Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung des Abbaus von Osteocalcin in humanem Serum oder Plasma sowie

Instrumente und Probengefäße zur Durchführung dieses Verfah¬ rens. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Verfahren zur Stabilisierung von endogenem Osteocalcin in humanen Se¬ rum- oder Plasmaproben bezeichnet werden, da es darauf be- ruht, daß der während der Zeit zwischen der Probengewinnung und der Messung des Osteocalcins normalerweise zu beobach¬ tende Abbau des endogenen Osteocalcins verhindert wird.

Humanes Osteocalcin, das auch als Vitamin K-abhängiges Kno- chenprotein oder γ-Carboxyglutaminsäure enthaltendes Protein [im englischsprachigen Schrifttum: bone Gla protein (BGP) ] bezeichnet wird, ist ein spezifischer Peptidbestandteil der Knochenmatrix. Das Peptid besteht aus 49 Aminosäuren und weist die folgende Aminosäuresequenz auf:

Tyr-Leu-Tyr-Gln-Trp-Leu-Gly-Ala-Pro-Val-Pro-Trv-Pro-Asp-Pro- Leu-Glu-Pro-Arq-Arq-Gla-Val-Cvs-Gla-Leu-Asn-Pro-Asp-Cys-Af-p - Glu-I-eu-Ala-Asp-Arq-Ile-Gly-Phe-Gln-Glu-Ala-Tyr-Arg-Arg-Phe - Tyr-Gly-Pro-Val ⁴⁹

Das Peptid wird von den Osteoblasten synthetisiert, und ein geringer Teil des gebildeten Osteocalcins gelangt in das Blut. Über die Bestimmung der Konzentration dieses Osteocal¬ cins im Blut sind bestimmte wertvolle Rückschlüsse auf den Stoffwechsel des Knochens möglich, wobei zur ergänzenden In¬ formation auf die Arbeit von ian, J.B. und Gundberg, CM. in: Clinical Orthopaedics and Related Research, 226, Seite 267 bis 291 (1988) verwiesen wird. Über die Bestimmung der Osteocalcinkonzentration in humanem Serum oder Plasma können danach möglicherweise hilfreiche Informationen für die Dia¬ gnose und Therapie von Knochenstoffwechselstörungen erhalten werden.

Zur Messung der Osteocalcinkonzentration wurden verschiedene Verfahren entwickelt. So ist nach an sich bekannten Verfah¬ ren die Bestimmung der Osteocalcinkonzentration auf immundi¬ agnostischem Wege möglich, beispielsweise nach dem Verfahren gemäß US-A-4 438 208 und der in dem Patent DE 38 33 936 der Anmelderin beschriebenen verbesserten Ausführungsform eines solchen Verfahrens.

Die EP 0 557 663 AI betrifft ein immundiagnostisches Bestim¬ mungsverfahren, bei dem ein ganz spezieller monoklonaler Antikörper gegen Osteocalcin verwendet wird, der bestimmte Konformationen erkennt, die für das sogenannte decarboxy- lierte oder untercarboxylierte Osteocalcin typisch sind. Das decarboxylierte oder untercarboxylierte Osteocalcin unter¬ scheidet sich dadurch von carboxyliertem Osteocalcin, daß bei ersterem die ursprünglichen GLU-Reste in den Positionen 17, 21 und 24 des Osteocalcinmoleküls nicht oder nicht voll¬ ständig zu GI_A-Resten carboxyliert sind. Der unterschiedli¬ che Carboxylierungsgrad führt dazu, daß sich die Formen kon-

formativ unterscheiden.

Damit man mit einem "konformativen" Antikörper der verwende¬ ten Art auch die Gesamtmenge an Osteocalcin messen kann, d.h. also auch das carboxylierte Osteocalcin erfassen kann, wird der Probe für die Bestimmung ein Calciumsalz zugesetzt, da sich gezeigt hat, daß sich in Anwesenheit des Calciumsal- zes die Konformation des carboxylierten Osteocalcins so ver¬ ändert, daß der spezielle Antikörper auch das carboxylierte Osteocalcin erkennt und dieses für Meßzwecke genau wie das de- bzw. untercarboxylierte Osteocalcin bindet. Es geht in der EP 0 557 663 AI nicht um eine Stabilisierung des Osteo¬ calcins zwischen der Probennahme und der eigentlichen immun¬ diagnostischen Bestimmung.

Unabhängig davon, nach welchem Verfahren die Osteocalcinkon¬ zentration bestimmt wird, ist es für eine zuverlässige und klinisch relevante Bestimmung des Osteocalcins in der Probe Voraussetzung, daß die gemessene Osteocalcinkonzentration die Konzentration zum Zeitpunkt der Blutabnahme wiederspie¬ gelt. Konzentrationsveränderungen im Zeitraum zwischen Blut¬ entnahme und eigentlicher Konzentrationsmessung führen näm¬ lich dazu, daß unbrauchbare Meßergebnisse erhalten werden.

Es ist nunmehr bereits bekannt, daß endogenes Osteocalcin in Blutproben abgebaut wird (siehe Lian und Gundberg (1988) a. a. 0. und Coleman et al (1988) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 24, 1211-1217) . Das hat zur Folge, daß in Abhängigkeit von der Art und Dauer der Lagerung der Probe vor der Messung "falsch niedrige" Osteocalcinkonzentrationen im Serum oder

Plasma gefunden werden. Es wurde bereits vorgeschlagen, die¬ ses Problem dadurch zu umgehen, daß man Seren/Plasmaproben unmittelbar nach ihrer Gewinnung vor einer Lagerung ein¬ friert oder lyophilisiert. Beide Verfahren sind jedoch un- praktisch (z. B. der Transport von Seren in gefrorenem Zu¬ stand) oder teuer und aufwendig (Lyophilisation) .

Eine sofortige Messung der Osteocalcinkonzentration unmit¬ telbar im Anschluß an eine Probennahme ist nur in den seltensten Fällen möglich, keinesfalls jedoch in der norma¬ len ärztlichen Praxis, wo es üblich ist, die von den Patien- ten gewonnenen Proben zur Untersuchung an ein Labor zu ver¬ schicken.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbes¬ sertes Verfahren zur Bestimmung von Osteocalcin in humanem Serum oder Plasma zu schaffen, bei dem der Abbau des endogenen Osteocalcins in der Probe verhindert und damit als Fehlerquelle beseitigt werden kann und bei dem zur Proben- stabilisation keine aufwendigen, unüblichen technischen Ma߬ nahmen getroffen werden müssen.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß Oberbegriff von Anspruch 1 dadurch gelöst, daß man der Probe unmittelbar bzw. während ihrer Gewinnung eine zur Verhinderung des O- steocalcinabbaus ausreichende Menge an divalenten Metallio- nen, insbesondere an Calciumionen, zusetzt.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfah¬ rens sind in den Unteransprüchen 2 bis 6 beschrieben.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können be¬ sonders präparierte Instrumente oder Probengefäße verwendet werden, wie sie in den Ansprüchen 7 und 8 näher beschrieben sind.

Bei der Schaffung der vorliegenden Erfindung wurde der Weg eingeschlagen, eine Substanz zu suchen, die, dem Serum oder Plasma zugesetzt, den Abbau des endogenen Osteocalcins ver¬ hindert.

Dabei wurde von der auch von Lian und Grundberg (1. 1. O.) geteilten Annahme ausgegangen, daß der Abbau des Osteocal¬ cins proteolytischer Natur ist, d. h. von im Serum und Pias-

ma vorhandenen Proteasen verursacht wird. Daher wurde zuerst versucht, den Osteocalcinabbau durch Zusatz geeigneter Pro- teolysehemmstoffe zu unterdrücken, beispielsweise solcher, wie sie in dem Verfahren gemäß Patent DE 38 33 936 erfolg- reich zur Verhinderung des Tracerabbaus eingesetzt wurden. Es zeigte sich, daß es nicht möglich ist, mit den bisher er¬ probten Proteolysehemmstoffen den Abbau des Osteocalcins zu verringern. Als dann versucht wurde, die ebenfalls als Pro- teolysehemmstoffe bekannten Metallchelatoren EDTA und o-Phenanthrolin zur Hemmung des Osteocalcinabbaus zuzuset¬ zen, wurde überraschenderweise statt einer Hemmung eine Be¬ schleunigung der Osteocalcinhydrolyse beobachtet.

Aus dieser Beobachtung wurden dann Schlüsse gezogen, die die Schaffung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichten: Wenn die beschleunigende Wirkung der Metallchelatoren auf den Osteocalcinabbau darauf beruht, daß die Metallionenkon- zentration in der Probe verringert wird, ist diese Metallio¬ nenkonzentration für die Abbaubarkeit des Osteocalcins wich- tig. Es wurde daher versucht, durch eine Erhöhung der Metal¬ lionenkonzentration im Serum eine Stabilisierung des Osteo¬ calcins zu erhalten.

Es zeigte sich, daß der Zusatz von löslichen Calciumsalzen, z. B. von Calciumchlorid CaCl ₂ , den Abbau von Osteocalcin völlig unterdrückt, wenn die zugesetzten Konzentrationen richtig gewählt werden. Zu diesem Zwecke wurde eine Reihen¬ untersuchung durchgeführt, die ergab, daß erst oberhalb von 20 mM CaCi ₂ in der Probe keine Veränderung der Osteocalcin- konzentration, nachgewiesen anhand der Osteocalcin-Immunre¬ aktivität, mehr erhalten wurde.

Offensichtlich wird durch Zusatz von Calciumionen und ande¬ ren, wie Calciumionen wirkenden zweiwertigen Metallionen das Osteocalcin in einen Zustand überführt, in dem es durch die anwesenden Proteasen nicht mehr abbaubar ist, ohne gleich¬ zeitig die für seine Bestimmung auf immundiagnostischem Wege

wesentliche Immunreaktivität zu verlieren.

Als Metallionen, die gleich oder ähnlich wie Calciumionen wirken, kommen insbesondere zweiwertige Metallionen und da- bei insbesondere wieder Magnesiumionen, Zinkionen,

Cobaltionen in Betracht ^* , es ist jedoch vorstellbar, daß sich in Kenntnis des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels einfa¬ cher Reihenversuche auch noch weitere zweiwertige oder mög¬ licherweise sogar dreiwertige Metallionen finden lassen, die im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Stabilisierung der Osteocalcinkonzentration wirksam sind.

Es ist ferner denkbar, daß gewisse Substanzen, von denen be¬ kannt ist, daß sie biochemisch ähnlich wirken wie Calciumio- nen, erfolgreich zur Verhinderung des Osteocalcinabbaus ein¬ gesetzt werden können.

Die Metallionen sollen der Probe aus einleuchtenden Gründen grundsätzlich so früh wie möglich nach der Probengewinnung zugesetzt werden, um das Einsetzen eines Osteocalcinabbaus in der gwonnenen Probe von Anfang an zu unterbinden.

Die Metallionen können grundsätzlich in beliebiger Form zu¬ gesetzt werden, solange sie ausreichend in der Probe in Lö- sung gehen. So können sie in Form löslicher fester Salze oder in Form von Lösungen in wäßrigen oder wassermischbaren Lösungsmitteln zugesetzt werden, solange die verwendeten Lö¬ sungsmittel, die nachfolgende Messung nicht stören.

In der Praxis kann das erfindungsgemäße Verfahren in ver¬ schiedener Weise vorteilhaft verwirklicht werden. So können Kits zur Osteocalcinbestimmung Substanzen und/oder präparierte Probengefäße beigefügt werden. Beispielsweise können die erforderlichen Calciumkonzentrationen in Form von Calciumtabletten beigefügt werden.

Da die Stabilisierung jedoch bereits bei der Probengewinnung

zu erfolgen hat, während die eigentliche Messung an einem ganz anderen Ort vorgenommen wird, ist es für die in der täglichen ärztlichen Praxis durchzuführenden Probennahmen von Vorteil, wenn spezielle Instrumente oder Probengefäße für die Osteocalcinbestimmung dem Arzt direkt zur Verfügung gestellt werden. So können dem Arzt Calciumtabletten in der richtigen Dosierungsmenge für die Probenstabilisation zur Verfügung gestellt werden, es können ihm jedoch auch speziell präparierte Instrumente, wie beispielsweise Blut- entnahmespritzen oder spezielle Gefäße für die Aufbewahrung und die Verschickung der Proben zur Verfügung gestellt wer¬ den, die die erforderlichen Metallkonzentrationen in geeig¬ neter Form von vorn herein enthalten. Eine vorteilhaft er¬ scheinende Möglichkeit der Präparierung derartiger Instru- mente oder Probengefäße besteht darin, auf der Wand einen festen, in der Probe löslichen Film anzubringen, der die Me¬ tallionen enthält und an die Probe freigibt. Dieser Film kann ausschließlich ein aufgetrockneter Salzfilm sein, er kann aber auch ein neutral reagierendes, probenlösliches Bindemittel enthalten. Die Metallionen werden in Form geeig¬ neter wasserlöslicher Salze mit verträglichen Anionen einge¬ setzt. So lassen sich die bevorzugten Calciumionen erfolg¬ reich in Form von Calciumchlorid einführen. Schlechtlösliche oder unlösliche Salze scheiden als ungeeignet in der Regel aus, genau wie solche Salze, deren Anionen für die Stabili¬ tät der Probe oder die nachfolgende Messung schädlich sind, beispielsweise wegen einer unerwünschten Beeinflussung des pH-Wertes.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand von Versuchen und Vergleichsversuchen noch näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 die Abnahme der Osteocalcinkonzentration in vier Serumproben als prozentuelle Abnahme der Osteocalcin-Immunreaktivität in einem RIA;

Fig. 2 den Effekt der Zugabe von CaCl ₂ (20 mM) zu

Proben entsprechend Fig. 1; und

Fig. 3 den Effekt der Zugabe von CaCl ₂ (20 mM) zu

Proben, bei denen die Osteocalcinkonzentra¬ tion als prozentuale verbleibende Osteocal¬ cin-Immunreaktivität in einem anderen kommer¬ ziellen RIA als in den Fig. 1 und 2 bestimmt wurde.

Fig. 4 den Vergleich des Osteocalcinabbaus in Serum¬ proben mit und ohne CaCl ₂ (20 mM) bei 4-tägi- ger Lagerung bei Raumtemperatur

Versuchsbeschreibunqen

Der Effekt verschiedener Substanzen und Zusatzmengen auf die Serum- und Plasmaproben im Hinblick auf die Stabilisierung der Osteocalinkonzentration in den Proben wurde bestimmt, indem die Osteocalcinmengen in den Proben zu verschiedenen Zeitpunkten und unter verschiedenen Bedingungen mit Hilfe des OSCAtest Osteocalcin BGP (Henning Berlin GmbH) ermittelt wurden.

Der verwendete RIA bestand aus folgenden Komponenten:

mit Anti-Osteocalcin (37-49) -Antikörper (polyklonal, Schaf) beschichteten Teströhrchen

- einem radioaktiv markierten Tracer (Analogpeptid N-Ace- tyl- ¹²⁵ I-Tyr-Gln-Glu-Ala-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Gly-Pro- Val) , der durch Zusatz von Leupeptin stabilisiert wurde (vgl. Patent DE 38 33 936)

- einer Standardreihe, welche aus humanem Knochenextrakt und humanem, osteocalcinfreiem Serum gebildet wurde

Durchführung des RIA:

In die Teströhrchen werden jeweils 50 μl Standard bzw. 50 μl Patientenserum und 250 μl Tracer pipettiert. Nach einer 20- 24-stündigen Inkubation bei 4°C wird durch einen Wasch¬ schritt freier von gebundenem Tracer getrennt und die im Röhrchen verbliebene Radioaktivität vermessen.

Wie aus HPLC-Untersuchungen bekannt ist, erkennt dieser RIA ausschließlich das intakte Osteocalcin.

Typische Ergebnisse, wie sie infolge eines Osteocalcinabbaus in den Proben erhalten werden, sind in Fig. 1 gezeigt. Die in der Figur wiedergegebenen Ergebnisse wurden dadurch er- halten, daß man frischgewonnene Seren für die in dem Dia¬ gramm angegebenen Zeiten bei Raumtemperatur (25°C) inkubier¬ te. Nach den angegebenen Zeiten wurde der Abbau beendet, indem die Proben eingefroren wurden. Anschließend wurden sämtliche Proben dann in einem Assaylauf mittels des oben beschriebenen RIA auf Osteocalcin vermessen.

Dabei zeigten die Kurven den Verlauf der Osteocalcin-Immun¬ reaktivität als Maß für die Konzentration des intakten Osteocalcins in den Proben für normale Seren.

Wie Fig. 1 zu entnehmen ist, wird in allen Proben ein deut¬ licher Abbau des Osteocalcins (Abnahme der Osteocalcin-Im¬ munreaktivität) erhalten, wenn Seren bei 25°C gelagert wer¬ den. Dieser Abbau läuft auch bei 4°C mit nur geringfügig verringerter Geschwindigkeit ab.

Versuch der Hemmung des Osteocalcinabbaus durch Zusatz von Proteolvsehemmstoffen

Im Einklang mit der Abnahme eines von Proteasen verursachten Osteocalcinabbaus wurde versucht, den Osteocalcinabbau durch

Zusatz von Proteolysehemmstoffen (ähnlich wie in Patent DE 38 33 936) zu verhindern.

Folgende Hemmstoffe wurden auf ihre Fähigkeit hin unter- sucht, den in Fig. 1 gezeigten Abbau von Osteocalcin zu ver¬ mindern, wobei in den Klammern hinter den geprüften Substan¬ zen die Inhibitorkonzentration zum Zeitpunkt der Inkubation mit Serum angeben ist :

Amastatin (100 μM) , Bestatin (100 μM) , Leupeptin (100 μM) ,

Pepstatin (100 μM) , Elastatinal (100 μM) , Benzamidin (1 mM) , Phosphoramidon (1 mM) , Trasylol (1,6 x 10 ⁶ Einheiten/ml), Heparin (5 mg/ml), Trypsin-Inhibitor aus der Sojabohne (0,1 mg/ml) , Antithrombin III (0,1 Einheiten/ml), N-Ethylmaleimid (2 mM) , p-Chlormercuriphenylsulfonsäure (1 mM) , Diisopropyl- fluorophosphat (1 mM) , Phenylmethylsulfonylfluorid (2 mM) , o-Phenanthrolin (5 mM) , Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (10 mM) .

Keine dieser Substanzen führte zu einer Verringerung des Ab¬ baus von Osteocalcin. Im Falle der Metallchelatoren EDTA und o-Phenanthrolin wurde sogar eine Beschleunigung der Osteo- calcinhydrolyse beobachtet.

Zusatz von Calciumionen (CaCl ₂ )

Als anstelle von Proteolysehemmstoffen CaCl ₂ den Proben in einer solchen Menge zugesetzt wurde, daß die Konzentration in den Proben 20 mM betrug, wurde festgestellt, daß der Ab- bau von Osteocalcin vollständig unterdrückt war. Die Ergeb¬ nisse sind in Fig. 2 gezeigt.

Wie zu erkennen ist, bleibt bei Zusatz von CaCl ₂ zu der Probe die Osteocalcin-Immunreaktivität über einen Zeitraum von 4 Tagen unverändert .

Um die Calciumkonzentration zu ermitteln, die als Mindest-

relle Gültigkeit haben und nicht von dem eingesetzten kon¬ kreten RIA-Meßverfahren abhängig sind, wurde die Messung des Abbaus von Osteocalcin mittels des kommerziellen Osteocalcin RIA der Firma Isotopen Diagnostik CIS GmbH wiederholt.

Frischgewonnene Seren wurden für die in Fig. 3 angegebenen Zeiten in An- oder Abwesenheit von CaCl ₂ (20 mM) bei 25°C inkubiert. Die Bestimmung der verbleibenden Osteocalcinkon¬ zentration mittels des angegebenen RIA zeigte, daß durch Zusatz von CaCl ₂ die Abnahme der Osteocalcinkonzentration verhindert werden konnte.

Um den Abbau von Osteocalcin mit einer weiteren Methode zu untersuchen, wurde ein weiteres Experiment durchgeführt:

Radiojodiertes bovines Osteocalcin 1-49 (1 x 10 ⁶ cpm) wurde mit humanem Serum (300 μl) mit und ohne CaCl ₂ inkubiert (48 Stunden, 25°C) . Die Reaktionsmischung wurde anschließend über HPLC analysiert.

Als Trennsäule wurde eine μBondapak C ₁₈ -Säule der Firma Wa¬ ters verwendet. Die Säule war in Laufmittel A (Wasser : Ace- tonitril : Trifluoressigsäure) (95 : 5 : 0,1) (V/V/V) äqui- libriert. Nach dem Auftragen der Probe wurde in einem Gra- dienten aus Laufmittel A und Laufmittel B (Wasser : Acento- nitril : Trifluoressigsäure) (10 : 90 : 0,1) (V/V/V) elu- iert: In 3 min linear von 100/0 A/B nach 85/15 A/B, linear in 37 min auf 20/80 A/B und anschließend in 5 min linear auf 0/100 A/B. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1 ml/min. Die Radioaktivität des Säulenausflusses wurde kontinuierlich mittels eines Ramona-Radioaktivitätsmonitors (Fa. Raytest) detektiert.

Ergebnis:

Neben dem bovinen Osteocalcin (Elutionszeit : 17,1 min) wur¬ den weitere Peaks (Elutionszeiten 2,4, 7,2 und 9,5 min)

beobachtet, deren Entstehung jedoch durch den Zusatz von 20 M CaCl ₂ vollständig unterdrückt werden konnte.

Die Ergebnisse zeigen, daß der Abbau von bovinem Osteocalcin durch Zusatz von 20 mM CaCl ₂ völlig verhindert werden kann.