Nitzschia L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, notamment en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, d'une microalgue du genre Nitzschia, en particulier de l'espèce Nitzschia brevirostris. Le procédé permet d'obtenir un haut rendement en biomasse et un enrichissement des microalgues ainsi cultivées en lipides et plus particulièrement en acide docosahexaénoïque (DHA) et/ou en acide éicosapentaénoïque (EPA). Le procédé permet également d'obtenir un enrichissement des microalgues ainsi cultivées en caroténoïdes, et plus particulièrement, en fucoxanthine. Le procédé permet ainsi de sélectionner des souches de Nitzschia, en particulier de Nitzschia brevirostris, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en lipides et plus particulièrement en acides gras polyinsaturés, et/ou un haut rendement en caroténoïdes, plus particulièrement, en fucoxanthine. L'invention se rapporte aussi à une nouvelle souche de microalgue appartenant à l'espèce Nitzschia brevirostris, particulièrement adaptée à la production d'acides gras et de caroténoïdes. Cette nouvelle souche de Nitzschia brevirostris est utile pour produire de l'acide docosahexaénoïque (DHA) et/ou l'acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou de la fucoxanthine en mode mixotrophe.

Préambule

Les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.

Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres. P T/FR2013/050542

La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont généralement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés organiques ou de matière organique ne leur est pas favorable et n'améliore pas leur croissance. Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique.

D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.

Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme coexistent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang, C. et al. (2000) ; Biochemical Engineering Journal, 6 :87-102].

Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.

Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés (AGHI) de la série des oméga-3 (PUFA-u)3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA ou C20:5 ω3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6 ω3), et de la série des oméga-6 (PUFA-u)6), en particulier, l'acide arachidonique (ARA ou AA ou encore acide eicosatétraènoïque C20:4 ω6) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques.

Considéré comme nutriment essentiel, le DHA est nécessaire au développement normal et fonctionnel des cellules, et joue un rôle crucial dans divers processus et fonctions biochimiques. Sa nature polyinsaturée lui confère une importance cruciale vis-à-vis des propriétés de la membrane cellulaire, chez les végétaux comme chez les animaux : fluidité, flexibilité et perméabilité sélective permettant par exemple une adaptation effective, et même la survie, aux basses températures, en particulier chez les poissons.

Le DHA est un constituant structurel majeur du cerveau humain. Le DHA représente 15-20 % du cortex cérébral (le cerveau d'un adulte contient au moins 20 g de DHA) et 30-60 % de la rétine. Il est indispensable au développement du système nerveux central et à la fonction rétinienne, par incorporation dans les membranes cellulaires, et joue un rôle capital dans l'acquisition et le maintien satisfaisant des mécanismes de la vision et de la mémoire.

Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, incorporation dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive.

De nouvelles sources de ces acides gras tels que ΙΈΡΑ, le DHA et

TARA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés.

Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol. Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt.

A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que ces dernières recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. (2010) ; Hydrobiologia, 639:153- 171].

La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Parmi les espèces des différentes classes composant ces phylums, qui produisent des acides gras, il existe des variations importantes en ce qui concerne la teneur des microalgues en acides gras polyinsaturés. Par ailleurs, les proportions relatives de lipides, notamment d'EPA, de DHA et d'ARA dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture.

D'autre part, les caroténoïdes sont également des molécules d'intérêt. Ils sont généralement utilisés en tant que pigments, mais ils ont aussi un rôle important pour la santé de l'homme en tant qu'agents antioxydants. Enfin, ils présentent la capacité de stimuler le système immunitaire. La fucoxanthine est un exemple d'un caroténoïde, et est notamment contenue dans le wakame, algue utilisée dans la cuisine japonaise.

Pour mettre en œuvre la production des acides gras et/ou de carotenoïde(s) par des microalgues à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Par exemple, les cultures peuvent être réalisées en condition autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe selon la souche, la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources telles que la main d'œuvre et la facilité de poursuivre la culture doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales.

En tout état de cause, il est souhaitable que les microalgues soient cultivées dans des conditions optimales pour augmenter le rendement de(s) l'acide(s) gras et du ou des caroténoïde(s) à produire. Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple, une biomasse au-delà de 30 g/1 de matière sèche, et plus de 20 % d'acides gras en poids par rapport aux lipides totaux). Pour des caroténoïdes, un rendement au-delà de 0,2 % en matière sèche de microalgue est souhaitable.

Les microalgues du genre Nitzschia sont des diatomées marines que l'on trouve généralement dans les eaux froides telles que celles de l'Arctique ou de l'Antarctique. Ces microalgues sont connues principalement pour la production d'acide eicosapentaènoïque (EPA) en mode hétérotrophe.

On note toutefois que le mode mixotrophe a été étudié sur l'espèce Nitzschia laevis afin d'évaluer son impact sur la synthèse d'EPA.

Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de microalgue de l'espèce Nitzschia brevirostris, cultivables en mode mixotrophe permettant, dans les conditions de la présente invention, une production à haut rendement d'acides gras polyinsaturés, en particulier de DHA et/ou d'EPA, et/ou de fucoxanthine.

Une souche (FCC 810) représentative des nouvelles souches de Nitzschia brevirostris ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro d'accession CCAP 1052/21. Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, avec une gamme de variations d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques.

L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures ou de moindre intensité lumineuse, perçue généralement comme stressante par les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Nitzschia brevirostris ayant une production élevée de biomasse, de lipides et plus particulièrement d'acides gras polyinsaturés, et/ou du ou des caroténoïde(s), en particulier de la fucoxanthine. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle d'acides gras polyinsaturés, en particulier de DHA et/ou d'EPA, et/ou de la fucoxanthine, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes de culture autotrophes.

Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après. Description détaillée

La présente invention a donc pour objet un procédé de culture des microalgues du genre Nitzschia, notamment de l'espèce Nitzschia brevirostris, en mode mixotrophe dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 μηιοΙ. m ^"2 , s ^"1 et 1000 pmol. m ^"2 , s ^"1 , de préférence, entre 30 et 400 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Ces variations peuvent généralement avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence, entre 2 et 200 fois par heure. Le procédé selon l'invention permet un enrichissement des microalgues du genre Nitzschia en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en DHA et/ou en EPA, et/ou en caroténoïde(s), plus particulièrement en fucoxanthine. Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs.

Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide docosahexaénoïque (DHA) et/ou en acide éicosapentaénoïque (EPA), et/ou en caroténoïde(s), plus particulièrement en fucoxanthine. Ce procédé peut être également utilisé, pour sélectionner des souches du genre Nitzschia, en particulier de l'espèce Nitzschia brevirostris, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés, notamment en DHA et/ou en EPA, et ou en caroténo ^' ïde(s), plus particulièrement en fucoxanthine.

La culture en mode mixotrophe de cette microalgue s'effectue préférentiellement en présence de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. Ce substrat carboné organique comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol.

Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés organiques adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention.

Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre de nouvelles souches de microalgues du genre Nitzschia (Division : Bacillariophyta, Ordre : Bacillariales, Famille : Bacillariaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans un milieu minéral, par exemple, milieu f plus silice enrichie en azote [Guillard, R.R.L. (1975). Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, dans Culture of Marine Invertebrate Animais, pp 26-60. Smith W.L. and Chanley M. H (Eds.) Plénum Press, New York], dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend du glucose, ou du lactate, dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM.

Ces nouvelles souches de Nitzschia, plus particulièrement de Nitzschia brevirostris peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention décrit plus loin.

Une souche représentative des souches de Nitzschia selon l'invention est la souche FCC 810 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, sous le numéro CCAP 1052/21. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives de biomasse ainsi que des lipides et plus particulièrement du DHA et/ou de ΙΈΡΑ quand elles sont cultivées en mode mixotrophe avec un apport en lumière variable ou discontinu, selon l'invention. Elles sont également capables de produire des quantités significatives de caroténoïde(s), plus particulièrement de la fucoxanthine.

Selon les analyses taxonomiques réalisées, la souche CCAP 1052/21 appartient à l'espèce Nitzschia brevirostris. L'invention porte sur toute souche de l'espèce Nitzschia brevirostris, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que le DHA. L'invention porte aussi sur toute espèce de microalgue du genre Nitzschia, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telle que décrite dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que le DHA et/ou ΙΈΡΑ et/ou des caroténoïdes, plus particulièrement de la fucoxanthine.

Les souches de Nitzschia brevirostris isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de biomasse ainsi que de lipides riches en DHA et/ou EPA, ledit DHA ou EPA pouvant représenter plus de 20 %, plus de 25 % ou plus de 30 % des lipides totaux contenus dans les microalgues. Egalement les souches de Nitzschia brevirostris isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de caroténoïde(s), plus particulièrement de la fucoxanthine, pouvant représenter plus de 0,2 % en matière sèche, plus préférentiellement plus de 0,25 % en matière sèche sur la matière sèche totale de microalgue (ce qui inclut la teneur en caroténoïdes contenus dans ladite microalgue).

Dans la présente invention, la biomasse obtenue avec la souche FCC 810, isolée par le demandeur, d'une culture en conditions mixotrophes en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, est de 10 à 60 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode hétérotrophe. Par mode hétérotrophe, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais sans apport de lumière.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Nitzschia, notamment de l'espèce Nitzschia brevirostris en mode mixotrophe, en présence d'un éclairement variable ou discontinu au cours du temps, par exemple sous forme de flashs, notamment en vue de produire des acides gras polyinsaturés, tels que le DHA et/ou EPA, et/ou un ou des caroténoïde(s), tel que de la fucoxanthine.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des microalgues du genre Nitzschia, notamment de l'espèce Nitzschia brevirostris à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés tels que le DHA et/ou ΙΈΡΑ, et/ou un haut rendement en caroténoïde(s), plus particulièrement en fucoxanthine, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps. Il est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides et/ou des caroténoïdes. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des lipides et/ou des caroténoïdes. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques et/ou en caroténoïdes pour résister aux contraintes de leur environnement.

Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.

Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée du flash peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être de 1/10 d'une seconde, ou de 2/10 d'une seconde, ou de 3/10 d'une seconde, ou de 4/10 d'une seconde ou de 5/10 d'une seconde, ou de 6/10 d'une seconde, ou de 7/10 d'une seconde, ou de 8/10 d'une seconde, ou de 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. La durée du flash est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.

En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 120 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Les flashs peuvent être émis à intervalle régulier ou non dans le temps. En cas d'émission à intervalle régulier, le nombre de flashs par heure correspond alors à une fréquence (F) ayant une période temporelle (T), étant considéré que F = 1/T. Cette période temporelle peut être comprise entre 1 seconde et 30 minutes, ou entre 1 seconde et 36 secondes, ou encore entre 1 ,2 seconde et 30 secondes, ou entre 1 ,44 seconde et 9 secondes, ou entre 1 ,8 seconde et 6 secondes, ou entre 2,4 secondes et 4,5 secondes. Cette fréquence peut être également comprise entre 18 secondes et 30 minutes, préférentiellement entre 24 secondes et 6 minutes, plus préférentiellement entre 36 secondes et 4 minutes, et plus préférentiellement encore entre 72 secondes et 3 minutes. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est entre 5 et 1000 μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 , de préférence entre 5 et 500 μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ou 50 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , et plus préférentiellement entre 150 et 300 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Par définition, 1 pmol. m ^"2 , s ^"1 correspond à 1 μΕ m ^*2 , s ^"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.

Selon un mode particulier de l'invention, l'intensité de la lumière est comprise entre 50 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 , la période temporelle de la fréquence des flashs est comprise entre 10 secondes et 60 minutes pour une durée de flash comprise entre 1 seconde et 1 minute.

Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues. Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (pmol. m ^"2 , s ^"1 ), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 pmol. m ^"2 , s ^"1 . L'intensité de la lumière peut également varier, entre 5 et 400 μηιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de la lumière est entre 70 et 300 pmol. m ^"2 , s ^"1 et plus préférentiellement entre 100 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 .

Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 et 100 pmol. m ^"2 s ^"1 , ou 5 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ou 50 et 800 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence, les valeurs 50 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , les valeurs 0 et 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 ou préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 μητιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , les valeurs 0 et 600 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , les valeurs 0 et 800 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 ou encore les valeurs 0 et 1000 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 .

Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art.

Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 10 ⁵ et 5 x 10 ⁵ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 15 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , de préférence, entre 5 et 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 , par exemple, de préférence, entre 20 et 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 400 pmol. m ^"2 , s ^"1 par exemple, de préférence, entre 50 et 150 pmol. m ^"2 , s ^"1 .

Selon certains modes de réalisation, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 10 ⁵ et 5 x10 ⁵ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 , de préférence, entre 5 et 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 pmol. m ^"2 . s ^"1 , par exemple, de préférence, entre 50 et 400 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 pmol. m ^{" 2} . s ^"1 par exemple, de préférence, entre 200 et 500 pmol. m ^"2 , s ^"1 .

Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 pmol. m ^"2 . Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 pmol. m ^"2 , par heure.

Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 9000 pmol. m ^"2 . Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 12 000 pmol. m ^"2 . Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 μιηοΙ. m ^"2 .

Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 pmol. m ^"2 , s ¹ , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 240 000 pmol. m ^"2 .

Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture quand la densité cellulaire est 10 ⁵ et 5 x 10 ⁵ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 pmol. m ^"2 , de préférence encore entre 2000 et 5000 pmol. m ^"2 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 pmol. m ^"2 , de préférence, entre 6000 et 50 000 et de préférence encore entre 12 000 et 45 000 pmol. m ^"2 , par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple, de préférence, entre 45 000 et 200 000 pmol. m ^"2 , et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 150 000 pmol. m ^"2 .

Selon un mode de l'invention, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁵ et 5 x 10 ⁵ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 pmol. m ^"2 à 4500 pmol. m ^"2 . Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 pmol. m ^"2 . Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 pmol. m ^-2 . Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁵ et 5 x10 ⁵ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 μιηοΙ. m ^"2 à 30 000 μιτιοΙ. m ^"2 . Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 μιτιοΙ. m ^"2 . Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 350 et 450 μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 pmol. m ^"2 .

L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.

Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés, notamment de DHA et/ou d'EPA, et/ou une production plus élevée de caroténoïde(s), plus particulièrement de fucoxanthine.

Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches du genre Nitzschia, en particulier de l'espèce Nitzschia brevirostris à caractère mixotrophe, similaires à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 1052/21 , et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés et/ou en caroténoïde(s). Ce procédé de culture est caractérisé en ce qu'il comprend des étapes suivantes :

a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Nitzschia dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m ^"2 , s ^"1 et 1000, de préférence entre 5 et 400 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 3600, de préférence 5-400 fois par heure,

b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement

c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées.

Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.

Avantageusement, la culture en mode mixotrophe s'effectue dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m ^"2 , s ^"1 et 400 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure

Pour réaliser la sélection des souches, différentes souches du genre Nitzschia, en particulier de l'espèce Nitzschia brevirostris, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte, avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. II est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et/ou variable et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés organiques dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et/ou variable et aux substrats carbonés organiques offrent généralement un meilleur rendement pour la production de caroténoïdes et de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique et fucoxanthine plus abondant parmi les caroténoïdes) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée de DHA et/ou EPA).

Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'une population hétérogène et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue et/ou variable présentant une gamme d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques, avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.

Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des lipides.

Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes :

d) une étape de récupération des lipides des microalgues et éventuellement

e) l'extraction du DHA et/ou de ΙΈΡΑ des lipides récupérés.

Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des caroténoïdes.

Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes :

d) une étape de récupération de la matière hydrophobe des microalgues et éventuellement

e) l'extraction du DHA et/ou de ΙΈΡΑ et/ou de la fucoxanthine de la matière hydrophobe récupérée.

Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce du genre Nitzschia, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire le DHA et/ou de ΙΈΡΑ, et/ou de la fucoxanthine.

Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en DHA et/ou en EPA, et/ou d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en caroténoïde(s), plus particulièrement en fucoxanthine.

L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Nitzschia à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier le DHA et/ou ΙΈΡΑ. L'invention a également pour but l'optimisation de la production en caroténoïde(s), plus particulièrement en fucoxanthine. Les souches de l'espèce Nitzschia brevirostris sont spécialement concernées.

Les méthodes d'extraction sélective des lipides dont le DHA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-917] et par [McCreary DK, Kossa WC, Ramachandran S, Kurtz RR. (1978), "A novel and rapid method for the préparation of methyl esters for gas chromatography: application to the détermination of the fatty acids of edible fats and oils.", J Chromatogr Sci. 16(8):329-31.]

Les méthodes d'extraction et d'analyse des caroténoïdes, dont la fucoxanthine, sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Wright et al. (1991) (S.W. Wright, S.W. Jeffrey, R.F.C. Mantoura, C.A. Llewellyn, T. Bjornland, D. Répéta, N. Welschmeyer : Improved HPLC method for the analysis of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton. Marine ecology progress séries : Vol. 77 : 183-196, 1991 ).

L'invention porte également sur les microalgues du genre Nitzschia, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces microalgues sont enrichies en acides gras polyinsaturés. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 20 %, souvent plus de 25 % et parfois même plus de 30 % de DHA et/ou d'EPA par rapport au pourcentage total de lipides. Les microalgues peuvent également comprendre un taux de fucoxanthine de plus de 0,2 % en matière sèche, préférentiellement plus de 0,25 % en matière sèche sur la matière sèche de microalgue. Exemple 1

Les cultures de Nitzschia brevirostris FCC 810 ont été réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 25°C. L'agitation est réalisée grâce à 2 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration suivante : hélice de Rushton et hélices tripales à pompage descendant. La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au mini = 100 rpm et au maxi = 250 rpm et Qmini =0,5 wm / Qmaxi = 2 wm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente.

Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 rpm) en enceinte thermo statée (25°C) et éclairée entre 80 et 100 uE. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu F plus silice enrichie en azote. Le substrat carboné organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est le glucose à des concentrations entre 100 mM et 150 mM. Suivi des cultures :

La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFB, Whatman, puis séchage à l'étuve à 100°C pendant 24h minimum avant pesée).

Concernant la quantification des lipides totaux, 7.10 ⁸ cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier. Eclairement :

La culture est illuminée avec 180 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 5 secondes et une intensité de 300 μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 .

L'apport de lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des LED (Diodes Electro Luminescentes) réparties autour de la paroi externe du fermenteur. Un pilotage informatique déclenche l'alimentation des LED pour des temps d'éclairement ou des flashs.

Résultats :