TITRE : Production de protéines d'intérêt dans une souche bactérienne non-sporulante

La présente invention se rapporte à un nouveau système de production de protéines d'intérêt composée d'une souche bactérienne non-sporulante du genre Bacillus transformée avec un plasmide contenant une cassette d'expression d'une protéine d'intérêt contrôlée par un promoteur fort actif en phase en stationnaire. Les protéines d'intérêt ainsi produites sont contenues dans un sac bactérien constitué de la membrane bactérienne ou ancrées à la surface de la bactérie.

L'utilisation de bactéries recombinantes pour produire des protéines d'intérêt, telles que l'insuline et l'hormone de croissance, est connue de longue date et a été largement mise en oeuvre, mais elle a aussi montré ses limites. En effet, les bactéries sont incapables de produire des protéines ayant une structure complexe comme les anticorps ou les facteurs de coagulation sanguine. Pour être stables et actives in vivo et donc efficaces chez l'homme, ces protéines doivent subir de multiples modifications post-traductionnelles.

Il arrive également que des protéines hétérologues d'intérêt soient toxiques pour la cellule bactérienne les produisant. Vincent Ecochard et al., dans « Techniques et stratégies en biologie moléculaire », master professionnel, octobre 2011, http://www.m2p-egpr.ups- tlse.fr/Documents%20archives/Cours/Cours%20partie%202.pdf, détaillent les solutions qui peuvent être apportées pour produire de telles protéines dans un système bactérien. Néanmoins, il n'est pas simple d'identifier la meilleure solution par rapport à la protéine à produire. Les Auteurs concluent en effet que la dernière solution et le meilleur recours est d'utiliser un système de traduction in vitro.

Rosano et al., dans « Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges », Front. Microbiol., 17 April 2014, https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00172, indiquent que seules quelques souches d'E. coli sont capables de produire des protéines toxiques, mais le niveau de production de ces protéines est faible. Une solution pourrait être apportée en sécrétant la protéine à l'extérieur de la cellule bactérienne ou dans le périplasme, en utilisant différents promoteurs.

Un système bactérien de production de protéines d'intérêt simple à mettre en oeuvre et avec un rendement important est donc nécessaire, en particulier pour la production de protéines d'intérêt pouvant être toxiques.

Bacillus thuringiensis (Bt) est une bactérie Gram-positive sporulante qui produit d'importantes quantités de protéines insecticides (protéines Cry et Cyt). Lorsque certains gènes de sporulation de Bt ne sont plus exprimés comme spoOA, sigE ou sigF, ou lorsque leur produit n'est plus fonctionnel à la suite d'une mutation, la bactérie est incapable d'entrer en sporulation et reste bloquée en phase stationnaire. Une conséquence de l'inactivation des gènes de sporulation est l'arrêt de la multiplication bactérienne, les bactéries sont donc non viables.

Les Inventeurs ont montré qu'une souche de Bt non-sporulante conduit à la formation de sacs bactériens. De façon surprenante, ils ont aussi montré que, dans de telles souches non sporulantes, la production de protéines d'intérêt peut être obtenue en plaçant le gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur spécifiquement activé pendant la phase stationnaire. Ainsi, la protéine d'intérêt est produite pendant la phase stationnaire et reste encapsulée dans les sacs bactériens. Les Inventeurs ont également montré que ces protéines sont produites en grande quantité et que leur localisation dans les sacs bactériens les protège de la dégradation et facilite grandement leur récupération et leur purification. Selon un mode de réalisation particulier, il est également possible d'exprimer les protéines d'intérêt de façon à ce qu'elles s'ancrent à la surface des cellules bactériennes.

Ce nouveau système permet dès lors de produire des protéines d'intérêt, en particulier des protéines instables ou toxiques pour la cellule bactérienne productrice, celle-ci étant non sporulante et non viable.

Ainsi, la présente invention se rapporte à une souche bactérienne du genre Bacillus non-sporulante qui contient un plasmide recombinant comprenant une cassette d'expression composée :

(i) d'un promoteur fort actif en phase en stationnaire et régulé par un régulateur choisi parmi CodY, AbrB, SinR, PlcR et NprR ; et

(ii) de la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt.

Préférentiellement, la souche bactérienne est choisie parmi les souches de Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus weihenstephanensis, et plus préférentiellement il s'agit d'une souche de Bacillus thuringiensis. Les souches Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, peuvent aussi être utilisées sous réserve d'être préalablement transformées pour exprimer les gènes papR et plcR activant respectivement les promoteurs PpapR et PplcR et/ou pour exprimer les gènes npnR et nprX activant le promoteur PnprA.

De façon préférée, les souches bactériennes utilisées sont les souches Bt kurstaki HD-73 ou Bt 407. Selon l'invention, la souche bactérienne est une souche non sporulante. En effet, les souches non sporulantes sont avantageuses en ce qu'elles ne présentent pas de lyse cellulaire, ainsi, les protéines d'intérêt produites sont conservées dans la bactérie productrice et protégées de la dégradation par les protéases extracellulaires. Afin de supprimer l'activité de sporulation d'une souche du genre Bacillus, il est possible d'inactiver tout gène essentiel à la sporulation comme les gènes impliqués dans l'expression du régulateur transcriptionnel SpoOA responsable de l'initiation de la sporulation ou dans l'expression des facteurs sigma de sporulation SigE, SigF, SigH et SigK ; de préférence, le gène inactivé est spoOA ou sigE. L'inactivation de ces gènes peut être obtenue par interruption ou modification de la séquence codante, ou par délétion de tout ou partie du gène. La délétion est obtenue par double crossing- over entre les régions adjacentes situées en amont et aval du gène, en utilisant des plasmides dont la réplication est thermosensible, par exemple les plasmides pRN5101 (Lereclus et al., Expansion of insecticidal host range of Bacillus thuringiensis by in vivo genetic recombination. Biotechnology (NY) 10: 418-421,1992) ou pMAD (Arnaud et al., New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, gram-positive bacteria. Appl Environ Microbiol 70: 6887- 6891,2004), et en utilisant les protocoles décrits dans ces articles. La délétion du gène spoOA (désignée AspoOA) a un effet très précoce, dès l'entrée des bactéries en phase stationnaire, empêchant notamment les bactéries de s'engager dans le processus de sporulation (Lereclus et al., Overproduction of encapsulated insecticidal crystal proteins in a Bacillus thuringiensis spoOA mutant. Biotechnology (N Y) 13: 67-71, 1995). La délétion du gène sigE (désignée AsigE) a un effet plus tardif, bloquant la progression du processus de sporulation (Bravo et al., Analysis of crylAa expression in sigE and sigK mutants of Bacillus thuringiensis. Mol Gen Genet 250: 734-741, 1996). Dans les deux cas, la bactérie ne se multiplie plus, meurt et contient presque uniquement la protéine d'intérêt.

De façon préférée, la souche utilisée est Bt kurstaki HD-73 AspoOA ou Bt 407 AsigE.

Les plasmides recombinants utilisables selon l'invention comprennent classiquement une origine de réplication et au moins un système de sélection consistant en un ou plusieurs gènes permettant la sélection des bactéries transformées, par exemple des gènes de résistance aux antibiotiques. Tout plasmide, de préférence à haut nombre de copies, adapté à l'hôte bactérien utilisé peut être mis en oeuvre.

Les plasmides appropriés selon l'invention sont des plasmides permettant une expression dans les bactéries du genre Bacillus.

De préférence, les plasmides utilisés sont ceux présentant une forte stabilité ségrégationnelle et/ou structurale.

La notion de stabilité ségrégationnelle signifie que le plasmide n'est pas perdu au cours des générations ; en d'autres termes, il se maintient de façon stable dans la cellule bactérienne et est transmis aux cellules filles. La stabilité ségrégationnelle du plasmide pHT1030 a été démontrée (Lereclus et al., 1992. spbA locus ensures the segregational stability of pHT1030, a novel type of Gram-positive replicon. Mol. Microbiol. 7: 35-46). Cette stabilité est due à la présence du gène spbA qui est aussi présent dans les plasmides dérivés du pHT1030, tels que pHT3101, pHT304, pHT315 et pHT370 (Arantes et al., 1991. Construction of cloning vectors for Bacillus thuringiensis. Gene 108: 115-119). La stabilité ségrégationnelle du plasmide pBC16 et de ses dérivés a aussi été déterminée (Lereclus et al., 1992. spbA locus ensures the segregational stability of pHT1030, a novel type of Gram-positive replicon. Mol. Microbiol. 7: 35-46).

La stabilité structurale se définit comme une non recombinaison intramoléculaire du plasmide. La stabilité structurale du plasmide pHT1030 et de ses dérivés est démontrée par le fait qu'ils peuvent porter des fragments d'ADN exogène de grande taille (> 10 kb) sans subir de remaniements moléculaires (Lereclus étal., 1989. Transformation and expression of a cloned delta-endotoxin gene in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-217).

De préférence, il s'agit de plasmides à haut nombre de copies notamment dérivés du plasmide pHT1030, tels que pH3101, pHT304, pHT315 et pHT370, de préférence pH315, ou dérivés du plasmide pBC16, du pE194 ou du pC194 ou de plasmides à bas nombre de copies comme le pHT73, plasmide résident de la souche Bt kurstaki HD-73 ou le pBMB299, plasmide résident de la souche Bt kurstaki HD1.

Selon l'invention, la cassette d'expression insérée dans ledit plasmide contient au moins un promoteur fort et la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt.

Un promoteur fort est un promoteur permettant une transcription forte du ou des gène(s) qu'il contrôle. Le promoteur fort peut provenir de la cellule hôte utilisée pour l'expression de la protéine d'intérêt ; il peut aussi s'agir d'un promoteur exogène. Les promoteurs forts sont préférentiellement des promoteurs activés en début de phase stationnaire et qui restent fonctionnels pendant une grande partie de cet état physiologique. De façon courante, l'expression des promoteurs est évaluée avec l'activité de la R-galactosidase (AS, en unités/mg de protéine) selon le calcul décrit dans Perchât et al. ("A cell-cell communication system regulates protease production during sporulation in bacteria of the Bacillus cereus group", Molecular Biology, Vol. 82, 3, p. 619-633, 2011) : AS = (A ₄₂ o x 1500000) / (T x V x C).

A420 : absorbance à 420 nm

T : temps de réaction en min

V : volume de l'extrait brut en pL

C : concentration en protéines en pg/mL

En utilisant cette formule, un promoteur est considéré comme fortement exprimé lorsque l'AS est supérieure à 500 U/mg prot. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le promoteur fort est régulé par un régulateur choisi parmi PlcR et NprR. Les promoteurs forts sont préférentiellement choisis parmi PpapR (SEQ. ID. N°l), PpIcB (SEQ. ID. N°2), PnprA (SEQ. ID. N°3) et PnprR (SEQ. ID. N°4).

Selon un second mode de réalisation de l'invention, le promoteur fort est régulé par un régulateur choisi parmi CodY, AbrB et SinR et encore plus préférentiellement le promoteur fort est choisi parmi PoppA (SEQ. ID. N°5), PnppC (SEQ. ID. N°6), PinhAl (SEQ. ID. N°7) et Pco/Y (SEQ. ID. N°8).

De façon préférée, le régulateur est CodY et le promoteur fort est PoppA ou PnppC.

La cassette d'expression selon l'invention peut en outre comprendre :

- une séquence stabilisatrice de l'ARNm positionnée en aval du promoteur et en amont de la séquence du gène codant la protéine hétérologue ; de préférence, il s'agit de STAB-SD de séquence SEQ ID N°9 ; de préférence, la séquence STAB-SD est en aval du +1 de transcription et à une position comprise entre environ 100 et 500 nucléotides en amont du site de liaison ribosomique (dit RBS pour Ribosome Binding Site), préférentiellement entre 100 et 300 nucléotides et plus préférentiellement entre 100 et 150 nucléotides ; et/ou

- une séquence terminatrice du gène crylAc, désignée, TcrylAc, par exemple de séquence présentant au moins 90% d'identité avec la SEQ ID N°10, de préférence, il s'agit de la SEQ ID N°10 ; cette séquence est clonée en aval du gène codant la protéine d'intérêt.

Le choix de ces séquences ne doit toutefois pas être considéré comme limitant du fait qu'il est à la portée de l'homme du métier de substituer ces séquences par des séquences aux fonctions équivalentes.

On entend par protéine d'intérêt, une protéine endogène ou une protéine qui n'est pas naturellement exprimée par la souche bactérienne selon l'invention, aussi désignée protéine hétérologue. De préférence, la protéine d'intérêt est une protéine cytotoxique naturellement exprimée par une souche du genre Bacillus ou une protéine d'intérêt industriel comme des enzymes, telles que protéases, lipases, amylases ; des hormones ; des antigènes, par exemple, utilisables comme immunogènes, des peptides ou des protéines à usage thérapeutique ; la protéine d'intérêt peut ainsi trouver application dans le domaine de la protection des cultures, la lutte antivectorielle, la production commerciale d'enzymes et l'industrie pharmaceutique, en particulier pour la production de vaccins.

La cassette d'expression selon l'invention conduit à l'expression puis à l'accumulation de protéines d'intérêt dans des sacs bactériens ou à leur ancrage à la surface de la bactérie. Son utilisation est particulièrement appropriée à la production de protéines instables ou toxiques pour la souche productrice. La construction de la cassette d'expression selon l'invention et son incorporation dans un plasmide sont réalisées par les techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier tel qu'illustré dans la partie expérimentale.

Le plasmide selon l'invention peut être introduit dans la bactérie hôte selon les techniques connues de l'homme du métier ; en particulier, la transformation de la bactérie hôte peut être réalisée par électroporation (Lereclus et al., 1989) ou par conjugaison hétérogramique (Tieu-Cuot et al., 1987). La cassette d'expression contenant le gène d'intérêt peut aussi être introduite sur le chromosome bactérien ou sur un plasmide résident par recombinaison homologue (Lereclus et al., 1992).

La présente invention se rapporte aussi à un procédé de production d'une protéine d'intérêt comprenant les étapes de : a- préparation de la souche bactérienne selon l'invention ; b- culture de ladite souche bactérienne en phase stationnaire ; et c- optionnellement, purification de ladite protéine d'intérêt.

La culture de la souche bactérienne est réalisée sur un milieu de culture contenant au moins une source d'azote et de glucose en des concentrations appropriées à une température comprise de préférence entre 25 et 35°C, de manière préférentielle la température est de l'ordre de 30°C ; par exemple, le milieu de culture est le milieu LB.

La purification de la protéine d'intérêt peut être réalisée par centrifugation ; en complément, les méthodes de chromatographie d'exclusion, de chromatographie en échange d'ions ou encore de chromatographie d'affinité peuvent être mises en oeuvre.

Selon un mode de réalisation particulier, un gène codant pour un domaine protéique d'export (tel qu'un peptide signal) ou d'ancrage (tel que LysM (SEQ. ID N°ll), SLH (SEQ ID N°12) ou LPXTG (Navarre et al., Microbiol Mol Biol Rev 63(1):174-229.DOI: 10.1128, 1999)) des protéines à la surface des bactéries est cloné en cis du gène codant la protéine d'intérêt.

Ainsi, la cassette d'expression selon l'invention peut comprendre :

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PpapR, PpIcB, PnprA, PnprR, PoppA, PnppC, PinhAl et PcalY et préférentiellement choisi parmi PoppA et PnppC ;

(ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et optionnellement une séquence stabilisatrice de l'ARNm, de préférence STAB-SD, et/ou la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc ; ou (i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PpapR, PpIcB, PnprA, PnprR, PoppA, PnppC, PinhAl et PcalY et préférentiellement choisi parmi PoppA et PnppC ;

(ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et une séquence stabilisatrice de l'ARNm, de préférence STAB-SD ; ou

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PpapR, PpIcB, PnprA, PnprR, PoppA, PnppC, PinhAl et PcalY et préférentiellement choisi parmi PoppA et PnppC ;

(ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc ; ou encore

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PpapR, PpIcB, PnprA, PnprR, PoppA, PnppC, PinhAl et PcalY et préférentiellement choisi parmi PoppA et PnppC ;

(ii) optionnellement la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et une séquence stabilisatrice de l'ARNm, de préférence STAB-SD, et la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc.

Selon des modes de réalisation particuliers, la souche utilisée est une bactérie du genre Bacillus l spoOA, de préférence Bt AspoOA, encore préférentiellement Bt HD73 AspoOA, et la cassette d'expression comprend :

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PpapR, PpIcB, PoppA, PnprR, PnppC et PnprA et préférentiellement choisi parmi PoppA et PnppC ;

(ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et optionnellement une séquence stabilisatrice de l'ARNm, de préférence STAB-SD, et/ou la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc ; ou

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PpapR, PpIcB, PoppA, PnprR, PnppC et PnprA et préférentiellement choisi parmi PoppA et PnppC ; (ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et une séquence stabilisatrice de l'ARNm, de préférence STAB-SD ; ou

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PpapR, PpIcB, PoppA, PnprR, PnppC et PnprA et préférentiellement choisi parmi PoppA et PnppC ;

(ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc ; ou encore

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PpapR, PpIcB, PoppA, PnprR, PnppC et PnprA et préférentiellement choisi parmi PoppA et PnppC ;

(ii) optionnellement la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et une séquence stabilisatrice de l'ARNm, de préférence STAB-SD, et la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc.

Selon d'autres modes de réalisation particuliers, la souche utilisée est une bactérie du genre Bacillus AsigE, de préférence Bt AsigE, encore préférentiellement Bt 407 AsigE et la cassette d'expression comprend :

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PcalY et PinhAl ;

(ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et optionnellement une séquence stabilisatrice de l'ARNm, de préférence STAB-SD, et/ou la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc ; ou

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PcalY et PinhAl ;

(ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt, de préférence STAB-SD ; et une séquence stabilisatrice de l'ARNm ; ou

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PcalY et PinhAl ;

(ii) optionnellement, la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc ; ou encore

(i) un promoteur fort actif en phase en stationnaire choisi parmi PcalY et PinhAl ;

(ii) optionnellement la séquence d'un gène codant pour une protéine d'export ou d'ancrage ;

(iii) la séquence d'un gène codant une protéine d'intérêt ; et une séquence stabilisatrice de l'ARNm, de préférence STAB-SD, et la séquence terminatrice du gène crylAc, TcrylAc.

Selon un mode de réalisation particulier, la protéine d'intérêt produite est une protéine insecticide de B. thuringiensis.

Il est connu que de telles protéines peuvent être utilisées en tant que biopesticide dans des préparations contenant classiquement la protéine insecticide libre sous forme de cristal et des spores bactériennes, pour lutter contre les ravageurs de cultures ainsi que contre les vecteurs de maladie tels que les moustiques. En particulier, il pourra s'agir des protéines de la famille Cry (protéines du cristal) ou des protéines de la famille Cyt (toxines insecticides cytolytiques) ou des protéines Vip3 (toxines actives contre les insectes lépidoptères) et plus préférentiellement les protéines de la famille Cry.

Après leur expression, elles sont protégées de la dégradation par la membrane bactérienne qui constitue l'enveloppe du sac bactérien. De plus, la non-sporulation de la bactérie confère à l'invention l'avantage de ne pas disséminer les spores dans l'environnement.

Selon un autre mode de réalisation, la protéine d'intérêt produite peut être un enzyme d'intérêt industriel (protéases, lipases, amylases...) ou médical. L'encapsulation de cette protéine dans le sac bactérien facilite sa récupération et sa purification, et réduit donc les coûts de production.

Selon un troisième mode de réalisation, la protéine d'intérêt produite peut être une protéine entière ou un fragment de protéine pouvant servir d'antigène, par exemple des protéines de microorganismes (virus, bactéries, champignon) ou de parasites.

Dans ce mode de réalisation, il peut être avantageux que la protéine ou son fragment soit ancré à la surface du sac bactérien. Ce mode de réalisation présente un intérêt marqué pour la préparation de vaccins. Ainsi la présente invention propose une plateforme bactérienne qui peut être avantageusement exploitée pour la production de protéines intéressant de multiples domaines tels que la protection des cultures, la lutte antivectorielle, la production commerciale d'enzymes et l'industrie pharmaceutique. En outre, cette technologie a un faible coût et un excellent rendement permettant une production en masse.

FIGURES

[Fig 1] A, souche HD73 wt ; B, souche HD73 AspoOA.

[Fig 2] souche 407 AsigE

[Fig 3] Mesure de l'activité R-galactosidase dans les bactéries HD73 wt portant la fusion transcriptionnelle Pp/cB-STAB-SD-/ocZ (courbe noire) ou la fusion trancriptionelle PpIcB-lacZ (courbe grise).

[Fig 4] Mesure de l'activité R-galactosidase dans des bactéries HD73 AspoOA portant la fusion transcriptionnelle PpopR-STAB-SD-/ocZ (courbe grise) ou la fusion trancriptionelle PoppA-STAB-SD- lacZ (courbe noire).

[Fig 5] Mesure de l'activité R-galactosidase dans des bactéries 407 ksigE portant la fusion transcriptionnelle Pco/Z-STAB-SD-ZocZ-TermCrylAc (courbe noire) ou la fusion trancriptionnelle Pco/Z-STAB-SD-ZocZ (courbe grise).

[Fig 6] Mesure de la fluorescence à différents temps de culture, dans des bactéries HD73 wt (gris) et HD73 AspoOA (noir) portant la fusion transcriptionnelle PpopR-STAB-SD-g/p-TermCrylAc.

[Fig 7] Production de toxines d'intérêt sous le contrôle des promoteurs PoppA et PpapR associés aux éléments stabilisateurs STAB-SD et TermCrylAc. Observation microscopique d'une souche HD73 AspoOA transformée avec un plasmide portant les fusions transcriptionnelles PoppA-STAB- SD-toxl-TermCrylAc et PpopR-STAB-SD-tox2-TermCrylAc (A) ou d'une souche HD73 AspoOA ne contenant pas le plasmide décrit ci-dessus (B). Electrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS de la souche produisant les toxines d'intérêt (C). M, marqueur de poids moléculaire.

EXEMPLES

1. Effet de la création d'un phénotype non sporulant sur la formation de sacs bactériens

Les souches asporulantes correspondent à la souche Bt HD73 wt dans laquelle le gène spoOA a été délété (Bt HD73 AspoOA) ou à la souche Bt 407 wt dans laquelle le gène sigE a été délété (Bt 407 AsigE). Pour ces deux souches, les gènes spoOA et sigE ont été délétés par double crossing over en utilisant le plasmide pMAD et le protocole décrit par Arnaud et coll. (Arnaud et al., 2004).

La culture correspondant à la souche Bt HD73 wt est constituée presque exclusivement de spores (Figure IA). En revanche, aucune spore n'est visible dans le cas du mutant Bt HD73 AspoOA (Figure IB). Le mutant Bt HD73 spoOA montre la formation de sacs bactériens (gris clair sur la Figure IB). De même, contrairement à la souche Bt 407 wt, la souche Bt 407 AsigE ne forme aucune spore et est composée de sacs bactériens (Figure 2). Les souches Bt HD73 wt et spoOA ont été cultivées en milieu liquide HCT YEG à 30°C pendant 72h avant d'être examinées au microscope. Ce milieu est composé du milieu HCT (0,7% hydrolysat de caséine, 0,5% tryptone, 0.68% KH2PO4, 0,012% MgSO4 7H2O, 0,00022% MnSO4 4H2O, 0,0014% ZnSO4 7H2O, 0,008% citrate d'ammonium ferrique, 0,018% CaCl2 4H2O à pH 7,2) supplémenté de 0,3% de glucose et de 0,05% d'extrait de levure.

La souche Bt 407 AsigE a été cultivée en milieu liquide HCT YEG à température ambiante pendant 96h avant d'être examinées au microscope.

2. Effet de la séquence stabilisatrice STAB-SD sur l'activité promotrice d'un gène de phase stationnaire

Les Inventeurs ont ajouté la séquence stabilisatrice d'ARN STAB-SD entre le promoteur PpicB et le gène rapporteur lacZ sur le plasmide pHT304-18Z-PplcB pour générer le plasmide pHT304-18- PplcB-STAB-SD-lacZ. La séquence stabilisatrice d'ARN STAB-SD a tout d'abord été clonée entre les sites de restriction Xbal et BamHI du vecteur pHT304-18. Puis, le promoteur PpicB a été cloné en amont entre les sites de restriction Pstl et Xbal.

La souche Bt HD73 wt a été transformée avec les plasmides pHT304-18Z-PplcB et pHT304-18— PplcB-STAB-SD-lacZ puis cultivée en milieu LB à 30°C.

Le milieu de culture LB (Luria Bertani) est un milieu complexe classiquement utilisé pour la mise en culture des souches bactériennes, il est composé de tryptone, 10 g/L ; extrait de levure, 5 g/L ; NaCI, 10 g/L. Les composants sont solubilisés dans 800 mL d'eau déminéralisée, le pH est ensuite ajusté à 7,0 et le volume est complété à 1 L. Le milieu est stérilisé par autoclavage à 121 ⁹ C pendant 15 minutes. tO correspond au début de la phase de transition entre la phase exponentielle et la phase stationnaire de croissance.

Ainsi, l'activité de PpicB, promoteur actif en phase stationnaire, a été comparée en présence et en absence de STAB-SD.

Les résultats de la figure 3 montrent que le promoteur PpicB est actif dans les deux constructions vectorielles : en présence et en absence de STAB-SD. La présence de STAB-SD augmente l'expression de la p-galactosidase.

3. Activité de promoteurs de phase stationnaire dans le mutant AspoOA

Les fragments d'ADN correspondant aux séquence des promoteurs de gènes exprimés en phase stationnaire PoppA ou PpapR suivies de la séquence STAB-SD ont été synthétisés et clonés dans le vecteur pHT315. Le gène rapporteur lacZ a été cloné en aval de ces séquences. Les vecteurs ont été introduits dans des cellules Bt HD73 spoOA. tO correspond au début de la phase de transition entre la phase exponentielle et la phase stationnaire de croissance.

Les souches bactériennes ont été cultivées en milieu HCT YEG à 30°C.

L'activité R-galactosidase de ces souches a été mesurée au cours de leur croissance et montre une forte activité de ces promoteurs aux temps indiqués sur la figure 4, et une activité plus importante pour le promoteur PoppA à partir de tO.

4. Effet de la sé stabilisatrice sur I' d'un gène de stationnaire

La séquence correspondant au terminateur du gène crylAc a été clonée en aval de la fusion transcriptionnelle entre le promoteur d'un gène exprimé en phase stationnaire (PcalY) et le gène rapporteur lacZ sur le plasmide pHT304.18Z pour générer le plasmide pPcalY-STAB-SD-/ocZ-

TermCrylAc. Ce vecteur a été introduit dans des cellules Bt 407 AsigE. tO correspond au début de la phase de transition entre la phase exponentielle et la phase stationnaire de croissance.

Les souches bactériennes ont été cultivées en milieu LB à 30°C.

L'activité R-galactosidase de cette souche a été mesurée et comparée à celle d'une souche portant le même vecteur à l'exception de la séquence TermCrylAc. Les résultats montrent que les deux plasmides permettent l'expression de la R-galactosidase, la fusion portant la séquence TermCrylAc conduit à une expression plus forte que celle ne la portant pas (Figure 5).

5. Effet de l'association des éléments géné sur I'

Les souches Bt HD73 wt et Bt HD73 AspoOA ont été transformées avec le plasmide pHT315 portant la fusion transcriptionnelle PpapR-STAB-SD-g/p-TermCrylAc afin de mesurer l'activité de cette fusion transcriptionnelle dans le contexte génétique AspoOA et de la comparer à l'activité de la souche wt (Figure 6).

Le plasmide a été construit de la façon suivante. Le fragment d'ADN correspondant à la séquence du promoteur PpapR suivie des séquences STAB-SD et TermCrylAC a été synthétisé et cloné dans le vecteur pHT315. Le gène rapporteur gfp a été cloné en aval de cette séquence. tO correspond au début de la phase de transition entre la phase exponentielle et la phase stationnaire de croissance.

Les souches bactériennes ont été cultivées en milieu HCT YEG à 30°C.

Les résultats montrent que l'association des différents éléments génétiques (plasmide, promoteur

PpapR, séquence STAB-SD et séquence TermCrylAc) est fonctionnelle dans la souche HD73 spoOA.

De plus, la mesure de la fluorescence produite par les souches HD73 AspoOA et HD73 wt montre que l'expression du gène gfp est plus forte dans le contexte génétique AspoOA que dans le contexte sauvage.

6. Effet de l'association des éléments génétiques sur la production de protéines insecticides

Une souche HD73 spoOA a été transformée avec un plasmide portant les fusions transcriptionnelles PoppA-STAB-SD-crylAh-TermCrylAc et PpopR-STAB-SD-crylCo-TermCrylAc. La production des toxines d'intérêt CrylAb et CrylCa correspondant aux gènes crylAb et crylCa, respectivement, a été vérifiée au microscope à contraste de phase et par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS (Figure 7). Les bactéries ont été cultivées en milieu PEP YEGx à 30°C et récoltées 48h post-inoculation. Ce milieu est composé de 0,7% hydrolysat de caséine, 0,5% peptone, 0.68% KH2PO4, 0,012% MgSO4 7H2O, 0,00022% MnSO4 4H2O, 0,0014% ZnSO4 7H2O, 0,008% citrate d'ammonium ferrique, 0,018% CaCl2 4H2O, à pH 7,2 supplémenté de 0,3% glucidex et 0,05% d'extrait de levure.

Les résultats montrent la production des toxines sous forme de cristal dans les sacs bactériens HD73

AspoOA portant PoppA-STAB-SD-crylAh-TermCrylAc et PpopR-STAB-SD-crylCo-TermCrylAc (Figure 7 A) tandis qu'une souche HD73 spoOA ne contenant pas le plasmide décrit ci-dessus présente des sacs bactériens sans cristaux (Figure 7 B). De plus, l'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS montre que les toxines d'intérêt représentent la majorité des protéines des sacs bactériens (Figure 7 C).

SEQUENCES

SEQ ID n°l - PpapR Région promotrice du gène papR de Bacillus thuringiensis

CTAGAACCATGAATTAAAAGAATCACTTATAAAAAAAATGAAGAAATAAAAAAGACA TAAAGAACAAATA

TGCATAATTGCATAAAGTCTGGATAATTTTTCATGATATATTTAAAGAAAAAATGCG G

SEQ ID n°2 - PpIcB Région promotrice du gène pIcB de Bacillus thuringiensis

AGCATGTGTATGCTTTACTCTTTTTTTACATTAGTTTAGACAAGCCTTAATAATAGT TTATTAAAATGAAAGT

GTATTCATTCATTATATTCACTGTGTATAAAGTTATAATGATATGAACATTTGCATA TTTTAATTTAGTGATA

GAAATTTCGTGAAAGGTGGGATATTCTAGTCATAGGTTAACCGGACGACATCATAGG ATCCTAACAAAATG

TTTACAATAATTCAATTATAAAATGGAGG

SEQ ID n°3 - PnprA Région promotrice du gène nprA de Bacillus thuringiensis

TTTTTTCAATATTTGTTCCTCAAAATTCTACAAAACTTGAGAAATAAATTAATTGAA TTTTTAGTATATTAATA

GTGGAAACATAATGCTAATATGAAACTACTCTTTTTCAAAAAAATTTTTATTAGGGG GAAGGTTCATG

SEQ ID n°4 - PnprR Région promotrice du gène nprR de Bacillus thuringiensis

GAAGTGAAGTCAAGAGAGAAAAAAATGAAATTATGCATATTTTTTAGAAAATTTATA TTTATCAATTTATAT

TTCTCCGAATTTTATGTATTATTAGAGTAATGGGGTAATGAGAATGGAGG

SEQ ID n°5 - PoppA Région promotrice du gène oppA de Bacillus thuringiensis

CTAGACCGTCAAAATATTACTAGAATTATTATACTATAAAAGCTATAATAAGTACTA GGATTAATTTTTTGAA

AATTATACGCAATTAAAGGTCTGATTTTAAGATGATGGTAGCAATGTTAATGTATCC CTTTACGAAAAATTT

AAAATATAAATATTTTATTAAAAATTTTAACAAAAAAACAAAAAACTATAIIG Ç ATTGTTATATTATATGT

ATAATGAAAATTGTAGAAACTTGGAGATTATTCTTTCAATTCTACTTTTTAACAAGT GAGGGTACAGGAAGT

GCAATTAGGGGAGG

SEQ ID n°6 - PnppC Région promotrice du gène nppC de Bacillus thuringiensis

ATTCCACTTTTATATAAAAAGATTTTTGAATATTTTTTCAACTTACCCTTGTCAAAC ATTGTCAATTTATATTA

AAATAACAACATACAAAATATTTAGTCTTTTCAGAAAAGATGGAGGGATAGCCATG

SEQ ID n°7 - PinhAl Région promotrice du gène inhAlde Bacillus thuringiensis

AATTGTGATATATTCGTATGCTAACTATGAAATTTTTACAAATATATTAAAAATATT ACATGATATGACTAAA

TATTGAAAAAATATTGAATTTTTAATAAAATTCAATTTGTAATACATATTATTTATT AGGGGAGGAAATATG

GGATG

SEQ ID N°8 - PcalY Région promotrice du gène calY de Bacillus thuringiensis.

AAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAGTGTGAGGGAACGTTAGCCCTCACCTCTTTG TTTTTCTTTTTTCTTA

TAGTATTAAATGATTTGAGTGTGAAAAAAGTTATAAATTATCATTGTTTTTTTCTGA AAAGTCTAAATGATAT

TGAGAAATAAAAATAACTGAAAATATTAATAAATATGTGTTGTGTTTATATAGGGTT GTTCGTTATAATGAA

CATAAGGTTTTTAAAAAAGAACACATATTAGCTAAGCTAATATAGTTTTCTTTACAT CTCTTATTGAAAAATA

AGTGATAAAAATATAAAAAAAAGCTAGGGGGAATTGATT Le + 1 de transcription est indiqué en caractère gras. Les boîtes -10 des promoteurs sont soulignées d'un trait fin. Les boîtes -35 sont soulignées de 2 traits. La séquence d'ADN reconnue par PlcR (boîte PlcR) des promoteurs PpapR et PpIcB est soulignée d'un trait épais.

SEQ ID N°9 - STAB-SD Bacillus thuringiensis gaaaggaggg atgcc

SEQ ID N°10 - TcrylAc - Bacillus thuringiensis aaactcaggt ttaaatatcg ttttcaaatc aattgtccaa gagcagcatt acaaatagat aagtaatttg ttgtaatgaa aaacggacat cacctccatt gaaacggagt gatgtccgtt ttactatgtt attttctagt aatacatatg tatagagcaa cttaatcaag cagagatatt ttcacctatc gatgaaaata tctctgcttt ttcttttttt at

SEQ ID N°ll Séquence contenant 2 domaines LysM tels que décrits par Shao et al., 2009, Microb Cell Fact 8, 48. doi:10.1186/1475-2859-8-48.

ATGATTCAAATTGTAACGGTTCGTAGCGGTGATAGCGTATATAGCTTGGCATCAAAA TATGGATCAACACC TGACGAAATAGTAAAAGACAATGGACTAAATCCCGCTGAAACGCTCGTTGTTGGTCAGGC ACTTATCGTTA ATACGAAAGGAAATAATTATTATGTACAGCCTGGTGACAGCCTCTATCGGATTTCTCAAA CATATAATGTCC CCCTCGCTAGTTTAGCTAAAGTTAATAATTTATCTTTAAAATCTATTCTCCATGTCGGAC AACAATTATATGT ACCAAAAGGCACA

SEQ ID N° 12 : Séquence contenant 3 domaines SLH tels que décrits par Fedhila et al., 2006, Mol. Microbiol. 62: 339-355. doi: 10.1111/j.1365-2958.2006.05362.x.

GAAGATGAGAAAACAGAAGTGGTAGAATTTAAAGATGTACCAAAGGGACATTGGTCA GAAGAAGCAATT

AATTACTTAGCGAAAGAAAAATTATTTATAGGCTATGGAAATGGTGAATTTGGATTT GGTGATAACATTACT

CGTGGACAAGTAGCACTTCTAATACAAAGATATTTAAAATTAGAAAATAATCTAGAA CAAAAAACGGCATT TACAGATACGAAAGGAAATATGTATGAAACGGCTATTGATGCAGTGGTTCAAGCTGGAAT TATGACAGGC TATGGAAATGGTATGTTCCGTCCGGATGGAGTATTAACTCGATATGAAATGTCAGTAGTA CTACAAAGAGT ATTTCAGTTAAAAGAAAATGAAAATAGTGCAGAGAATTTTAAAGATGTACCAAATGGCCA TTGGGCGAAA GGATATGTGAAAGCTTTAGTGGATAATAAAATATCAAAAGGCGACGGGGAAGGGAATTTT TTAGGAGATA ATTTCGTAACACGTGAACAATACGCACAGTTTTTGTATAATGCAATAAAGAAA