La présente invention a trait au domaine de 1'inactivation in vitro d' ^~ jents infectieux de nature virale, bactériologique ou encore parasitaire susceptibles de contaminer des milieux liquides biologiques, et concerne plus particulièrement un nouveau procédé de traitement d'un tel milieu biologique pour au moins partiellement inactiver les agents infectieux qu'il peut contenir.

La gravité des problèmes de contamination des receveurs de transfusions de sang ou de dérivé sanguin est actuellement remise en lumière en liaison avec le développement épidémique du SIDA. Cela étant, ce sont de nombreux virus qui peuvent être transmis d'un patient à l'autre par transfusion de sang, et notamment les virus HIV, HTLV1 et CMV, les virus des hépatites, etc.

De même, la sécurité des produits transfusionnels vis-à-vis de maladies comme le paludisme ou la maladie de

Chagas est un souci majeur des centres de transfusion dans les zones d'endémie. Ainsi, à côté des précautions usuelles de dépistage, qui ne sont pas à même de résoudre complètement ces problèmes, il est nécessaire d'utiliser des techniques destinées à réduire encore le risque de contamination par transfusion. Cela étant, on ne connaît pas à l'heure actuelle de moyen efficace pour inactiver les agents infectieux potentiellement présents dans des concentrés érythrocytaires tout en conservant la qualité de ces concentrés.

Par ailleurs, il existe à l'heure actuelle une demande croissante adressée aux centres de conservation du sperme et aux centres de fécondation in vitro par des hommes séropositifs vis-à-vis du virus du SIDA VIH, hommes qui souhaiteraient avoir des enfants mais ne le peuvent sans risque de contaminer leur partenaire et leur enfant. Et ces deux types d'organismes souhaitent

légitimement mieux se prémunir contre les risques de contamination liés à l'utilisation du sperme des donneurs.

Sur un plan plus général, il existe une forte demande pour inactiver in vitro des éventuels agents infectieux présents dans un liquide biologique destiné à une utilisation in vivo (par transfusion, insémination, ingestion...) sans pour autant dégrader les propriétés utiles d'un tel liquide et notamment capacité de conservation des hématies pour le sang, pouvoir fécondant pour le sperme, durée de vie, etc.

Et actuellement il n'existe aucune technique de traitement de tels produits qui soit capable de satisfaire efficacement à cette demande. Par ailleurs, il est déjà connu dans la technique antérieure d'utiliser à titre expérimental des ultrasons pour:

- libérer un virus (tel que le virus de la grippe) des cellules hôtes; ^_ homogénéiser une suspension virale;

- dissocier des complexes Ag-Ac;

- désagréger les virus pour en séparer les divers constituants; ou encore

- provoquer des altérations de diverses cellules, et en particulier le phénomène d'hémolyse.

Par ailleurs, en ce qui concerne le domaine de 1' inactivation virale, on a déjà utilisé des ultrasons de façon occasionnelle et anecdotique non pas pour 1'inactivation des virus, mais pour l'étude purement expérimentale des propriétés virales ou encore pour la mise au point de techniques virologiques (notamment extraction de virions à partir de leurs cellules hôtes) .

En outre, toutes ces recherches sur ce sujet ont fait appel à des champs ultrasonores à basse fréquence (de 10 à 50 kHz) engendrés par des cuves de nettoyage ou de broyage cellulaire. Le document le plus représentatif

de la technique antérieure est "Changes in light- scattering, absorption, fluorescence and biological characteristics ot influenza virus A (HIN'l) exposed ro soni r ^' icarion" , CM. ZAH-RϋA et λ. . PETRFSCU, Rev. Rouni: Med. - Virol .. 3 . 2 , 105-107, 1984. Ce document enseigne l'application d'un champ ulfrasonore d'une fréquence de 20 kHz dans une cuve de 600 , en décrivant simpL m nt les anomalies morphologiques, observées au riu ro-.î o e électronique, apparues pendant l'exposi on. La présente invention est basée sur la découverte expérimentale selon laquelle, dans certaines conditions, une irradiation ultrasonore est capable d'inactiver de façon efficace des agents infectieux divers, c'est-à-dire de les empêcher définitivement de se répliquer sans pour autant dégrader les produits biologiques ainsi traités.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de traitement d'un milieu biologique liquide susceptible d'être contaminé par au moins un agent infectieux de nature virale, parasitaire ou bactériologique, caractérisé en ce qu'on applique au milieu un faisceau cohérent d'ultrasons à une fréquence comprise entre environ 0,1 et 100 MHz, de manière à inactiver le ou les agents infectieux.

De façon préférée, on applique le faisceau d'ultrasons pendant une durée comprise entre 1 et 10.000 secondes. En outre, un faisceau d'ultrasons d'une puissance surfacique comprise entre 0,5 et 50 /cm ² est particulièrement avantageux.

Le mécanisme exact des inactivations virales observées en mettant en oeuvre le procédé de la présente invention n'est pas encore identifié avec certitude. On peut néanmoins mentionner les hypothèses suivantes :

- le champ ultrasonore crée à ces fréquences un phénomène intense de cavitation transitoire grâce auquel, au moment du collapsus des bulles, ^" il est engendré des pressions et des températures locales élevées ainsi que

des ondes de choc. Ces phénomènes créent des radicaux libres en grand nombre, dont l'activité chimique peut être une clé du phénomène d' inactivation observé;

- les ultrasons sont à l'origine de relaxations moléculaires telles que certaines protéines ou l'acide nucléique de l'agent infectieux viennent à se modifier; ou encore:

- les ultrasons provoquent la mise en vibration du milieu à fréquence élevée à un degré tel que la structure mécanique de la capside virale se rompt.

On peut noter ici que l'analyse de la technique antérieure concernant le comportement de cellules, et notamment d'hématies, sous l'effet d'une irradiation ultrasonore, bien que toutes les études qui y sont décrites impliquent des ultrasons à basse fréquence, de l'ordre de 10 à 80 kHz, et malgré des conditions disparates de mise en oeuvre, conduit à favoriser l'hypothèse selon laquelle le phénomène de cavitation, soit directement par effet mécanique au voisinage du collapsus, soit indirectement par la production de radicaux libres ou d'ondes de choc, est responsable de l'effet d'inactivation observé.

D'autres aspects, buts et avantages de la présente invention apparaîtront mieux à la lecture de la description détaillée suivante de formes de réalisation préférées d'appareils pour la mise en oeuvre du procédé, donnée à titre d'exemple non limitatif et faite en référence aux dessins annexés, sur lequel :

- la figure 1 est une vue schématique en élévatio- d'un dispositif expérimental pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention,

- la figure 2 est une vue en coupe verticale axiale d'une cuve d'irradiation ultrasonore selon l'invention, et

- la figure 3 est un diagramme illustrant les résultats obtenus dans un cas particulier avec le procédé de l'invention.

On indiquera tout d'abord que, d'une figure à l'autre, des éléments ou parties identiques ou similaires sont désignés par les mêmes numéros de référence.

En référence tout d'abord à la figure 1, un appareil d'irradiation pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention comprend une cuve 100, de préférence en aluminium, de forme parallélépipédique. Dans une paroi latérale 101 de la cuve 100 est pratiquée une ouverture 102 au droit de laquelle est fixée rigidement, par exemple par collage, une céramique 110, protégée par un boîtier étanche 120. Par exemple, la cuve 100 peut avoir un volume de 80 cm ³ et la céramique 110 une surface de 9 cm ² . Sur la paroi 102 de la cuve qui est opposée à la paroi 101 est fixé, du côté intérieur, un réflecteur 130 d'ondes ultrasonores, de manière à créer dans la cuve un champ stationnaire d'ondes ultrasonores. II est à noter que, dans une variante de réalisation, le réflecteur 130 peut être remplacé par un matériau absorbant les ultrasons aux fréquences considérées, de manière à créer dans ce cas un champ progressif d'ultrasons. Des moyens sont prévus pour assurer dans la cuve

100 une circulation d'eau réfrigérée. Ces moyens comprennent un bac 140 das lequel sont disposés de l'eau et des glaçons. Un tube 141 relie le bac 140 à l'entrée d'une pompe à eau 142 dont la sortie est reliée par un second tube 143 à un raccord d'entrée 103 de la cuve 100. Un raccord de sortie 104 de la cuve est relié par u troisième tube 144 au bac 140.

La partie d'alimentation de la céramique s compose d'un générateur à haute fréquence 150 dont l sortie est reliée d'une part à un amplificateur à haut fréquence 160 et d'autre part à un oscilloscope 170.

La fréquence et l'amplitude du signal de sortie du générateur 150 peuvent être réglées.

La sortie de l'amplificateur 160 est reliée, par un câble coaxial approprié 161, à la céramique 110. On peut ainsi créer dans la cuve 100, par l'intermédiaire de la céramique 110, un champ ultrasonorc de fréquence et d'intensité déterminées, ces conditions étant visualisées sur l'oscilloscope.

Un tube à essais 200 contenant l'échantillon de liquide biologique à irradier est plongé dans l'eau contenue dans la cuve 100, à travers une ouverture appropriée (non illustrée) formée dans la paroi supérieure 105 de la cuve.

On a représenté sur la figure 2 une variante de réalisation de l'ensemble de la cuve 100. La cuve comporte ici une paroi latérale cylindrique 106, un fond 107 formant également platine support et un couvercle 108, assemblés entre eux par des moyens mécaniques appropriés, avec des étanchéités convenables. La cuve peut être réalisée avantageusement en duralumin.

Les ultrasons sont ici engendrés par une céramique 110 de forme circulaire disposée horizontalement et réalisée par exemple en une céramique ferro-électrique. La céramique 110 est fixée dans une ouverture 107a pratiquée dans la paroi de fond 107. L'âme 161a du câble d'alimentation 161 est soudée sur la face inférieure de la céramique, tandis que son blindage est soudé au fond 107. Par ailleurs, un cordon de soudure périphérique 107b entre la face supérieure de la céramique et la paroi 107 constitue l'autre connexion d'alimentation de la céramique.

L'échantillon de liquide biologique à traiter est contenu dans un tube vertical d'échantillon 200, également en duralumin, traversant une ouverture prévue dans le couvercle 108. Le tube 200 est fermé à son extrémité supérieure par un bouchon 201 et à son

extrémité inférieure par une membrane 202 en "Kapton" (Marque déposée), perméable à l'irradiation ultrasonore.

De même que dans le cas de la figure 1, on fait circuler dans la cuve 100 de l'eau réfrigérée, en faisant intervenir les raccords 103 et 104.

En disposant dans la région supérieure de la cuve 100 un réflecteur d'ultrasons approprié (non représenté), on établit ainsi lorsque la céramique 110 est alimentée un champ stationnaire d'ultrasons dans la cuve 100, champ auquel est exposé le liquide biologique contenu dans le tube 200.

Conformément à un aspect essentiel de l'invention, le champ ultrasonore a une fréquence comprise entre 0,1 et 100 MHz, de préférence entre 1 et 20 MHz. L'intensité surfacique du champ ultrasonore est préférentiellement comprise entre 0,5 et 50 W/cir , et la durée d'irradiation optimale, qui varie en fonction de la fréquence et de l'intensité du champ et du type d'agent infectieux à inactiver, peut être comprise entre 1 et 10000 secondes.

Exemple 1

On va décrire ci-dessous une expérience d'inactivation virale d'une souche d'herpèsvirus de type II en suspension dans un milieu biologique de conservation.

Des échantillons ont été soumis à un champ ultrasonore dans le dispositif représenté sur la figure 2.

L'appréciation du pouvoir infectieux du virus a été réalisée par culture cellulaire pendant quatre jours, sur cellule MRC5. Le titrage a été réalisé par le calcul de la dose infectante 50 (DI 50%) , par la méthode de Reed et Muench; on peut rappeler ici que, selon cette procédure, on calcule la dilution 10 ^π qui aurait infecté 50% de la culture cellulaire. Une diminution de 4 log du titre des virus exposés aux ultrasons par rapport à celui

_d e virus témoir a été retenue ici comme critère d' inactivation de cette souche virale.

_C ette expérience a été résumée dans le tableau I ci-après, qui indique les résultats obtenus avec diverses énergies ultrasonores I et diverses fréquences ultrasonores F.

_C es résultats sont symbolisés comme suit :

+ indique une inactivation totale du virus ^;

( ₊ ) indique une inactivation partielle du virus (diminution du titre viral, mais inférieure à 4 log ^{) ;} et indique une absence de modification du titre viral, c'est-à-dire aucune inactivation.

Par ailleurs, on a indiqué dans chaque cas la _d urée minimale d'irradiation nécessaire pour atteindre le résultat indiqué (en secondes) .

TABLEAU I

Traitement du virus HSV II _C ultures Cellulaires Véro/0,025 μl/4j

On peut observer sur le tableau -I qu'une inactivation partielle ou totale est obtenue pour chacune des fréquences d'ultrasons utilisées. On note en outre qu'aux fréquences les plus basses (autour de 1 MHz) , 1 ' inactivation est réalisée avec de faibles intensités d'ultrasons. A 3 et 5 MHz, une intensité plus grande, de l'ordre de 20 /cm ² , est requise. Enfin aux fréquences les plus élevées (7 et 11 MHz) et avec une forte intensité, 1 ' inactivation peut être réalisée avec les durées les plus courtes.

Exemple 2

La deuxième expérience a consisté à étudier 1 ' inactivation d'une souche d'échovirus, toujours en suspension dans un milieu biologique de conservation, dans les mêmes conditions et avec les mêmes méthodes que pour l'exemple 1.

Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-dessous .

TABLEAU II

Traitement d'échovirus Cultures cellulaires Véro/0 ,025μl/4j

On peut voir sur ce tableau que les conditions d'exposition aux ultrasons permettant 1 'inactivation sont proches de celles observées pour 1 'herpèsvirus type II, mais les durées de traitement sont plus élevées. On note «gaiement que les fréquences les plus élevées (7 et 11 MHz) paraissent être les plus favorables.

Exemple 3

^u On a étudié l'effet inactivant des ultrasons sur le virus HIV1 (souche HTLVIII-RF) . On a mis ce virus en suspension dans un surnageant de culture constitué de milieu RPMI 1640 additionné de 20% de sérum de veau foetal décomplé enté, de 1% de glutamine et de 1% de

^• 5 mélange antibiotique et antifongique. Ce surnageant a été réparti dans cinq tubes, dont on a conservé le premier comme témoin. Les quatre autres tubes ont été soumis à un traitement par ultrasons à une fréquence de 4,7 MHz avec une puissance surfacique de 30 W/cm ² pendant ⁰ 2000 s pour deux d'entre eux et 5000 s pour les deux autres. On a ensuite effectué un titrage viral par observation de l'effet cytopathogène après 5 jours sur cellules lymphocytaires Sup Tl.

Les résultats sont présentés sur la figure 3 des ^ dessins, avec en abcisse la durée d'exposition aux ultrasons et en ordonnée le titre (en logarithme à base 10) de la dose infectieuse 50%.

On observe une diminution de l'activité virale de plus de 3 log pour les milieux traités pendant 2000 s et ⁰ de plus de 5 log pour les milieux traités pendant 5000 s.

On en conclut que, dans un milieu faiblement protéique comme celui étudié, contenant 20% de sérum de veau foetal, on peut obtenir une inactivation de l'ordre de 4 log en traitant le milieu pendant une durée comprise 5 entre environ une demi-heure et une heure.

Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée à la forme de réalisation décrite ci- dessus et représentée sur les dessins, mais l'homme de l'art saura y apporter toute variante ou modification conforme à son esprit.

En particulier, bien que l'on ait décrit ci-dessus des appareillages expérimentaux pour irradier des échantillons de liquides biologiques, l'homme de l'art saura concevoir des appareils capables de traiter des _Q liquides biologiques en des quantités importantes, en multipliant la capacité de la cuve et la taille et la puissance du dispositif engendrant le champ d'ultrasons ou d'une autre manière. A cet égard, on peut envisager un traitement global d'un liquide contenu dans un récipient tel qu'un tube, une poche ou un bac, et ce de façon immédiate après le prélèvement ou différée. On peut également envisager d'app±iquer le champ ultrasonore à une partie d'une tubulure de recueil du sang dans le cas des dons sanguins. o ^Pa r ailleurs, le champ ultrasonore peut être comme on l'a indiqué plus haut stationnaire ou progressif, et les ondes ultrasonores peuvent être émises de façon continue ou puisée, les modes de mise en oeuvre les plus appropriés étant déterminés par l'expérience au cas pas 5 cas.

En outre, il est clair qu'on peut combiner le traitement par ultrasons décrit ci-dessus avec tout autre traitement susceptible d'amplifier l'effet des ultrasons. Par exemple, on peut utiliser des détergents de type 0 désoxycholate ou sodium dodécylsulfate, ou encore des produits se fixant sur les acides nucléiques, tels que l'acridine et ses dérivés, les porphyrines, les chlorines, les composés cycliques, etc. Ces substances sont de préférence incorporées au milieu biologique à ₅ traiter avant l'exposition aux ultrasons.

Enfin, les procédés de génie génétique et de génie cellulaire permettent de fabriquer aujourd'hui des produits thérapeutiques injectables (notamment insuline, anticorps spécifiques, vaccins, etc.) nécessitant des procédures, ou issus de cellules transformées, susceptibles de contenir des virus d'origine humaine ou animale. L'invention s'applique bien entendu également au traitement de ces produits afin d'en assurer la sécurité virale.