xilo-oligossacarideos (xilobiose e xilotriose) . A segunda melhor condição de extração de pectina foi obtida a 120°C durante 10 e 60 minutos (ensaios 2 e 4) . O material extraído apresentou 58% de pectina e foram produzidos 0,54 mg/mL e 1300 mg/mL de xilo-oligossacarideos, respectivamente. O alto rendimento em xilo-oligossacarideos do ensaio 4 se deve à auto hidrólise ácida da hemicelulose do material, uma conversão de 70,35% da xilana presente na biomassa em XOS . Entretanto, esta produção acompanha inibidores, além de um menor rendimento de extração e pureza de pectina. A Figura 2 apresenta a superfície resposta do DCCR para extração de pectina (p < 0.10) . Não foi possível obter uma superfície resposta com adequado valor de R2 para a pureza da pectina.

Tabela 4: Composição dos xilo-oligossacarideos quantificados nos sobrenadantes da extração de pectina em cada ponto do DCCR.

Extração de xilana

[79] A xilana foi extraida do residue sólido remanescente da extração de pectina (ensaio 8) . As porcentagens de hemicelulose presente nos resíduos sólidos da extração de pectina estão apresentadas na Tabela 2. 0 ensaio 8 rendeu a maior pureza de pectina e o residue sólido com maior concentração de hemicelulose. A xilana foi extraida deste material com 2,5%, 5%, 15% e 24% de KOH, a 120°C por 30 min e proporção de sólidos 1:10. Foram analisados diferentes volumes de etanol adicionado para precipitação da xilana extraida.

[80] Seguindo a metodologia, que recomenda a adição de 10 volumes de etanol para cada volume de ácido acético adicionado para neutralizar o KOH, quanto maior a concentração de KOH, maior a quantidade de etanol adicionada, o que aumenta custos de reagentes. Por exemplo, lOmL 2,5% KOH necessita ImL de ácido acético, já lOmL 24% KOH necessita 5mL de ácido para neutralizar o pH, o que aumenta o volume de etanol de lOmL para 50mL. Percebeu-se que maiores volumes de etanol reduziram a pureza da xilana extraida de 69% (com 2.5% KOH) para 15% (com 24% KOH) . Desta forma fixou-se o volume de etanol para 1 volume reacional . Ou seja, para cada lOmL de solução de KOH e biomassa, seriam adicionados ácido acético em quantidade suficiente para neutralizar a solução e lOmL (mais o volume de ácido) de etanol gelado. Desta forma não foram apresentadas diferenças nas massas extraídas com diferentes concentrações de KOH.

[81] Constatou-se que 2,5% de KOH e 1 volume de etanol rendeu a xilana mais pura, de 69%, levando-se em conta apenas a composição de oligômeros de xilose (os demais 30% são referentes a outros tipos de hemicelulose também extraídas no processo, principalmente arabinanas, além de pequena quantidade de celulose) . Menor concentração de KOH e menor quantidade de etanol para precipitação da xilana resultaram em maior pureza e rendimento de hidrólise. A eficiência de extração deste processo também foi alta, uma vez que o residue da extração de xilana apresentou menos de 8% de hemicelulose e 76% de celulose.

Hidrólise enzimática da Xilana extraída

[82] A hidrólise enzimática para produção de XOS empregou a xilana extraída da etapa 3. O residue sólido da extração de pectina da etapa 2 também foi utilizado para comparação dos rendimentos.

[83] O residue sólido, rico em hemicelulose (Tabela 2, ensaio 8) , rendeu 0.46mg de XOS por mg de xilana (pura) presente no material, utilizando uma concentração de sólidos de 3%. Maiores concentrações de sólido resultaram em inibição enzimática e menos de 0.2mg de XOS por mg de xilana (Tabela 5) .

Tabela 5: Rendimentos da hidrólise de residue sólido de pectina (ensaio 8)

[84] Já a hidrólise de xilana extraida na melhor condição apresentada na etapa 3 (69% de pureza) rendeu 9,16 g/L de XOS, o que representa uma conversão de 72, 68% de xilana em XOS, utilizando concentração de sólidos de 2% (Tabela 6) , comprovando a necessidade da extração de xilana para aumentar a eficiência de conversão e produção de XOS. Maiores concentrações de sólido inibiram a enzima. 0 produto de hidrólise apresentou 0,32g/L de monossacarideos . 0 principal oligossacarideo obtido foi xilotetraose (x4) , o que corresponde a aproximadamente 74% dos XOS produzidos (Tabela 7 ) .

[85] Considerável fração de compostos fenólicos é extraida com a fração de xilana (Tabela 2) . Pode-se afirmar que o hidrolisado é rico em XOS e compostos fenólicos antioxidantes , e que boa parte da atividade antioxidante advém dos xilo-oligossacarideos , uma vez que o produto de hidrólise que apresentou maior concentração de XOS também foi o que apresentou maior atividade antioxidante, não proporcional à quantidade de fenóis totais.

[86] A Figura 3 apresenta o balanço de massa dos processos de extração e produção de XOS. A composição quimica de cada fração está apresentada em suma na Tabela 1. Tabela 6: Hidrólise enzimática de xilana extraida de residue sólido de pectina, quantificação de fenóis totais e atividade antioxidante total (CAT) .

Tabela 7 : Composição dos XOS produzidos

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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