SECTOR DE LA TÉCNICA Industria láctea, transformación de frutos secos, producción de horchata, producción de leche de almendras, postres lácteos.

ESTADO DE LA TÉCNICA En las zonas de clima templado y seco, existen pocas explotaciones de ganado vacuno, por lo que evidentemente, la leche para consumo en fresco no es parte de su acervo cultural. Sin embargo, tradicionalmente se han elaborado numerosas bebidas a partir de productos vegetales de gran valor nutricional y notables cualidades organolépticas, entre las que destacan la leche de almendras y la horchata. El consumo de almendra y productos derivados está ligado a la cultura de estas regiones de clima mediterráneo desde tiempos prerromanos, constituyendo un alimento de alto valor nutritivo y energético de baja alergenicidad. Su composición bioquímica varia poco entre las numerosas variedades conocidas: la fracción lipidica es rica en ácidos grasos poliinsaturados, por lo que posee propiedades anticolesterolémicas, sus proteínas son altamente digeribles y el principal carbohidrato que contiene es la sacarosa (Características fisico-quimicas y tecnológicas de la almendra de la Comunidad Valenciana (1999) , Monografías. VoIs I, II y III.- AINIA, Valencia) . Sus cualidades sensoriales son excelentes pues tienen sabor propio y característico. Desde antiguo se conoce y utiliza la "leche de almendras" por sus propiedades nutricionales en nutrición infantil de sustitución, como complemento de la dieta en mujeres en lactación y personas de edad avanzada, asi como por sus propiedades cosméticas. Teniendo en cuenta la composición porcentual media del fruto seco (Tabla 1) , la leche o lechada de almendras con un contenido en materia seca del 10-15% puede aproximarse nutricionalmente a la leche de vaca, con un ligero exceso de grasa y deficiencia de azúcares. No obstante, el contenido en minerales de la leche de vaca es todavía muy superior (Tabla 2) .

Tabla 1 Comparacióndel contenido promedio en nutrientes de las principales variedades de almendra con la leche de vaca. GJ

FUENTES : (a) Características fisico-químicas y tecnológicas de la almendra de la Comunidad Valenciana (1999) , Monografías . VoIs I, II y III.- AINIA, Valencia; USDA National Nutrient Datábase for Standard Reference, Reléase 16 (July2003) . (b) MiIk and Dairy product technology (1998) (ed. E: Spreer) Marcel Deckker , Inc, New York, USA.

Tabla 2 Comparación del contenido promedioen minerales de las principales variedades de almendra con la leche de vaca (mg/100 g)

FUENTES : (a) Características fisico-químicas y tecnológicas de la almendra de la Comunidad Valenciana (1999) , Monografías. VoIs I, II y III.- AINIA, Valencia. (b) MiIk and Dairy product technology (1998) (ed. E: Spreer) Marcel Deckker , Inc, New York, USA

Existen hoy en día numerosas casas comerciales que distribuyen productos líquidos fabricados exclusivamente a partir de almendras, avellanas u otros frutos secos, a los que legalmente no se puede denominar leche y que en su defecto utilizan los términos batido, lechada, etc. El producto comercial más antiguo de esta gama puede que sea la crema o concentrado de almendras, que es una pasta de almendras finamente molidas lista para disolver en agua por el consumidor y que se conserva bien gracias a la elevada concentración de azúcar añadido (40%) . Sin embargo, no consta que existan publicaciones ni producto comercial registrado que se hay preparado fermentando este sustrato. En la cuenca mediterránea y norte de África se cultiva y consumen los tubérculos de Cyperus sculentus (inglés: "earth almond", "tigernut") como fruto seco. En España se denomina "chufa", y con ella se prepara la horchata, llamada antiguamente leche de chufa. Este extracto de chufa posee un alto contenido en almidones y azúcares (Tabla 3) , asi como una gran proporción de ácidos grasos poliinsaturados (principalmente ácido oleico) . Tabla 3 Valor nutricional de la horchata de chufa (Tigernut,Cyperus sculentu^

FUENTES: (a) La horchata de chufas: higienización, estabilización y tipificación (1985) Editores: B.Lafuente, F. Gasque, F. Piñaga, R. ViIa. Instituto de Agroquimica y Tecnología de Alimentos (CSIC) I. S.B.N. : 84-00-06072-5. (b) Real decreto 1338/1988, de 28 de octubre, por el que se aprueba la reglamentación técnico-sanitaria para la elaboración y venta de horchata de chufa.

La elaboración tradicional de la horchata de chufa comienza con el lavado y tratamiento germicida de la chufa. Una vez aclarado, se ponen en remojo un tiempo, se aclara y se procede a su trituración en un molino. En la trituración se añaden aproximadamente 3 litros de agua por kilo de chufa, se prensa para obtener el primer extracto y se tamiza. El residuo del tamiz y el del prensado se mezclan, añadiendo alrededor de dos litros de agua por Kg de chufa, se prensa, tamiza y forma un segundo extracto que se une al anterior, con lo que se obtiene el extracto final. Finalmente el proceso de elaboración de la horchata se completa disolviendo la proporción deseada de azúcar de caña (sacarosa) , por lo general entre 100 y 150 gramos por litro de extracto, se tamiza de nuevo (procedimiento resumido, según el Consejo Regulador de la Horchata de Chufa de Valencia, www.chufadevalencia.org/ESP/HORCHATA) . Tradicionalmente se consumía de forma estacional y en fresco, pero numerosas firmas comerciales distribuyen todo el año este producto pasteurizado, esterilizado o congelado. Posee propiedades organolépticas muy características, sin embargo, su alto contenido en almidones no solubles y la falta de emulgentes naturales en este producto dificultan en gran medida su conservación en frió y su estabilidad tras el tratamiento térmico. Tampoco existe registro conocido de productos fermentados obtenidos a partir de horchata. Debido a los problemas de intolerancia a lactosa, alergias a proteínas de la leche y a una fuerte saturación del mercado, se observa el incremento en investigaciones y publicaciones, en las que se describe el uso de sustratos de fermentación de origen vegetal. Sin embargo, en ninguno se utilizó leche de almendra, de frutos secos u horchata como materia prima [Martensen, 0., Oste, R. y Obst, H. (2002) Texture promoting capacity and EPS formation by lactic acid bacteria in three different oat-based non-dairy media. Eur Food Res Technol 214: 232-236; Kovalenko-IV; Briggs-JL (2002) Textural characterization of soy-based yogurt by the vane method. Journal-of-Texture-Studies 33 (2) 105-118 ;Ashay-βDA; Taiwo-LB; Fasoyiro-SB; Akinnagbe-CA (2001) Compositional and shelf-life properties of soy- yogurt using two starter cultures. Nutrition-and-Food- Science; 31 (5) 247-250; Yazici-F; Alvarez-VB; Hansen-PMT (1997) Fermentation and properties of calcium-fortified soy milk yogurt. Journal-of-Food-Science; 62 (3) 457-461 ; Heenan-CN; Adams-MC; Hosken-RW; Fleet-GH (2002) Growth médium for culturing probiotic bacteria for applications in vegetarian food products. Lebensmittel-Wissenschaft-und- Technologie; 35 (2) 171-176] . También ha irrumpido en el mercado (especialmente en tiendas de alimentación natural, orgánica y vegetariana) una serie de sustitutivos lácteos y productos fermentados de origen vegetal, legumbres, fundamentalmente de soja, a pesar de sus carencias organolépticas y ciertos problemas de alergias derivados de su proteina. Existen patentes que registraron la utilización de productos vegetales como base para una fermentación láctica. Por ejemplo, la solicitud US2003031756: Method for preparing food products by fermenting soy milk with Streptococcus thermophilus. Boufassa Corinne; Tourancheau Myriam, 2003-02-13 , GERVAIS DANONE SA (US), recoge un procedimiento para la obtención de un nuevo tipo de producto, con postacidificación reducida, por fermentación con Streptococcus thermophilus, u otras bacterias lácticas, partiendo de leche de soja como base (50%), a la que se adicionan otros componentes, como harinas de granos o leche de almendras. Su diferente composición le aportará propiedades intrínsecamente diferentes al producto que se describe en esta invención. Por ejemplo, la patente CN1385082 Lactic acid drink having almond protein and preparation process thereof. Ma Jing. 2002-12-18, presenta una bebida acida obtenida a partir de leche y leche de almendra como materia prima, que se somete a fermentación láctica. Esta bebida se describe con propiedades beneficiosas para la salud y sabor agradable. No obstante, posee leche, algo que se pretende evitar en dietas vegetarianas, de alergia o intolerancia a componentes de la leche. Por ejemplo, la solicitud CN1270217: Green-series functional beverages An Guoqing, 2000-10-18, también describe el uso de leche fermentada como producto de partida al que se añaden batidos o extractos de nuez, cacahuete, sésamo negro, almendra, flor de crisantemo, etc., con el fin de mejorar su contenido en nutrientes o promover su absorción, prevenir o curar enfermedades. Como se ha mencionado, en esta invención que se describe más adelante se trató de evitar el uso de leche. Por otro lado, existe un gran auge de los denominados "Alimentos Funcionales", algunos de ellos por contener microorganismos calificados como probióticos. Éstos son microorganismos que, más allá del mero aporte nutricional, ejercen efectos beneficiosos sobre uno o más órganos, mejorando el estado general de salud, o reduciendo el riesgo de contraer enfermedades [American Journal of Clinical Nutrition (2001) Special issue on Prebiotics and Probiotics, Feb; VoI 73 (2 Suppl) ] . De forma más concreta, se ha demostrado los siguientes efectos de las bacterias "funcionales" (probióticos) : reducen el contenido en lactosa de productos lácteos, favorecen la degradación del colesterol y sales biliares, mejoran la respuesta inmunológica tanto local como sistémica, inhiben la proliferación de patógenos, producen numerosos metabolitos beneficiosos y vitaminas, y contribuyen a la eliminación de compuestos cancerigenos. Aunque los alimentos que los contienen se clasifican como Alimentos Funcionales, en muchos paises no pueden denominarse yogures ya que, por ejemplo, según el CODEX Alimentario español, "yogur es un producto fermentado hecho con leche (de vaca u otro animal) que contiene como minimo 107 ufc/ml de Streptococcus salivarius subsp thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus"

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención En esta invención, se describe cómo aprovechar la riqueza nutricional y las cualidades sensoriales de la almendra, frutos secos no legumbres y horchata, para preparar productos fermentados con bacterias lácticas y probióticos. Se han obtenido productos ante todo sabrosos, con múltiples efectos beneficiosos sobre la salud: Aquellos derivados de la almendra y frutos secos (ácidos grasos poliinsaturados, proteinas de fácil digestibilidad, bajo contenido en azúcares) y las propiedades probióticas de las bacterias que se utilicen. Estos, excluyen la presencia de proteinas lácteas, lactosa y proteinas de soja, evitando problemas de intolerancia y alergias, asi como su sabor a habichuela (soja) . Además, se puede edulcorar o enriquecer estos productos en ciertos minerales (Fe, Ca) , vitaminas, fibra u oligosacáridos con efecto bifidogénico, etc. Debido también a su alto contenido en potasio y magnesio, estos productos constituyen un excelente complemento nutricional para sectores concretos de población, como niños, adolescentes, deportistas o personas de tercera edad. Descripción detallada de la invención La presente invención consiste en una gama de productos obtenidos por fermentación láctica de bebidas, de origen vegetal, tradicionales en la Europa mediterránea y norte de África, como pueden ser la leche (o batido) de almendras y la horchata, asi como otros productos nuevos de similar naturaleza obtenidos de otros frutos secos. Tanto la leche de almendras como la horchata, son productos muy ricos en nutrientes, aunque con diferente composición. La deliberada ausencia de leche, soja y derivados de ambos en estos nuevos productos evitará problemas de intolerancia y alergias a aquellos. Además, estos nuevos productos ofrecen sabores básicos diferentes que excluyen el sabor lácteo, asi como el marcado sabor a habichuela de la soja y sus derivados. En el producto obtenido los recuentos de coliformes son cero, y posee baja postacidificación, es decir el pH desciende menos de 0,1-0,2 unidades de pH en 28 dias. A estos productos, se les pueden añadir sustancias y aditivos para obtener productos que posean caracteristicas fisicoquimicas, nutricionales y sensoriales muy diversas. Asi mismo, puede eliminarse todo o parte del aceite de la almendra, que por si mismo es valioso, para obtener derivados bajos en grasa y para estandarizar el producto.

La leche (o batido) de almendras, frutos secos y horchata. - Tiene una gran importancia la obtención de una matriz liquida que contenga azúcares fermentables por las bacterias lácticas que se utilizarán como iniciadores, asi como proteinas y aditivos, de forma que se obtenga una buena textura y viscosidad en el producto fermentado terminado (equivalente a la del yogur tradicional, yogures bebibles o leches fermentadas) . Además, la matriz liquida de partida debe poseer una gran calidad microbiológica, al menos equivalente a la leche de vaca pasteurizada (recuentos de patógenos y enterobacterias = 0; mesófilos totales <102) , puesto que normalmente se someterá a temperaturas de 30-370C durante la fermentación. Para ello, todos los procesos se deben realizar de forma muy higiénica. El proceso se inicia con el triturado, este puede realizarse en una o varias fases. Si se realiza en una sola fase, se añaden antes los azúcares y aditivos. Si se realiza un triturado grosero previo, se añaden los azúcares y otros aditivos tras este primer triturado, antes del molido fino. Para el molido fino, se utiliza un molino de piedras o coloidal hasta obtener una suspensión de textura al gusto, desde suave a granulosa, ajustándose la concentración de materia seca también al gusto. A continuación se procede la extracción (o adición) de ácidos grasos o aceites y, posteriormente, a su homogeneización, hasta obtener un tamaño uniforme de las particulas en suspensión. En los ensayos realizados, los aditivos se adicionan antes del molido fino por adaptarse mejor a nuestras condiciones, pero podrian añadirse en otras fases de la preparación. El tratamiento térmico es de fundamental importancia, para reducir los recuentos bacterianos y, por tanto, asegurar su calidad higiénica, realizándose a continuación del molido y homogeneización. Las condiciones de temperatura, tiempo y presión dependerán de la naturaleza del producto (por ejem. almendras, avellanas, chufa, etc) , del tamaño de particulas de la suspensión, su concentración de sólidos, viscosidad, carga microbiológica entes del tratamiento y de la estabilidad al tratamiento térmico de los componentes. Este tratamiento puede provocar la desnaturalización de las proteinas, pero favorece la gelificación de los almidones propios, asi como de los aditivos añadidos para estabilizar el producto, como goma de xantano, pectina, goma de garrofin, goma de acacia u otros polimeros. Los ensayos con leche de almendra que se describen en esta patente se realizaron sobre materia prima pasteurizada en nuestra planta piloto, pero también se ensayó la fermentación sobre producto comercial (batido de almendras, Diemilk, Nitriops) tratado a altas temperaturas (UHT) con los mismos resultados. Así mismo, los ensayos con leche (batido) de avellana y horchata, se realizaron con productos esterilizados por el método UHT.

Fermentación.- Las bacterias lácticas y bifidobacterias utilizadas fermentan la lactosa (azúcar disacárido de la leche) y otros azúcares produciendo ácido láctico (produce acidificación) , polisacáridos (dan textura gelatinosa) y compuestos volátiles (aportan aromas) . Tanto los frutos secos como la chufa poseen suficientes azúcares mono y disacáridos (como glucosa, fructosa y sacarosa) como para garantizar su fermentación, no obstante, también se pueden añadir antes o después del molido fino en cantidad abundante como sustrato de fermentación y como edulcorante. Aunque se podría añadir también lactosa, en los ejemplos que se describen se evitó la presencia de la misma, puesto que el producto que se pretende conseguir no debe tener lactosa y pese a que se podría garantizar su eliminación se prefería obviar las consecuencias negativas que comporta para muchos consumidores. Hasta el momento, se han realizado ensayos con resultados muy satisfactorios utilizando diversos fermentos lácticos de la especie St. salivarius subsp thermophilus, así como de ésta misma bacteria St. salivarius subsp thermophilus junto con Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus. Otras especies probióticas se pueden incorporar fácilmente a estos productos, como Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus fermentum o Lactobacillus reuteri . Asimismo, puede también fermentarse la leche de almendra con inoculo de kéfir, obteniendo, por ejemplo, kéfir de almendra o de horchata. El inoculo de kéfir no es una única bacteria/levadura, sino que es un cultivo mixto y además muy variable en su composición de cepas.

Como se describe en los ejemplos, para obtener la acidez necesaria (pH < 4,6), el inoculo inicial recomendable de St. salivarius subsp thermophilus está en torno a 106 - 107 ufc/ml y el de los probióticos (otras especies) se ajusta en función de su potencial fermentativo y de otros factores que relacionados con sus efectos metabólicos. Asimismo, la temperatura óptima de incubación es de 42°C para St. salivarius subsp thermophilus, pero puede variar en función de las otras especies inoculadas y las caracteristicas del producto.

El producto final.- La seguridad de estos productos está garantizada, por el simple hecho de que, todos los componentes utilizados para su elaboración se consumen habitualmente y están autorizados. Asi, utilizaremos como materia prima productos pasteurizados o esterilizados de consumo tradicional (frutos secos molidos u horchata, agua y aditivos alimentarios autorizados) , a los que se le añaden cultivos iniciadores de productos lácteos y probióticos obtenidos de empresas especializadas, con las correspondientes garantias. Los productos obtenidos poseen consistencia similar al yogur tradicional, yogures bebibles o leches fermentadas es decir, con valores de viscosidad aproximadamente entre 60 y 250 mPas/seg, en función del cultivo iniciador y aditivos utilizados. En este sentido, según las medidas realizadas en nuestro laboratorio, cabe diferenciar entre las leches fermentadas bebidas con menor grado de viscosidad de 37 a 1 5-160 mPas/seg (respectiamente de, Leche Fermentada Natural [Central Lechera Asturiana] y Dan'up [Danone]) y los yogures y leches fermentadas para comer "con cuchara", que poseen valores medios de 210 a 250 mPas/seg (Yogurt Natural y Bio [Danone], La Lechera [Nestlé], etc) . Aunque esta propiedad puede ajustarse a otros valores mediante los aditivos adecuados. Son ante todo sabrosos, con acidez variable según los inóculos de iniciadores o probióticos utilizados (causada por la formación de ácido láctico) y un suave aroma y sabor de producto lácteo fermentado (posiblemente por la formación de diacetilo y acetaldehido) . Esto los hace propicios para mezclarse con diferentes productos, como frutas diversas, chocolate, miel, cereales, diversos tipos de esencias y sabores que podrán ampliar enormemente la gama de productos derivados de éstos, o que se obtengan por mezclas posteriores. La inclusión de especies bacterianas probióticas, tiene como consecuencia que el producto poseerá múltiples efectos beneficiosos sobre la salud: aquellos derivados de la almendra y frutos secos (ácidos grasos poliinsaturados, proteinas de fácil digestibilidad, alto contenido en K+, bajo contenido en azúcares, etc.), o de la horchata, y las propiedades probióticas de las bacterias que se utilicen. Puesto que la fermentación microbiana consume una cantidad determinada del azúcar disuelto, se pueden diseñar productos con distintos azúcares y distintas cantidades de ellos, para obtener productos con distintas propiedades, como su sabor dulce o capacidad astringente. También se pueden utilizar edulcorantes artificiales y azúcares no metabolizables (fructosa, sorbitol, etc.) en la confección de productos bajos en calorias o para diabéticos. Además, se puede enriquecer estos productos en ciertos minerales (Fe, Ca) , vitaminas, fibra u oligosacáridos con efecto bifidogénico, etc. para que estos productos cubran las necesidades de sectores concretos de población, como niños, adolescentes o personas de tercera edad. Una realización particular de esta invención que tendria bastante importancia, daria lugar a productos FERMENTADOS PASTEURIZADOS CON "EFECTO BIFIDUS", pero QUE NO REQUERIRÁN CADENA DE FRÍO. Ello se conseguirá añadiendo, entre otros aditivos, oligofructosacáridos o diferentes almidones a la matriz de lechada de almendras, ajustando su concentración, asi como la de otros gelificantes (los oligofructosacáridos tienen por si mismos propiedades espesantes) para obtener la viscosidad deseada. En este caso, se llevará a cabo la fermentación inicial, al menos con una cepa de S. salivarius subsp thermophilus, y posteriormente el producto se pasteuriza, quedando listo para comercialización. Aunque este producto carecerá de fermentos lácticos y probióticos vivos, aportará ventajas logisticas y de comercialización importantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDODE LAS FIGURAS FIGURA 1 : Evolución del pH durante la fermentación de lechada de almendras inoculada con 107 ufc/ml de tres cepas de Streptococcus salivarius subsp thermophilus: BS5 (B), BS9 (Δ)y BS127 (X) . La linea del control representa la evolución del pH de la lechada sin inocular con iniciadores. FIGURA 2: Evolución del pH durante la fermentación de lechada de almendras inoculada con 108 ufc/ml de St. salivarius subsp thermophilus BS5 (B), St. salivarius BS5 más Bifidobacterium lactis BL230 (Δ)y St. salivarius con L. casei BL227 (X) . La linea del control representa la evolución del pH de la lechada sin inocular con iniciadores. FIGURA 3 : Evolución del pH durante la fermentación de batido de avellanas inoculada con 108 ufc/ml de St. salivarius subsp thermophilus BS5 y Lactobacillus acidophilus BL228 (B) . La linea del control representa la evolución del pH de la lechada sin inocular con iniciadores. FIGURA 4 Evolución del pH durante la fermentación de horchata de chufa (Cyperus sculentus) inoculada con 108 ufc/ml de St. salivarius subsp thermophilus BS5 y Lactobacillus acidophilus BL228. La linea del control representa la evolución del pH de la horchata sin inocular con iniciadores.

EJEMPLO 1 OBTENCIÓN UN PRODUCTO FERMENTADO CON St. salivarius subsp thermophilus A PARTIR DE LECHE DE ALMENDRAS. Materiales utilizados.- Las almendras utilizadas fueron de las variedades Marcona y Ferraduel, obteniéndose resultados similares con ambas variedades. Se probaron diferentes agentes estabilizantes (gelificantes o espesantes) como, goma de garrofin, goma de xantano, goma de acacia, almidón de maiz, carragenato y pectina, en concentraciones del 0,5% y 0,3%, seleccionándose finalmente la goma de xantano, goma de acacia y carragenato. Los gelificantes y estabilizantes son de naturaleza muy variada y tienen efecto sinérgico. Se probaron diferentes concentraciones de azúcar (de 10 a 77 g/1) que fue siempre sacarosa (azúcar de caña) . Equipamiento de planta piloto.- Calderin de vapor (Groen), picadora doméstica con vaso de cristal (Braun) , Molino Coloidal (Fryma) , homogenerizador (Mantón Gauli) , intercambiador tubular fabricado por Luzzysa S.A. y automatizado por SUGEIN S.A., y cabina de flujo laminar (Telstar S.A.) . Otro equipo de laboratorio. - Viscosimetro Tester VT5R (Haake) Métodos m±crobiológicos. - Los recuentos en placa de petri se realizaron en los siguientes medios de cultivo para: Coliformes, VRBG a 42°C; clostridios sulfitoreductores, TSC-D-cicloserina a 42°C; mesofilos totales TSA a 37°C; esporulados aerobios, LBA a 37°C, después de calentar 10 min a 600C; Streptococcus STA a 420C; lactobacilos y Bifidobacterium lactis, MRS a 37°C. Seguimiento de la acidificación del producto durante la fermentación.- Para el seguimiento de las fermentaciones se utilizó un equipo de medición de pH y conductividad (Consort) con 6 puertos y conexión a puerto RS322 de un ordenador de sobremensa.

1.- Obtención de una leche (o batido) de almendras homogeneizado y pasteurizado. En primer lugar, se debe obtener un sustrato pasteurizado (libre de contaminantes y posibles patógenos) con propiedades óptimas para soportar el crecimiento de bacterias lácticas (fermentos lácticos) , de forma que las propiedades fisicas, nutricionales y organolépticas del producto obtenido tras la fermentación sean las adecuadas. Distintos lotes de entre 1 y 2 Kg de almendra descascarillada se escaldaron en un calderin de aproximadamente 5 L de capacidad. Tras su pelado manual con guantes higiénicos, se sometieron a un primer molido grosero en una picadora de vaso (Braun) tras el que se le añadió el agua, hasta tener una concentración de almendras de 100 g/L, y los aditivos en las siguientes proporciones: 66 g/L de azúcar de caña, 3 g/L de goma de acacia, 3 g/L de goma de xantano y 3 g/L de I-carragenato. A continuación se sometió la mezcla a un picado fino en un molino coloidal hasta que el producto tenia aspecto lechoso, la textura fina y sin que se puedan percibir fragmentos al paladar. A continuación se homogeneizó a una presión de 300 Kg/cm2. En este punto se tendrá un punto de control del proceso con recuento bacterianos (Tabla 4, datos "Antes de pasteurizar") . Luego se bombeó en el intercambiador tubular para su pasteurización. El tratamiento térmico se realizó a presión atmosférica durante más de 6 minutos a 95°C. A esta temperatura, tratamientos más prolongados pueden dar lugar a la rotura de la suspensión, posiblemente por la desnaturalización de proteinas. Tras la pasteurización se realiza el segundo control con recuentos bacterianos (Tabla 4) . Los datos del control microbiológico del proceso se muestran en la Tabla 4. La principal conclusión es que se debe mantener la temperatura de 95 0C más de 6,30 min. para tener recuentos de mesófilos totales <10 u.f.c. por mililitro. A continuación se mezclarian los inóculos de los cultivos y se realizaria un recuento bacteriano. Tabla4. Puesta a punto de parámetros del proceso de pasteurización: recuentos bacterianos y pH de la lechada de almendras. N3 O 2. - Ensayo de fermentación con St. salivarius subsp thermσphllus. Aunque la almendra posee 3,5 a 4,2 % de azúcares simples fermentables (Tabla 1), deseamos ensayar la adición de otros mono y disacáridos (como glucosa, fructosa y sacarosa) en cantidad abundante como sustrato de fermentación y edulcorante. La eficacia en la fermentación de estos azúcares dependerá de la especie bacteriana y la cepa utilizada. El conocimiento previo de la capacidad fermentativa de distintas bacterias lácticas candidatas y los métodos desarrollados en nuestro laboratorio nos ha permitido seleccionar de forma rápida aquellas que producen acidificación y formación de polisacáridos idóneas para el tipo de producto que se desea. En este punto se realiza la medida de la viscosidad, recuentos bacterianos y caducidad. Los ensayos realizados con diversas cepas de la especie St. salivarius subsp thermophilus han sido muy satisfactorios (Figura 1) . Puede observarse que con las tres cepas utilizadas se puede alcanzar el pH deseado en estos productos (4,4 - 4,6), aunque con distintos tiempos de fermentación. Como consecuencia, el número de coliformes detectado en este producto siempre fue cero.

Ejemplo 2 OBTENCIÓN UN PRODUCTO FERMENTADO A PARTIR DE LECHADA DE ALMENDRAS CON PROBIÓTICOS Una vez desarrollado el primer producto fermentado o PRODUCTO BASE del ejemplo anterior, se ensayó la adición de bacterias probióticas. Hoy en dia, las más utilizadas comercialmente son cepas de las especies: Bifidobacterium lactis, L. casei, L.rhamnosus, L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. johnsonii, L. fermentum y L. reuteri, entre otras. El propio St. salivarius subsp thermophilus, que junto a Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus es responsable de la fermentación del yogur, frecuentemente se considera como probiótico por si mismo. Cada cepa de probiótico posee características metabólicas propias. Por ello se deberán ajustar ciertas condiciones, como la temperatura de incubación y la naturaleza de los azúcares adicionados (ver arriba) , con el fin de obtener productos aptos para el consumo y en los que los probióticos estén en números altos, pues se estima que la ingesta mínima de un probiótico debe ser superior a 109 bacterias por dosis. Se ensayó en experimentos independientes la co- inoculación de la leche de almendras (de idéntica composición a la descrita anteriormente) con St. salivarius subsp thermophilus y además tres cepas de las especies: Bifidobacterium lactis, L. casei y L. acidophilus. Al incubar a 370C para permitir el crecimiento de las cepas probióticoas, St. salivarius subsp thermophilus fermenta y se desarrolla más lentamente que a 42°C (ver Figura 1) . No obstante, los resultados muestran que la adición de una nueva bacteria acelera el proceso de fermentación (Figura 2) , obteniéndose en todos los casos productos con características fisicoquímicas y sensoriales muy aptas (Tabla 5) . La Tabla 5, también muestra los parámetros microbiológicos del proceso, demostrándose que, sobre la leche de almendras, hay proliferación de las bacterias inoculadas. Las propiedades del producto obtenido suelen ser idóneas, salvo en el caso de la inoculación con L. casei, en cuyo caso, se debería modificar el azúcar añadido o el inoculo para mejorar sus posibilidades comerciales.

Tabla5. Resultado de diferentes ensayos de fermentación de leche de almendra con diferentes cultivos iniciadores. N3 GJ Conservación de la viabilidad y postacidificación de los diferentes probióticos en leche de almendras fermentada. Con el fin de estudiar la viabilidad de las bacterias probióticas introducidas en estos productos a lo largo del tiempo de almacenaje en refrigeración y exposición en los mostradores de frió, se determinó la diferencia entre el número de viables al inicio (dia 1) y a los 23-30 dias de conservación en refrigeración (4°C) en tres fermentaciones que contenían St. salivarius subsp thermophilus BS5, St. salivarius subsp thermophilus BS5 y Lactobacillus acidophilus BL228 y St. salivarius subsp thermophilus BS5 y Bifidobacterium lactis BL230 (Tabla 6) . Como conclusión se puede afirmar que, si bien los recuentos de St. thermophilus descienden en todos los casos alrededor de 1 orden de magnitud, Lactobacillus acidophilus y, especialmente, Bifidobacterium lactis permanece n casi con el mismo nivel de viabilidad.

TABLA6. Efecto de la incubación a 40C sobre los recuentos de viables de St. salivarius subsp thermophilus (BS5) , Lactobacillus acidophilus (BL228) y Bifidobacterium lactis (BL230) , asi como sobre el pH, en cada una de las tres fermentaciones de leche de almendras realizadas para estudiar su acidificación en frió. En relación con el fenómeno negativo de continuada acidificación de los productos fermentados durante el almacenamiento (postacidificación) hemos podido constatar que apenas cambia en 0,10- 0,12 unidades de pH (Tablaβ) .

EJEMPLO 3 OBTENCIÓN DE PRODUCTOS FERMENTADOS A PARTIR DE OTROS FRUTOS SECOS: FERMENTACIÓN DE UN BATIDO DE AVELLANAS La avellana, y otros frutos secos, también poseen pequeñas cantidades de azúcares simples fermentables, sin embargo, deseamos ensayar la adición de sacarosa en cantidad abundante como sustrato de fermentación y edulcorante. Para el ensayo que se describe, partimos de un batido de avellanas (Diemilk, Nutriops) esterilizado a alta temperatura (UHT) con 7% de avellanas, maltodextrinas y sacarosa, dando la siguiente composición por 100 g: hidratos de carbono, 6.3 g; azucares, 3.6 g; grasas, 2.2 g (saturada, 0.6 g, monoinsaturada, 1.2 g; poliinsaturada, 0.4 g) ; fibra alimentaria, 0.4 g; Na 0.05g. A este producto se añadieron inóculos de las especies, St. salivarius subsp thermophilus BS5 y L.acidophilus BL228 y se incubó a 37°C (Figura 3) . Pudo observarse un descenso adecuado del pH (4,53) y una buena proliferación de las dos bacterias inoculadas, dando como resultado características fisicoquímicas y sensoriales excelentes (Tabla 4) . Asi, la viscosidad se estimó en 110 mPas. (Tabla 7) .

Tabla7. Resultado de diferentes ensayos de fermentación de batido (o leche) de avellana con S.thermophilus BS5 y L.acidophilusBL228. N3 EJEMPLO 4 OBTENCIÓN DE UN PRODUCTO FERMENTADO A PARTIR DE HORCHATA DE CHUFA La alta concentración de azúcares presente en la horchata constituye un excelente sustrato fermentable para las bacterias lácticas y bifidobacterias. Al poseer una baja concentración de proteínas (Tabla 3), la viscosidad deberá lograrse por producción de exopolisacáridos bacterianos y/o por la adición de estabilizantes y materias gelificantes. La alta concentración de almidones en la horchata impide el uso de tratamientos térmicos a más de 72°C sin que se cause su gelificación. Ello requiere tratamientos adicionales como la decantación o la utilización de enzimas amiloliticos previos al tratamiento térmico. Para el ensayo de fermentación, tomamos una horchata comercial UHT (Frixia, Industrias Lácteas Moráis, S.A.) con los siguientes ingredientes: agua, chufa, azúcar, emulgente (E472, E471), aromas naturales, canela y limón. A este producto se le añadieron inóculos de, St. salivarius subsp thermophilus BS5 y L.acidophilus BL228 y se incubó a 370C (Figura 4) . Tras incubar 3h y 45 minutos, se logró un descenso del pH adecuado (pH=4,47), obteniéndose un producto con aspecto cremoso (viscosidad de 60 mPas) y sabor excelente (Tabla 6) . Aunque las bacterias inoculadas no lograron proliferar en la horchata como en otros sustratos, si mostraron ser metabólicamente muy activas, como se deduce por el descenso del pH.

Tablaβ. Resultado de diferentes ensayos de fermentación de de horchata con S. thermophilus BS5 y L.acidophilusBL228. N3 00 Ejemplo 5 PRODUCTOS FERMENTADOS PASTEURIZADOS CON "EFECTO BIFIDUS" Esta aplicación tendría bastante importancia, daria lugar a productos FERMENTADOS PASTEURIZADOS QUE NO REQUERIRÁN CADENA DE FRÍO a partir de cualquiera de los ejemplos anteriores añadiendo una etapa de pasteurización tras la fermentación... Esta realización particular se realiza a partir de los ejemplos anteriores a los que se añade, entre otros aditivos, oligofructosacáridos o diferentes almidones de utilización lenta (para conseguir el "EFECTO BIFIDUS") a la matriz de lechada de almendras, ajustando su concentración, asi como la de otros gelificantes (los oligofructosacáridos tienen por si mismos propiedades espesantes) para obtener la viscosidad deseada. En este caso, se lleva a cabo la fermentación inicial, al menos con una cepa de S. salivarius subsp thermophilus, y posteriormente el producto se pasteuriza, quedando listo para comercialización. Aunque este producto carece de fermentos lácticos y probióticos vivos, pero aporta ventajas logísticas y de comercialización importantes.