Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur chromatographischen Trennung von Nukleinsäuregemischen in ihre doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäureanteile, indem Gesamt- nukleinsäuren gleichzeitig an einen mineralischen Träger absor¬ biert werden und danach die Trennung in doppelsträngige Nuklein¬ säure und einzelsträngige Nukleinsäure durch fraktionierte Elution erfolgt oder indem doppelsträngige Nukleinsäure oder einzelsträngige Nukleinsäure einer flüssigen Probe selektiv an einen mineralischen Träger absorbiert werden sowie Lösungen und Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens .

Präparation von Nukleinsäuren, sowohl RNA wie auch DNA, hat zunehmend an Bedeutung gewonnen. Dabei werden beispielsweise die biologischen Quellen, aus denen die RNA oder DNA isoliert werden soll, aufgeschlossen, beispielsweise durch mechanische Einflüsse oder chemische Einflüsse, wie Behandlung mit Detergen- zien etc. So folgt auf den Zellaufschluß zur Gewinnung der Nukleinsäure üblicherweise eine Cäsiumchlorid-Dichtegradien- tenzentrifugation oder eine Extraktion mit Phenol. Diese Me¬ thoden sind zwar zur Isolation von Nukleinsäuren geeignet, weisen aber Nachteile auf, die ihre Handhabung erschweren. So setzt die Cäsiumchlorid-Dichtegrandientenzentrifugation den Einsatz von zeit- und kostenintensiver Ultrazentrifugation voraus, wohingegen der Umgang mit Phenol aus arbeitsschutz- rechtlichen Erwägungen nicht unbedenklich erscheint.

So hat es in der Vergangenheit nicht an Versuchen gefehlt, die Isolation von Nukleinsäuren zu vereinfachen.

Die DE 36 39 949 AI, DE 40 34 036 AI oder DE 41 39 664 AI befassen sich z.B. mit Verbesserungen der Nukleinsäurereinigung mittels chromatographischer Methoden unter Vermeidung apparativ aufwendiger Verfahren, wie der Hochdruckflüssigkeitschromatogra¬ phie (HPLC) . Obwohl diese Methoden bereits beispielsweise gegenüber der Ultrazentrifugation oder Phenolextraktion einen Fortschritt darstellen, sind sie technisch relativ aufwendig und arbeitsintensiv. Da zur Fraktionierung oftmals mehrere Reinigungsschritte nacheinander durchgeführt werden müssen, ist die Bearbeitung insbesondere von kleinen Probenmengen z. B. durch Substanzverlust problematisch.

Die EP 0 389 063 A2 betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Iso¬ lierung von Nukleinsäuren. Dabei wird die Nukleinsäuren ent¬ haltende Quelle in Gegenwart chaotroper Ionen aufgeschlossen und dann mit einem unter diesen Bedingungen Nukleinsäuren adsor¬ bierendem Material behandelt. Als solches Material wird Diato¬ meenerde oder andere Siliciumoxid enthaltende mineralische Träger genannt. Es gelingt nach der in der EP 0 389 063 A2 genannten Methode RNA und DNA und RNA und ssRNA gleichzeitig zu isolieren. Eine wünschenswerte Fraktionierung der an dem Siliciumdioxidträger gebundenen Nukleinsäuren in DNA- und RNA- Anteile wird jedoch nicht erreicht. RNA kann dann durch Zugabe von RNAse abgebaut werden, so daß die DNA übrig bleibt.

Gillespie et al . offenbaren im US-Patent-Nr. US 5,155,018 ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von biologisch aktiver RNA aus biologischen Quellen enthaltend RNA, DNA und andere Zellinhaltsstoffe. Dabei wird die RNA enthaltende Quelle mit Partikeln in Kontakt gebracht, welche silicagelhaltige Materia¬ lien wie feinverteiltes Glas sind. Der Bindungspuffer, aus wel¬ chem die RNA an dem Material adsorbiert wird, ist angesäuerte chaotrope Salze enthaltende Lösungen. Unter diesen Bedingungen wird RNA aber nicht DNA an dem Silicamaterial gebunden. Die Ver¬ wendung von angesäuerten chaotropen Puffern besitzt den Nachteil,

daß bei der Ansäuerung Guanidiniumthiocyanat (GTC) -haltiger Bindungspuffer die Gefahr der Blausäurebildung besteht und somit besondere Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen. Weiterhin wird die DNA durch Säureeinwirkung zerstört . Darüberhinaus läßt sich nach diesem Verfahren eine DNA Aufreinigung aus der authen¬ tischen Probe nicht durchführen.

Little beschreibt in US-Patent-Nr. 5,075,430 ein Verfahren zur Reinigung von Plasmid- und anderer DNA, sowohl einzelsträngig wie auch doppelsträngig, durch Immobilisierung der DNA auf Diatomeenerde in Anwesenheit eines chaotropen Agens, woraufhin die DNA mit Wasser oder mit einem Puffer mit niedrigem Salzge¬ halt eluiert wird. Nach der Methode ist eine Reinigung von DNA/RNA nicht möglich.

M. A. Marko et al. beschreiben in "Analytical Biochemistry" 121, Seiten 382 bis 387 (1982) ein Verfahren zur Isolierung im großen Maßstab von hochgereinigter Plasmid-DNA unter Verwendung der alkalischen Extraktion und Bindung an Glaspulver. Eine Frak¬ tionierung und getrennte Reinigung von RNA und DNA aus einer einzigen Probe wird nicht beschrieben.

An die Rohpräparation der Nukleinsäuren schließen sich Folge- reaktionen an. Diese Folgereaktionen stellen bestimmte Anfor¬ derungen sowohl an die Isolierungsprozedur, als auch an die Reinheit und Integrität der isolierten Nukleinsäuren. Insbeson¬ dere wenn in der Folge enzymatische Amplifikationsreaktionen wie PCR (Polymerase Chain Reaction) , LCR (Ligase Chain Reac- tion) , NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) oder 3SR (self-sustained Sequence Replication) Anwendung finden, sollte die Präparation der Nukleinsäuren ohne die Gefahr von Kreuzkontaminationen anderer Proben möglich sein, und die isolierten Nukleinsäuren sollten frei von störenden Zellbe¬ standteilen und/oder Metaboliten vorliegen. Die enzymatische

Amplifikation von DNA (z. B. PCR) oder RNA (z. B. RNA-PCR) gewinnt aufgrund ihrer Spezifität und Sensitivität nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern zunehmend auch im medizini¬ schen Bereich für diagnostische Zwecke an Bedeutung. So bei¬ spielsweise für die Detektion von Nukleinsäuresequenzen aus kleinsten Mengen an Zellen und/oder Geweben oder Biopsiemateria- lien oder zum Nachweis von viralen Nukleinsäuren aus Blut oder Plasma. Für diese Anwendungen sind neben den genannten Anfor¬ derungen auch an Ausbeute und Reproduzierbarkeit des Verfahrens zur Nukleinsäureisolierung höchste Anforderungen gestellt.

Ein der Erfindung zugrundeliegendes technisches Problem besteht darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem es nicht nur gelingt RNA und DNA aus biologischen Proben wie Zeil-Lysaten und Gewebe- Lysaten getrennt voneinander aber aus derselben Probe stammend aufzureinigen, sondern generell doppelsträngige von einzelsträn¬ gige Nukleinsäuren. Das Verfahren sollte dabei möglichst kosten¬ günstig arbeiten, indem beispielsweise preisgünstige unmodifi- zierte Trennmaterialien Verwendung finden können. Das Verfahren sollte darüber hinaus auch zur Probenvorbereitung für die Diagnostik geeignet und mit verschiedenen Amplifikationsmethoden kompatibel sein. Weiterhin sollen die bei der Diskussion des Standes der Technik angesprochenen Nachteile vermieden werden.

Überraschenderweise wird das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 in seinen Verfahrensalternativen 1.1 bis 1.4 gelöst. Die Unteransprüche 2 bis 11 betreffen bevorzugte Aus¬ führungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Ansprüche 12 bis 21 Lösungen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren bzw. die Verwendung dieser Lösungen und Anspruch 22 betrifft eine Zusammenstellung enthaltend die für das erfindungsgemäße Verfahren notwendigen Komponenten.

Im einzelnen stellt sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Fraktionierung von doppelsträngigen und einzelsträngigen Nu- kleinsäure-Strukturen aus biologischen Quellen in folgenden Verfahrensalternativen dar.

Die zu trennende Nukleinsäurearten (einzel- und doppelsträngige) enthaltende Probe wird mit mindestens einem mineralischen Träger behandelt, wobei die Behandlungsbedingungen durch ein entspre¬ chendes wäßriges Gemisch von Salzen, insbesondere chaotrope Substanzen und Alkoholgruppen enthaltender Substanz so einge¬ stellt sind, daß überwiegend die einzelsträngige Nukleinsäure- Fraktion an einem ersten mineralischen Träger adsorbiert wird, während die doppelsträngige Nukleinsäure nicht adsorbiert wird. Die austretende doppelsträngige Nukleinsäure kann dann mit an sich bekannten Verfahren weiter bearbeitet werden. Die am ersten mineralischen Träger adsorbierte einzelsträngige Nukleinsäure wird nach gegebenenfalls durchgeführten Waschschritten eluiert unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser. Die nicht adsorbierte doppelsträngige Nukleinsäure, die aufgefangen wurde, kann weiter aufgereinigt werden, indem z.B. die Fraktion anschließend durch ein entsprechendes wäßriges Gemisch von Sal¬ zen, insbesondere chaotrope Substanzen, und alkoholgruppenhal- tigen Substanzen auf solche Bedingungen eingestellt wird, daß die doppelsträngige Nukleinsäure an einem zweiten mineralischen Träger adsorbierbar und, nach gegebenenfalls durchgeführten Waschschritten, eluierbar wird unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser.

In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah¬ rens werden zur Trennung von einzelsträngiger Nukleinsäure und doppelsträngiger Nukleinsäure die Behandlungsbedingungen so eingestellt, daß Erdalkali-Ionen komplexierende Substanzen in Abwesenheit von Alkoholgruppen enthaltenden Substanzen in der Lösung enthalten sind, wobei die einzelsträngige Nukleinsäure

nicht an dem ersten mineralischen Träger adsorbiert wird und von der übrigen Probe abgetrennt werden kann. Die abgetrennte einzelsträngige Nukleinsäure kann dann mit an sich bekannten Verfahren weiter bearbeitet werden. Die doppelsträngige Nuklein¬ säure bindet jedoch überwiegend an dem ersten mineralischen Träger und kann, nach gegebenenfalls durchgeführten Waschschrit¬ ten, eluiert werden, unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser. Die so erhaltene doppelsträngige Nukleinsäure kann dann mit an sich bekannten Verfahren weiter bearbeitet werden.

Die nicht adsorbierte einzelsträngige Nukleinsäure, welche aufgefangen wurde, kann dann anschließend insbesondere durch Zugabe von Alkoholgruppen enthaltenden Substanzen auf solche Bedingungen eingestellt werden, daß die einzelsträngige Nuklein¬ säure dann an einem zweiten mineralischen Träger adsorbierbar. und, nach gegebenenfalls durchgeführten Waschschritten, eluier- bar wird unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser.

Werden die Behandlungsbedingungen so eingestellt, daß Netz-, Wasch- oder Dispergiermittel in Abwesenheit von Alkoholgruppen aufweisenden Substanzen in der Lösung enthalten sind, wird die einzelsträngige Nukleinsäure unter diesen Behandlungsbedingungen nicht an einem ersten mineralischen Träger adsorbiert und kann mithin von der übrigen Probe abgetrennt und weiter verarbeitet werden. Die doppelsträngige Nukleinsäure bindet jedoch über¬ wiegend an den ersten mineralischen Träger und kann nach gege¬ benenfalls durchgeführten Waschschritten unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser eluiert werden. Die eluier- te doppelsträngige Nukleinsäure kann danach mit an sich bekann¬ ten Verfahren weiter bearbeitet werden.

Die nicht adsorbierte, aufgefangene einzelsträngige Nukleinsäure kann dann anschließend vorzugsweise durch Zugabe von Alkohol- gruppen enthaltenden Substanzen auf solche Bedingungen einge¬ stellt werden, daß die einzelsträngige Nukleinsäure dann an

einem zweiten mineralischen Träger adsorbierbar und, nach gegebenenfalls durchgeführten Waschschritten, eluierbar wird unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gewährleistet die Fraktionierung von gemeinsam gebundener einzelsträngiger Nukleinsäure und doppelstrangiger Nukleinsäure. Dabei werden die Behandlungsbedingungen durch ein entsprechendes wäßriges Gemisch von Salzen, insbesondere chaotrope Substanzen und Alkoholgruppen enthaltenden Substanzen so eingestellt, daß die Gesamtnukleinsäure aus einzelsträngiger Nukleinsäure und doppelsträngiger Nukleinsäure an einem mineralischen Träger adsorbiert wird, gefolgt von einer Fraktionierung der an den ersten Träger gebundenen doppelsträngigen/einzelsträngigen Nukleinsäure durch selektive Elution der doppelsträngigen Nukleinsäure mittels Behandlung mit einer Lösung verminderter Ionenstärke und Konzentration einer Alkoholgruppen enthaltenden Substanz oder Elution der einzelsträngigen Nukleinsäure mittels einer Lösung enthaltend eine Erdalkali-Ionen komplexierende Substanz und/oder ein Netz-, Wasch- oder Dispergiermittel sowie eine oder mehrere Salzart (en) , insbesondere chaotrope Substan¬ zen. Im ersten Fall bleibt dann die einzelsträngige Nukleinsäure auf dem Träger gebunden, wohingegen im zweiten Falle die doppel¬ strängige Nukleinsäure an dem mineralischen Träger gebunden bleibt. Die jeweils eluierte Fraktion kann dann mit an sich bekannten Verfahren weiter bearbeitet werden.

Die Einstellung der Behandlungsbedingungen mit Alkoholgruppen enthaltenden Substanzen und Salzen, insbesondere chaotrope Substanzen zur Trennung der Nukleinsäuren erfolgt erfindungs- gemäß unter Zugrundelegung der nachstehenden physiko-chemischen Grundlagen, die hier zum ersten Mal formuliert sind.

Fig. 1 zeigt die Bindung einzelsträngiger/doppelsträngiger Nukleinsäure am Beispiel einzelsträngiger RNA und doppelsträngi- ger DNA. .Es wird die RNA/DNA-Bindung aus einem Gewebelysat an einen mineralischen Träger in Abhängigkeit der Konzentration einer Alkoholgruppen enthaltenden Substanz (hier Ethanol) und einer chaotropen Substanz (hier GTC) beschrieben. Unter der Vo¬ raussetzung, daß die Konzentration einer der Substanzen, Alkohol oder chaotroper Substanz, konstant ist, ist festzustellen, daß bei hoher Alkoholkonzentration und/oder Menge chaotroper Sub¬ stanz, beide Nukleinsäurearten (RNA/DNA) am mineralischen Träger gebunden werden. Unterschreitet die Konzentration einer oder beider Substanzen (Alkohol oder chaotropes Reagenz) einen bestimmten Wert, dann bindet keine der Nukleinsäure in nennens¬ wertem Maße an dem mineralischen Träger. Dazwischen binden überraschenderweise RNA und DNA so unterschiedlich an den mineralischen Träger, daß dies zur Trennung der Nukleinsäuren ausgenutzt werden kann. So können - ausgehend von Zellen - nach Lyse der Zellen mit hoher Konzentration an chaotropen Substan¬ zen, durch anschließende Zugabe einer Alkoholgruppen enthalten¬ den Substanz oder eines Gemisches aus Alkoholgruppen enthal¬ tender Substanz und Wasser oder Puffer, Konzentrationen von chaotroper Substanz und Alkoholgruppen enthaltener Substanz so eingestellt werden, daß eine selektive Bindung der RNA erzielt wird, während die DNA im Durchbruch verbleibt. Im Beispiel gemäß Figur 1 würde man eine Konzentration von 1,75 M GTC und 30 Vol% Ethanol wählen, um eine Trennung von RNA von DNA durch fraktio¬ nierte Bindung zu erreichen.

Andererseits kann unter Bedingungen hoher Konzentration an Alkoholgruppen enthaltender Substanz und/oder hoher Konzentra¬ tion an chaotroper Substanz eine simultane Bindung von einzel¬ strängiger Nukleinsäure und doppelsträngiger Nukleinsäure am mineralischen Träger erreicht werden, und durch Verringerung der Konzentration an Alkoholgruppen enthaltender Substanz

und/oder chaotroper Substanz zunächst die Desorption der dop¬ pelsträngigen Nukleinsäure eingeleitet werden. Die einzelsträn¬ gige Nukleinsäure bleibt dabei gebunden und eluiert bei noch weiterer Verringerung der Konzentration einer oder beider Substanzen. Im Beispiel gemäß Fig. 1 würde man Konzentrationen von 1,75 M GTC und 45 Vol% Ethanol wählen, um eine Bindung der Gesamtnukleinsäure zu erreichen. Wie in Beispiel 8 exemplarisch verdeutlicht wird, würde man zur selektiven Desorption der DNA eine Konzentration von 0,3 M GTC und 10 Vol% Ethanol wählen.

Es ist mithin möglich, die RNA und DNA durch Adsorption an einem mineralischen Träger zu trennen, oder aber zunächst die Gesamt¬ nukleinsäure an den mineralischen Träger zu adsorbieren und die einzelsträngige Nukleinsäure oder doppelsträngige Nukleinsäure selektiv zu eluieren.

Gegebenenfalls können vor der Elution der jeweiligen Nuklein¬ säure (einzelsträngige Nukleinsäure oder doppelsträngige Nuk¬ leinsäure) auch Waschschritte durchgeführt werden.

Die Elution erfolgt dann jeweils unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser. Die zuerst vom mineralischen Träger desorbierte Nukleinsäure wird anschließend durch Erhöhung der Ionenstärke und/oder der Konzentration Alkoholgruppen enthal¬ tender Substanzen so eingestellt, daß die doppelsträngige Nukleinsäure oder einzelsträngige Nukleinsäure an einem zweiten mineralischen Träger adsorbiert wird und, nach gegebenenfalls durchgeführten Waschschritten, eluiert wird unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser.

Da Nukleinsäuren beispielsweise auch in Kochsalz/Ethanol-Gemis¬ chen an mineralische Träger adsorbieren und unter Bedingungen geringer Ionenstärke oder mit Wasser eluiert werden können, ist

anzunehmen, daß die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Salzlösungen nicht zwingend chaotrope Salze enthalten müssen, sondern daß jede Salzlösung in Kombination mit einer Alkohol- gruppen enthaltenden Substanz Anwendung finden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in vorteilhafter Weise die Bearbeitung kleiner Probenmengen, gewährleistet eine ein¬ fache und sichere Handhabung unter Vermeidung von Präzipita- tionsschritten. Weiterhin ist das Verfahren gemäß der Erfindung wenig kosten- und personalintensiv durchführbar und kann in einfacher Weise die Bearbeitung einer Vielzahl von Proben gleichzeitig ermöglichen. Das Verfahren ist aufgrund seiner Vielseitigkeit und einfachen Handhabbarkeit auch für die Auto¬ matisierung geeignet.

Erfindungsgemäß können mit dem Verfahren aus Nukleinsäure- Strukturen enthaltenden Quellen Doppelstrang/Einzelstrang- Nukleinsäurestrukturen getrennt werden. Als Quellen, die zu trennenden Nukleinsäurestrukturen beinhalten können, kommen die z.B. im Anspruch 7 genannten Quellen in Frage. Diese sind im einzelnen Zellkulturen, Gewebe jeder Art, Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Faeces, Mikroorganismen wie Bak¬ terien, Viren wie Cytomegalie-Virus, HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis-δ-Virus, Pflanzen, Pflanzenteile, Embryonen, Keim¬ linge, Früchte oder Nukleinsäuren enthaltende Gemische nach enzymatischen Reaktionen wie in vitro Transkription und/oder cDNA-Synthese und/oder reverse Transkription mit anschließender Polymerasekettenreaktion (PCR) .

Zellen werden vorzugsweise zunächst in einem wäßrigen Lyse- system, welches chaotrope Substanzen und/oder andere Salze en¬ thält, aufgeschlossen, indem im einfachsten Falle die Zellen damit versetzt werden. Gegebenenfalls kann durch mechanische Einwirkung der Prozeß des Aufschliessens beschleunigt werden.

Danach wird die so behandelte Probe, je nach Problemstellung welche Nukleinsäureart von der anderen getrennt werden soll, wie in den Verfahrensschritten 1.1 bis 1.4 gemäß Patentanspruch 1 beschrieben, weiter aufgearbeitet.

Einige der genannten Ausgangsmaterialien wie beispielsweise Bakterien können, aufgrund der Beschaffenheit ihrer Zellwände, nicht direkt in chaotrope Substanzen enthaltenden wäßrigen Systemen lysiert werden. Diese Ausgangsmaterialien müssen daher, bevor sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, vorbehandelt werden, beispielsweise mit lytischen Enzymen.

Systeme zur Lysierung der die Nukleinsäure enthaltenden Quellen sind vorzugsweise Lösungen chaotroper Substanzen in einer Kon¬ zentration von 0,1 bis 10 M. Als chaotrope Substanzen kommen insbesondere Salze wie Natriumperchlorat, Guanidiniumhydrochlo- rid, Guanidinium-iso-thiocyanat/Guanidinium-thiocyanat, Na- triumjodid, Kaliumjodid und/oder Kombinationen davon in Frage.

Auch wäßrige Lösungen enthaltend Salze wie Natriumchlorid, Lithiumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumacetat, Magnesiumchlorid in einer Konzentration von 0,1 bis 10 M oder Harnstoff in entsprechenden Konzentrationen von 0,1 bis 10 M und/oder Kom¬ binationen dieser Stoffe können als wäßrige Systeme zur Lyse bzw. Bindung der die Nukleinsäure enthaltenden Quellen verwendet werden.

Die Alkoholgruppen aufweisenden Substanzen sind vorzugsweise niedere aliphatische Alkohole mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen wie Methanol _/ Ethanol, Isopropanol, Butanol und Pentanol. Sie werden vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 90 Vol.-% ein¬ gesetzt .

Der mineralische Träger besteht vorzugsweise aus porösen oder nicht porösen Metalloxiden oder Metallmischoxiden, Silicagel, Materialien, die überwiegend aus Glas bestehen, wie nicht modifizierte Glaspartikel, Glasmehl, Quarz, Aluminiumoxid, Zeolithe, Titandioxid, Zirkondioxid mit einer Partikelgröße des mineralischen Trägermaterials von 0,1 μm bis 1.000 μm und einer Porengröße von 2 bis 1.000 μm. Das poröse oder nicht poröse Trägermaterial kann in Form loser Schüttungen vorliegen oder als Filterschichten ausgebildet sein in Form von Filterschichten aus Glas, Quarz oder Keramik und/oder einer Membran, in der Silicagel angeordnet ist und/oder als Partikel oder Fasern aus mineralischen Trägern und Geweben aus Quarz oder Glaswolle vorliegen sowie Latex-Partikeln mit oder ohne funktioneilen Gruppen oder Frittenmaterialien aus Polyethylen, Polypropylen, Polyvinyliden-fluorid, insbesondere ultra high molecular weight Polyethylen, high density Polyethylen.

Als Erdalkali-Ionen bindende Substanz kommt insbesondere Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder EGTA in Frage und als Netz-, Wasch- oder Dispergiermittel ist ein Sarkosinat ein¬ setzbar.

Gewünschtenfalls können die erfindungsgemäß erhaltenen Nuklein¬ säuren durch weitere chromatographische Verfahren wie Anionen- austauscherchromatographie gereinigt werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann als einzelsträngige Nuklein¬ säure insbesondere RNA von doppelsträngiger Nukleinsäure (DNA) getrennt werden. Liegt DNA einzelsträngig vor, kann diese DNA dann auch von doppelsträngiger DNA, wie auch von doppelsträngi¬ ger RNA getrennt werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung kommenden Lösungen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Als Lysepuffer und/oder Bindungspuffer kommen erfindungsgemäß

insbesondere wäßrige Lösungen enthaltend 0,5 bis 8,0 M Guani- dinium-iso-thiocyanat/Guanidiniumthiocyanat und/oder Guanidin- hydrochlorid, 0 bis 50 % Ethanol und/oder Isopropanol in Be¬ tracht .

Als Lösung zum Auswaschen bzw. Eluieren von an dem mineralischen Träger gebundenen Nukleinsäuren kommt eine wäßrige Lösung ent¬ haltend 0,1 bis 3 M Guanidinium-iso-thiocyanat/Guanidiniumthio- cyanat und/oder Guanidinhydrochlorid zusammen mit 1 bis 30 Vol .% Ethanol und/oder Isopropanol in Frage.

Als wäßriges Lösungssystem, das zum Binden von doppelsträngiger Nukleinsäure an mineralische Träger verwendet werden kann, kommt eine wäßrige Lösung enthaltend 1 bis 5 M Guanidin-iso-thiocyanat und/oder 1 bis 8 M Guanidinhydrochlorid mit 0,1 bis 5 % Sarkosi- naten oder 5 mM bis 200 mM EDTA in Betracht. Zum Binden von doppelsträngiger Nukleinsäure kommt auch eine Lösung enthaltend 1 bis 5 M Guanidiniumthiocyanat und/oder 1 bis 8 M Guanidinium- hydrochlorid, 5 mM bis 200 mM EDTA oder EGTA in Frage.

Die erfindungsgemäß beanspruchte Zusammenstellung von Komponen¬ ten zur Durchführung des Verfahrens in einem Kit weist insbeson¬ dere zum Durchfluß geeignete Hohlkörper auf, in dem der oder die mineralische (n) Träger in der bereits weiter oben beschrie¬ benen Form angeordnet ist (sind) . Der mineralische Träger kann in loser Schüttung vorliegen, welche zwischen zwei Einrichtungen fixiert ist oder in Form von Membranen, die in dem Hohlkörper angeordnet sind. Desweiteren können in dem Kit Lösungen enthal¬ ten sein oder die Bestandteile für die Zusammenstellung der Lösungen in konzentrierter Form. Daraus kann dann der Anwender die jeweils benötigten Lösungen in der notwendigen Konzentration herstellen.

Ein weiterer vorteilhafter Bestandteil der Zusammenstellung ist eine Vorrichtung zur Homogenisierung der Lösung auf Zeil-Lysa¬ ten. Eine besonders bevorzugte Vorrichtung zur Homogenisierung

ist in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP 95/00037 vor¬ geschlagen. Diese Vorrichtung besteht im wesentlichen aus mindestens zwei porösen Schichten, wobei die porösen Schichten abnehmende Porengröße aufweisen in Fließrichtung durch die Schichten gesehen. Beim Durchtritt des Zell-Lysats durch die abnehmende Porengrößen werden die viskosen Lösungen des Zell- Lysats homogenisiert.

Die Erfindung wird an den nachfolgenden Beispielen näher erläut¬ ert.

Materialien und Methoden

I. Silica- Trägermateriali en

Silica-Trägermaterialien wurden in Membranform oder als sus¬ pendierte Partikel eingesetzt.

1 . 1 . Silica -Membranen

Zwei Lagen einer Silica-Membran (z.B. Glasfaserfilter der Firma Whatman) wurden, wie in P 43 21 904 beschrieben, in einer Zentrifugen-Chromatographiesäule ("spin-Säule") fixiert. Für membranförmige Trägermaterialien wurde nach dem Standardproto¬ koll "spin-Prozedur" (vgl. 4.1) vorgegangen.

1 .2 . Silica-Partikel

Verschiedene Silica-Partikel (z.B. der Firmen Merck, Darmstadt und Sigma, St. Louis) wurden als 50 %-Suspension im jeweils verwendeten Lysepuffer (vgl. 3.1) eingesetzt. Die mittleren Partikeldurchmesser betrugen je nach Material 0,5 bis 50 μm. Es wurde nach dem Standardprotokoll "batch-Prozedur" (vgl. 4.2) vorgegangen.

2. Nukleinsäure enthaltende Quellen

2.1 Gewebe

Die zur Präparation eingesetzten Gewebe wurden sofort nach Entnahme in flüssigem Stickstoff gefroren und bei - 70°C gela¬ gert. Alternativ kann frisches Gewebe verwendet werden.

2.2 . Pflanzen

Blätter wurden unter flüssigem Stickstoff im Mörser zu einem feinen Pulver zermahlen und direkt zur Präparation eingesetzt oder bei - 70°C gelagert.

2. 3 . Zellkul tur

Zellen wurden nach der Ernte zweimal mit PBS gewaschen und pel¬ letiert. Aliquots mit entsprechender Zellzahl (bestimmt durch Auszählen in Thoma-Kammer) wurden frisch zur Präparation ein¬ gesetzt oder bei - 20°C gelagert.

Adhärent wachsende Zellen können alternativ in der Kulturschale gewaschen und durch Zugabe des jeweiligen Lysepuffers (vgl. 3.1) direkt in der Kulturschale lysiert werden.

2 . 4 . Plasma

ACD-Blut wurde 10 min bei 3.000 x g zentrifugiert, der-Überstand abgenommen und erneut wie oben zentrifugiert . Der nach der zweiten Zentrifugation erhaltene Überstand wurde aliquotiert und bei - 70°C gelagert.

2. 5. Bakterien

Kulturen wurden mit einer Übernacht-Kultur angeimpft und bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,5 - 0,8 angezogen. Aliquots mit der ent¬ sprechenden Zellzahl (1 OD ₆₀₀ = 10 ⁹ Zellen/ml) wurden pelletiert und die Zellpellets bei - 20°C gelagert oder frisch zur Präpara¬ tion eingesetzt.

3 • Reagenzien

3 . 1 . Lysepuffer

Ll 4,5 M GTC, 25 mM NaCitrat Ph 7,5, 0,7 % ß-Mercaptoethanol

(MSH)

L2 4,0 M GTC, 25 mM NaCitrat pH 7,5, 0,7 % ß-MSH

L3 5,0 M GTC, 50 mM TRIS/HCl pH 7, 0

L4 3,5 M GTC, 25 mM NaCitrat pH 7,5, 1 % ß-MSH

L5 2,5 M GTC, 25 mM NaCitrat pH 7,5, 1 % ß-MSH, 30 % Ethanol

L6 8,0 M GuHCl, 20 mM MOPS pH 7,0, 0,7 % ß-MSH

L7 3,0 M GTC, 25 mM NaCitrat pH 7,5, 1 % ß-MSH

L8 4,0 M GTC, 50 mM TRIS/HCl pH 7,5, 1 % Sarkosyl

L9 4,0 M GTC, 50 mM TRIS/HCl pH 7,5, 25 mM EDTA

3 .2 . Bindungsreagenz

Bl Ethanol

B2 n-Butanol

B3 Isopropanol

B4 70 % Ethanol in Wasser

B5 5, 9 M GTC

3 . 3 . Waschpuffer

Wl 2,0 M GTC, 25 mM TRIS/HCl pH 7,5, 30 % Ethanol

W2 4,0 M GTC, 40 mM TRIS/HCl pH 7,5, 20 % Isopropanol

W3 1,0 M GTC, 25 mM TRIS/HCl pH 7,5, 20 % Ethanol

W4 5,0 M GuHCl, 15 mM MOPS pH 7,0, 37 % Ethanol

W5 0,5 M GTC, 25 mM TRIS/HCl pH 7,5, 10 % Ethanol

4. Standardprotokolle

4 . 1 . "spin- Prozedur"

1) Nukleinsäure enthaltende Quelle mit Lysepuffer (vgl. 3.1.) versetzen und mittels eines Handhomogenisators vollständig homogenisieren

2) Bindungsreagenz (vgl. 3.2.) zugeben, um die jeweiligen Bindebedingungen einzustellen

3) Lysat auf die spin-Säule pipettieren und 15 Sekunden bei 10.000 Upm in einer Tischzentrifuge durch die Membran der spin-Säule zentrifugieren; falls das Volumen des Lysates das Füllvolumen der spin-Säule überschreitet, diesen Bindungsschritt wiederholen

4) den Säulendurchbruch gegebenenfalls weiteraufarbeiten oder verwerfen

5) 700 μl Waschpuffer (vgl. 3.3.) auf die spin-Säule pipet¬ tieren und wie in 3) beschrieben, zentrifugieren, um kontaminierende Zellbestandteile zu entfernen

6) die membrangebundenen Nukleinsäuren zweimal mit 700 μl 80 % Ethanol in Wasser salzfrei waschen, hierbei vorgehen wie in 5)

7) die spin-Säule zwei Minuten bei maximaler Drehzahl zen¬ trifugieren, um Ethanol vollständig zu entfernen

8) 50 bis 100 μl auf 80°C erwärmtes Wasser direkt auf die Membran der spin-Säule pipettieren und 1 Minute bei maxi¬ maler ^' Drehzahl zentrifugieren, um die Nukleinsäuren zu eluieren; den Elutionsschritt gegebenenfalls wiederholen.

4 .2 . "ba tch- Prozedur"

1) Nukleinsäure enthaltende Quelle mit Lysepuffer (vgl. 3.1.) versetzen und mittels eines Handhomogenisators vollständig homogenisieren

2) Bindungsreagenz (vgl. 3.2.) zugeben, um die jeweiligen Bindebedingungen einzustellen

3) 50 μl Silica-Suspension (50 % im Lysepuffer) zugeben und zur Bindung der Nukleinsäuren 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dabei mehrmals heftig aufwirbeln (vortexen)

4) 15 Sekunden bei 10.000 Upm in einer Tischzentrifuge zen¬ trifugieren, um das Silica-Material zu pelletieren

5) den Überstand abpipettieren und gegebenenfalls weiterauf¬ arbeiten oder verwerfen

6) 700 μl Waschpuffer (vgl. 3.3.) zum Pellet geben, heftig aufwirbeln (vortexen) bis das Pellet vollständig resuspen¬ diert ist und wie in 4) zentrifugieren

7) Waschschritt 6) zweimal mit 700 μl 80 % Ethanol in Wasser wiederholen, um das Silica-Material salzfrei zu waschen

8) pelletiertes Silica-Material 10 Minuten bei 56°C mit offenem Deckel trocknen

9) 50 bis 100 μl Wasser zugeben, das Pellet durch heftiges Aufwirbeln (Vortexen) komplett resuspendieren und 10 Minu¬ ten bei 56°C inkubieren, dabei mehrmals heftig aufwirbeln (vortexen) ; diesen Elutionsschritt gegebenenfalls wieder¬ holen

10) 1 Minute bei maximaler Drehzahl zentrifugieren und den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführen.

5. Elektrophoretische Methoden

Die isolierten Nukleinsäuren wurden auf Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegelen analysiert. Hierzu wurden 1,2 % Formaldehyd- oder 1,2 % 1 x TBE-Gele angefertigt.

Formaldehydgele wurden nach dem Lauf 3 bis 4 Stunden in Wasser, danach über Nacht in 10 μg/ml RNase A geschüttelt, um die RNA zu verdauen und somit die DNA besser sichtbar zu machen. TBE- Gele wurden ohne vorheriges Äquilibrieren RNase-verdaut .

Die im folgenden beschriebenen Beispiele verdeutlichen die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Alle hiernach isolierten Nukleinsäuren wurden elektrophoretisch analysiert und photometrisch quantifiziert. Der OD 260/280-Wert lag für alle Eluate zwischen 1.7 und 2.0.

Referenzbeispiele 1 bis 5

Isolierung von Gesamtnukleinsäure

In den nachfolgend aufgeführten Referenzbeispielen 1 bis 5 wurden die Binde-, Wasch- und Elutionsbedingungen jeweils so gewählt, daß sowohl DNA als auch RNA an den mineralischen Träger binden und gemeinsam eluiert werden.

Es wird anhand dieser Beispiel die Verwendung verschiedener Alkohole (Ethanol, Isopropanol, Butanol) als Bindungsreagenz verdeutlicht.

Referenzbeispiel 1

Isolierung von Gesamtnukleinsäure aus Nierengewebe

Aus 15 mg Nierengewebe (Ratte) wurde Gesamtnukleinsäure nach dem Standardprotokoll 4.1 isoliert. Das Gewebe wurde- mit 400 μl

Ll versetzt und homogenisiert, anschließend wurden 280 μl Bl zugegeben. Der ersten Waschschritt wurde mit Wl durchgeführt, das Elutionsvolumen betrug 2 x 50 μl.

Referenzbeispiel 2

Isolierung von Gesamtnukleinsäure aus Lebergewebe

Aus 7 mg Lebergewebe (Ratte) wurde Gesamtnukleinsäure nach dem Standardprotokoll 4.1 isoliert. Das Gewebe wurde mit 300 μl L2 versetzt und homogenisiert, anschließend wurden 200 μl B2 zugegeben. Der erste Waschschritt wurde mit Wl durchgeführt, das Elutionsvolumen betrug 2 x 50 μl.

Referenzbeispiel 3

Isolierung von Gesamtnukleinsäure aus HeLa -Zellen

Aus 1 x 10 ⁶ HeLa-Zellen wurde Gesamtnukleinsäure nach dem Standardprotokoll 4.1 isoliert. Die Zellen wurden mit 400 μl L2 versetzt und homogenisiert, anschließend wurden 200 μl Bl zugegeben. Der erste Waschschritt wurde mit Wl durchgeführt, das Elutionsvolumen betrug 1 x 50 μl.

Referenzbeispiel 4

Isolierung von Gesamtnukleinsäure aus Plasma

Gesamtnukleinsäure aus Plasma wurde parallel nach Standardpro¬ tokoll 4.1 und 4.2 isoliert. Hierfür wurden jeweils 200 μl Plasma mit 800 μl L3 und 660 μl B2 versetzt und gemischt; homogenisieren war hier nicht erforderlich. Im Ansatz für die "batch-Prozedur" (4.2) wurden zusätzlich 40 μl Silica-Suspension zugegeben. Der erste Waschschritt wurde in beiden Ansätzen mit W2 durchgeführt, das Elutionsvolumen betrug 2 x 100 μl .

Beispiel 1

Fraktionierte Bindung von RNA und DNA bei kons tanter GTC -Kon ¬ zentration und steigender Ethanolkonzentra tion

Die Abhängigkeit der RNA/DNA-Bindung an den mineralischen Träger bei konstanter GTC- und steigender Ethanolkonzentration wurde gezeigt, indem je Probenansatz 10 mg eines Nierengewebes in 350 μl L4 lysiert und zur Einstellung der Ethanolkonzentration je Ansatz 350 μl eines Ethanol/Wasser-Gemisches zugegeben wurde, dessen Ethanolgehalt zwischen 20 und 90 % Ethanol in Wasser lag. Zu einem weiteren Ansatz wurden 350 μl absoluter Ethanol gege¬ ben. Dies entsprach in den jeweiligen Ansätzen Bindebedingungen von konstanter GTC-Konzentration 1,75 M und steigender Ethanol¬ konzentration im Bereich von 10 bis 50 % (vgl. Fig. 1) .

Zu den so eingestellten Lysaten wurden in einer ersten Ver¬ suchsreihe je Ansatz 150.000 cpm eines ³² P-markierten 0.9 kb in vitro Transkripts gegeben und das Lysat auf den in eier spin- Säule fixierten mineralischen Träger pipettiert . Es wurde 15 Sekunden bei 10.000 Upm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und die Menge der an die Säule gebundenen und der im Säulen- durchbruch befindlichen Radioaktivität durch Cherenkov-Zählung bestimmt.

Die Versuchsreihe wurde wiederholt, wobei statt der ³² P-mar- kierten RNA, 150.000 cpm eines durch Klenow-Auffüllreaktion ³² P- markierten, linearisierten pTZ-Plasmides zugegeben wurden.

Wie Fig. 1 zeigt, bindet die RNA-Fraktion unter den beschrie¬ benen Bedingungen bereits ab Ethanolkonzentrationen größer 25 % an den mineralischen Träger, während die DNA-Fraktion erst ab Ethanolkonzentrationen größer 40 % bindet.

Beispiele 2 bis 8

Isolierung von Gesam -RNA

In den folgenden Beispielen wurden zur Bindung an den minera¬ lischen Träger die Alkohol/Salz-Gemische so gewählt (vgl. Fig. 1) , daß eine selektive RNA-Bindung erreicht wurde.

Die Bindebedingungen wurden dabei auf die Art des jeweiligen AufSchlußmaterials (Gewebe, Zellkultur, Pflanzen, Bakterien) abgestimmt .

Die Beispiele verdeutlichen die Verwendung von GTC, GuHCl oder GTC/Ethanol-Gemischen zur Lyse der Ausgangsmaterialien. Die Integrität der isolierten RΝA wurde durch Νorthern-blotting oder RT-PCR verifiziert.

Auf die Aufarbeitung der nicht an den Träger gebundenen DNA wurde in diesen Beispiele verzichtet. Die Aufreinigung von DNA aus dem Säulendurchbruch wird in Beispiel 12 gezeigt. Darüber hinaus kann die DNA durch Einstellung der in den Referenzbei- spielen 1 bis 5 gewählten Bindebedingungen aufgereinigt werden.

Beispiel 2

Isolierung von Gesamt-RNA aus Milzgewebe

Aus 15 mg Milzgewebe (Maus) wurde Gesamt-RNA nach dem Stan¬ dardprotokoll 4.1 isoliert. Das Gewebe wurde mit 350 μl L4 versetzt und homogenisiert, anschließend wurden 350 μl B4 zugegeben. Der erste Waschschritt wurde mit W3 durchgeführt, das Elutionsvolumen betrug 1 x 50 μl.

Beispiel 3

Isolierung von Gesamt-RNA aus Lebergewebe (A)

In diesem Beispiel wurde ein ethanol-haltiger Lysepuffer ver¬ wendet, so daß das Standardprotokoll 4.1 leicht modifiziert wurde.

8 mg Lebergewebe (Ratte) wurden mit 700 μl L5 versetzt und homogenisiert. Das Lysat wurde auf die spin-Säule pipettiert und ab Schritt 3) das Standardprotokoll 4.1 durchgeführt. Der erste Waschschritt wurde mit W3 durchgeführt, das Elutionsvo¬ lumen betrug 1 x 50 μl.

Beispiel 4

Isolierung von Gesamt-RNA aus Lebergewebe (B)

Aus 15 mg Lebergewebe (Ratte) wurde Gesamt-RNA nach dem Stan¬ dardprotokoll 4.1 isoliert. Das Gewebe wurde mit 300 μl L6 versetzt und homogenisiert, anschließend wurden 175 μl Bl zugegeben. Der erste Waschschritt wurde mit W4 durchgeführt, das Elutionsvolumen betrug 1 x 50 μl.

Beispiel 5

Isolierung von Gesamt-RNA aus HeLa-Zellen

Aus 1 x 10 ⁷ HeLa-Zellen wurde Gesamt-RNA parallel nach den Standardprotokollen 4.1 und 4.2 isoliert. Die Zellen wurden jeweils mit 350 μl L7 versetzt und homogenisiert, anschließend wurden je 350 μl B4 zugegeben. Im Ansatz für die "batch-Proze- dur" (4.2) wurden zusätzlich 50 μl Silica-Suspension zugegeben. Der erste Waschschritt wurde mit W3 durchgeführt, das Elutions¬ volumen betrug 1 x 50 μl .

Beispiel 6

Isolierung von Gesamt-RNA aus Tabak

Zur Gesamt-RNA-Isolierung aus Pflanzen wird das Standardproto¬ koll 4.1 leicht modifiziert. Nach Schritt 1) des Protokolls (Lyse) , wird ein Zentrifugationsschritt bei 5.000 Upm in einer Tischzentrifuge eingefügt, um nicht lysierte Zellbestandteile, wie z.B. Faserreste, abzutrennen. Der Überstand wird abgenommen, mit Bindungsreagenz versetzt und ab Schritt 2) nach der Stan¬ dardprozedur weiterverarbeitet.

Aus 100 mg Tabakblättern wurde Gesamt-PJSTA nach dem für Pflanzen modifizierten Standardprotokoll 4.1 isoliert. Das pulverisierte Zellmaterial wurde mit 600 μl L2 versetzt und homogenisiert, anschließend wurden 350 μl B4 zugegeben. Der erste Waschschritt wurde mit W3 durchgeführt, das Elutionsvolumen betrug 1 x 50 μl.

Beispiel 7

Isolierung von Gesamt-RNA aus E. coli

Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Bakterien wird vor der Durchführung des Standardprotokolls ein zusätzlicher Ar¬ beitsschritt eingefügt, um die Zellwände der Bakterien zu lysieren. Hierzu wird das Zellpellet in 400 μg/ml Lysozym in TE resuspendiert und 5 min auf Eis sowie 10 min bei Raumtempe¬ ratur inkubiert. Anschließend wird nach der Standardprozedur lysiert.

Aus 1 x 10 ⁹ E.coli wurde Gesamt-RNA nach dem für Bakterien modifizierten Standardprotokoll 4.1 isoliert. Das Pellet wurde in 80 μl 400 μl/ml Lysozym in TE resuspendiert und wie oben

beschrieben inkubiert. Anschließend wurden 270 μl L2 zugegeben, homogenisiert und 350 μl B4 zugegeben. Der erste Waschschritt wurde mit W3 durchgeführt, das Elutionsvolumen betrug 2 x 50 μl .

Beispiel 8

Selektive RNA-Bindung durch Optimierung des Waschpuffers

Wie dieses Beispiel zeigt, können durch Optimierung des im ersten Waschschrittes verwendeten Waschpuffers (Standardpro¬ tokoll 4.1.5) DNA-Kontaminationen von der spezifisch gebundenen RNA entfernt werden.

1 x 10 ⁶ HeLa-Zellen wurden jeweils nach Standardprotokoll 4.1 in 350 μl L4 lysiert, mit 350 μl B4 versetzt und an den Silica- Träger gebunden. Die Proben wurden dann im ersten Waschschritt mit folgenden Waschpuffer gewaschen:

Probe Waschpuffer

Nr. M GTC 25 mM % Etha¬ TRIS/HCl nol pH 7.5

1 0.3 + 5

2 0.6 + 5

3 0.9 + 5

4 0.3 - 5

5 0.6 - 5

6 0.9 - 5

7 - 12 wie 1-6, jedoch 10 % EtOH

8 - 18 wie 1-6, jedoch 20 % EtOH

R*) 1.75 - 35

*) Die Probe diente als Referenz; die Zusammensetzung des Waschpuffers entsprach den Bindebedingungen

Tab. 1 Zusammensetzung der Waschpuffer zum Auswaschen von DNA-Kontaminationen

Die weiteren Arbeitsschritte erfolgten nach dem Standardproto¬ koll; das Elutionsvolumen betrug 1 x 50 μl.

Die Hälfte des Eluates wurde auf einem 1,2 % Formaldehydgel analysiert (vgl. Fig. 2) . Das Gel wurde anschließend wie unter

"elektrophoretische Methoden" beschrieben mit RNaseA behandelt

(vgl . Fig. 3) .

Legende zu Figuren 2 und 3

Fig. 2: 1,2 % Formaldehydgel zur Analyse der Eluate aus Beispiel 8, Bindebedingungen: 1,75 M GTC, 12.5 m; , Nacitrat pH 7.5, 35 % Ethanol; Waschbedingungen: vgl. Tab. 1. Die Benennung der Spuren entspricht der Bezeichnung der Proben in Tabelle 1.

Fig. 3: RNase-Dau des Geles Fig. 2

Beispiele 9 und 10

Isolierung von DNA

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen 9 und 10 wurden die Bindebedingungen so gewählt, daß nur die DNA an den mineralis¬ chen Träger binden kann, während die RNA durchbricht.

Auf die Aufarbeitung der nicht an den Träger gebundenen RNA wurde in diesen Beispielen verzichtet. Die Aufreinigung von RNA aus dem Säulendurchbruch wird in Beispiel 11 gezeigt. Darüber- hinaus kann die RNA im Säulendurchbruch durch Einstellung der in Beispiel 2 bis 8 gewählten Bindebedingungen aufgereinigt werden.

Die selektive DNA-Bindung erfolgt im Lysepuffer in Abwesenheit von Alkohol, d.h. Schritt 2) der Standardprotokolle 4.1 und 4.2 entfällt.

Beispiel 9

Isolierung von genomischer DNA aus Nierengewebe

10 mg Nierengewebe (Ratte) wurde in 700 μl L8 lysiert. Die DNA wurde ohne Zugabe von Bindungsreagenz an den mineralischen Träger gebunden und im ersten Waschschritt mit 700 μl L8 gewa¬ schen. Danach wurde das Standardprotokoll 4.1 ab Schritt 6) durchgeführt. Das Elutionsvolumen betrug 2 x 50 μl.

Beispiel 10

Isolierung von genomischer DNA aus HeLa -Zellen

1 x 10 ⁷ HeLa-Zellen wurden in 700 μl L9 lysiert. Die DNA wurde ohne Zugabe von Bindungsreagenz an den mineralischen Träger gebunden und im ersten Waschschritt mit 700 μl L9 gewaschen. Danach wurde das Standardprotokoll 4.1 ab Schritt 6) durchge¬ führt. Das Elutionsvolumen betrug 2 x 50 μl.

Beispiele 11 bis 13

Trennung von Gesamt-RNA und genomischer DNA

Die nachfolgenden Beispiele 11 bis 13 zur getrennten Aufar¬ beitung von RNA und DNA aus demselben Zell-Lysat stellen Ver¬ knüpfungen der oben aufgeführten Beispiele zur RNA-, DNA- bzw. Gesamtnukleinsäureisolierung dar.

Die Trennung kann entweder durch differentielle Bindung oder durch fraktionierte Elution von RNA und DNA erfolgen.

Beispiele 11 und 12

Trennung von Gesamt -RNA und genomischer DNA durch dif f erentielle Bindung

Zur differentielle Bindung gibt es wiederum zwei Möglichkeiten:

Nach der Lyse können die Bedingungen entweder so gewählt werden, daß zunächst die DNA an den mineralischen Träger bindet (Bei¬ spiel 11) , oder aber die RNA kann im ersten Bindungsschritt adsorbiert werden, während die DNA aus dem Durchbruch aufgear¬ beitet wird (Beispiel 12) .

Beispiel 11

Isolierung von genomischer DNA und Gesamt-RNA aus Nierengewebe

10 mg Nierengewebe (Ratte) wurden in 350 μl L8 lysiert und die DNA im Lysepuffer an den mineralischen Träger gebunden. Zum Säulendurchbruch wurden 350 μl B4 gegeben und analog Beispiel 3.1 die Gesamt-RNA isoliert. Die Isolierung der genomischen DNA erfolgte wie in Referenzbeispiel 1.

Beispiel 12

Isolierung von Gesamt-RNA und genomischer DNA aus Lungengewebe

Aus 20 mg Lungengewebe (Ratte) wurde die Gesamt-RNA wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert. Die nicht-gebundene genomische DNA im Säulendurchbruch wurde isoliert, indem 350 μl Bl und 350 μl B5 zugegeben wurden und die DNA wie in Standardprotokoll 4.1 beschreiben an den mineralischen Träger gebunden wurde. Der ersten Waschschritt wurde mit Wl durchgeführt, das Elutionsvolu¬ men betrug 2 x 50 μl.

Beispiel 13

Trennung von Gesamt-RNA und genomischer DNA durch fraktionierte Elu tion

Das folgenden Beispiel verdeutlicht die selektive Elution der DNA-Fraktion der an den mineralischen Träger gebundenen Ge¬ samtnukleinsäure.

Die Bindebedingungen werden so gewählt, daß die Gesamtnuklein¬ säure an den mineralischen Träger bindet. Die DNA-Fraktion wird anschließend eluiert, während die RNA-Fraktion gebunden bleibt. Die eluierte DNA wird durch erneutes Einstellen auf DNA-Bin¬ debedingungen (vgl. Fig. 1) an einen weiteren mineralischen Träger gebunden und aufgearbeitet.

Isolierung von genomischer DNA und Gesamt-RNA aus Lebergewebe

15 mg Lebergewebe (Schwein) wurden nach Standardprotokoll 4.1 1) bis 4) in 300 μl L2 lysiert, mit 250 μl Bl versetzt und die Gesamtnukleinsäure an den mineralischen Träger gebunden. Die DNA-Fraktion wurde mit 300 μl W5 eluiert, während das Träger- material mit der noch gebundenen RNA-Fraktion ab 5) nach dem Standardprotokoll 4.1 behandelt wurde. Die DNA-Fraktion wurde aus dem Eluat durch Zugabe von 350 μl Bl und 250 μl B5 und Bindung an einen weiteren mineralischen Träger nach dem Stan¬ dardprotokoll 4.1 isoliert.