"Produits et procédé pour la décontamination des prions"

L'invention a pour objet des produits et procédés pour la décontamination de produits et matériaux infectés par des agents transmissibles non conventionnels (ATNC) responsables des encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles. L'invention vise plus spécialement la décontâmination de produits et matériaux infectés par les prions qui s'accumulent principalement dans le cerveau de l'hôte, plus particulièrement par une isoforme anormale, PrPsc (pour prpscrapie^ ^u^ r(§sulte d'une modification conformationnelle d'une protéine PrPc (PrP cellulaire) codée par l'hôte. L'apparition d'un nouveau variant de la maladie de Creutzfeldt Jakob en Grande- Bretagne et son lien possible avec encéphalopathié spongiforme bovine ont mis en avant une possible contagiosité de la maladie, en particulier par. des produits d'origine animale infectés, notamment par des aliments, et par des matériaux médico-chirurgicaux contaminés. En effet, les techniques actuelles de désinfection et de stérilisation ne permettent pas de détruire aisément les prions qui sont résistants à la plupart des procédés habituellement utilisés. Des Directives administratives ont édicté les règles à 'respecter en la matière, mais sont très lourdes à mettre en œuvre, onéreuses et nécessitent l'utilisation de produits toxiques. Au vu -de ce contexte, les inventeurs ont cherché des composés permettant une décontamination de l'agent pathogène simple, efficace et utilisable sur une grande majorité de surfaces et matériaux' médico-chirurgicaux. Leurs travaux ont montré l'efficacité de certains dérivés métalliques à cet égard. L'invention a donc pour but l'utilisation de tels composés pour l.a décontamination de prions. Elle vise également un procédé de traitement de matériaux et de produits infectés comprenant l'utilisation de ces composés. L'invention vise ainsi l'utilisation du Cu et de ses dérivés, pour la décontamination de prions. Selon une disposition supplémentaire de l'invention, ces dérivés sont mis en œuvre avec H2O2. De manière préférée, le dérivé métallique est CUSO4. Le ou les composés utilisés selon l'invention se présentent avantageusement sous forme de solutions aqueuses. L'étude de l'action de ces dérivés sur la décontamination des agents pathogènes responsables des maladies à prions a montré leur grande efficacité pour décontaminer les produits ou matériaux infectés . De manière avantageuse", il s'agit de surcroît de composés non toxiques, biodégradables aisément manipulables. L' invention vise donc également un procédé de décontamination ' de ' produits ou de matériaux infectés par des agents pathogènes responsables des maladies à prions, caractérisé en ce qu' il comprend leur mise en contact avec au moins un composé tel que défini ci-dessus ou d'une solution le renfermant, et le' cas échéant avec H2O2. Dans un mode préféré de réalisation' de l'invention, le dérivé métallique est CuSO4. Le traitement de décontaminatio.n est réalisé de préférence avec une solution renfermant ledit composé à raison d' au moins 500μM, notamment de 500 à. 1000 μM. ' . H2O2, lorsqu'il est utilisé est présent dans les solutions à raison d'environ 50 mM. Des résultats satisfaisants sont obtenus en opérant à température ambiante, pendant une durée de l'ordre de 15 à 60 min, notamment pendant environ 30 min. Ce ou ces composés et leurs solutions présentent ' ainsi un grand intérêt dans le cadre d'un usage hospitalier, où ils permettent, notamment, une décontamination des dispositifs médicaux ou médicaux-chirurgicaux à risques, comme les matériaux à usages multiples, tels que les endoscopes, sonde.s (dialyse) , ou encore une décontamination des surfaces' de travail, type paillasse ou sol, également à risques. Lesdits composés ou leurs solutions sont aussi particulièrement utiles pour décontaminer par exemple un matériel infectieux d'origine cérébrale et les produits biologiques provenant de sujets porteurs des formes infectieuses de la maladie- de' Creutzfeldt Jakob.- L'invention vise également l'utilisation desdits composés et de leurs solutions pour décontaminer les • produits d'origine sanguine ou du matériel biologique utilisé dans les greffes. De manière avantageuse, ces composés et solutions se sont avérés efficaces sur la souche de prion liée à 1 'ESB (encéphalopathie spongiforme txansmissible bovine ou maladie de la vache folle) . Ils sont donc applicables à tout type de prion quelque soit la souche et J-' origine de l'agent. Ils sont également utilisables avec avantage dans le cadre d'une application agro-alimentaire, notamment pour la décontamination de tout composé potentiellement infectieux et en particulier des farines animales ou autres produits d' origine animale contaminés. . Des applications d'intérêt comprennent également la décontamination de locaux, comme les abattoirs, de surface et appareils risquant d' être en contact avec les agents infectieux. On citera par exemple en particulier ceux provenant de ruminants . D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence aux figures 1 et 2 qui représentent, respectivement, .Exemple 1 : Solution de décontamination de prions renfermant CuSO4 et H2O2 a) Etude de l'action du cuivre associé à H2O2 sur la - dégradation de la PrPSc présente dans des homogénats de cerveaux infectieux de souris. Des solutions de CuSO4 et de H2O2 à différentes concentrations sont ajoutées à. des échantillons constitués par des extraits infectieux d' homogénats de cerveau murins et sont laissées en contact environ 30 min à température ambiante. Les échantillons sont ensuite déposés sur un gel de polyacrylamide SDS-PAGE après ajustement des concentrations en l'

protéines et digestion avec de la protéinase K (PK) à une concentration de 1 mg de PK pour 50 mg de protéine. La présence de PrPΞc est révélée par Western blot . Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 1. On 5. observe qu'à une concentration de lOOμM de CuSU4et de 5OmM de H2O2 ^IeS échantillons infectieux présentent des taux diminués de PrPSc. A une concentration de 500μM de CuSO4et de 5OmM de H2O2, le taux de PrPSc présent dans, les homogénats infectieux devient indétectable en Western blot (pistes 7 et 8) .A cette 0 ' concentration, l'effet est potentialisé par l'action de H2O2. En utilisant des doses "plus élevées de CuSO4 de 1 mM à 1OmM, le cuivre seul permet de faire disparaître le signal de PrPSc et H2O2 n' est plus nécessaire. Ces résultats sont confirmés en répétant ces expériences sur 5 des homogénats provenant de cerveaux de souris' infectés par- la - souche de priόn 22L.Des résultats similaires ont été obtenus sur des homogénats provenant de la souche murine Chandler et d'ESB, ce qui démontre que l'effet décontaminant n'est pas souche- dépendant. 0 b) Etude - de infectivité d'homogénats de cerveaux infectieux traités avec une forte concentration de cuivre in vitro Des homogénats de cerveaux 22L ont été traités pendant environ 30 min avec différentes concentrations de CuSO4 associé 5 ou non -à H2O2 à différentes concentrations. Ces homogénats infectieux sont dialyses, puis déposés sur des cellules de . neuroblastomes murins ayant- la capacité de répliquer l'agent infectieux. Des homogénats de cerveau non traité sont utilisés pomme 0 contrôle. Un Western blot est réalisé après 6 passages sur les lysats cellulaires et après digestion avec de la PK, afin de tester la présence dé PrPSc signifiant que les échantillons testés demeurent toujours infectieux. 5 Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 2.On constate que l'infection est diminuée par le traitement. l'

Exemple 2 : Tests in vivo Une confirmation des résultats observés in vitro a été réalisée. Des homogénats de cerveau infectieux 22L ont été traités notamment par 500 μM de CUSO4 et 100 mM d'H2O2. Les homogénats, traités ou non, ont été inoculés à des souris par voie intracérébrale. Les animaux témoins inoculés avec les homogénats non traités sont tous tombés malades en 168 jours +/- 2 jours. Certains animaux inoculés avec lès homogénats traités sont toujours vivants après plus de 300 jours. Ce résultat démontre qu'une réduction d'au moins 7 log du titre infectieux peut être obtenue par cette méthode de décontamination. Exemple 3 : Décontamination de matériaux chirurgicaux Des matériaux tels que des endoscopes sont immergés dans une solution renfermant lmg de CuSO4 pendant 20 min. Les tests effectués pour identifier la présence de prions après ce traitement se sont révélés négatifs. ' " Exemple 4 : Etude de efficacité de décontamination On rapporte ci-après les données concernant l'efficacité de décontamination testée in vivo après inoculation à la souris. Pour cela des homogénats de cerveaux contrôle et décontaminé ont été inoculés de façon intracérébrale à la souris (C57B1) . Les temps de survie des souris sont les suivants : 1) Inoculation des homogénats infectieux contrôles : 167,6 +/- 0,5 jours . • ' . 2 ) Homogénats traités au CuSO4 (0,5mM, 30 min, température ambiante) : 200,2 +/- 8,9 jours. 3 ) Homogénats traités au CuSO4 (ImM, 30 min, température ambiante) : 217,2 +/- 13,4 jours. 4 ) Homogénats traités au CuSO4 (ImM) + H2O2 (10OmM, 30 min, température ambiante) : 266,4 +/- 15,6 jours. Compte-tenu des ces durées d'incubation dans ces différentes conditions et d'une courbe de titration de l'agent infectieux réalisée sur ces souris, on peut estimer que la décontamination obtenue est supérieure à 104 dans les homogénats traités juste par le CuSO4 et supérieure à 105 dans l'homogénat traité au CuSO4 + H2O2.