L'invention est relative à des produits résul¬ tant de la conjugaison d'un support macromoléculaire, d'un haptène et d'un muramyl-peptide par l'intermédiaire d'un groupement substituant la partie saccharidique du muramyl-peptide, ces produits présentant des propriétés immunogènes sélectives de la partie hapténique qui en¬ trent dans leur constitution. Elle concerne plus parti¬ culièrement encore des compositions immunogènes conte- nant de tels produits en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable, compositions qui peuvent être utilisées pour la vaccination contre des antigènes pos¬ sédant un site antigénique ou epitope en commun avec 1 'haptène. On connaît 1 ' intérêt porté aux -.peptides synthé¬ tiques, de façon générale à des haptènes de faible poids moléculaire, pour constituer le principe actif de vac¬ cins susceptibles de protéger l'hôte contre 1*haptène ou le plus souvent contre un antigène pathogène. Ces hap- tènes ne présentent pas de pouvoir immunogène sensible, lorsqu'ils sont présentés à l'organisme de l'hôte. Di¬ verses méthodes ont déjà été proposées soit pour con¬ férer, soit renforcer les propriétés immunogènes de tels haptènes, soit encore pour renforcer 1' immunogénicité d'antigènes faibles, qu'il s'agisse d'antigènes faibles par nature, ou d'antigènes hautement purifiés dont une partie du pouvoir immunogène a été perdue, notamment au cours des opérations nécessaires à leur purification ou encore de sous-unités dérivées de ces antigènes, ces sous-unités portant cependant encore des sites

antigéniques caractéristiques de ces antigènes.

Il est entendu que l'on donnera dans ce qui suit, une signification extensive au mot "haptène" pour la commodité du langage. Le mot désignera dans ce qui suit non seulement les haptènes proprement dits, ayant par exemple un poids moléculaire au plus égal à 5 000, mais encore les antigènes faibles dont question ci- dessus. Une solution qui a été envisagée et qui conduit à une forte immunogénicité consiste dans la fixation (conjugaison ou couplage par covalence) desdits haptènes sur des supports macromoléculaires de poids moléculaires élevés. Les produits de conjugaison ou de couplage ainsi obtenus présentent ef ectivement souvent une immuno¬ génicité accrue susceptible d'induire in vivo une pro- duction efficace d'anticorps contre 1'haptène présent dans le produit de conjugaison ou même contre des anti¬ gènes de poids moléculaires plus élevés ayant un site antigénique ou un epitope en commun avec cet haptène.

Bien que l'on ait déjà proposé de nombreux sup- ports macromoléculaires susceptibles d'être tolérés par l'organisme, les conjugués ainsi produits présentent cependant un inconvénient important. Ils n'induisent pas seulement une réaction immunitaire in vivo à l'égard de 1'haptène, mais également contre le support macromolé- culaire lui-même. Cet inconvénient peut même présenter un caractère de gravité extrême, lorsque l'hôte a déjà été vacciné contre le support macromoléculaire. Ce cas peut se présenter, notamment lorsque le support macro¬ moléculaire est 1'anatoxine tétanique dont est connu 1 ' effet amplificateur important à 1 ' égard de la réaction immunogène d'haptènes éventuellement greffés sur cette anatoxine. Il a par ailleurs été démontré par des essais réalisés sur l'animal, que l'immunisation contre un hap¬ tène couplé à un support macromoléculaire contre lequel l'animal avait auparavant été immunisé, pouvaient même

entraîner la suppression de la capacité de réponse im¬ munitaire de l'organisme contre l'haptène, au lieu de l'augmenter. Il ne peut donc être envisagé de procéder à des vaccinations mettant en jeu un support macromolé- culaire contre lequel le receveur .est peut être déjà protégé. Tel serait en particulier le cas avec des produits de conjugaison entre un haptène déterminé et 1 'anatoxine tétanique, puisque celle-ci est utilisée pour la vaccination d'une partie importante de la population contre le tétanos. C'est l'une des raisons pour lesquelles l'utilisation pour la vaccination, de principes actifs résultant de la conjugaison entre un haptène portant un epitope spécifique d'un agent patho¬ gène contre lequel une protection est recherchée, d'une part, et un support macromoléculaire de poids molécu¬ laire élevé d'autre part, n'a pas été envisagée sérieu¬ sement dans la pratique jusqu'à ce jour. C'est aussi l'une des raisons qui a incité les chercheurs à trouver d'autres solutions techniques pour révéler ou accroître l'activité immunogène de tels haptènes, dans des propor¬ tions telles que leur utilisation en tant que principe vaccinant puisse être envisagée. Même si des résultats positifs ont été obtenus, il faut reconnaître que la capacité d'amplification recherchée des propriétés i - munogènes en cause n'est pas toujours atteint. Même dans les cas les plus favorables, cette amplification n'at¬ teint pas l'importance que l'on a déjà pu observer dans des conjugués formés, entre un haptène et un support macromoléculaire de poids moléculaire élevé, tel que 1 ' anatoxine tétanique ou 1 'anatoxine diphtérique.

L'invention a pour but de remédier en grande partie au moins aux difficultés susceptibles d'être ren¬ contrées dans l'utilisation de produits de conjugaison mettant en jeu un haptène et un support macromoléculaire du type sus-indiqué. Plus particulièrement, l'invention

a pour but de rendre ces produits de conjugaison tels que, tout en possédant un effet immunogène caractéris¬ tiques de l'haptène, ils soient en même temps sensible¬ ment dépourvus de cet effet vis-à-vis du support acro- moléculaire lui-même. En d'autres termes, l'invention a vocation de fournir des produits de conjugaison de ce type, dans lesquels cette activité immunogène anti¬ support macromoléculaire est pratiquement supprimée.

Le but de l'invention peut être atteint en ayant recours à des molécules porteuses résultant de la conju¬ gaison du support macromoléculaire choisi à un ou plu¬ sieurs groupes muramyl-peptide, par l'intermédiaire d'un groupement chimique jouant le rôle d'un bras, substi¬ tuant le noyau glucopyranosyle du muramyl-peptide, de préférence sur la position 6 de ce noyau.

Les produits de l'invention consistent donc dans des produits de conjugaison entre les molécules porteu¬ ses ainsi formées et 1 'haptène - ou les haptènes - eux- mêmes porteurs d'un ou plusieurs épitopes contenus dans une molécule, notamment un antigène contre lesquels une protection peut être recherchée.

Le produit de l'invention peut donc être carac¬ térisé comme contenant trois principes couplés entre eux par l'intermédiaire de liaisons covalentes, ces trois principes consistant respectivement en un support macro¬ moléculaire, un muramyl-peptide lié à ce support par un groupement chimique via son noyau glucopyranosyle et au moins un haptène portant au moins un epitope responsable de l'activité immunogène recherchée. De préférence, le bras est choisi de façon à conférer, si besoin, des propriétés amphiphiles à l'ensemble bras-muramyl-pep- tide.

L'expérience a montré que ce produit de triple- conjugaison bénéficie d'une double amplification de l'activité immunogène de l'haptène, en d'autres termes

des ' amplifications respectivement induites par le muramyl-peptide, dont les activités immuno-adjuvantes sont connues, et par la molécule porteuse, ce produit de triple conjugaison étant cependant sensiblement, sinon totalement, dépourvu d'activité immunogène à l'égard du support macromoléculaire ou de la molécule porteuse. Ce dernier effet (suppression ou masquage des propriétés immunogènes propres à la molécule porteuse ou au support macromoléculaire) est particulièrement remarquable, si l'on se rappelle les produits de conjugaison décrits à ce jour et formés entre des muramyl-peptides et des sup¬ ports macromoléculaires de poids moléculaires élevés, possédaient des effets immunogènes non seulement contre 1 ' haptène éventuellement également présent dans le pro- duit de conjugaison, mais aussi contre le support macromoléculaire.

Des muramyl-peptides préférés pour la modifica¬ tion recherchée du support macromoléculaire sont repré¬ sentés par la formule générale suivante :

dans ^" laquelle :

R. est un groupe OH ou un groupe O-C ₈ H.-NH- ou O-(C <_-)lu-Rα.. m étant un nombre entier de 1 à 10, et R3. étant une fonction aminé, carboxyle, thiol, hydroxyle ou un hydrogène,

- A est de l'oxygène ou un groupe NH ;

R _g est un groupe B-R ou CO-B-R dans lequel B est un groupe ou une chaîne linéaire ou ramifiée pouvant com¬ porter jusqu'à environ 100 atomes de carbone et R est un hydroxyle, carboxyle, aminé, thiol ou hydrogène, le groupe B étant éventuellement lui-même porteur de un ou plusieurs groupes fonctionnels du type de ceux désignés ci-dessus pour R, ou encore carbonyle, alcoxyle ou acy- le ; - R ₂ est un hydrogène ou un groupe alcoyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, notamment méthyle ; •- X est un résidu alanyle, arginyle, lysyle, asparagyle, aspartyle, cystéinyle, glutaminyle, glutamyle, glycyle, histidyle, hydroxyprolyle, isoleucyle, leucyle, méthio- nyle, phenylalanyle, prolyle, séryle, threonyle, trypto- phanyle ou valyle ;

Y est un groupe OH, H- ou, de préférence, OR-, ou NHR ₇ , R_ étant un groupe hydrocarboné pouvant avoir de 1 à 20 atomes de carbone ou pouvant être un acide aminé tel qu'indiqué pour X, tel qu'alanyle, séryle, valyle ou glycyle, ledit acide aminé étant libre, a idé ou estéri- fié, le groupe d' estérification pouvant comporter jus¬ qu'à 4 atomes de carbone ;

Z est un groupe carboxyle, carboxamide, ester compor- tant de 1 à 10 atomes de carbone, ou encore un groupe alcoyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, de préfé¬ rence -CH ₂ -CH ₃ ou -(CH ₂ ) ₂ -CH ₃ ; étant entendu que l'un au moins des groupes R. et R _fi (et de préférence R _g ) possède une fonction réactive permet- tant sa conjugaison avec une fonction réactive

mentaire portée par une autre molécule, en particulier le support macromoléculaire.

De préférence, dans le triple conjugué selon l'invention, le muramyl-peptide d'une part, 1 'haptène d'autre part, sont couplés au support macromoléculaire par l'intermédiaire de groupes fonctionnels distincts initialement présents sur ou portés par le support macromoléculaire.

Les "conjugués triples" ainsi obtenus - préférés vis-à-vis des autres couplages susceptibles d'être ima¬ ginés - pourront alors être représentés par la formule globale :

[Support macromoléculairej Haptène ^muramyl-peptidej

dans, laquelle x et y représentent les nombres respectifs de groupes haptène et de groupes muramyl-peptide fixés sur un même support macromoléculaire, étant alors entendu que la somme x + y ne saurait être plus élevée que le nombre total de groupes fonctionnels initialement portés par le support macromoléculaire de poids molécu¬ laire élevé, dont des exemples seront indiqués plus . loin. La somme x + y est par exemple comprise entre 2 et 100. Ceci étant, on remarquera que ne sont pas exclus de la protection les autres types de conjugaisons qui peuvent être envisagés. Par exemple, il peut être envi¬ sagé, si le groupe muramyl-peptide fixé sur le support macromoléculaire porte encore un groupe fonctionnel libre approprié, de le mettre également en oeuvre dans une opération de conjugaison avec 1 'haptène. Cependant, les conjugués préférés de l'invention sont ceux dans lesquels le muramyl-peptide et 1 'haptène sont greffés séparément l'un de l'autre sur le support mac ^' romolécu- laire.

Un groupe préféré de muramyl-peptides mis en oeuvre dans les "conjugués triples" de l'invention sont caractérisés par la formule suivante :

CH, î CH ₂ -Z

R„ 1 est -OH ou -0-C b._H 4. -NH. _-_, ou 0- (CH _o __ ) m -R avec m de 1 à

10 et Rcl étant une fonction aminé , carboxyle , thiol , hydroxyle ou un hydrogène ; - R est -H ou -CH ₃ ;

- R _c 6 est -C0(CH 2_.)n-R avec n de 1 à 10 et R étant une fonction aminé, carboxyle, thiol, hydroxyle ou hydro¬ gène;

- X est Ala, Gly, Ser ou Val ; Y est 0(CH ₂ ) -H avec p de 1 à 10 ;

- Z est C0-NH ₂ , C00(CH ₂ ) _r -H ou (CH ₂ ) _r ~CH ₃ avec r de 1 à 4.

De préférence, les résidus aminoacide entrant dans la constitution du groupe X sont levogyres (sauf dans le cas où X est constitué par un résidu glycyle) .

Les muramyl-peptides correspondant à des dérivés du type 2-(2-acétamido-2-désoxy-3-0-D-glucopyranosyl)- alcanoyl-peptides sont suffisamment connus pour qu'il soit inutile d'insister sur leurs modes de préparation. Cependant, comme on l'aura remarqué à la lecture

des significations des groupements appartenant aux mura¬ myl-peptides préférés qui ont été donnés ci-dessus, l'expression muramyl-peptides doit être entendue comme s 'étendant aussi à des muramyl-peptides du type 2-(2-a- cétamido-2-désoxy-3-0-D-glucopyranosyl)-alcanoyl-amino- acyl- nor Leucine ou à des dérivés de ces derniers muramyl-peptides .

Les composés de ce type, qui peuvent être fabri¬ qués par des procédés tout à fait analogues à ceux qui peuvent être mis en oeuvre dans la préparation des déri¬ vés connus du type 2-(2-acétamido-2-désoxy-3-0-D-gluco- pyranosyl)-alcanoyl-peptides, ont été plus particulière¬ ment décrits dans la demande de brevet français 85 06596 déposée le 30 Avril 1985. Le contenu de cette demande de brevet doit être considéré comme faisant également par¬ tie intégrante de la présente description, pour ce qui est d'éventuels détails relatifs à des modes de prépara¬ tion préférés de ces composés.

Des muramyl-peptides préférés appartenant à ce dernier type de composés préférés sont ceux dans les¬ quels Y est un groupe 0R_ ou NHR _? , R _? ayant la signifi¬ cation sus-indiquée, et dans lesquels le groupe NH-CH-C0Y

(Œ ₂ ) ₂ Z est un dérivé d'un groupe nor Leucine dextrogyre, plus particulièrement d'un groupe D-nor Leucine, dans lequel

Z = -CH ₂ -CH _3>

Quel que soit le type de muramyl-peptide utili- se, qu'il s'agisse de ceux dans lesquels le groupe

-CH-CO-Y I

CH I ² Z est dérivé de l'acide glutamique ou de ceux dans les- quels ce même groupe est dérivé de la nor Leucine ou de

ses ^" homologues, on observera encore que d'autres catégories de composés particulièrement avantageux pour la réalisation des conjugaisons sont ceux dans lesquels A est de l'oxygène et R _g un groupe -C0-(CH ₂ ) -C00H tel que le groupe succinyle -C0- ^' (CH ₂ ) ₂ ~C00H, ou le groupe -C0-(CH ₂ ) -NH ₂ , tel que le groupe epsilon-amino-caproyle -CO-(CH ₂ ) _g -NH ₂ , n étant un nombre de 1 à 10.

Dans d'autres composés préférés de l'invention, les groupes R _g contiennent seuls ou en combinaison avec les groupes qui viennent d'être mentionnés, des chaînes linéaires ou ramifiées, dont les maillons sont consti¬ tués de chaînes hydrocarbonées, dans lesquelles, le cas échéant, certains des atomes de carbone sont remplacés, de place en place, par des atomes d'azote et/ou d'oxy- gène, avec notamment pour conséquence la création de fonctions ester, éther, amido, imino, i ido, etc.

Parmi les éléments avantageusement contenus dans les chaînes B, on mentionnera des résidus aminoac le, notamment des chaînons contenant de 1 à 3 résidus a ino- acyle successifs, par exemple du type lysyle ou alanyle, (ceux-ci pouvant d'ailleurs être remplacés par tous au¬ tres aminoacyles du type indiqué à propos du groupe X) , ou encore des éléments glycéryle : -0-CH ₂ ~CH(0)-CH~-0- ou glycolyle : -0-CH ₂ ~CH ₂ -0- ou des éléments dérivés du glycerol ou du glycol, des acides ^" glyceriques ou glyco- liques, par exemple ceux combinant des éléments glycé¬ ryle ou glycolyle, d'une part, et des éléments amino- cyle, d'autre part.

D'autres groupes B préférés sont formés par des chaînes telles que ci-dessus définies, elles-mêmes porteuses de ramifications, par exemple par des groupes acylés, notamment des acides gras, lesquels comprennent respectivement notamment de 14 à 30 atomes de carbone, par exemple les groupes pal itoyle. Ainsi, des groupes B préférés contiennent en

particulier des éléments terminaux représentés par la formule :

-0CH ₂ -CH0(R _Q )-CH ₂ 0(R _g ) dans lesquels R _ft et R _q sont des groupements acyle com- prenant de 14 à 30, notamment de 16 à 24, atomes de carbone.

Au titre des muramyl-peptides préférés suscep¬ tibles d'être mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, on mentionnera ceux qui peuvent être désignés par les formules abrégées suivantes (la désignation "MurNAc" concernant le groupe N-acétylmuramique) :

- 6-0-epsilon-aminocaproyl-MurNAc-L-Ala-D-Gln-0nBu ;

- 6-0-epsilon-aminocaproyl-MurNAc-L-Ala-D-Nle-0nBu ;

- 6-0-succinyl-MurNAc-L-Ala-D-Gln-0nBu ; - 6-0-succinyl-MurNAc-L-Ala-D-Nle-0nBu ; ou encore les dérivés semblables dans lesquels les grou¬ pes ester n-butyliques (OnBu) sont remplacés par des groupes ester méthylique (OMe) .

Au titre des supports macromoléculaires préfé- rées susceptibles d'être mis en oeuvre dans les "conju¬ gués triples" de l'invention, on mentionnera des molé¬ cules naturelles du type sérumalbumine humaine, anato- xines ou autres supports macromoléculaires porteurs ayant des poids moléculaires d'au moins 50 000, par exemple de 50 000 à 250 000 daltons. On peut également avoir recours à des polymères peptidiques synthétiques, du type polylysine ou du genre de ceux décrits dans le brevet européen 13 651.

D'une façon générale, on préfère les supports macromoléculaires constitués par des chaînes peptidiques dont la séquence comporte un grand nombre de groupes fonctionnels latéraux permettant le couplage par covalence, avec les muramyl-peptides particuliers mis en oeuvre dans le cadre de cette invention et/ou avec les haptènes dont 1 ' immunogénicité doit être induite. A cet

égard, les toxines tétaniques et diphtériques sont particulièrement préférées. Par exemple, la toxine tétanique, qui a un poids moléculaire de l'ordre de 160000, porte une cinquantaine de groupes NH_ terminaux libres permettant de fixer iin nombre suffisant de groupes haptène et muramyl-peptide. Ces toxines peuvent, après fixation desdits muramyl-peptides et/ou des haptènes, être ensuite aisément détoxifiées, par exemple par un traitement classique par le formaldéhyde. Des conditions dans lesquelles ces conjugaisons peuvent être réalisées, puis les toxines détoxifiées (si nécessaire) sont illustrées plus loin, notamment en rapport avec la fixation sur la toxine tétanique d'un peptide contenant un élément de surface de la protéine de surface du sporozoïte de Plasmodium knowlesi et de 6-0-epsilon-aminocaproyl-MurNAc-L-Ala-D-Gln-0nBu.

L'invention s'applique enfin à la production de "conjugués triples" faisant intervenir tout haptène comprenant au moins un "site antigénique" utilisable pour l'induction d'anticorps in vivo, sous réserve qu'il soit conjugué à une molécule amplificatrice de son immu¬ nogénicité.

Par "groupe comprenant au moins un site antigé¬ nique", il faut entendre tout groupe contenu dans un antigène à l'égard duquel une production in vivo d'anti¬ corps est recherchée ou tout groupe équivalent sur le plan immunogénique. Au titre des haptènes susceptibles d'être pris en considération dans le cadre de la pré¬ sente demande de brevet, on mentionnera, par exemple, ceux qui répondent à la définition qu'en donne la deman¬ de de brevet européen 89 290 déposée par l'Agence Natio¬ nale de Valorisation de la Recherche (ANVAR) . Il ne s'agit donc pas seulement d'haptènes porteurs d'un site antigénique qui, lorsque ces haptènes sont couplés à une

molécule amplificatrice, leur confère la capacité d'in¬ duire in vivo des anticorps protecteurs contre des agents pathogènes déterminés. L'invention s'étend encore à la fabrication de conjugués triples mettant en jeu d'autres haptènes, tels que ceux envisagés dans la de¬ mande de brevet européen 89 290, par exemple des hormones .

On mentionnera de façon non limitative parmi les haptènes qui peuvent entrer dans la constitution des "conjugués triples" selon l'invention le facteur de li¬ bération de la lutéotropine, connue sous la désignation LH-RH, des fragments peptidiques, ou des peptides syn¬ thétiques doués de propriétés analogues, par exemple - des décapeptides du type Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ₂ ou l'acide libre correspondant pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly ; des peptides C-terminaux dé la gonadotropine chorio- nique humaine (hCG) ; - des peptides C-terminaux de la sous-unité β de la hCG, notamment un triacontapeptide contenant les résidus a i- noacyles correspondant à ceux de l'hCG-β ou de dérivés synthétiques terminaux du genre de ceux décrits par S. Matsura et coll. (publication déjà mentionnée plus haut), des fragments de FSH, etc, ou des peptides consistant essentiellement en les séquences 109-145 et 111-145 des sous-unités C-terminales de hCG-β décrites par Arthur C.J. (Lee et coll. dans "Molecular Immunolo- gy", vol. 17, p. 749-756). L'invention permet le cou- plage de tels fragments hCG-β à 1 'anatoxine tétanique, pour la production de vaccins contraceptifs pour la femme.

La conjugaison des hormones qui précèdent avec les deux autres constituants tels que mentionnés ci- dessus, conduit à des principes immunogènes susceptibles

d'induire très efficacement in vivo la production d'anticorps contre les hormones naturelles en question.

On mentionnera encore, à titre d'exemples d'hap¬ tènes utilisables dans les conjugués triples selon 1 ' in- vention, ceux qui mettent e jeu différents peptides synthétiques ayant des séquences de résidus aminoacyle en commun avec les principaux peptides constitutifs de l'antigène HBsAg, notamment ceux dont les aminoacyles d'extrémité correspondent à ceux qui, dans la séquence de HBsAg, occupent les positions suivantes : 48-81 ; 2-16 ; 22-35 ; 95-100 ; 117-137 ; 122-137 ; 117-135 (se¬ lon les structures donnée par Pasek et coll. et repro¬ duites dans l'article de Lerner et coll. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 28., N ^* 6, 3403-3407. On mentionne- ra également à titre d'haptènes appropriés les peptides vaccinants porteurs de sites antigéniques caractéris¬ tiques de la toxine diphtérique, des virus de la grippe, de l'herpès, de la poliomyélite, etc.

On citera en outre des peptides synthétiques du genre de ceux décrits par E.H. Beachey et coll. qui sont susceptibles, lorsque couplés avec un muramyl-peptide, de former des anticorps actifs contre la protéine M de la surface de Streptococcus pyogenes, cette protéine étant désignée plus loin dans l'exemple II, sous l'abré- viation "M24". On peut également se référer aux séquen¬ ces peptidiques définies dans le brevet américain 4 284 537, plus particulièrement celles définies sous les abréviations CB _g et CB ₇ .

Des haptènes peptidiques particulièrement préfé- rés sont un ou plusieurs de ceux définis ci-après :

Les haptènes mis en jeu ont été les suivants : 1 ^* ) SODP : octodécapeptide contenant une séquen¬ ce de la "boucle diphtérique" et de formule : H ₂ N-Ala-Ala-cys-Ala-Gly-Asn-Arg-Val-Arg-Arg-Ser-Val-Gly- Ser-Ser-Leu-Lys-Cys.

2 ^* ) SCB7 : peptide contenant un epitope caracté¬ ristique du streptococcus type M24 contenant la séquen¬ ce :

Asn-Phe-Ser-Thr-Ala-Asp-Ser-Ala-Lys-Ile-Lys-Thr-Leu-Glu- AlaGlu-Lys- la-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Lys-Ala-Asp-Leu-Glu- Lys-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala.

3 ^* ) HBs (peptide 99-121) ; peptide comprenant un site antigénique de l'enveloppe du virus contenant la séquence : Asp-tyr-Gln-Gly-Met-Leu-Pro-Val-Cys-Pro-Leu-Ile-Pro-Gly- 100 110

Ser-Ser-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys . 20 4 ^* ) DDP Mal : peptide portant un epitope carac- teristique d'un antigène protecteur contre Plasmodium knowlesi. agent de la malaria du singe, décrit par Godson G.N. et coll. (1983), Nature, 305 (29-33, consti¬ tué par la séquence :

Tyr-Gln-Ala-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln-Pro-Gln- Ala-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln-Pro-Cys .

On peut aussi utiliser un peptide copiant un élément de la structure du parasite humain Plasmodium falciparum décrit par Enea et coll. (Science, 1984, 225 , p

628) ou par Dame et coll. (Science, 1984, 225. 593. Il s'agit d'un tetrapeptide du type (Asn-Ala-Asn-Pro) avec n étant de 2 à 8.

Ces exemples n'ont bien entendu aucun caractère limitatif. En outre, les haptènes utilisables ne sau¬ raient être limités à des peptides. Il s'agit par exem- pie aussi d'haptènes saccharidiques ou osidiques. On mentionnera par exemple les groupes sanguins A et B, le polysaccharide C du streptococcus C, l'acide cellobiuro- nique (Pneumo type III), tel que décrit par W.F. Goebel, "J. Exp. Medicine", 1939, p. 353-363, ou l'acide para- aminophénylcellobiuronique.

Enfin, les haptènes susceptibles d'être mis en oeuvre peuvent être constitués par des polypeptides syn¬ thétiques ou hémi-synthétiques contenant plusieurs sites antigéniques distincts entre eux et aptes à fournir des "polyvaccins" . De tels polyvac ^' cins ont été décrits dans la demande de brevet français 84 13989 déposée le 12 Septembre 1984.

Pour mémoire, on rappelle certaines des techni¬ ques préférées pour réaliser les conjugaisons entre le support macromoléculaire, d'une part, et le muramyl- peptide et l'haptène, d'autre part.

Conformément à une première technique, on peut avoir recours à une réaction de couplage par 1 ' intermé¬ diaire de glutaraldéhyde, dans la mesure où le support macromoléculaire, 1'haptène et le muramyl-peptide con¬ sidéré comportent tous des fonctions a iné.

^• S'agissant de la conjugaison entre le support macromoléculaire et le muramyl-peptide, on peut avoir recours à toutes formes de couplage mettant en jeu des positions déterminées sur le cycle glucopyranosyle du muramyl-peptide. En particulier, ces liaisons inter¬ viendront au niveau de la position en C. , de préférence de celle en C _g du cycle glucopyranosyle du muramyl- peptide. En ce qui concerne les substitutions impliquant le groupement R _g , on peut avoir recours aux méthodes de couplage couramment utilisées en synthèse peptidique entre les fonctions appropriées portées, d'une part, par le muramyl-peptide et, d'autre part, par le support macromoléculaire, l'un portant par exemple une fonction aminé et l'autre une fonction carboxyle, hydroxyle ou sulfhydrile ou vice-versa.

Bien entendu, on peut avoir recours à tout autre type de liaison, mettant en jeu les combinaisons pouvant intervenir entre une fonction sulfhydrile portée par

l'un des partenaires que constituent le support macro¬ moléculaire et le muramyl-peptide et un groupe maléimide porté par l'autre réactif, par exemple en faisant usage de la technique décrite par T. Kitagawa et T. Aikagawa dans "J. Bioche . " 21 (1976), 233.

La conjugaison peut se faire en utilisant les modes classiques de diazotisation ou de réaction mettant en jeu un isothiocyanate, notamment lorsque le muramyl- peptide porte une fonction aromatique aminée (notamment au niveau du groupe R. ) et lorsque le support macro¬ moléculaire porte une fonction aminé susceptible d'in¬ tervenir dans cette réaction. De telles techniques de réalisation sont décrites par exemple par B.F. Erlanger dans "Pharmacol. Rev.", .25 (1973), 271. Le couplage peut également être réalisé par la réduction d'une base de Schiff réalisée entre une fonc¬ tion aldéhyde portée par _, l'un des réactifs et une fonc¬ tion aminé portée par l'autre (G.R. Gray, "Arch. Bio¬ chem. Biophys. 163 (1974), 426). Toutes ces réactions sont en soi bien connues et le spécialiste appréciera que de nombreuses variantes peuvent être aménagées pour aboutir aux mêmes résultats . En ce qui concerne d'ailleurs plus particulièrement des couplages covalents qui mettent en oeuvre le groupe R ₁ du muramyl-peptide, on remarquera aussi que les conju¬ gaisons peuvent s'effectuer au moyen d'un pontage, l'agent de pontage consistant par exemple en un réactif bifonctionnel . De préférence, le groupe de pontage entre le muramyl-peptide et le support macromoléculaire dans le conjugué final n'excédera pas la longueur d'un enchaînement correspondant à celle d'une chaîne hydro¬ carbonée p-décylique.

De tels agents de pontage sont par exemple men¬ tionnés dans le brevet 78 16792 déposé le 5 Juin 1978. Dans ce qui précède, il a surtout été évoqué le

cas ^" du couplage entre le muramyl-peptide choisi et le support macromoléculaire.

Il va de soi que des techniques semblables peu¬ vent être mises en oeuvre pour réaliser le couplage de 1 'haptène au support macromolaire ou à la molécule porteuse.

Naturellement, l'ensemble des réactions qui pré¬ cèdent suppose que les fonctions actives éventuellement portées par les partenaires et qui ne doivent pas parti- ciper à la réaction de couplage soient éventuellement protégées. Il s'agit là de questions bien connues des spécialistes et il n'y a pas lieu d'insister à leur su¬ jet.

Lorsque les haptènes et les muramyl-peptides sont couplés séparément au support macromoléculaire, les proportions relatives d'haptène et de muramylpeptides seront ajustées en fonction du nombre de groupes fonc¬ tionnels libres disponibles sur ledit support macro¬ moléculaire. L'expérience et les exemples ci-après montrent qu'il n'est pas nécessaire de "saturer" le support ma¬ cromoléculaire en groupes muramyl-peptides de la caté¬ gorie envisagée. On constate en effet que le masquage ou la suppression de la réaction immunogène propre au support macromoléculaire lui-même est rapidement anihi- lée. Il y aura par contre généralement avantage à fixer sur le support macromoléculaire - ou sur la chaîne - autant de groupes haptène qu'il est possible, pour obtenir une réaction immunogène maximum spécifique à 1'haptène.

Avantageusement, le nombre de groupes muramyl- peptide par rapport au nombre de chaînes du support macromoléculaire (nombres exprimés en équivalents NH_ mis en oeuvre dans la réaction) seront dans un rapport 1:1 et le nombre de groupes haptène par rapport au

nombre de chaînes de support macromoléculaire seront également dans un rapport au moins égal, cependant de préférence supérieur à 1, par exemple de 1 à 5.

Dans ce qui précède, on a surtout évoqué le cas des fixations distinctes de ^' 1 ' aptène et du muramyl- peptide sur le support macromoléculaire. On peut naturellement aussi envisager d'autres combinaisons, par exemple celles envisagées plus haut, par exemple celles où l'on fixe au support macromoléculaire le muramyl- peptide au niveau de la position 6 de son noyau saccha¬ ridique, puis l'on fixe 1 'haptène sur la partie pepti- dique ou, de préférence, la position 1 du noyau saccha¬ ridique du muramyl-peptide. On peut également envisager de fixer d'abord l'haptène sur le muramyl-peptide, no- tamment au niveau de la position 1 du cycle sacchari¬ dique de ce dernier, avant que 1 ' intervienne la fixation de l'ensemble sur le support raacromoléculaire, par l'intermédiaire de la position en 6 du cycle glucopyra¬ nosyle du muramyl-peptide précédemment modifié. D'autres caractéristiques de l'invention appa¬ raîtront encore au cours de la description des exemples qui suivent. Il sera d'abord fourni un exemple particu¬ lier de production d'un conjugué triple conforme à l'invention mettant en jeu le 6-0-epsilon-aminocaproyl- MurNAc-L-Ala-D-Gln-OnBu (encore désigné sous l'abrévia¬ tion ^u MDP-6-0-( ε-aminocaproyl)-murabutide" dans les tableaux qui suivent) . On exposera ensuite les pro¬ priétés biologiques observées avec le conjugué triple obtenu. On indiquera également à titre de comparaison les propriétés observées avec un "conjugué triple" obtenu avec un muramyl-peptide n'entrant pas dans la catégorie des muramyl-peptides mis en jeu dans le cadre de l'invention, on l'occurrence la N-acétyl-muramyl-L- alanyl-D-isoglutaminyl-L-lysine (MDP-lysine) .

I - Procédé d'obtention du conjugué sur toxine téta- nigue.

La description qui suit s'applique à la fabri¬ cation d'un produit de conjugaison mettant en oeuvre des proportions particulières des constituants initiaux indiqués ci-après. Il va sans dire que la méthode est applicable de la même manière à la production de pro¬ duits de triple conjugaison formés à partir de propor¬ tions différentes des constituants initiaux, par exemple les conjugués A à F mentionnés plus loin.

L'agent couplant est la glutaraldéhyde employée à la concentration finale de 5,2 mM. La glutaraldéhyde sert à la fois d'agent couplant et détoxifiant lorsque la molécule porteuse est la toxine non détoxifiée, ce qui permet la disponibilité de suffisamment de groupe¬ ments H ₂ (une cinquantaine pour une molécule ayant 160000 de poids moléculaire) pour lier suffisamment de muramyl-peptide adjuvant et de peptide antigénique (il va sans dire que la "détoxification" est superflue lorsque la molécule porteuse utilisée est elle-même non toxique) .

Le peptide est, dans cet exemple, un peptide copiant un élément de-structure de la protéine de sur¬ face du sporozoïte de Plasmodium knowlesi. Sa structure est décrite dans Godson et coll. (Nature, 1983, 305. 29) et son immunogénicité a été étudiée par gysin et coll. (J. Exp. Mec, 1984, J_60, 935).

La réaction s ' effectue en tampon carbonate-bi¬ carbonate de sodium 0, 1M pH 8,5. La toxine tétanique (2,35 mg), le peptide de sporozoïte (3,75 mg) et le 6-0-( ε-amino-caproyl)-murabutide (2 mg) sont mis en solution et le glutaraldéhyde est ajouté sous agitation. La réaction dure une semaine et le produit est filtré sur tamis moléculaire, notamment celui commercialisé sous la marque SEPHADEX-G25 de façon à éliminer toutes

les molécules ayant des poids moléculaires inférieurs à 20 000.

Dans le cas du peptide utilisé, il n'y a pas de réaction possible entre le peptide couplé à la toxine tétanique et le muramyl-peptide, car le peptide ne con¬ tient qu'un groupement réactif à ce pH. Si le peptide et l'adjuvant se conjuguent, le produit de la réaction est éliminé à la filtration ; aussi, le seul conjugué possi¬ ble est le tryptique où le peptide (pep) et le muramyl- peptide adjuvant (adj) sont liés séparément sur la toxine tétanique (a ^' dj-support-pep) . Quand le même procédé est mis en oeuvre avec des peptides portant plusieurs groupements fonctionnels, on peut faire réagir le muramyl-peptide seul avec la toxine tétanique pendant un certain temps, avant d'ajouter le peptide au milieu de réaction, pour favoriser la liaison toxine tétanique- adjuvant par rapport à la liaison peptide-adjuvant susceptible de venir se conjuguer à son tour au support macromoléculaire. Le conjugué finalement obtenu est ensuite soumis aux tests suivants : a) HPLC. Le poids moléculaire du conjugué re¬ cherché correspond à un monomère (entre 150000 et 180000 daltons). Les produits de haut poids moléculaire, s'ils en sont formés, sont éliminés par gel-filtratiόn sur tamis moléculaire d'agarose réticulée, du type SEPHAROSE 6BCL. b) Dosage du glycopeptide couplé. Le dosage est effectué par la méthode de Reissig (J. Biol . chem. , 1956, 217, 959). Parmi les rapports expérimentés, le plus favorable a été 2 μg de muramyl-peptide (exprimé en MDP) pour 100 μg de conjugué. Des conjugués dans les¬ quels la dose de muramyl-peptide était de 1 μg pour 100 μg de conjugué ont permis d'obtenir des résultats similaires.

c) Antigénicité de la toxine tétanigue. Ce con¬ trôle est effectué par la méthode ELISA. La toxine téta¬ nique et les conjugués sont dilués de façon à obtenir 10 μg d'antigène tétanique dans 50 μl. Cinquante microli- très de chaque dilution sont déposés dans les puits de ' la plaque. Après traitement adéquat pour obtenir la fixation de l'antigène sur les plaques, on dépose une quantité fixe de sérum antitétanique calculée pour avoir une densité optique voisine de 1 , après révélation par le système anti-anticorps marqués à la peroxydase. Dans l'expérience mise en oeuvre, les chiffres suivants ont été obtenus :

P.O. obtenue Toxine tétanique 10 μg 0,715 Conjugué contenant 10 μg de toxine tétanique 0,145 Bruit de fond 0,120

Cette expérience montre que la conjugaison du muramyl-peptide et du peptide à la toxine tétanique ont modifié 1'antigénicité de celle-ci. Les expériences décrites ci-après montrent que ce phénomène a également modifié son immunogénicité, sans affecter ses propriétés de support macromoléculaire. d) Absence de toxicité. Deux tests ont été pra¬ tiqués . L'un de ces tests a permis de montrer que la toxine tétanique a perdu son activité toxique. Dix souris ont reçu chacune une quantité de conjugué correspondant à 10 doses mortelles de toxine tétanique : elles ont été observées une semaine sans manifester aucun signe clinique du tétanos.

Le second test a consisté en un essai pyrogène ; il a montré que 1,5 μg de muramyl-peptide conjugué n'a induit, chez aucun des trois lapins testés, d'élévation de température supérieure ou égale à 0,5 ^* C. Rappelons que 0,8 μg d'un conjugué de MDP-Lys et de toxine

tétanique, obtenu par couplage dans les mêmes conditions ont provoqué des élévations de température variant de 1,6 ^* C à 2 ^* C. On remarquera que dans ce dernier essai, la conjugaison s'était, par nécessité, effectuée au niveau du groupe peptidique du muramyl-peptide !

II - Essais biologjgues et propriétés comparées de con¬ jugués triples conformes à l'invention et de conjugués triples mettant en oeuyre le même haptène et le même support macromoléculaire, d'une part, et la MDP-lvsine d'autre part.

Par la méthode de production de liaisons cova- lentes mettant en jeu le glutaraldéhyde dans les condi¬ tions qui ont été indiquées ci-dessus, on a produit des conjugués triples mettant en oeuvre des proportions initiales variables du peptide, de la toxine tétanique et soit du 6-0-ε-aminocaproyl-murabutide (conjugués D, E et F) , soit de MDP-lysine (conjugués A, B et C) . Les quantités de muramyl-peptide seront exprimées en équi¬ valents MDP-(N-acétyl-muramyl)-L-alanyl-D-isoglutamine) . II sera également dans ce qui suit fait référence aux équivalents NH _? , pour l'appréciation des rapports des différents constituants entrant dans les conjugués triples considérés ci-après.

Les conjugués A et D ont été obtenus à partir de 2,35 mg de toxine tétanique, 3,75 mg du peptide mala- rique et 2 mg de MDP ; les conjugués B et E ont été obtenus à partir de 2,35 mg de TT ; 7 ,5 mg de PEP et de 1 mg de MDP ; enfin, les conjugués C et F ont été obte¬ nus à partir de 11,7 mg de TT, 18,75 mg de PEP et 0,5 mg de MDP. Enfin, notamment pour les besoins des compa¬ raisons, un conjugué PEP-TT a été obtenu en procédant comme décrit plus haut, par la conjugaison de PEP et de toxine tétanique. La toxine a été utilisée comme sup¬ port, car elle contenait davantage de groupes réactifs que 1 'anatoxine.

La détoxification des conjugués obtenus a été réalisée par addition de quantités suffisantes de glutaraldéhyde, puis par incubation pendant 5 jours. Les conjugués obtenus et les proportions relatives de leurs constituants apparaissent dans le tableau I . La déto- xification complète de chacun des conjugués a été véri¬ fiée avant utilisation, par injection sous-cutanée à 3 souris d'une dose de conjugué correspondant à la dose double de TT entraînant la mort des animaux. La détoxi- fication a été constatée du fait de l'absence de tout signe de paralysie dans les souris utilisées dans ce test ou dans celles qui ont fait l'objet des essais qui suivent.

Des groupes comprenant chacun 6 souris adultes femelles BALB/c ont été immunisés de façon sous-cutanée avec 50 μg de chacun des conjugués A-C (tableau II) administrés sous forme de solution saline. Un autre groupe a reçu 50 μg du PEP-TT en un mélange avec 1.00 μg de MDP-lysine au sein d'une solution saline. 6 souris témoins ont reçu 50 μg de PEP-TT en solution saline en l'absence d'adjuvant. Les animaux ont reçu un rappel avec les mêmes antigènes 3 semaines plus tard, puis ont été saignés soit 7 jours, soit 14 jours après le rappel. Dans une deuxième série d'expériences, les animaux ont été immunisés avec 50 μg des conjugués D-F (tableau I) au sein d'une solution saline ou avec 50 μg de PEP-TT en mélange avec 100 μg de 6-0-aminocaproyl-murabutide au sein d'une solution saline. Des souris témoins ont reçu 50 μg de PEP-TT sans l'adjuvant. Les animaux ont été saignés 2 semaines après les immunisations primaires. Au jour 25, ils ont reçu une injection de rappel. Enfin, des prélèvements de sang ont été faits après des délais respectivement de 7, 14 et 123 jours après le rappel. Les séru s prélevés chez les animaux dans chacun des groupes considérés ont été

réunis et testés pour leurs capacités à induire la pro¬ duction in vivo d'anticorps anti-peptide et anti-téta¬ nique dans des essais de diagnostic mettant en jeu la méthode ELISA. La protéine native a été reconnue par des anticorps anti-peptide dans des radio-immuno-essais (de l'anglais radio-immuno-assay : RIA) en utilisant des extraits sporozoïte fixés sur des plaques plastiques, selon la méthode de Vanderberg et coll. , 1969, et par des essais mettant en jeu des anticorps et une fluo- rescence indirecte (indirect fluorescence antibody test: IFA) selon la méthode Gvadz et coll., 1979. La réaction des circumsporozoïtes (CSP) selon Nordin et coll. , 1979, a été utilisée pour tester l'activité biologique des anticorps anti-PEP. Production d'anticorps in vitro.

Des cellules spléniques ont été obtenus à partir de souris. Ces cellules, obtenues dans des conditions aseptiques, ont été lavées et suspendues à une concen-

7 tration de 10 cellules/ml dans le milieu connu sous la désignation RPMI 1640 fabriqué par la Société SEROMED, contenant 2 g/1 de NaHC0 ₃ de la glutamine (2 mM) , 100 unités/ml de pénicilline, 100 μg/ l de streptomycine, 5% de sérum de veau foetal et du 2-mercaptoéthanol (2x10 -5M), les suspensions ont été réparties en portions aliquotes de 100 μl. Celles-ci ont été placées dans les puits de plaques pour cultures de tissus à 96 puits (Costar) . 20 μl de TT ou de PEP-TT ont été ajoutés dans chacun des puits à raison de 0,1 μg/ml. Les volumes finaux dans chacun des puits ont été ajustés à 0,2 ml. Les puits témoins ne recevaient pas d'antigène. Les plaques ont été incubées dans une atmosphère contenant 10 % de C0 ₂ et 90 % d'oxygène à 37 ^* C. Au 4ème jour, les plaques ont été lavées pour éliminer l'antigène. 6 jours plus tard, les surnageants ont été recueillis et testés pour leur teneur en anticorps par la méthode ELISA.

Les résultats suivants ont ainsi pu être observés .

Réponse in vivo exprimée en quantité d'anticorps pro¬ duits à des conjugués avant des taux de substitution variables en PEP, TT et MDP-lvsine.

Les résultats du tableau II font apparaître que les titres en anticorps produits à 1 ' égard tant du peptide que de TT varient dans certaines proportions selon les taux de peptide et d'adjuvant fixés sur TT. Ce sont les souris qui ont été immunisées avec le conjugué qui contenait la plus forte teneur en peptide qui ont manifesté la plus forte réponse anti-PEP. L'accroisse¬ ment du taux de substitution de MDP-lysine ne s'est pas manifesté par une réponse concomitante anti-PEP plus élevée ; par contre, l'augmentation du taux de substi¬ tution en MDP-lysine s ' est manifestée par une réponse anti-TT élevée. Les mélanges de MDP-lysine avec le PEP-TT ont entraîné un léger accroissement de la réponse en anticorps anti-PEP vis-à-vis des témoins ; un fort accroissement de la réponse en anticorps a cependant été observé lorsque l'adjuvant a été conjugué à TT. On a également observé des titres anti-TT plus élevés que chez les témoins, dans ceux des groupes qui avaient été traités avec le MDP-lysine (groupe 3) . Ce résultat signifie clairement que la conjugaison de l'adjuvant à PEP-TT se manifeste par un accroissement des réponses tant à l'égard du peptide que du support. Réponse in vivo en anticorps à l'égard de conjugués contenant le 6-0-ε-amino-caproyl-murabutide. Deux essais ont été réalisés avec ces derniers types de conjugués. Des résultats représentatifs de ces essais sont montrés dans le tableau III. On remarque que tous les groupes ayant reçu les adjuvants ont manifesté des réponses immunitaires approximativement équivalentes 15 jours après le rappel, et ce indépendamment de la

conjugaison ou de la non-conjugaison de l'adjuvant avec PEP-TT. Cette équivalence a été observée malgré le fait que les conjugués D-F ne contenaient respectivement que 1,0 μg, 0,6 μg et 0,3 μg d'adjuvant par 50 μg de conju- gué. Il résulte des observations qui ont été faites que des conjugués contenant 100 fois moins de l'adjuvant induisent des réponses en anticorps anti-peptide du même ordre de grandeur que les mélanges mettant en oeuvre le muramyl-peptide non combiné par covalence avec l'anti- gène. Un contraste manifeste a cependant été observé au niveau des réponses primaires anti-tétaniques. Ceux des animaux qui avaient reçu les conjugués n'ont conduit qu'à des réponses très faibles (titres inférieurs à 400) tandis que ceux qui avaient reçu PEP-TT seul ou en mélange avec l'adjuvant ont conduit à l'observation de titres 8-40 fois supérieurs.

Les différences entre les réponses anti-support qui pouvaient être observées entre les groupes 1-2 d'une part, et les groupes 3-5 d'autre part ont même été davantage prononcées postérieurement aux rappels (aux jours 32 et 39) . Des groupes traités avec le conjugué, c'est le groupe 5 qui avait été traité avec le conjugué contenant les plus faibles proportions d'adjuvant qui a manifesté des réponses en anticorps anti-TT les plus élevées. La production en anticorps anti-TT fortement favorisée chez les animaux qui avaient reçu l'adjuvant sous forme associée (et non conjuguée) aux autres constituants du conjugué pouvait encore être observée 123 jours après l'injection de rappel. Les observations suivantes ont été faites au niveau des réponses anti-peptide. On a observé chez les animaux traités avec les conjugués D et E des réponses un peu plus élevées que celles constatées chez ceux des animaux qui avaient été traités avec PEP-TT en mélange avec l'adjuvant. Il a été constaté une activité

adjuvante relativement faible chez ceux des animaux qui avaient reçu le conjugué F, donc celui dont les teneurs en adjuvant étaient initialement faibles. Ces résultats semblent indiquer que la dose d'adjuvant utilisée (0,3 μg/souris/injection) était à la limite des quantités minima nécessaires pour induire une réponse anti-peptide.

L'ensemble de ces résultats montre néanmoins que les groupements adjuvants amphiphiles exposés à la sur- face du support, et ce après conjugaison de la molécule porteuse ainsi formée avec le peptide, jouent un rôle important au niveau de 1 ' induction de la production d'anticorps anti-PEP et anti-TT respectivement.

Des observations semblables ont été faites au jour 32 dans ceux des animaux dont la réactivité a été testée par RIA en mettant en oeuvre la protéine circum- sporozoïte naturelle, dans les plaques en plastique re¬ vêtues avec des extraits de sporozoïtes et d'adjuvant incomplet de Freund. Les activités biologiques, mesurées par ^" CSP ont également été mesurées. Les résultats obte¬ nus sont indiqués dans le tableau IV. Des titres élevés ont été observés dans les sérums provenant de tous les groupes, que ce soit dans ceux qui avaient reçu PEP-TT en mélange avec l'adjuvant ou chez ceux qui avaient été traités avec le conjugué triple. Cependant, ce sont les animaux traités avec le conjugué D qui ont conduit aux titres les plus élevés (aussi bien dans les tests IFA que CSP) . Ces résultats démontrent que ce sont les conjugués qui non seulement reconnaissent le parasite dans sa forme tridimensionnelle, mais encore entraînent une régression de la protéine circumsporozoïte des parasites vivants .

Production d'anticorps in vitro par des cellules splé- nigues des souris, au contact d'un conjugué PEP-TT-6-0- . ε-amino-caproyl ) -murabutide .

La capacité des cellules spleniques de souris de produire des anticorps anti-TT in vitro comme suite à une stimulation avec PEP-TT ou du TT libre a été testée, en raison du taux particulièrement faible des anticorps circulants anti-TT chez ces animaux, lorsque ceux-ci avaient été traités avec des conjugués contenant le murabutide. Les résultats sont montrés dans le tableau V. Les surnageants de ces cultures ont été testés dans le système ELISA. Ils révèlent que seules les cellules spleniques des groupes 4 et 5 ont fabriqué des anticorps anti-TT, après avoir été stimulées soit avec TT, soit avec PEP-TT in vitro. Au contraire, tous les groupes expérimentaux se sont révélés produire des anticorps anti-peptide, lorsqu'ils ont été stimulés in vitro avec PEP-TT. Des anticorps anti-PEP n'ont pas été détectés dans des surnageants de cellules spleniques d'animaux témoins (groupe 1), peut-être parce que la population des cellules productrices d'anticorps anti-PEP au sein de la rate des animaux n'ayant pas reçu l'adjuvant était trop faible pour être détectée. Ces résultats démontrent que la conjugaison du 6-0-( ε-amino-caproyl)-murabutide au PEP-TT conduit à une stimulation moins efficace à l'égard du support macromoléculaire TT que ne le fait un mélange du support macromoléculaire agissant en tant qu'antigène avec l'adjuvant. Cette différence peut être due à des modifications introduites dans les détermi¬ nants de TT ou au fait que ces déterminants ont été rendus inaccessibles au système immunitaire, d'où 1' immunogénicité réduite observée. Les essais qui précèdent appellent les obser¬ vations suivantes .

Des différences considérables ont été observées dans les essais d'adjuvanticité in vivo effectués avec des conjugués triples contenant les mêmes supports

macrόmoléculaires et peptides, par contre, des muramyl- peptides différents, notamment le 6-0-(ε-amino-caproyl)- murabutide et le MDP-lysine respectivement. Dans le cas du dernier adjuvant, l'accroissement de la proportion d'adjuvant dans le conjugué a également entraîné l'accroissement de la réponse anti-support macromolé¬ culaire. Au contraire, lorsque le muramyl-peptide entrant dans la constitution du conjugué était le 6-0-( ε-amino-caproyl)-murabutide amphiphilique, la réponse en anticorps anti-TT n'a guère été augmentée. Cependant, des sérums de souris traitées avec le conjugué contenant le plus d'adjuvant ont aussi donné les titres les plus élevés en anticorps reconnaissant le peptide et la protéine native. Ces derniers types de conjugués ont également provoqué une réaction CSP. Celle-ci est corrélable au degré de protection qui peut être observé chez les souris et les singes. En consé¬ quence, les doses faibles de 6-0-( ε-amino-caproyl)-mu¬ rabutide conjugué à PEP-TT se sont révélées induire une réponse en anticorps protecteurs nettement plus élevée que celle qui peut être obtenue avec les doses du même adjuvant en l'absence de conjugaison ou avec le MDP-lysine.

Les sérums de souris traitées avec les conjugués contenant le murabutide se sont révélés avoir des titres d'anticorps anti-TT beaucoup plus faibles que les sérums des animaux qui avaient reçu PEP-TT (en l'absence du muramyl-peptide) . Plusieurs hypothèses peuvent être formulées pour expliquer cette réponse réduite. Selon une première hypothèse, l'utilisation des muramyl- peptides particuliers entrant dans le cadre de l'inven¬ tion a introduit des changements conformationnels du support macromoléculaire à l'occasion de sa conjugaison avec le peptide et l'adjuvant. Selon une seconde hypo- thèse, 1'antigénicité du support macromoléculaire a été

modifiée par masquage de ses déterminants, ceux-ci étant alors rendus inaccessibles aux cellules du système immu¬ nitaire.

Le couplage du 6-0-(ε-amino-caproyl)-murabutide à la toxine tétanique rend peut-être 1 'anatoxine suffi¬ samment hydrophobe pour qu'elle soit légèrement masquée à l'égard du système immunitaire, tandis qu'au contraire le peptide est davantage exposé et sensible à l'action adjuvante du muramyl-peptide. C'est peut-être en raison du caractère hydrophile du MDP-lysine que l'effet adju¬ vant à l'égard de la toxine s'ajoute à l'effet adjuvant observable à l'égard du peptide.

Enfin, les essais de production d'anticorps in vitro ont été choisis de façon à déterminer si des cel- Iules de souris qui avaient été stimulés avec les con¬ jugués pourraient être également stimulés in vitro par PEP-TT ou TT et par conséquent pour déterminer dans quelle mesure les déterminants de l'anatoxine tétanique étaient exprimés au sein des conjugués. Les résultats montrent clairement que les cellules des groupes traités avec le conjugué ne donnent que de faibles réponses, sinon une absence de réponse à TT, que celui-ci soit utilisé à l'état libre ou à l'état conjugué au peptide. Ces résultats soutiennent l'hypothèse que 1 'antigénicité de TT au sein des conjugués triples a été modifiée. Par contre, les réponses anti-peptide in vivo sont approxi¬ mativement les mêmes dans les groupes 1-4 (tableau II), un peu plus faibles pour les animaux du groupe 5. En outre, des cellules de tous ces groupes formaient des anticorps anti-peptide in vitro, après stimulation avec PEP-TT. Pris dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que l'absence de production d'anticorps anti-TT in vitro par les cellules des groupes 1-3, était due à une alté¬ ration des déterminants antigéniques du support macromo- léculaire ou à leur masquage, au cours de la stimulation

in vivo. Enfin, les essais démontrent encore que la production d'anticorps anti-peptide peut être fortement stimulée par l'utilisation de conjugués conformes à l'invention, même lorsque ceux-ci ne contiennent que des proportions relativement faibles des muramyl-peptides particuliers envisagés .

Il résulte des essais qui précèdent que les con¬ jugués triples selon l'invention ont une immunogénicité spécifiquement dirigée contre 1 'haptène. L'invention concerne donc également des composi¬ tions pharmaceutiques dans lesquelles les conjugués tri¬ ples sus-définis sont associés à un véhicule physiologi- quement acceptable.

Des compositions pharmaceutiques avantageuses sont constituées par des solutions injectables contenant une dose efficace d'au moins un conjugué triple selon l'invention. De préférence, ces solutions sont réalisées dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, de préfé¬ rence saline ou glucosée. L'invention concerne également des compositions dans lesquelles ces conjugués triples sont encapsulés dans des liposomes aptes à former des suspensions injectables.

L'invention concerne plus particulièrement de telles solutions ou suspensions qui sont aptes à être administrées par injections intradermiques, intramuscu¬ laires ou sous-cutanées, intraveineuses ou encore par scarifications .

L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques, administrables par d'autres voies, no- tamment par voie orale ou rectale, ou encore sous des formes destinées à venir en contact avec des muqueuses, notamment les muqueuses oculaires, nasales, pulmonaires ou vaginales .

En conséquence, elle concerne des compositions pharmaceutiques dans lesquelles l'un au moins des

conjugués triples selon l'invention se trouve associé à des excipients pharmaceutiquement acceptables, solides ou liquides, adaptés à la constitution de formes d'ad¬ ministration orales, oculaires ou nasales, ou à des excipients adaptés à la constitution de formes d'admi¬ nistration rectale. Elle concerne aussi des compositions destinées à la voie pulmonaire, notamment des solutions préparées en vue de l'administration au moyen d'un appa¬ reil d'aérosols classique. A titre d'exemples de doses susceptibles d'être administrées, pour stimuler les réponses immunitaires de l'hôte contre des antigènes déterminés, on mentionnera des doses, en microgrammes par kg de corps, par exemple de 50 à 1000, de préférence de 100 à 300, μg/kg, lorsque l'administration est effectuée par voie parenterale, ou de 0,5 à 10 g/kg par voie orale.

Des compositions vaccinales préférées selon l'invention contiennent en outre un véhicule, tel que la polyvinylpyrrolidone, facilitant l'administration du vaccin. A -la place de la polyvinylpyrrolidone, on peut utiliser tout autre type d'adjuvant au sens classique que l'on donnait autrefois à cette expression, c'est-à- dire d'une substance permettant l'absorption plus aisée d'un médicament ou facilitant son action dans 1 ' orga- nisme. A titre d'exemples d'autres adjuvants de ce der¬ nier type, on mentionnera encore la carboxyméthylcellu- lose, les hydroxydes et phosphates d'aluminium ou tous autres adjuvants de ce type, bien connus de l'homme de l'art. Les compositions pharmaceutiques selon l'inven¬ tion sont donc essentiellement destinées à induire chez l'hôte une réaction immunitaire, lui permettant de pro¬ duire des anticorps ou une immunité à médiation cellu¬ laire à l'égard d'un antigène contenant le site antigé- nique spécifiquement porté par 1 'haptène entrant dans le

conjugué triple selon l'invention.

L'invention concerne aussi plus particulièrement un autre type de compositions pharmaceutiques utiles en thérapeutique humaine ou vétérinaire, chaque fois qu'est recherchée une modification de ^' 1 ' évolution ou du compor¬ tement de l'organisme humain ou animal, par exemple au niveau de la fécondité de l'espèce ou de l'orientation dirigée de son métabolisme vers la suppression de cer¬ taines hormones . Dans des cas préférés de ce dernier type, 1 'haptène entrant dans le conjugué mis en oeuvre est constitué par l'hormone elle-même ou un fragment de celle-ci.

Dans le domaine vétérinaire, on citera en outre la production accrue de certains constituants, au détri- ment d'autres constituants. On citera par exemple les applications des vaccins vétérinaires administrés dans le but d'accroître chez l'animal la production de viande par castration immunologique.

L'invention a en particulier pour objet des com- positions vétérinaires contenant des doses efficaces des susdits conjugués triples, dans lesquels 1'haptène lui- même est constitué soit par l'hormone elle-même, soit par une séquence peptidique ayant une partie commune avec l'hormone, l'hormone appartenant à la classe des hormones peptidiques ou glycopeptidiques . Une hormone particulièrement intéressante à cet égard est constituée par le facteur de libération de l'hormone lutéostimu- lante LH-RH.

Des doses unitaires efficaces de ces conjugués sont, à titre d'exemples, comprises entre environ 50 et 1000, de préférence de 100 à 300, μg/kg de corps, lors¬ qu'ils sont administrés par voie parenterale, et entre environ 0,5 et 10 mg/kg lorsqu'ils sont administrés par voie orale..

L'invention concerne également encore des réac¬ tifs biologiques essentiellement formés à partir de ces conjugués triples. En particulier, la partie hapténique peut être constituée par un principe actif de médicament ou de drogue (par exemple la morphine) ou encore le pro¬ duit d'expression, d'un oncogène. Ces réactifs biologi¬ ques peuvent alors être utilisés pour fabriquer des an¬ ticorps, notamment d'anticorps monovalents ou monoclo- naux. Ces anticorps sont alors à leur tour utiles pour la constitution de réactifs permettant par exemple l'étude de l'action de médicaments en cause sur l'hôte vivant. En particulier, ces anticorps permettront la détection de récepteurs cellulaires, ou encore l'étude du métabolisme et du mode d'action des médicaments en cause.

Comme il va de soi, et comme il résulte de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation plus spécialement indiqués, elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes, notamment celles où le muramyl-peptide entrant dans les conjugués triples de l'invention porterait des substi¬ tuants distincts de ceux qui ont été indiqués, dans la mesure où ces substituants n'entraîneraient cependant pas de modification du comportement sus-indiqué du muramyl-peptide ainsi modifié à l'intérieur des con¬ jugués triples ici considérés.

On remarquera encore que les contenus des documents et brevets mentionnés dans la présente demande sont considérés comme appartenant à la description de cette dernière.

TABLEAU I

A B L E A U II

Effet sur les réponses anti-peptide et anti-support de différents rapports de substitu¬ tion entre le peptide malarique et la MDP-lysine sur 1 'anatoxine tétanique.

Valeurs exprimées en titres de sérum donnant une D.O. de 2 x bruit de fond x 10 dans un essai ELISA.

A B L E A U III

Effet de différents rapports de substitution de l'anatoxine tétanique, du peptide mala¬ rique et de l'adjuvant sur les réponses anti-anatoxine tétanique et anti-peptide.

∞

Valeurs exprimées en titres de sérum donnant une D.O. de 2 x bruit de fond x 10 dans un essai ELISA.

A B L E A U IV

Reconnaissance du peptide et de la protéine native par des anticorps anti-peptide

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T A B L E A U

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