Verschiedene biosynthetische Produkte, wie beispielsweise Feinchemikalien, wie unter anderem Aminosäuren, Vitamine, Carotinoide, aber auch Proteine werden über natürli- che Stoffwechselprozesse in Zellen hergestellt und werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik-, Feed-, Food- und pharmazeutischen Industrie.

Diese Substanzen, die zusammen als Feinchemikalien/Proteine bezeichnet werden, umfassen unter anderem organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht- proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlenhydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine, Carotinoide und Cofaktoren, sowie Proteine und Enzyme. Ihre Produktion im Großmaßstab erfolgt zum Teil mittels biotechnologischer Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen, die entwickelt wurden, um große Mengen der jeweils gewünschten Substanz zu produzieren und sezernieren.

Carotinoide werden de novo in Bakterien, Algen, Pilzen und Pflanzen synthetisiert. In den letzten Jahren wird zunehmend versucht, auch Pflanzen als Produktionsorganis- men für Feinchemikalien, insbesondere für Vitamine und Carotinoide zu nutzen.

Ein natürliches Gemisch aus den Carotinoiden Lutein und Zeaxanthin wird beispiels- weise aus den Blüten von Marigold Pflanzen (Tagetes Pflanzen) als sogenanntes Ole- oresin extrahiert. Diese Oleoresin findet Anwendung sowohl als Inhaltsstoff von Nah- rungsergänzungsmitteln als auch im Feed-Bereich.

Lycopin aus Tomaten findet ebenso Anwendung als Nahrungsergänzungsmit- tel, während Phytoen überwiegend im kosmetischen Bereich verwendet wird.

Ketocarotinoide, also Carotinoide, die mindestens eine Keto-Gruppe enthalten, wie beispielsweise Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'- Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixanthin sind natürliche Antioxidantien und

Pigmente, die von einigen Algen, Pflanzen und Mikroorganismen als Sekundärmetabo- lite produziert werden.

Aufgrund ihrer farbgebenden Eigenschaften werden die Ketocarotinoide und insbeson- dere Astaxanthin als Pigmentierhilfsstoffe in der Tierernährung, insbesondere in der Forellen-, Lachs-und Shrimpszucht verwendet.

Ein wirtschaftliches biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von natürlichen, bio- synthetischen Produkten und insbesondere Carotinoiden ist daher von großer Bedeu- tung.

WO 0032788 beschreibt einige Carotinoid Biosynthesegene aus Pflanzen der Gattung Tagetes und offenbart, wie genetisch veränderte Pflanzen der Gattung Tagetes herge- stellt werden könnten, um in den Petalen verschiedene Carotinoidprofile zu erhalten und damit gezielt bestimmte Carotinoide herzustellen. Dazu ist es nötig, einige Bio- synthesegene überzuexprimieren und andere zu unterdrücken.

Zur Überexpression der neu gefundenen Carotinoid-Biosynthesgene in Pflanzen der Gattung Tagetes wird in WO 0032788 der petalenspezifische Promotor der Ketolase aus Adonis vernais postuliert.

Aufgrund einer Vielzahl möglicher Schwierigkeiten bei der Überexpression bestimmter Gene besteht ein ständiges Bedürfnis, weitere Promotoren zur Verfügung zu stellen, die eine Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes ermöglichen.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zu Grunde, weitere Promotoren zur Verfügung zu stellen, die die Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes ermöglichen.

Demgemäß wurde gefunden, dass sich die Promotoren, ausgewählt aus der Gruppe A) EPSPS Promotor B) B-Gene Promotor C) PDS Promotor und D) CHRC Promotor sehr gut zur Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes eignen, mit der Maßgabe, dass Gene aus Pflanzen der Gattung Tagetes, die in Wildtyppflanzen der Gattung Tagetes von dem jeweiligen Promotor exprimiert werden, ausgenommen sind.

Die Erfindung betrifft daher die Verwendung eines Promotors, ausgewählt aus der Gruppe A) EPSPS Promotor B) B-Gene Promotor C) PDS Promotor und D) CHRC Promotor zur Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes, mit der Maßgabe, dass Gene aus Pflanzen der Gattung Tagetes, die in Wildtyppflanzen der Gattung Tagetes von dem jeweiligen Promotor exprimiert werden, ausgenommen sind.

Benfey et al. (Plant Cell Volume 2, pp. 849-856) beschreiben den EPSPS Promotor aus Petunia als petalenspezifischen Promotor zur Expression von Genen in Petunia hybrida.

Ronen et al. (PNAS Volume 97, Number 20, 11102-11107 beschreiben den B-GENE Promotor aus Tomate als blütenspezifischen Promotor zur Expression von Genen in Tomaten.

Corona et al. (Plant Journal Volume 9 Number 4 pp. 505-512), Mann et al. (Nature Bio- technology Volume 18 pp. 888-892) und Rosati et al. (Plant Journal Volume 24 Num- ber 3 413-419) beschreiben den PDS Promotor aus Tomate als frucht-und blütenspe- zifischen Promotor zur Expression von Genen in Tomaten und Tabak.

Vishnevetsky et al. (Plant Journal Volume 20 Number 4 pp. 423-431) beschreiben den CHRC Promotor aus Gurke als blütenspezifischen Promotor zur Expression von Ge- nen in Gurke, und weiteren Pflanzen wie z. B. Nelke, Sonnenblume, Tabak.

Es sind weiterhin zahlreiche blütenspezifische Promotoren aus verschiedenen Orga- nismen in der Literatur bekannt. Dabei wurde überraschend festgestellt, dass viele die- ser Promotoren in Pflanzen der Gattung Tagetes nicht zur Expression, insbesondere nicht zur blütenspezifischen oder petalenspezifischen Expression von Genen führen.

Es war daher überraschend, dass sich die Promotoren, ausgewählt aus der Gruppe A) EPSPS Promotor B) B-Gene Promotor

C) PDS Promotor und D) CHRC Promotor sehr gut zur Expression, insbesondere zur blütenspezifischen und besonderes bevor- zugt zur petalenspezifischen Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes eignen.

Unter einem Promotor wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivi- tät verstanden, also eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure, im folgenden auch Gen bezeichnet, die Expres- sion, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert.

Unter #Transkription" wird erfindungsgemäß der Prozess verstanden, durch den aus- gehend von einer DNA-Matrize ein komplementäres RNA-Molekül hergestellt wird. An diesem Prozess sind Proteine wie die RNA-Polymerase, sogenannte Sigma-Faktoren und transkriptionelle Regulatorproteine beteiligt. Die synthetisierte RNA dient dann als Matrize im Prozess der Translation, der dann zum biosynthetisch aktiven Protein führt.

Unter einer"funktionellen Verknüpfung"versteht man in diesem Zusammenhang bei- spielsweise die sequentielle Anordnung einer der erfindungsgemäßen Promotoren und einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz oder das zu exprimierende Gen hinter (d. h. am 3'-Ende) der er- findungsgemäßen Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kova- lent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promo- torsequenz und der zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basen- paare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.

Unter"Expressionsaktivität"wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge Protein, also die Expressionsrate, verstanden.

Unter"spezifischer Expressionsaktivität"wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge Protein pro Promotor verstanden.

Bei einer"verursachten Expressionsaktivität"oder"verursachten Expressionsrate"im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp die Bildung eines Proteins verursacht, das im Wildtyp so nicht vorhanden war.

Bei einer"erhöhten Expressionsaktivität"oder"erhöhten Expressionsrate"im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit die gebildete Menge des Proteins erhöht.

Die Bildungsrate, mit der ein biosynthetsich aktives Protein hergestellt wird, ist ein Pro- dukt aus der Rate der Transkription und der Translation. Beide Raten können erfin- dungsgemäß beeinflusst werden und damit die Rate der Bildung von Produkten in ei- nem Mikroorganismus beeinflussen.

Die Bezeichnung"dass Gene aus Pflanzen der Gattung Tagetes, die in Wildtyppflan- zen der Gattung Tagetes von dem"jeweiligen"Promotor exprimiert werden, ausge- nommen sind", bedeutet, dass beispielsweise der EPSPS Promotor aus Pflanzen der Gattuung Tagetes nicht zur Expression von EPSPS-Genen aus Pflanzen der Gattuung Tagetes verwendet wird. Dahingegen kann das EPSPS-Gen aus Pflanzen der Gattung Tagetes erfindungsgemäß durch einen B-Gene Promotor, PDS Promotor oder CHRC Promotor aus Pflanzen der Gattung Tagetes eprimiert werden.

Unter dem Begriff'Wildtyp"oder"Wildtyppflanze"wird erfindungsgemäß die entspre- chende Ausgangspflanze der Gattung Tagetes verstanden.

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff"Pflanze"die Ausgangspflanze (Wild- typ) oder eine erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanze der Gattung Tagetes oder beides verstanden werden.

Vorzugsweise wird unter"Wildtyp"für die Erhöhung oder Verursachung der Expressi- onsaktivität oder Expressionsrate und für die Erhöhung des Gehalts an biosyntheti- schen Produkten die Pflanze Tagetes erecta, insbesondere die Pflanze Tagetes erecta Hybrid 50011 (WO 02012438) als Referenzorganismus verstanden.

Unter einem"EPSPS Promotor"werden Promotoren verstanden, die natürlicherweise in Organismen, vorzugsweise in Pflanzen, die Genexpression einer Nukleinsäure, ko- dierend eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase, regulieren, sowie von diesen Promotorsequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden oder

durch Fragmentierung dieser Promotorsequenzen ableitbare Nukleinsäuresequenzen, die noch diese Expressionsaktivität aufweisen und somit funktionelle Äquivalente dar- stellen.

Diese EPSPS Promotorsequenzen aus anderen Organismen, insbesondere Pflanzen, als den nachstehend angegebenen Promotorsequenzen lassen sich insbesondere durch Homologievergleiche in Datenbanken oder Hybridisierungsstudien mit DNA- Bibliotheken verschiedener Organismen unter Verwendung der nachstehend beschrie- benen EPSPS Promotorsequenzen oder den Nukleinsäuren, kodierend eine 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase, auffinden.

Vorzugsweise werden dazu die Nukleinsäuren, kodierend eine 5-Enolpyruvylshikimat- 3-phosphatsynthase, verwendet, da in der kodierenden Sequenz konservierte Bereiche häufiger sind als in der Promotorsequenz.

Unter einer 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Shikimat-3-Phosphat in 5-Enolpyruvylshikimat- 3-Phosphat umzuwandeln.

Bevorzugte EPSPS Promotoren enthalten A1) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1,2 oder 3 oder A2) eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nukleinsäureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 1,2 oder 3 aufweist oder A3) eine Nukieinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.

1,2 oder 3 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder A4) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A1), A2) oder A3) Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 stellt eine Promotorsequenz der 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) aus Petunia hybrida (AAH19653) dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 stellt eine Promotorsequenz der 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) aus Petunia hybrida (M37029) dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 3 stellt eine weitere Promotorsequenz der 5- Enolpyruvylshikimat-3-phösphatsynthase (EPSPS) aus Petunia hybrida dar.

Die Erfindung betrifft weiterhin EPSPS Promotoren, enthaltend eine von diesen Se- quenzen (SEQ. ID. NO. 1,2 oder 3) durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nuklein- säureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 1,2 oder 3 aufweist.

Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße EPSPS Promotoren lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO : 1,2 oder 3 leicht auffinden.

Künstliche erfindungsgemäße EPSPS Promotor-Sequenzen lassen sich ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 1,2 oder 3 durch künstliche Variation und Mutation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auf- finden.

Die folgenden Definition und Bedingungen der Identitätsvergleiche und Hybridisie- rungsbedingungen gelten für alle Nukleinsäuren, also alle Promotoren und Gene der Beschreibung.

Unter dem Begriff"Substitution"ist der Austausch einer oder mehrerer Nukleotide durch ein oder mehrere Nukleotide zu verstehen."Deletion"ist das Ersetzen eines Nukleotides durch eine direkte Bindung. Insertionen sind Einfügungen von Nukleotiden in die Nukleinsäuresequenz, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Nukleotide ersetzt wird.

Unter Identität zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr ; 5 (2) : 151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Multiple alignment parameter : Gap opening penalty 10 Gap extension penalty 10 Gap separation penalty range 8 Gap separation penalty off % identity for alignment delay 40

Residue specific gaps off Hydrophilic residue gap off Transition weighing 0 Pairwise alignment parameter : FAST algorithm on K-tuplesize 1 Gap penalty 3 Window size 5 Number of best diagonals 5 Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 1 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 1, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine Identi- tät von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 2 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 2, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine Identi- tät von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 3 aufweist, wird dementsprechend eine Nukieinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 3, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine Identi- tät von mindestens 60 % aufweist.

Besonders bevorzugte EPSPS Promotoren weisen mit der jeweiligen Nukleinsäurese- quenz SEQ. ID. NO. 1,2 oder 3 eine Identität von mindestens 70%, bevorzugter min- destens 80%, mindestens 90%, mindestens 92%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens 99% auf.

Weitere natürliche Beispiele für EPSPS Promotoren lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 1,2 oder 3, aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich be- kannter Weise leicht auffinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher EPSPS Promotoren, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. No. 1,2 oder 3 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst min- destens 10, bevorzugter mehr als 12,15, 30,50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.

Unter"hybridisieren"versteht man die Fähigkeit eines Poly-oder Oligonukleotids, unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen vorzugsweise zu 90-100% kom- plementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern-oder Southern-Blot- Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.

Die Hybridisierung erfolgt erfinungsgemäß unter stringenten Bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Mani- atis, T., in : Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57 oder in Current Protocols in Molecular Biolo- gy, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6. 3. 1-6.3. 6 beschrieben : Unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden : Die über Nacht Inkubation bei 42°C in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium Citrat), 50 mM Natrium Phosphat (ph7,6), 5x Denhardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschen der Filter mit 0, 1x SSC bei 65°C.

Unter einem"funktionell äquivalenten Fragment"werden für Promotoren Fragmente verstanden die im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen wie die Aus- gangssequenz.

Unter"im wesentlichen gleich"wird eine spezifische Expressionsaktivität verstanden die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, bevor- zugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen Expressionsaktivität der Aus- gangssequenz aufweist.

Unter"Fragmente"werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform A1), A2) oder A3) beschriebenen EPSPS Promotoren verstanden. Vorzusgweise weisen diese Fragmente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30,50 oder besonders be- vorzugt mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ.

ID. NO. 1,2 oder 3 auf.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1,2 oder 3 als EPSPS Promotor, d. h. zur Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes.

Alle vorstehend erwähnten EPSPS Promotoren sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäure- bausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthe- tischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Unter einem"B-Gene Promotor"werden Promotoren verstanden, die natürlicherweise in Organismen, vorzugsweise in Pflanzen, die Genexpression einer Nukleinsäure, ko- dierend eine Lycopin-ß-Cyclase, insbesondere eine chromoplastenspezifische Lycopin- ß-Cyclase, regulieren, sowie von diesen Promotorsequenzen durch Substitution, Inser- tion oder Deletion von Nukleotiden oder durch Fragmentierung dieser Promotorse- quenzen ableitbare Nukleinsäuresequenzen, die noch diese Expressionsaktivität auf- weisen und somit funktionelle Äquivalente darstellen.

Diese B-Gene Promotorsequenzen aus anderen Organismen, insbesondere Pflanzen, als den nachstehend angegebenen Promotorsequenzen lassen sich insbesondere durch Homologievergleiche in Datenbanken oder Hybridisierungsstudien mit DNA- Bibliotheken. verschiedener Organismen unter Verwendung der nachstehend beschrie- benen B-Gene Promotorsequenzen oder den Nukleinsäuren, kodierend eine Lycopin- ß-Cyclase, auffinden.

Vorzugsweise werden dazu die Nukleinsäuren, kodierend eine Lycopin-ß-Cyclase, verwendet, da in der kodierenden Sequenz konservierte Bereiche häufiger sind als in der Promotorsequenz.

Unter einer Lycopin-ß-Cyclase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Akti- vität aufweist, Lycopin in-Carotin und/oder ß-Carotin umzuwandeln.

Bevorzugte B-Gene Promotoren enthalten B1) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 4,5 oder 6 oder B2) eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nukleinsäureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 4,5 oder 6 aufweist oder B3) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.

4,5 oder 6 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder B4) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter B1), B2) oder B3) Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 4 stellt eine Promotorsequenz der chro- moplastenspezifischen Lycopin-ß-Cyclase (B-Gene) aus Lycopersicon esculentum (AAZ51517) dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 5 stellt eine Promotorsequenz der chro- moplastenspezifischen Lycopin-ß-Cyclase (B-Gene) aus Lycopersicon esculentum (AAZ51521) dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 6 stellt eine weitere Promotorsequenz der chromoplastenspezifischen Lycopin-ß-Cyclase (B-Gene) aus Lycopersicon esculentum dar.

Die Erfindung betrifft weiterhin B-Gene Promotoren, enthaltend eine von diesen Se- quenzen (SEQ. ID. NO. 4,5 oder 6) durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nuklein- säureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 4,5 oder 6 aufweist.

Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße B-Gene Promotoren lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO : 4,5 oder 6 leicht auffinden.

Künstliche erfindungsgemäße B-Gene Promotor-Sequenzen lassen sich ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 4,5 oder 6 durch künstliche Variation und Mutation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auf- finden.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 4 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 4, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 5 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ! D NO : 5, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 6 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 6, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 60 % aufweist.

Besonders bevorzugte B-Gene Promotoren weisen mit der jeweiligen Nukleinsäurese- quenz SEQ. ID. NO. 4,5 oder 6 eine Identität von mindestens 70%, bevorzugter min- destens 80%, mindestens 90%, mindestens 92%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens 99% auf.

Weitere natürliche Beispiele für B-Gene Promotoren lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 4,5 oder 6 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich be- kannter Weise leicht auffinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher B-Gene Promotoren, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. No. 4,5 oder 6 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst min- destens 10, bevorzugter mehr als 12,15, 30,50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.

Die Hybridisierungbedingungen sind vorstehend beschrieben.

Unter einem"funktionell äquivalenten Fragment"werden für Promotoren Fragmente verstanden, die im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen wie die Aus-

gangssequenz.

Unter"im wesentlichen gleich"wird eine spezifische Expressionsaktivität verstan- den, die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, be- vorzugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen Expressionsaktivität der Ausgangssequenz aufweist.

Unter"Fragmente"werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform B1), B2) oder B3) beschriebenen B-Gene Promotoren verstanden. Vorzusgweise weisen diese Fragmente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30,50 oder besonders be- vorzugts mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 4,5 oder 6 auf.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 4,5 oder 6 als B-Gene Promotor, d. h. zur Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes.

Alle vorstehend erwähnten B-Gene Promotoren sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäure- bausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthe- tischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Unter einem"PDS Promotor"werden Promotoren verstanden, die natürlicherweise in Organismen, vorzugsweise in Pflanzen, die Genexpression einer Nukleinsäure, kodie- rend eine Phytoendesaturase, regulieren, sowie von diesen Promotorsequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden oder durch Fragmentierung die- ser Promotorsequenzen ableitbare Nukleinsäuresequenzen, die noch diese Expressi- onsaktivität aufweisen und somit funktionelle Äquivalente darstellen.

Diese PDS Promotorsequenzen aus anderen Organismen, insbesondere Pflanzen, als den nachstehend angegebenen Promotorsequenzen lassen sich insbesondere durch Homologievergleiche in Datenbanken oder Hybridisierungsstudien mit DNA- Bibliotheken verschiedener Organismen unter Verwendung der nachstehend beschrie- benen PDS Promotorseqüenzen oder den Nukleinsäuren, kodierend eine Phytoende-

saturase, auffinden.

Vorzugsweise werden dazu die Nukleinsäuren, kodierend eine Phytoendesaturase, verwendet, da in der kodierenden Sequenz konservierte Bereiche häufiger sind als in der Promotorsequenz.

Unter einer Phytoendesaturase wird vorzugsweise ein Protein verstanden, das die en- zymatische Aktivität aufweist, Phytoen in Phytofluen umzuwandeln.

Bevorzugte PDS Promotoren enthalten C1) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 7,8, 9 oder 10 oder C2) eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nukleinsäureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 7,8, 9 oder 10 aufweist oder C3) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.

7,8, 9 oder 10 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder C4) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter C1), C2) oder C3) Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 7 stellt eine Promotorsequenz der Phytoende- saturase (PDS) aus Lycopersicon esculentum (U46919) dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 8 stellt eine Promotorsequenz der Phytoende- saturase (PDS) aus Lycopersicon esculentum (X78271) dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 9 stellt eine Promotorsequenz der Phytoende- saturase (PDS) aus Lycopersicon esculentum (X171023) dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 10 stellt eine weitere Promotorsequenz der Phytoendesaturase (PDS) aus Lycopersicon esculentum dar.

Die Erfindung betrifft weiterhin PDS Promotoren, enthaltend eine von diesen Sequen- zen (SEQ. ID. NO. 7, 8, 9 oder 10) durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nuklein- säureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 7,8, 9 oder 10 aufweist.

Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße PDS Promoto- ren lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Da-

tenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ) D NO : 7,8, 9 oder 10 leicht auffinden.

Künstliche erfindungsgemäße PDS Promotor-Sequenzen lassen sich ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 7,8, 9 oder 10 durch künstliche Variation und Mutation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auf- finden.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 7 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 7, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine Identi- tät von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 8 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 8, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine Identi- tät von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 9 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 9, ins- besondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine Identi- tät von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 10 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 10, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine 1- dentität von mindestens 60 % aufweist.

Besonders bevorzugte PDS Promotoren weisen mit der jeweiligen Nukleinsäurese- quenz SEQ. ID. NO. 7,8, 9 oder 10 eine Identität von mindestens 70%, bevorzugter mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 92%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens 99% auf.

Weitere natürliche Beispiele für PDS Promotoren lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 7,8, 9 oder 10 aus verschiedenen Organismen, deren

genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich be- kannter Weise leicht auffinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher PDS Promotoren, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. No. 7,8, 9 oder 10 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst min- destens 10, bevorzugter mehr als 12,15, 30,50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.

Die Hybridisierungbedingungen sind vorstehend beschrieben.

Unter einem"funktionell äquivalenten Fragment"werden für Promotoren Fragmente verstanden, die im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen wie die Aus- gangssequenz.

Unter"im wesentlichen gleich"wird eine spezifische Expressionsaktivität verstanden, die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, bevor- zugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen Expressionsaktivität der Aus- gangssequenz aufweist.

Unter"Fragmente"werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform C1), C2) oder C3) beschriebenen PDS Promotoren verstanden. Vorzusgweise weisen diese Frag- mente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30,50 oder besonders bevor- zugts mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ.

ID. NO. 7,8, 9 oder 10 auf.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 7,8, 9 oder 10 als PDS Promotor, d. h. zur Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes.

Alle vorstehend erwähnten PDS Promotoren sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebau- steine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2.

Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Unter einem"CHRC Promotor"werden Promotoren verstanden, die natürlicherweise in Organismen, vorzugsweise in Pflanzen, die Genexpression einer Nukleinsäure, kodie- rend ein Chromoplasten-assoziiertes Protein C regulieren, sowie von diesen Promotor- sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden oder durch Fragmentierung dieser Promotorsequenzen ableitbare Nukleinsäuresequenzen, die noch diese Expressionsaktivität aufweisen und somit funktionelle Äquivalente darstel- len.

Diese CHRC Promotorsequenzen aus anderen Organismen, insbesondere Pflanzen, als den nachstehend angegebenen Promotorsequenzen lassen sich insbesondere durch Homologievergleiche in Datenbanken oder Hybridisierungsstudien mit DNA- Bibliotheken verschiedener Organismen unter Verwendung der nachstehend beschrie- benen CHRC Promotorsequenzen oder den Nukleinsäuren kodierend ein Chro- moplasten-assoziiertes Protein C auffinden.

Vorzugsweise werden dazu die Nukleinsäuren kodierend ein Chromoplasten- assoziiertes Protein C verwendet, da in der kodierenden Sequenz konservierte Berei- che häufiger sind als in der Promotorsequenz.

Bevorzugte CHRC Promotoren enthalten D1) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 11,12, 13 öder 14 oder D2) eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nukleinsäureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 11,12, 13 oder 14 aufweist oder D3) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.

11,12, 13 oder 14 unterstringenten Bedingungen hybridisiert oder D4) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter Dol), D2) oder D3) Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 11 stellt eine Promotorsequenz des Chro- moplasten-assoziiertes Protein C (CHRC) aus Gurke (AAV36416) dar.

Die Nukieinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 12 stellt eine weitere Promotorsequenz des Chromoplasten-assoziiertes Protein C (CHRC) aus Gurke dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 13 stellt eine weitere Promotorsequenz des Chromoplasten-assoziiertes Protein C (CHRC) aus Gurke dar.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 14 stellt eine weitere Promotorsequenz des chromoplasten assoziiertes Protein C (CHRC) aus Gurke dar.

Die Erfindung betrifft weiterhin CHRC Promotoren, enthaltend eine von diesen Se- quenzen (SEQ. ID. NO. 11,12, 13, oder 14) durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nuk- leinsäureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 11,12, 13, oder 14 aufweist.

Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße CHRC Promoto- ren lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Da- tenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO : 11,12, 13, oder 14 leicht auffinden.

Künstliche erfindungsgemäße CHRC Promotor-Sequenzen lassen sich ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 11,12, 13, oder 14 durch künstliche Variation und Mutati- on, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auffinden.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 11 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 11, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Iden- tität von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 12 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 12, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Iden- tität von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 13 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 13, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Iden- tität von mindestens 60 % aufweist.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 14 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die bei einem'Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 14,

insbesondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine I- dentität von mindestens 60 % aufweist.

Besonders bevorzugte CHRC Promotoren weisen mit der jeweiligen Nukleinsäurese- quenz SEQ. ID. NO. 11,12, 13, oder 14 eine Identität von mindestens 70%, bevorzug- ter mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 92%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens 99% auf.

Weitere natürliche Beispiele für CHRC Promotoren lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO : 11,12, 13, oder 14 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher CHCRC Promotoren, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. No. 11,12, 13, oder 14 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz um- fasst mindestens 10, bevorzugter mehr als 12,15, 30,50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.

Die Hybridisierungbedingungen sind vorstehend beschrieben.

Unter einem"funktionell äquivalenten Fragment"werden für Promotoren Fragmente verstanden, die im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen wie die Aus- gangssequenz.

Unter"im wesentlichen gleich"wird eine spezifische Expressionsäktivität verstanden, die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, bevor- zugter 90%, besonders bevorzugt 95%-der spezifischen Expressionsaktivität der Aus- gangssequenz aufweist.

Unter"Fragmente"werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform D1), D2) oder D3) beschriebenen CHRC Promotoren verstanden. Vorzusgweise weisen diese Frag- mente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30,50 oder besonders bevor- zugts mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ.

ID. NO. 11,12, 13, oder 14 auf.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 11, 12,13, oder 14 als CHRC Promotor, d. h. zur Expression von Genen in Pflanzen der

Gattung Tagetes.

Alle vorstehend erwähnten CHRC Promotoren sind weiterhin in an sich bekannter Wei- se durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebau- steine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2.

Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Mit den erfindungsgemäßen Promotoren lässt sich prinzipiell jedes Gen, also jede Nuk- leinsäure, kodierend ein Protein, in Pflanzen der Gattung Tagetes exprimieren, insbe- sondere blütenspezifisch exprimieren, besonders bevorzugt petalenspezifisch expri- mieren.

Diese in Pflanzen der Gattung Tagetes zu exprimierenden Gene werden im folgenden auch"Effektgene"genannt.

Bevorzugte Effektgene sind beispielsweise Gene aus dem Biosynthesweg von Ge- ruchsstoffen und Blütenfarben, deren Expression oder erhöhte Expression in Pflanzen der Gattung Tagetes zu einer Veärnderung der Geruchs und/oder der Blütenfarbe von Blüten der Pflanzen der Gattung Tagetes führt.

Die Biosynthese von flüchtigen Geruchskomponenten, speziell in Blüten, wurde in den letzten Jahren an verschiedenen Modellorganismen wie Clarkia breweri und Antirhinum majus L. studiert, Flüchtige Geruchskomponenten werden beispielsweise innerhalb des Monoterpen-und Phenylpropan-Stoffwechsels gebildet werden. Im ersten Fall handelt es sich um Linalool ; von den Phenylpropanen sind Methyleneugenol, Benzylacetat, Methylbenzoat und Methylsalicat abgeleitet.

Für die Biosynthese von Linalool, (ISo) Methyleigenol, Benzylacetat und Methytsalicinat sind bevorzugte Gene ausgewählz aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend eine Lina- lool-Synthase (LIS), Nukleinsäuren kodierend eine S-Adenosyl-L-Met : (iso)-Eugenol-O- Methyltransferase (IEMT), Nukleinsäuren kodierend eine Acetyl-CoA-Benzylalkohol- Acetyltransferase und Nukleinsäuren kodierend eine S-Adenosyl-L-Met : Salicylsäure- Methyltransferase (SAMT). Nukleinsäurensequenzen und Proteinsequenzen zu den genannten enzymatischeh Aktivitäten sind in Dudareva et al. Plant Cell 8 (1996), 1137-

1148 ; Wang et al. Plant Physiol. 114 (1997), 213-221 und Dudareva et al. Plant J. 14 (1998) 297-304) beschrieben.

Besonders bevorzugte Effektgene sind Gene aus Biosyntheswegen von biosyntheti- schen Produkten die in Pflanzen der Gattung Tagetes natürlicherweise, d. h. im Wildtyp oder durch genetische Veränderung des Wildtyp hergestellt werden können, insbe- sondere in Blüten hergestellt werden können, besonders bevorzugt in Petalen herge- stellt werden können.

Bevorzugte biosynthetische Produkte sind Feinchemikalien.

Der Begriff"Feinchemikalie"ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Verbidnungen, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw., jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, Kosmetik, Food und Feed-Industrie. Diese Verbindun- gen umfassen organische Säuren, wie beispielsweise Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin-und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Ku- ninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH : Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure), Diole (bspw. Propan- diol und Butandiol), Kohlenhydrate (bspw. Hyaluronsäure und Trehalose), aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin und Indigo), Vitamine, Carotinoide und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27,"Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH : Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten ; und Ong, A. S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease"Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research-Asien, abgehalten am 1. -3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Cor- poration, ISBN : 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebe- nen Chemikalien). Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemika- lien sind nachstehend weiter erläutert.

1. Aminosäure-Metabo/ismus und Verwendungen Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff"Aminosäure"ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen a ! s Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinan-

der verknüpft sind, wohingegen die nicht-proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH : Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der D-oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vor- findet. Biosynthese-und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die"essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin), so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosyn- these mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Bio- syntheseswege in die übrigen 11"nichtessentiellen"Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu syn- thetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenom- men werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.

Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren inte- ressante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen An- wendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts-und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mono- natriumglutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threonin, Tryptophan und D-/L- Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids-technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg. ) Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH : Weinheim). Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Protei- nen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S) -5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.

Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakte- riellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H. E. (1978) Ann.

Rev. Biochem. 47 : 533-606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von a-

Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthe- se von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse), und ergibt nach Oxidations-, Transaminie- rungs-und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenketten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serintranshydroxymethylase katalysierten Reaktion.

Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse-und Pento- sephosphatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schritt- Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt- Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosynthese- produkte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker.

Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenproduk- te für die Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21"Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäure- produktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure- Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer be- stimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für ei- nen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure- Biosynthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24,"Biosynthesis öf Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Amino- säure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>II. Vitamine, Carotinoide, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Vemven- dungen

Vitamine, Carotinoide, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakte- rien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindun- gen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farb- stoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hilfsstoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH : Weinheim, 1996). Der Begriff"Vitamin"ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden kön- nen. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen um- fassen. Der Begriff"Cofaktor"umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auf- treten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein ; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff"Nutrazeutikum"umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z. B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren).

Bevorzugte Feinchemikalien oder biosynthetische Produkte, die in Pflanzen der Gat- tung Tagetes, insbesondere in Petalen der Blüten der Pflanzen der Gattung Tagetes hergestellt werden können, sind Carotinoide, wie beispielsweise Phytoen, Lycopin, Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'- Hydroxyechinenon, Adonirubin, Violaxanthin und Adonixanthin.

Besonders bevorzugte Carotinoide sind Ketocarotinoide, wie beispielsweise Asta- xanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adoni- rubin, Violaxanthin und Adonixanthin.

Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Indus- trial Chemistry,"Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH : Weinheim, 1996, Michal, G.

(1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons ; Ong, A. S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease"Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research-Asien, abgehalten

am 1. -3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).

Thiamin (Vitamin B1) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol- Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B2) wird aus Guanosin-5'-triphosphat (GTP) und Ribose-5'-phosphat synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavin- mononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als"Vitamin B6"bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5'-phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxin- hydrochlorid), sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6- methylpyridin. Panthothenat (Pantothensäure, R- (+)-N- (2, 4-Dihydroxy-3, 3-dimethyl-1- oxobutyl)-ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-getriebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure. Die für die Biosyn- theseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5'-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, son- dern auch die Produktion von (R)-Pantoinsåure, (R)-Pantolacton, (R)-Panthenol (Provi- tamin B5), Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.

Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganis- men ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene i- dentifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster-Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Ener- gie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des a-Ketoglutaratdehydrogenasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Sub- stanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthe- se der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechsel- zwischenprodukten Guanosin-5'-triphosphat (GTP), L-Glutaminsäure und p- Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.

Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin B12) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin B12 ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der betei- ligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als"Niacin"bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der

wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinamidade- nindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.

Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreie chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien ebenfalls durch großange- legte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin B6, Pantothenat und Biotin. Nur Vitamin B12 wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. in-vitro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.

111. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid-und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen Gene für den Purin-und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Beg- riff"Purin"oder"Pyrimidin"umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der Nuklein- säuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff"Nukleotid"beinhaltet die grundle- genden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose-Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff"Nukleosid"umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Mole- küle oder ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA-und DNA-Synthese zu hemmen ; wird diese Aktivität zielgerichtet bei kanzeroge- nen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs-und Replikations-Fähigkeit von Tumorzel- len hemmen.

Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energie- speicher (d. h. AMP) oder als Coenzyme (d. h. FAD und NAD) dienen.

Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese me- dizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin-und/oder Pyrimidin- Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R. l. und Lyons, S. D. (1990)"Po- tent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic a- gents", Med. Res. Reviews 10 : 505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyritnidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medi- kamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J. L."Enzymes in Nucleotide Synthesis"Curr. Opin.

Struct. Biol. 5 (1995) 752-757 ; Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatz- möglichkeiten : als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemikalien (z. B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin), als

kalien (z. B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin), als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als Geschmacksverstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A., (1996)"Nucleotides and Related Com- pounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH : Weinheim, S. 561-612). En- zyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid-oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.

Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Ü- bersichten siehe bspw. Zaikin, H. und Dixon, J. E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis"in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287 ; und Michal, G. (1999)"Nucleotides and Nucleosides" ; Kap. 8 in : Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Der Purin-Metabolismus, das Objekt intesiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus in höhe- ren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5'-phosphat (IMP) aus Ribose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5'-- monöphosphat (GMP) oder Adenosin-5'-monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Ver- bindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Pyrimidinbiosynthe- se erfolgt über die Bildung von Uridin-5'-monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat.

UMP wiederum wird in Cytidin-5'-triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyriboseform des Nukle- otides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA- Synthese teilnehmen.

IV. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über a, a-1, 1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet.

Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik-und Biotechno- logie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610 ; Singer, M. A. und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467 ; Paiva, C. L. A. und Panek, A. D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314 ; und Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102). Trehaiose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert

und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.

Besonders bevorzugte biosynthetische Produkte sind ausgewählt aus der Gruppe or- ganische Säuren, Proteine, Nukleotide und Nukleoside, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromat- sche Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren, Enzyme und Proteine.

Bevorzugte organische Säuren sind Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure Bevorzugte Nukleoside und Nukleotide sind beispielsweise beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH : Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten.

Bevorzugte biosynthetische Produkte sind weiterhin Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, wie beispielsweise Arachidonsäure, Diole wie beispielsweise Propandiol und Butandiol, Kohlenhydrate, wie beispielsweise Hyaluronsäure und Trehalose, aro- matische Verbindungen, wie beispielsweise aromatische Amine, Vanillin und Indigo, Vitamine und Cofaktoren, wie beispielsweise beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of, Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH : Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten ; und Ong, A. S., Niki, E. und Packer, L. (1995)"Nutrition, Lip- ids, Health and Disease"Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research- Asien, abgehalten am 1. -3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), En- zyme Polyketide (Cane et al. (1998) Science 282 : 63-68), und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN : 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen Chemikalien.

Besonders bevorzugte Gene, die mit den erfindungsgemäßen Promotoren in Pflanzen der Gattung Tagetes exprimiert werden sind demnach Gene, ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinoge- nen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren ko- dierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodie- rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Carotinoiden, insbesondere Ketocarotinoiden,

Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen.

Bevorzugte Feinchemikalien oder biosynthetische Produkte, die in Pflanzen der Gat- tung Tagetes, insbesondere in Petalen der Blüten der Pflanzen der Gattung Tagetes hergestellt werden können, sind Carotinoide, wie beispielsweise Phytoen, Lycopin, Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'- Hydroxyechinenon, Adonirubin, Violaxanthin und Adonixanthin.

Besonders bevorzugte Carotinoide sind Ketocarotinoide, wie beispielsweise Asta- xanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adoni- rubin, Violaxanthin und Adonixanthin.

Ganz besonders bevorzugte Gene, die mit den erfindungsgemäßen Promotoren in Pflanzen der Gattung Tagetes exprimiert werden sind demnach Gene die Proteine aus dem Biosyntheseweg von Carotinoiden kodiern.

Insbesondere bevorzugt sind Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, Nukleinsäuren <BR> <BR> <BR> kodierend eine ß-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine £-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine Epoxidase, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nuk- leinsäuren kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase ; Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase, Nukleinsäuren ko- dierend eine Isopentenyl-Diphosphat-A-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Ge- ranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nuk- leinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen- Desaturase, Nukleinsäuren kodierend eine Prephytoen-Synthase, Nukleinsäuren ko- dierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend ein crtISO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Pro- tein.

Unter einer Ketolase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität auf- weist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Keto- Gruppe einzuführen.

Insbesondere wird unter einer Ketolase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Canthaxanthin umzuwandeln.

Beispiele für Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, und die entsprechenden Ketola- sen, sind beispielsweise Sequenzen aus Haematoccus pluvialis, insbesondere aus Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Ac- cession NO : X86782 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 15, Protein SEQ ID NO : 16), Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Accession NO : D45881 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 17, Protein SEQ ID NO : 18), Agrobacterium aurantiacum (Accession NO : D58420 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 19, Protein SEQ ID NO : 20), Alicaligenes spec. (Accession NO : D58422 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 21, Protein SEQ ID NO : 22), Paracoccus marcusii (Accession NO : Y15112 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 23, Protein SEQ ID NO : 24).

Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession NO : NP442491 ; Nukleinsäure :-SEQ ID NO : 25, Protein SEQ ID NO : 26).

Bradyrhizobium sp. (Accession NO : AF218415 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 27, Protein SEQ ID NO : 28).

Nostoc sp. Strain PCC7120 (Accession NO : AP003592, BAB74888 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 29, Protein SEQ ID NO : 30).

Haematococcus pluvialis (Accession NO : AF534876, AAN03484 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 31, Protein : SEQ ID NO : 32) Paracoccus sp. MBIC1143 (Accession NO : D58420, P54972 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 33, Protein : SEQ ID NO : 34) Brevundimonas aurantiaca (Accession NO : AY166610, AAN86030 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 35, Protein : SEQ ID NO : 36) Nodularia spumigena NSOR10

(Accession NO : AY210783, AA064399 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 37, Protein : SEQ ID NO : 38) Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Accession NO : NZAABC01000195, ZP00111258 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 39, Protein : SEQ ID NO : 40) Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Accession NO : NZ_MBC01000196 ; Nukleinsäure : SEQ ID. NO : 41, Protein : SEQ ID NO : 42) Deinococcus radiodurans R1 (Accession NO : E75561, AE001872 ; Nukleinsäure : SEQ ID NO : 43, Protein : SEQ ID NO : 44), Synechococcus sp. WH 8102, Nukleinsäure : Acc.-No. NZAABD01000001, Basenpaar 1,354, 725-1,355, 528 (SEQ ID NO : 75), Protein : Acc.-No. ZP00115639 (SEQ ID NO : 76) (als putatives Protein anno- tiert), Unter einer ß-Cyclase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität auf- weist, einen endständigen, linearen Rest von Lycopin in einen ß-lonon-Ring zu über- führen.

Insbesondere wird unter einer ß-Cyclase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, y-Carotin in ß-Carotin umzuwandeln.

Beispiele für ß-Cyclase-Gene sind Nukleinsäuren, kodierend eine ß-Cyclase aus To- mate (Accession X86452). (Nukleinsäure : SEQ. ID NO : 45, Protein : SEQ lD NO : 46), sowie ß-Cydasen der folgenden Accession Nummern : S66350 lycopene beta-cyclase (EC 5.5. 1. -)-tomato CAA60119 lycopene synthase [Capsicum annuum] S66349 lycopene beta-cyclase (EC 5.5. 1. -)-common tobacco CAA57386 lycopene cyclase [Nicotiana tabacum] AAM21152 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis] AAD38049 lycopene cyclase [Citrus x paradisi] AAN86060 lycopene cyclase [Citrus unshiu] AAF44700 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis] AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina] MG10429 beta cyciase rragetes erecta] AAA81880 lycopene cyclase AAB53337 Lycopene beta cyclase AAL92175 beta-lycopene cyclase [Sandersonia aurantiaca] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus] AAM45381 beta cyclase [Tagetes erecta] AAO 18661 lycopene beta-cyclase [Zea mays] AAG21133 chromoplast-specific lycopene beta-cyclase [Lycopersicon esculentum] AAF18989 lycopene beta-cyclase [Daucus carota] ZP_001140 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str. MIT9313] ZP_001050 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str.

CCMP1378] ZP_001046 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str.

CCMP1378] ZP 001134 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str. MIT9313] ZP 001150 hypothetical protein [Synechococcus sp. WH 8102] AAF10377 lycopene cyclase [Deinococcus radiodurans] BAA29250 393aa long hypothetical protein [Pyrococcus horikoshii] BAC77673-lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3] AAL01999 lycopene cyclase [Xanthobacter sp. Py2] ZP 000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus] ZP_000941 hypothetical protein [Novosphingobium aromaticivorans] AAF78200 lycopene cyclase [Bradyrhizobium sp. ORS278] BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae] CAA64855 lycopene cyclase [Streptomyces griseus] AAA21262 dycopene cyclase [Pantoea agglornerans] C37802 crtY protein-Erwinia uredovora BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae] AAA64980 lycopene cyclase [Pantoea agglomerans] AAC44851 lycopene cyclase BAA09593 Lycopene cyclase [Paracoccus sp. MBIC1143] ZP 000941. hypothetical protein [Novosphingobium aromaticivorans] CAB56061 lycopene beta-cyclase [Paracoccus marcusii] BAA20275 lycopene cyclase [Erythrobacter longus] ZP_000570 hypothetical protein [Thermobifida fusca] ZP 000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus] AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus] AAB53337 Lycopene beta cyclase BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3]

Eine besonders bevorzugteß-Cyclase ist weiterhin die chromoplastenspezifische ß- Cyclase aus Tomate (AAG21133) (Nukleinsäure : SEQ. ID. No. 49 ; Protein : SEQ. ID.

No. 50) Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Hydroxy-Gruppe einzuführen.

Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Canthaxänthin in Astaxanthin umzuwandeln.

Beispiele für ein Hydroxylase-Gene sind : eine Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase aus Haematococcus pluvialis, Accessi- on AX038729, WO 0061764) ; (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 49, Protein : SEQ ID NO : 50), sowie Hydroxylasen der folgenden Accession Nummern : lemblCAB55626. 1, CAA70427.1, CAA70888. 1, CAB55625.1, AF499108_1, AF315289_1, AF296158_1, AAC49443. 1, NP_194300. 1, NP_200070. 1, AAG10430. 1, CAC06712.1, AAM88619. 1, CAC95130.1, AAL80006. 1, AF162276_1, AAO53295. 1, AAN85601. 1, CRTZERWHE, CRTZPANAN, BAB79605.1, CRTZALCSP, CRTZ_AGRAU, CAB56060.1, ZP00094836. 1, AAC44852. 1, BAC77670.1, Nu-745389. 1, Nu-344225. 1, Nu-849490. 1, ZP_00087019. 1, NP_503072. 1, NP_852012. 1, NP_115929. 1, ZP00013255. 1 Eine besonders bevorzugte Hydroxylase ist weiterhin die Hydroxylase aus Tomate (Accession Y14810, CrtR-b2) (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 51 ; Protein : SEQ ID NO. 52).

Unter einer HMG-CoA-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A in Mevalonat umzuwan- deln.

Unter einer (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl- Diphosphat in Isopentenyldiphosphat und Dimethylallyldiphosphate umzuwandeln.

Unter einer 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Hydroxyethyl-ThPP und Glycerinaldehyd-3- Phosphat in 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat umzuwandeln.

Unter einer 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase wird ein Protein ver- standen, das die enzymatische Aktivität aufweist, 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat in 2- C-methyl-D-erythritol 4-Phosphat umzuwandeln Unter einer Isopentenyl-Diphosphat-A-Isomerase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Isopentenyl-Diphosphat in Dimethylallylphosphat um- zuwandeln.

Unter einer Geranyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzy- matische Aktivität aufweist, Isopentenyl-Diphosphat und Dimethylallylphosphat in Ge- ranyl-Diphosphat umzuwandeln.

Unter einer Farnesyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzy- matische Aktivität aufweist, sequentiell 2 Molekülelsopentenyl-Diphosphatmit Dimethy- lallyi-Diphosphat und dem resultierenden Geranyl-Diphosphat in Farnesyl-Diphosphat umzuwandeln Unter einer Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Farnesyl-Diphosphat und Isopentenyl-Diphosphat in Geranyl-Geranyl-Diphosphat umzuwandeln.

Unter einer Phytoen-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Akti- vität aufweist, Geranyl-Geranyl-Diphosphat in Phytoen umzuwandeln.

Unter einer Phytoen-Desaturase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Phytoen in Phytofluen und/oder Phytofluen in 4-Carotin (Zetacarotin) umzuwandeln.

Unter einer Zeta-Carotin-Desaturase wird ein Protein verstanden, das die enzymati- sche Aktivität aufweist, -Carotin in Neurosporin und/oder Neurosporin in Lycopin um- zuwandeln.

Unter einem crtISO-Proteins wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivi- tät aufweist, 7,9, 7', 9'-tetra-cis-Lycopin in all-trans-Lycopin umzuwandeln.

Unter einem FtsZ-Protein wird ein Protein verstanden, das eine Zellteilungs und Plasti- denteilungs-fördernde Wirkung hat und Homologien zu Tubulinproteinen aufweist.

Unter einem MinD-Protein wird ein Protein verstanden, das eine multifunktionele Rolle bei der Zellteilung aufweist. Es ist eine Membran-assoziierte ATPase und kann inner- halb der Zelle eine oszillierende Bewegung von Pol zu Pol zeigen.

Beispiele für HMG-CoA-Reduktase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine HMG-CoA-Reduktase aus Arabidopsis thaliana, Accession NM_106299 ; (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 53, Protein : SEQ ID NO : 54), sowie weitere HMG-CoA-Reduktase-Gene aus anderen Organismen mit den folgen- den Accession Nummern : P54961, P54870, P54868, P54869,002734, P22791, P54873, P54871, P23228, P13704, P54872, Q01581, P17425, P54874, P54839, P14891, P34135,064966, P29057, P48019, P48020, P12683, P43256, Q9XEL8, P34136,064967, P29058, P48022, Q41437, P12684, Q00583, Q9XHL5, Q41438, Q9YAS4, 076819, 028538, Q9Y7D2, P54960,051628, P48021, Q03163, P00347, P14773, Q12577, Q59468, P04035, 024594, P09610, Q58116, 026662, Q01237, Q01559, Q12649, 074164, 059469, P51639, Q10283, 008424, P20715, P13703, P13702, Q96UG4, Q8SQZ9, 015888, Q9TUM4, P93514, Q39628, P93081, P93080, Q944T9, Q40148, Q84MM0, Q84LS3, Q9Z9N4, Q9KLM0 Beispiele für (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut- 2-enyl-Diphosphat-Reduktase aus Arabidopsis thaliana (lytB/ISPH), ACCESSION AY168881, (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 55, Protein : SEQ ID NO : 56), sowie weitere (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : T04781, AF270978_1, NP_485028. 1, NP_442089. 1, NP_681832. 1, ZP_00110421. 1, ZP_00071594. 1, ZP_00114706. 1, ISPH_SYNY3, ZP_00114087. 1, ZP_00104269. 1, AF398145 1, AF398146_1, MD55762. 1, AF514843_1, NP_622970. 1, Nu-348471. 1, NP_562001. 1, NP_223698. 1, NP_781941. 1, ZP_00080042. 1, NP_859669. 1, NP_214191. 1, ZP_00086191.1, ISPH_VIBCH, NP_230334. 1, Nu-742768. 1, NP_302306. 1, ISPH MYCLE, NP_602581. 1, ZP_00026966. 1, NP_520563. 1,

NP_253247. 1, NP_282047. 1, ZP00038210. 1, ZP00064913. 1, CAA61555. 1, ZP_00125365.1, ISPH_ACICA, EAA24703.1, ZP_00013067. 1, ZP_00029164. 1, NP_790656. 1, NP_217899. 1, NP_641592. 1, NP_636532. 1, NP_719076. 1, NP_660497. 1, NP_422155. 1, NP_715446. 1, ZP00090692. 1, NP 759496. 1, ISPH_BURPS, ZP_00129657. 1, NP_215626. 1, Nu-335584. 1, ZP00135016. 1, NP_789585. 1, NP_787770. 1, NP_769647. 1, ZP00043336. 1, NP_242248. 1, ZP00008555. 1, NP_246603. 1, ZP00030951. 1, NP_670994. 1, NP_404120. 1, Nu-540376. 1, Nu-733653. 1, NP_697503.1, NP_840730. 1, NP_274828. 1, Nu-796916. 1, ZP00123390. 1, NP_824386. 1, Nu-737689. 1, ZP00021222. 1, NP_757521. 1, NP_390395. 1, ZP00133322. 1, CAD76178.1, NP_600249. 1, NP_454660. 1, NP_712601. 1, NP_385018. 1, NP_751989. 1 Beispiele für 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase aus Lyco- persicon esculentum, ACCESSION #AF143812 (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 57, Prote- in : SEQ ID NO : 58), sowie weitere 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase-Gene aus anderen Organis- men mit den folgenden Accession Nummern : AF143812_1, DXS_CAPAN, CAD22530.1, AF1822861, NP193291. 1, T52289, AAC49368. 1, AAP14353. 1, D71420, DXS_ORYSA, AF443590_1, BAB02345.1, CAA09804. 2, NP_850620. 1, CAD22155.2, AAM65798. 1, NP_566686. 1, CAD22531.1, AAC33513.1, CAC08458. 1, AAG10432. 1, T08140, AAP14354. 1, AF428463_1, ZP00010537. 1, NP_769291. 1, AAK59424. 1, NP_107784. 1, NP_697464. 1, NP_540415. 1, NP_196699. 1, NP_384986. 1, ZP 00096461. 1, ZP_00013656. 1, NP_353769. 1, BAA83576. 1, ZP00005919. 1, ZP00006273. 1, NP_420871. 1, AAM48660. 1, DXSRHOCA, ZP00045608. 1, ZP00031686. 1, NP_841218. 1, ZP00022174. 1, ZP00086851. 1, NP_742690. 1, NP_520342. 1, ZP00082120. 1, NP_790545. 1, ZP00125266. 1, CAC17468.1, NP_252733. 1, ZP00092466. 1, NP_439591. 1, NP_414954. 1, NP_752465. 1, NP_622918. 1, NP_286162. 1, NP_836085.1, NP_706308. 1, ZP00081148. 1, NP_797065. 1, NP_213598. 1, NP_245469. 1, ZP00075029. 1, NP_455016.1, NP_230536. 1, NP_459417. 1, NP_274863. 1, NP_283402. 1, NP_759318. 1, NP_406652. 1, DXS_SYNLE, DXS SYNP7, NP 440409. 1, ZP 00067331. 1, ZP00122853. 1, NP_717142. 1, ZP00104889. 1, NP_243645. 1, NP_681412. 1, DXSSYNEL, NP637787. 1, DXS_CHLTE, ZP_00129863. 1, NP_661241. 1, DXS_XANCP, NP_470738. 1, NP_484643. 1, ZP00108360. 1, NP_833890. 1, NP_846629. 1, NP_658213. 1, NP_642879. 1, ZP00039479. 1, ZP00060584. 1, ZP_00041364. 1, ZP_00117779. 1,

NP_299528. 1 Beispiele für 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase aus Arabidopsis thaliana, ACCESSION &num AF148852, (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 59, Protein : SEQ ID NO : 60), sowie weitere 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : AF148852, AY084775, AY054682, AY050802, AY045634, AY081453, AY091405, AY098952 ; AJ242588, AB009053, AY202991, NP201085. 1, T52570, AF331705_1, BAB16915. 1, AF367205_1, AF250235_1, CAC03581.1, CAD22156.1, AF182287_1, DXR_MENPI, ZP_00071219. 1, Nu-488391. 1, ZP00111307. 1, DXRSYNLE, AAP56260. 1, NP_681831. 1, NP_442113. 1, ZP 00115071. 1, ZP_00105106. 1, ZP_00113484. 1, Nu-833540. 1, NP_657789. 1, NP_661031. 1, DXR_BACHD, Nu-833080. 1, Nu-845693. 1, NP_562610. 1, NP_623020. 1, NP_810915. 1, NP243287 : 1, ZP_00118743. 1, NP464842. 1, NP470690. 1, ZP_00082201.1, NP_781898. 1, ZP_00123667. 1, NP 348420. 1, NP_604221. 1, ZP_00053349. 1, ZP00064941. 1, NP_246927. 1, NP_389537. 1, ZP00102576. 1, NP_519531. 1, AF124757_19, DXR_ZYMMO, NP_713472. 1, NP_459225. 1, NP_454827. 1, ZP00045738. 1, NP_743754. 1, DXRPSEPK, ZP00130352. 1, NP_702530. 1, NP_841744. 1, NP_438967. 1, AF514841_1, NP_706118.1, ZP_00125845. 1, NP_404661. 1, NP_285867. 1, NP_240064. 1, NP_414715. 1, ZP_00094058.1, NP_791365. 1, ZP00012448. 1, ZP00015132. 1, ZP00091545. 1, NP_629822. 1, NP_771495. 1, NP_798691. 1, NP_231885. 1, NP_252340. 1, ZP_00022353. 1, NP_355549. 1, NP_420724. 1, ZP00085169. 1, EAA17616. 1, NP_273242. 1, NP_219574. 1, NP_387094. 1, NP_296721. 1, ZP 00004209. 1, NP_823739. 1, NP_282934. 1, BAA77848. 1, NP_660577. 1, NP_760741. 1, NP_641750. 1, NP_636741. 1, NP_829309. 1, NP_298338. 1, NP_444964. 1, NP_717246. 1, NP_224545.1, ZP_00038451. 1, DXR_KITGR, NP_778563. 1.

Beispiele für Isopentenyl-Diphosphat-#-Isomerase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-A-Isomerase aus Adonis palaestina clone AplPI28, (ipiAa1), ACCESSION #AF188060, veröffentlicht durch Cun- ningham, F. X. Jr. and Gantt, E. : Identification of multi-gene families encoding isopente- nyl diphosphate isomerase in plants by heterologous complementation in Escherichia coli, Plant Cell Physiol. 41 (1), 119-123 (2000) (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 61, Protein :

SEQ ID NO : 62), sowie weitere Isopentenyl-Diphosphat-A-lsomeraseGene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : Q38929,048964, Q39472, Qu3907, 035586, P58044, 042641,035760, Q10132, P15496, Q9YB30, Q8YNH4, Q42553, 027997, P50740,051627, 048965, Q8KFR5, Q39471, Q39664, Q9RVE2, Q01335, Q9HHE4, Q9BXS1, Q9KWF6, Q9CIF5, Q88WB6, Q92BX2, Q8Y7A5, Q8TT35 Q9KK75, Q8NN99, Q8XD58, Q8FE75, Q46822, Q9HP40, P72002, P26173, Q9Z5D3, Q8Z3X9, Q8ZM82, Q9X7Q6,013504, Q9HFW8, Q8NJL9, Q9UUQ1, Q9NH02, Q9M6K9, Q9M6K5, Q9FXR6,081691, Q9S7C4, Q8S3L8, Q9M592, Q9M6K3, Q9M6K7, Q9FV48, Q9LLB6, Q9AVJ1, Q9AVG8, Q9M6K6, Q9AVJ5, Q9M6K2, Q9AYS5, Q9M6K8, Q9AVG7, Q8S3L7, Q8W250, Q941E1, Q9AVI8, Q9AYS6, Q9SAY0, Q9M6K4, Q8GVZ0, Q84RZ8, Q8KZ12, Q8KZ66, Q8FND7, Q88QC9, Q8BFZ6, BAC26382, CAD94476.

Beispiele für Geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase aus Arabidopsis tha- liana, ACCESSION &num Y17376, Bouvier, F. ; Suire, C., d'Harlingue, A., Backhaus, R. A. and Camara, B. ; Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant J. 24 (2), 241-252 (2000) (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 63, Protein : SEQ ID NO : 64), sowie weitere Geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : Q9FT89, Q8LKJ2, Q9FSW8, Q8LKJ3, Q9SBR3, Q9SBR4, Q9FET8, Q8LKJ1, Q84LG1, Q9JK86 Beispiele für Famesyl-Diphosphat-Synthase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase aus Arabidopsis thaliana (FPS1), ACCESSION #U80605, veröffentlicht durch Cunillera, N., Arro, M., De- lourme, D., Karst, F., Boronat, A. und Ferrer, A. : Arabidopsis thaliana contains two diffe- rentially expressed farnesyl-diphosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 271 (13), 7774-7780 (1996)., (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 65, Protein : SEQ ID NO : 66),

sowie weitere Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : P53799, P37268, Q02769, Q09152, P49351,024241, Q43315, P49352,024242, P49350, P08836, P14324, P49349, P08524, 066952, Q08291, P54383, Q45220, P57537, Q8K9A0, P22939, P45204,066126, P55539, Q9SWH9, Q9AVI7, Q9FRX2, Q9AYS7, Q941E8, Q9FXR9, Q9ZWF6, Q9FXR8, Q9AR37,050009, Q941E9, Q8RVK7, Q8RVQ7,004882, Q93RA8, Q93RB0, Q93RB4, Q93RB5, Q93RB3, Q93RB1, Q93RB2, Q920E5.

Beispiele für Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine Geranyl-geranyl-DiphosphatYSynthase aus Sinaps alba, ACCESSION #X98795, veröffentlicht durch Bonk, M., Hoffmann, B., Von Lintig, J., Schledz, M., AI-Babili, S., Hobeika, E., Kleinig, H. and Beyer P. : Chloroplast import of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveals differential fates prior to membrane binding and oligomeric assembly, Eur. J. Biochem. 247 (3), 942-950 (1997), (Nuklein- säure : SEQ ID NO : 67, Protein : SEQ ID NO : 68), sowie weitere Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : P22873, P34802, P56966, P80042, Q42698, Q92236,095749, Q9WTN0, Q50727, P24322, P39464, Q9FXR3, Q9AYN2, Q9FXR2, Q9AVG6, Q9FRW4, Q9SXZ5, Q9AVJ7, Q9AYN1, Q9AVJ4, Q9FXR7, Q8LSC5, Q9AVJ6, Q8LSC4, Q9AVJ3, Q9SSU0, Q9SXZ6, Q9SST9, Q9AVJ0, Q9AVI9, Q9FRW3, Q9FXR5, Q941F0, Q9FRX1, Q9K567, Q93RA9, Q93QX8, CAD95619, EAA31459 Beispiele für Phytoen-Synthase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine Phytoen-Synthase aus Erwinia uredovora, ACCES- SION # D90087 ; veröffentlicht durch Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yama- no, S., Izawa, Y., Nakamura, K. und Harashima, K. : Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli ; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990), (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 69, Protein : SEQ ID NO : 70), sowie weitere Phytoen-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern :

CAB39693, BAC69364, AAF10440, CAA45350,. BAA20384, AAM72615, BAC09112, CAA48922, P001091, CAB84588, AAF41518, CAA48155, AAD38051, AAF33237, AAG10427, AAA34187, BAB73532, CAC19567, AAM62787, CAA55391, AAB65697, AAM45379, CAC27383, AAA32836, AAK07735, BAA84763, P000205, AAB60314, P001163, P000718, AAB71428, AAA34153, AAK07734, CAA42969, CAD76176, CAA68575, P 000130, P 001142, CAA47625, CAA85775, BAC14416, CAA79957, BAC76563, P000242, P000551, AAL02001, AAK15621, CAB94795, AAA91951, P000448 Beispiele für Phytoen-Desaturase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine Phytoen-Desaturase aus Erwinia uredovora, AC- CESSION # D90087 ; veröffentlicht durch Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K. und Harashima, K. : Elucidation of the Erwinia ure- dovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products ex- pressed in Escherichia coli ; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990), (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 71, Protein : SEQ ID NO : 72), sowie weitere Phytoen-Desaturase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : AAL15300, A39597, CAA42573, AAK51545, BAB08179, CAA48195, BAB82461, <BR> <BR> <BR> AAK92625, CAA55392, AAG10426, AAD02489, AA024235, AAC12846, AAA99519, AAL38046, CAA60479, CAA75094, ZP001041, ZP001163, CAA39004, CAA44452, ZP001142, ZP000718, BAB82462, AAM45380, CAB56040, ZP_001091, BAC09113, AAP79175, AAL80005, AAM72642, AAM72043, ZP000745, ZP001141, BAC07889, CAD55814, ZP 001041, CAD27442, CAE00192, ZP001163, ZP000197, BAA18400, AAG10425, ZP_001119, AAF13698, 2121278A, AAB35386, AAD02462, BAB68552, CAC85667, AAK51557, CAA12062, AAG51402, AAM63349, AAF85796, BAB74081, AAA91161, CAB56041, AAC48983, AAG14399, CAB65434, BAB73487, ZP001117, ZP_000448, CAB39695, CAD76175, BAC69363, BAA17934, ZP000171, AAF65586, ZP_000748, BAC07074, ZP001133, CAA64853, BAB74484, ZP_001156, AAF23289, AAG28703, AAP09348, AAM71569, BAB69140, ZP000130, AAF41516, AAG18866, CAD95940, NP_656310, MG10645, Z-P_000276, ZP_000192, ZP_000186, AAM94364, EAA31371, ZP_000612, BAC75676, AAF65582 Beispiele für Zeta-Carotin-Desaturase-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase aus Narcissus pseudonar- cissus, ACCESSION &num AJ224683, veröffentlicht durch AI-Babili, S., OeIschlegel, J. and

Beyer, P. : A cDNA encoding for beta carotene desaturase (Accession No. AJ224683) from Narcissus pseudonarcissus L.. (PGR98-103), Plant Physio. 117,719-719 (1998), (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 73, Protein : SEQ ID NO : 74), sowie weitere Zeta-Carotin-Desaturase-Gene aus anderen Organismen mit den fol- genden Accession Nummern : Q9R6X4, Q38893, Q9SMJ3, Q9SE20, Q9ZTP4,049901, P74306, Q9FV46, Q9RCT2, ZDSNARPS, BAB68552.1, CAC85667.1, AF372617_1, ZDS TARER, CAD55814.1, CAD27442.1, 2121278A, ZDS_CAPAN, ZDS_LYCES, NP_187138. 1, AAM63349. 1, ZDSARATH, AAA91161.1, ZDS_MAIZE, AAG14399. 1, Nu-441720. 1, NP_486422. 1, ZP_00111920. 1, CAB56041. 1, ZP 00074512. 1, ZP_00116357. 1, NP_681127. 1, ZP_00114185. 1, ZP00104126. 1, CAB65434.1, NP_662300. 1 Beispiele für crtISO-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine crtlSO aus Lycopersicon esculentum ; ACCESSION #AF416727, veröffentlicht durch Isaacson, T., Ronen, G., Zamir, D. and Hirschberg, J. : Cloning of tangerine from tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the pro- duction of beta-carotene and xanthophylls in plants ; Plant Cell 14 (2), 333-342 (2002), (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 75, Protein : SEQ ID NO : 76), sowie weitere crtISO-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : AAM53952 Beispiele für FtsZ-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine FtsZ aus Tagetes erecta, ACCESSION #AF251346, veröffentlicht durch Moehs, C. P., Tian, L., Osteryoung, K. W. and Dellapenna, D. : Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001), (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 77, Protein : SEQ ID NO : 78), sowie weitere FtsZ-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern : CAB89286.1, AF205858_1, NP_200339. 1, CAB89287.1, CAB41987.1, AAA82068.1, T06774, AF383876_1, BAC57986. 1, CAD22047.1, BAB91150.1, ZP00072546. 1,

NP_440816. 1, T51092, NP_683172. 1, BAA8511. 1, 1, NP_487898. 1, JC4289, BAA82871. 1, Nu-781763. 1, BAC57987.1, ZP_00111461. 1, T51088, NP_190843. 1, ZP 00060035. 1, NP_846285. 1, AAL07180. 1, NP_243424. 1, NP_833626. 1, AAN04561. 1, AAN04557. 1, CAD22048.1, T51089, NP_692394. 1, NP_623237. 1, NP_565839. 1, T51090, CAA07676. 1, NP_113397. 1, T51087, CAC44257.1, E84778, ZP_00105267. 1, BAA82091. 1, ZP_00112790. 1, BAA96782.1, Nu_348319. 1, Nu_471472. 1, ZP_00115870. 1, NP_465556. 1, NP_389412. 1, BAA82090. 1, NP_562681. 1, AAM22891. 1, Nu-371710. 1, NP_764416. 1, CAB95028.1, FTSZ_STRGR, AF120117_1, NP_827300. 1, JE0282, NP_626341. 1, AAC45639. 1, NP_785689. 1, NP_336679. 1, NP_738660. 1, ZP00057764. 1, AAC32265. 1, NP_814733. 1, FTSZMYCKA, NP216666. 1, CAA75616. 1, NP_301700.1, NP_601357. 1, ZP00046269. 1, CAA70158. 1, ZP00037834. 1, NP_268026. 1, FTSZ ENTHR, NP 787643. 1, NP_346105. 1, AAC32264. 1, JC5548, AAC95440. 1, NP_710793. 1, NP_687509. 1, NP_269594. 1, AAC32266. 1, NP_720988. 1, NP_657875. 1, ZP_00094865.1, ZP_00080499. 1, ZP00043589. 1, JC7087, NP_660559. 1, AAC46069. 1, AF179611_14, AAC44223. 1, NP_404201. 1.

Beispiele für MinD-Gene sind : Eine Nukleinsäure, kodierend eine MinD aus Tagetes erecta, ACCESSION #AF251019, veröffentlicht durch Moehs, C. P., Tian, L., Osteryoung, K. W. und Dellapen- na, D. : Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal deve- lopment ; Plant Mol. Biol. 45 (3), 281-293 (2001), (Nukleinsäure : SEQ ID NO : 79, Prote- in : SEQ ID NO : 80), sowie weitere MinD-Gene mit den folgenden Accession Nummern : NP_197790. 1, BAA90628.1, NP_038435. 1, NP_045875. 1, AAN33031. 1, NP_050910. 1, CAB53105.1, NP_050687. 1, NP_682807. 1, NP_487496. 1, ZP_00111708. 1, ZP00071109. 1, NP_442592. 1, NP_603083. 1, NP_782631. 1, ZP00097367. 1, ZP00104319. 1, NP_294476. 1, NP_622555. 1, NP_563054. 1, NP_347881. 1, ZP_00113908. 1, NP_834154. 1, NP_658480. 1, ZP00059858. 1, NP_470915. 1, NP_243893. 1, NP_465069. 1, ZP_00116155. 1, NP_390677. 1, NP_692970. 1, NP_298610. 1, NP_207129. 1, ZP_00038874. 1, NP_778791. 1, NP_223033. 1, NP_641561. 1, NP_636499. 1, ZP_00088714. 1, NP_213595. 1, NP_743889. 1, NP_231594. 1, ZP00085067. 1, NP_797252.1, ZP_00136593. 1, NP_251934. 1, NP_405629. 1, NP_759144. 1, ZP00102939. 1, NP_793645. 1, NP_699517. 1, NP_460771. 1, NP_860754. 1, NP_456322. 1, NP_718163. 1, NP_229666. 1, NP_357356. 1, NP_541904. 1, NP_287414. 1, NP_660660. 1, ZP 00128273. 1, NP_103411. 1, NP_785789. 1, NP_715361. 1, AF149810_1,

Nu_841854. 1, Nu_437893. 1, ZP00022726. 1, EAA24844.1, ZP00029547. 1, NP521484. 1, NP_240148. 1, NP_770852. 1, AF345908_2, NP_777923. 1, ZP00048879. 1, NP_579340. 1, NP_143455. 1, NP_126254. 1, NP_142573. 1, NP_613505. 1, NP_127112. 1, NP_712786. 1, Nu-578214. 1, NP_069530. 1, NP_247526. 1, AAA85593. 1, NP_212403. 1, Nu-782258. 1, ZP_00058694.1, NP_247137. 1, NP_219149. 1, NP_276946. 1, NP_614522. 1, ZP00019288. 1, CAD78330.1 Die Erfindung betrifft ferner eine genetisch veränderte Pflanze der Gattung Tagetes, wobei die genetische Veränderung zu einer Erhöhung oder Verursachung der Expres- sionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch die Regulation der Expression dieses Gens in der Pflanze durch die erfindungsgemä- ßen Promotoren.

Wie vorstehend erwähnt, wird unter"Expressionsaktivität"erfindungsgemäß die in ei- ner bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge Protein, also die Expressi- onsrate verstanden.

A, I Unter spezifischer Expressionsaktivität"wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge Protein pro Promotor verstanden.

Bei einer"verursachten Expressionsaktivität"oder"verursachten Expressionsrate"im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp die Bildung eines Proteins verursacht, das im Wildtyp der Pflanze der Gattung Tagetes nicht vorhanden war.

Beispielsweise weisen Wildtyp-Pflanzen der Gattung Tagetes kein Ketolase-Gen auf.

Die Regulation der Expression des Ketolase-Gens in der Pflanze durch die erfindungs- gemäßen Promotoren fürht somit zu einer Verursachung der Expressionsrate.

Bei einer #erhöhten Expressionsaktivität" oder #erhöhten Expressionsrate"im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp der Pflanze der Gattung Tagetes in einer bestimmten Zeit die gebildete Menge des Proteins erhöht.

Beispielsweise weisen Wildtyp-Pflanzen der Gattung Tagetes ein Hydroxylase-Gen auf. Die Regulation der Expression des Hydroxylase-Gens in der Pflanze durch die erfindungsgemäßen Promotoren fürht somit zu einer Erhöhung der Expressionsrate.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes wird die Regulation der Expression von Genen in der

Pflanze durch die erfindungsgemäßen Promotoren dadurch erreicht, dass man a) einen oder mehrere erfindungsgemäße Promotoren in das Genom der Pflanze ein- bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kon- . trolle der eingebrachten erfindungsgemäßen Promotoren erfolgt oder b) ein oder mehrere Gene in das Genom der Pflanze einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der. Kontrolle der endogenen, erfin- dungsgemäßen Promotoren erfolgt oder c) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend mindestens einen erfindungs- gemäßen Promotor und funktionell verknüpft eine oder mehrere zu exprimierende Ge- ne in die Pflanze einbringt.

In einer bevorzugten Ausführungsform bringt man gemäß Merkmal c) ein oder mehrere Nukleinsäurekonsfrukte, enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Promotor und funktionell verknüpft eine oder mehrere zu exprimierende Gene, in die Pflanze ein.

Die Integration der Nukleinsäurekonstrukte in der Pflanze der Gattung Tagetes kann dabei intrachromosomal oder extrachromosomal erfolgen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Promotoren und bevorzugte zu exprimierende Gene (Effektgene) sind vorstehend beschrieben.

Im folgenden wird exemplarisch die Herstellung der genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes mit erhöhter oder verursachter Expressionsrate eines Effektgens beschrieben.

Die Transformation kann bei den Kombinationen von genetischen Veränderungen ein- zeln oder durch Mehrfachkonstrukte erfolgen.

Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch Transformation der Ausgangspflanzen, mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das mindestens einen der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Promotoren enthält, die mit einem zu exprimierenden Effekten und gegebenenfalls weiteren Regulationssignalen funktiònell verknüpft sind.

Diese Nukleinsäurekonstrukte, in denen die erfindungsgemäßen Promotoren und Ef- fektgene funktionell verknüpft sind, werden im folgenden auch Expressionskassetten genannt.

Die Expressionskassetten können weitere Regulatiönssignale enthalten, also regulati- ve Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der Effektgene in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskasset- te stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, mindestens einen erfin- dungsgemäßen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungs- signal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwi- schenliegenden kodierenden Sequenz des Effektgens für mindestens eines der vor- stehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, das jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der ko- dierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekonstrukte, Expressi- onskassetten und Vektoren für Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, sowie die transgenen Pflanzen der Gattung Tagetes selbst beschrieben.

Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten, aber nicht darauf beschränkten Sequen- zen, sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärkern wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion mindes- tens eines erfindungsgemäßen Promotors mit mindestens einem Gen, vorzugsweise mit einem der vorstehend beschriebenen Effektgene, und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Nukleinsäure-Sequenz inserierten Nukleinsäure, die für ein plastiden- spezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängi- gen Rekombinations-und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Mole- cular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987), beschrieben sind.

Die vorzugsweise insertierte Nukleinsäuren, kodierend ein plastidäresTransitpeptid, gewährleisten die Lokalisation in Plastiden und insbesondere in Chromoplasten.

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäure- Sequenz für ein Effektgen-Produkt-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusions- proteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevor- zugt sind für die Chromoplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation der Effektgene in die Chromoplasten vom Effektgenprodukt-Teil enzymatisch ab- gespalten werden.

Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Nicotiana taba- cum Transketolase oder einem anderen Transitpeptid (z. B. dem Transitpeptid der klei- nen Untereinheit der Rubisco (rbcS) oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2 oder dessen funktioneiiem Äquivalent abgeleitet ist.

Besonders bevorzugt sind Nukleinsäure-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden- Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Tabak in drei Leserastem als Kpnl/BamHl Fragmente mit einem ATG-Codon in der Ncol Schnittstelle : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> pTP09<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Kpnl GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTC <BR> <BR> <BR> <BR> GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-< BR> <BR> <BR> <BR> CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-<BR&g t; <BR> <BR> <BR> TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGG-<BR> ; <BR> <BR> <BR> GATCC_BamHI<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> pTP 10 <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Kpnl GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTC <BR> <BR> <BR> <BR> GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT- CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG- <BR> <BR> <BR> TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-<BR> <BR> <BR> <BR> GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG-<BR& gt; <BR> <BR> <BR> GATCC BamHl pTP11

Kpnl_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCMGCTATCCTCTCTC< BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> GTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-< BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-<BR&g t; <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGG-<BR&g t; <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> GATCC BamHl Weitere Beispiele für ein plastidäres Transitpeptid sind das Transitpeptid der plastidä- ren isopentenyl-pyrophosphat Isomerase-2 (IPP-2) aus Arabisopsis thaliana und das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat Carboxylase (rbcS) aus Erbse (Guerineau, F, Wooiston, S, Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression cas- sette for targeting foreign proteins into the chloroplasts. Nucl. Acids Res. 16 : 11380).

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Nukleinsäure- Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterogen Genabschnitten ver- schiedener Organismen bestehen.

Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist.

Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adap- toren oder. Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor-und die Terminator-Regionen in Transkrip- tionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstel- len für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allge- meinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann so- wohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet vorzugsweise in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche

sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Beispiele für einen Terminator sind der 35S-Terminator (Guerineau et al. (1988) Nucl Acids Res. 16 : 11380), der nos Terminator (Depicker A, Stachel S ; Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM. Nopaline synthase : transcript mapping and DNA sequen- ce. J Mol Appi Genet. 1982 ; 1 (6) : 561-73) oder der ocs Terminator (Gielen, J, de Beuckeleer, M, Seurinck, J, Debroek, H, de Greve, H, Lemmers, M, van Montagu, M, Schell, J (1984) The complete sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5. EMBO J. 3 : 835-846).

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt wer- den. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans- versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese,"primer-repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.

Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion,"chewing-back"oder Auffüllen von Überhängen für"bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Li- gation zur Verfügung gestellt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vor- zugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobac- terium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti- Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktio- nelle Äquivalente.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet.

Dazu können an sich bekannte Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden.

Geeignete Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Protoplastentransfor- mation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone-die sogenannte"particle bombardment"Methode, die Elektropo- ration, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der, vorstehend beschriebene, durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von

S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev.

Plant Physio. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben.

Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeig- net ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) oder besonders bevorzugt pSUN2, pSUN3, pSUN4 oder pSUN5 (WO 02/00900).

Mit einem Expressionsplasmid transformierte Agrobakterien können in bekannter Wei- se zur Transformation von Pflanzen verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Zur bevorzugten Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, im folgenden auch transgene Pflanzen bezeichnet, wird die fusionierte Expressionskassette in einen Vek- tor, beispielsweise pBin19 oder insbesondere pSUN5 und pSUN3 kloniert, der geeig- net ist, in Agrobacterium tumefaciens transformiert zu werden. Mit einem solchen Vek- tor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen verwendet werden, indem beispiels- weise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw.

Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein oder mehrere in die Expressionskassette integrierte Gene enthalten.

, Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Effektgenen wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispiels- weise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in"Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations-und Klonierungstechniken kön- nen die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermeh- rung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pJIT117 (Guerineau et al.' (1988) Nucl. Acids Res. 16 : 11380), pBR332, pUC-Serien,

M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E coli als auch in Agrobakterien replizieren können.

Die Erfindung betrifft daher weiterhin eine genetisch veränderte Pflanze der Gattung Tagetes, enthaltend einen erfindungsgemäßen Promotor und funktionell verknüpft ein zu eprimierendes Gen, mit der Maßgabe, dass Gene aus Pflanzen der Gattung Tage- tes, die in Wildtyppflanzen der Gattung Tagetes von dem jeweiligen Promotor expri- miert werden, ausgenommen sind.

Bevorzugte erfindungsgemäße Promotoren und bevorzugte Effektgene sind vorste- hend beschrieben.

Insbesondere bevorzugt sind Effektgene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäu- ren, kodierend eine Ketolase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxyiase, Nuklein- säuren kodierend eine ß-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine £-Cyclase, Nuklein- säuren kodierend eine Epoxidase, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA- Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl- Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Reduktoisomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-A- lsomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäu- ren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Ge- ranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend eine Prephytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, Nuk- leinsäuren kodierend ein crtISO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein.

Bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen der Gattung Tagetes sind Marigold, Tage- tes erecta, Tagetes patula, Tagetes lucida, Tagetes pringlei, Tagetes palmeri, Tagetes minuta oder Tagetes campanulata.

Durch die erfindungsgemäßen Promotoren ist es mit Hilfe der vorstehend beschriebe- nen, erfindungsgemäßen Verfahren möglich, in den vorstehend beschriebenen, erfin- dungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes die Stoffwech- selwege zu spezifischen biosynthetischen Produkten zu regulieren.

Dazu werden beispielsweise Stoffwechselwege, die zu einem spezifischen biosyntheti- schen Produkt führen, durch Verursachung oder Erhöhung der Transkriptionrate bzw.

Expressionsrate von Genen dieses Biosyntheseweges verstärkt, indem die erhöhte

Proteinmenge zu einer erhöhten Gesamtaktivität dieser Proteine des gewünschten Biosyntheseweges und damit durch einem verstärkten Stoffwechselfluß zu dem ge- wünschen biosynthetischen Produkt führt.

Je nach gewünschtem biosynthetischen Produkt muss die Transkriptionsrate bzw. Ex- pressionsrate verschiedener Gene erhöht bzw. reduziert werden. In der Regel ist es vorteilhaft, die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate mehrere Gene zu verändern, d. h. die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu Er- höhen und/oder die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu reduzieren.

In den erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen ist mindestens eine erhöh- te oder verursachte Expressionsrate eines Gens auf einen erfindungsgemäßen Promo- tor zurückzuführen.

Weitere, zusätzliche veränderte, d. h. zusätzlich erhöhte oder zusätzlich reduzierte Ex- pressionsraten von weiteren Genen in genetisch veränderten Pflanzen können, müs- sen aber nicht auf die erfindungsgemäßen Promotoren zurück gehen.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produk- ten durch Kultivierung von erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden durch Kultivierung von erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen der Gat- tung Tagetes, dadurch gekennzeichnet, dass die zu exprimierenden Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase, Nukleinsäuren kodie- rend eine E-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine Epoxidase, Nukleinsäuren kodie- rend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3- Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Reduktoisomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat- A-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nuklein- säuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleirisäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren kodie- rend eine Prephytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin- Desaturase, Nukleinsäuren kodierend ein crtISO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein

FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein.

Die Carotinoide sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Phytoen, Phytofluen, Lycopin, Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3- Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin, Violaxanthin und Adonixanthin.

Insbeondere betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Ketoca- rotinoiden durch Kultivierung von erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes, dadurch gekennzeichnet, dass die zu exprimierenden Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, Nukleinsäuren kodierend eine ß- Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine e-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine Epoxidase, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphät-Reduktoisomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphät-A-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend eine Prephytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend ein crtlSO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein.

Die Ketocarotinoide sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin, Violaxanthin und Adonixanthin.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten, insbesondere Carotinoiden, vorzugsweise Ketocarotinoiden, wird vorzugsweise dem Kuitivierungsschritt der genetisch veränderten Pflanzen ein Ernten der Pflanzen und ein Isolieren der biosynthetischen Produkte, insbesondere Carotinoide, vorzugsweise Ketocarotinoide aus den Pflanzen, vorzugsweise aus den Petalen der Pflanzen, ange- schlossen.

Die genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes werden in an sich bekannter Weise auf Nährböden gezogen und entsprechend geerntet.

Die Isolierung von Ketocarotinoiden aus den geernteten Blütenblättern erfolgt bei- spielsweise in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Trocknung und an-

schließender Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemischer oder physikalischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermi- sche Trennverfahren, wie Rektifizierverfahren oder physikalische Trennverfahren, wie beispielsweise Chromatographie. Die Isolierung von Ketocarotinoiden aus den Blüten- blättern erfolgt beispielsweise bevorzugt durch organische Lösungsmittel wie Aceton, Hexan, Heptan, Ether oder tert.-Methylbutylether.

Weitere Isolierverfahren von Ketocarotinoiden, insbesondere aus Blütenblättern, sind beispielsweise in Egger und Kleinig (Phytochemistry (1967) 6,437-440) und Egger (Phytochemistry (1965) 4,609-618) beschrieben.

Ein besonders bevorzugtes Ketocarotinoid ist Astaxanthin.

Die Ketocarotinoide fallen im erfindungsgemäßen Verfahren in Blütenblättern in Form ihrer Mono-oder Diester mit Fettsäuren an. Einige nachgewiesene Fettsäuren sind z. B.

Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolensäure, und Laurinsäure (Kamata und Simpson (1987) Comp. Biochem. Physiol. Vol. 86B (3), 587-591).

Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen oder Pflanzenteile, wie insbesondere Blütenblätter mit erhöhtem Gehalt an biosynthetischen Produkten, insbesondere Carotinoide, insbesondere Ketocarotinoide, insbesondere Astaxanthin, können auch beispielsweise direkt oder nach an sich be- kannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Futter-und Nah- rungsergänzungsmittel verwendet werden.

Ferner können die genet5isch veränderten Pflanzen zur Herstellung von biosyntheti- schen Produkt-, insbesondere Carotinoid-, insbesondere Ketocarotinoid-, insbesondere Astaxanthin-haltigen Extrakten und/oder zur Herstellung von Futter-und Nahruhgser- gänzungsmitteln sowie von Kosmetika und Pharmazeutika verwendet werden.

Die genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes weisen im Vergleich zum Wildtyp einen erhöhten Gehalt an dem gewünschten biosynthetischen Produkten, ins- besondere Carotinoide, insbesondere Ketocarotinoide, insbesondere Astaxanthin auf.

Unter einem erhöhten Gehalt wird in diesem Fall auch ein verursachter Gehalt an Ke- tocarotinoiden, bzw. Astaxanthin verstanden.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt :

Allgemeine Experimentelle Bedingungen : Sequenzanalyse rekombinanter DNA Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz- DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1 : Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NOST-Ketolase aus Nostoc sp. PCC 7120 kodiert Die DNA, die für die NOST-Ketolase aus Nostoc sp. PCC 7120 kodiert, wurde mittels PCR aus Nostoc sp. PCC 7120 (Stamm der"Pasteur Culture Collection of Cyanobac- terium") amplifiziert.

Für die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskultur von Nostoc sp.

PCC 7120, die 1 Woche mit Dauerlicht und konstantem Schütteln (150 rpm) at 25°C in BG 11-Medium (1.5 g/l NaN03, 0.04 g/1 K2P04x3H20, 0.075 g/l MgS04xH20, 0.036 g/1 CaC12x2H20, 0.006 g/l citric acid, 0.006 gel Ferric ammonium citrate, 0.001 g/1 ED- TA disodium magnesium, 0.04 g/l Na2C03, 1ml trace metal mix A5+Co (2. 86 g/l H3B03, 1.81 g/l MnC12x4H2o, 0.222 g/l ZnS04x7H2o, 0.39 g/1 NaMo04X2H2o, 0.079 g/l CuS04x5H20, 0.0494 g/1 Co (N03) 2x6H20)) gewachsen war, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulve- risiert.

Protokoll für DNA Isolation aus Nostoc PCC7120 : Aus einer 10 ml Flüssigkultur wurden die Bakterienzellen durch 10minütige Zentrifuga- tion bei 8 000 rpm pelletiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser zerstoßen und gemahlen. Das Zellmaterial wurde in 1 ml 10mM Tris HCI (pH 7.5) resuspendiert und in ein Eppendorf Reaktionsgefäß (2ml Vo- lumen) überführt. Nach Zugabe von 100 ul Proteinase K (Konzentration : 20 mg/ml) wurde die Zellsuspension für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 500 NI Phenol extrahiert. Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13 000 upm wurde die obere, wässrige Phase in ein neues 2 ml-Eppendorf Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde 3mal wiederholt. Die DNA wurde durch Zu- gabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5.2) und 0.6 Volumen Isopropanol ge- fällt und anschließend mit 70% Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet wurde bei Raum- temperatur getrocknet, in 25 aul Wasser aufgenommen und unter Erhitzung auf 65°C

gelöst.

Die Nukieinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nostoc PCC 7120, wurde mittels"po- lymerase chain reaction" (PCR) aus Nostoc sp. PCC 7120 unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (NOSTF, SEQ ID No. 79) und eines antisense- spezifischen Primers (NOSTG SEQ ID No. 80) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem ent- halten war : - 1 ul einer Nostoc sp. PCC 7920 DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM NOSTF (SEQ ID No. 79) - 0. 2 mM NOSTG (SEQ ID No. 80) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 25. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X94°C 2 Minuten 35X94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten 72°C 3 Minuten 1X72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 79 und SEQ ID No. 80 resultierte in einem 805 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (SEQ ID No. 81). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) kloniert und der Klon pNOSTF-G er- halten.

Sequenzierung des Klons pNOSTF-G mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätig- te eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 88,886-89, 662 des Datenbankein- trages AP003592 identisch ist. Diese Nukleotidsequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nostoc sp. PCC 7120.

Beispiel 2 Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert Die DNA, die für die NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert, wurde mittels PCR aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Stamm der"American Type Culture Collection") amplifiziert.

Für die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskultur von Nostoc punctiformeATCC 29133, die 1 Woche mit Dauerlicht und konstantem Schütteln (150 rpm) at 25°C in BG 11-Medium (1.5 g/1 NaN03, 0.04 g/l K2PO4x3H2O, 0.075 g/l MgSO4xH2O, 0.036 g/1 CaCl2x2H2O, 0.006 g/1 citric acid, 0.006 g/1 Ferric ammonium citrate, 0.001 girl EDTA disodium magnesium, 0.04 g/1 Na2CO3, 1ml Trace Metal Mix "A5+Co" (2.86 g/1 H3BO3, 1.81 g/1 MnCl2x4H2o, 0.222 g/1 ZnSO4x7H20, 0.. 39 g/1 Na- Mo04X2H20, 0.079 g/1 CuSO4x5H2O, 0. 0494 g/1 Co (NO3) 2x6H20)) gewachsen war, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert.

Protokoll für die DNA-Isolation aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 : Aus einer 10 ml Flüssigkultur wurden die Bakterienzellen durch 10 minütige Zentrifuga- tion bei 8000 rpm pelletiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser zerstoßen und gemahlen. Das Zellmaterial wurde in 1 ml 10mM Tris-HCI (pH 7.5) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (2ml Vo- lumen) überführt. Nach Zugabe von 100 Eul Proteinase K (Konzentration : 20 mg/ml) wurde die Zellsuspension für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 500 ul Phenol extrahiert. Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13 000 upm wurde die obere, wässrige Phase in ein neues 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde 3mal wiederholt. Die DNA wurde durch Zu- gabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5.2) und 0.6 Volumen Isopropanol ge- fällt und anschließend mit 70% Ethanol-gewaschen. Das DNA-Pellet wurde bei Raum- temperatur getrocknet, in 25 lul Wasser aufgenommen und unter Erhitzung auf 65°C gelöst.

Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133, wur- de mittels"polymerase chain reaction" (PCR) aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (NP196-1, SEQ ID No. 82) und

eines antisense-spezifischen Primers (NP196-2 SEQ ID No. 83) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem ent- halten war : - 1 ul einer Nostoc punctiforme ATCC 29133 DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM NP196-1 (SEQ ID No. 82) - 0. 2 mM NP196-2 (SEQ ID No. 83) - u110X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 25. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X94°C 2 Minuten 35X94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten 72°C 3 Minuten 1 X72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 82 und SEQ ID No. 83 resultierte in einem 792 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (NP196, SEQ ID No. 84). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Ampli- fikat in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (invitrogen) kloniert und der Kion pNP196 erhalten.

Sequenzierung des Klons pNP196 mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 140.571-139. 810 des Datenbank- eintrages NZAABC01000196 identisch ist (inverse orientiert zum veröffentlichen Da- tenbankeintrag) mit der Ausnahme, daß G in Position 140. 571 durch A ersetzt wurde, um ein Standard-Startkodon ATG zu erzeugen. Diese Nukleotidsequenz wurde in ei- nem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nostoc punctiforme ATCC 29133.

Dieser Kion pNP196 wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJ1T117 (Guerineau et al. 1988, Nucal. Acids Res. 16 : 11380) verwendet.

pJIT117 wurde modifiziert, indem der 35S-Terminator durch den OCS-Terminator (Oc- topine Synthase) des Ti-Plasmides pTi15955 von Agrobacterium tumefaciens (Daten- bankeintrag X00493 von Position 12,541-12, 350, Gielen et al. (1984) EMBO J. 3 835- 846) ersetzt wurde.

Das DNA-Fragment, das die OCS-Terminatorregion beinhaltet, wurde mittels PCR un- ter Verwendung des Plasmides pHELLSGATE (Datenbankeintrag AJ311874, Wesley et al. (2001) Plant J. 27 581-590, nach Standardmethoden aus E. coli isoliert) sowie der Primer OCS-1 (SEQ ID No. 85) und OCS-2 (SEQ ID No. 86) hergestellt.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die die Octopin Synthase (OCS) Terminatorregion (SEQ ID No. 87) beinhaltet, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten waren : - 100 ng pHELLSGATE plasmid DNA - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM OCS-1 (SEQ ID No. 85) - 0. 2 mM OCS-2 (SEQ ID No. 86) -5 uI 10X PCR-Puffer (Stratagene) - 0. 25 ul Pfu Polymerase (Stratagene) - 28. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X94°C 2 Minuten 35X94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 1 Minute 1X72°C 10 Minuten Das 210 bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR- Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pOCS erhalten.

Sequenzierung des Klons pOCS bestätigte eine Sequenz, die mit einem Sequenzab- schnitt auf dem Ti-Plasmid pTi15955 von Agrobacterium tumefaciens (Datenbankein- trag X00493) von Position 12.541 bis 12.350 übereinstimmt.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 210 bp Sall-Xhol Fragmentes aus pOCS und Ligierung in den Sall-Xhol geschnittenen Vektor pJIT117.

Dieser Klon heisst pJO und wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONP196 verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 782 Bp Sphl-Fragmentes aus pNP196 und Ligierung in den Sphl geschnittenen Vektor pJO. Der Klon, der die NP196-Ketolase von Nostoc punctiforme in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJONP196.

Beispiel 3 : Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der NP196- Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in Tagetes erecta Die Expression der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715).

Die Expression erfolgte unter Kontrolle des blütenspezifischen Promoters EPSPS aus Petunia hybrida (Datenbankeintrag M37029 : Nukleotidregion 7-1787 ; Benfey et al.

(1990) Plant Cell 2 : 849-856).

Das DNA Fragment, das die EPSPS Promoterregion (SEQ ID No. 88) aus Petunia hybrida beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethoden aus Petunia hybrida isoliert) sowie der Primer EPSPS-1 (SEQ ID No. 89) und EPSPS-2 (SEQ ID No. 90) hergestellt.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das EPSPS-Promoterfragment (Datenbankein- trag M37029 : Nukleotidregion 7-1787) beinhaltet, erfolgte in einem 50 gel Reaktionsan- satz, in dem enthalten war : - 100 ng genomischer DNA aus A. thalianä - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM EPSPS-1 (SEQ ID No. 89) - 0. 2 mM EPSPS-2 (SEQ ID No. 90) - 5 ul 10X PCR-Puffer (Stratagene) - 0. 25 ul Pfu Polymerase (Stratagene) - 28. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X94°C 2 Minuten 35X94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 2 Minute 1X72°C 10 Minuten Das 1773 Bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR- Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pEPSPS erhalten.

Sequenzierung des Klons pEPSPS bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich durch zwei Deletion (Basen ctaagtttcagga in Position 46-58 der Sequenz M37029 ; Basen aaaaatat in Position 1422-1429 der Sequenz M37029) und die Basenaustausche (T statt G in Position 1447 der Sequenz M37029 ; A statt C in Position 1525 der Sequenz M37029 ; A statt G in Position 1627 der Sequenz M37029) von der publizierten EPSPS- Sequenz (Datenbankeintrag M37029 : Nukleotidregion 7-1787) unterscheidet. Die zwei Deletionen and die zwei Basenaustausche an den Positionen 1447 und 1627 der Se- quenz M37029 wurden in einem unabhängigen Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentieren somit die tatsächliche Nukleotidsequenz in den verwendeten Petu- nia hybrida Pflanzen.

Der Klon pEPSPS wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONP196 verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1763 Bp Sacl-Hindlil Fragmentes aus pEPSPS und Ligierung in den Sacl-Hindlil geschnittenen Vektor pJONP196. Der Klon, der den Promoter EPSPS anstelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heisst pJOESP : NP196. Diese Expressionskassette enthält das Fragment NP196 in der kor- rekten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS-Transitpeptid.

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP107 wurde das 2.961 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP : NP196 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert MSP 107 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp), Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der EPSPS-kontrollierten NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP108 wurde das 2.961 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP : NP196 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert.

MSP 108 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp), Fragment rbcS TP FMGMENTdas rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostocpunctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Beispiel 4 : Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert Die DNA, die für die NP195-Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 kodiert, wurde mittels PCR aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Stamm der"American Type Culture Collection") amplifiziert. Die Präparation von genomischer DNA aus einer Sus- pensionskultur von Nostoc punctiforme ATCC 29133 wurde in Beispiel 19 beschrieben Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133, wur- de mittels"polymerase chain reaction" (PCR) aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (NP195-1, SEQ ID No. 91) und eines antisense-spezifischen Primers (NP195-2 SEQ ID No. 92) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte. in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem ent- halten war : - 1 ul einer Nostoc punctiforme ATCC 29133 DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM NP195-1 (SEQ ID No. 91) - 0. 2 mM NP195-2 (SEQ ID No. 92) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ui R Taq Polymerase (TAKARA) - 25. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X94°C 2 Minuten 35X94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten 72°C 3 Minuten 1X72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 91 und SEQ ID No. 92 resultierte in einem 819 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (NP195, SEQ ID No. 93). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Ampli- fikat in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pNP195 erhalten.

Sequenzierung des Klons pNP195 mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 55,604-56, 392 des Datenbank- eintrages NZAABC010001965 identisch ist, mit der Ausnahme, daß T in Position 55.604 durch A ersetzt wurde, um ein Standard-Startkodon ATG zu erzeugen. Diese Nukleotidsequenz wurde in einem unabhängigem Ampiifikationsexperiment reprodu- ziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nostoc punctiforme ATCC 29133.

Dieser Klon pNP195 wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJ0 (in Beispiel 6 beschrieben) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 809 Bp Sphl-Fragmentes aus pNP195 und Ligierung in den Sphl geschnittenen Vektor pJO. Der Klon, der die NP195-Ketolase von Nostoc punctiforme in der korrekten Orien- tierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJONP195.

Beispiel 5 : Amplifikation einer DNA, die die gesamte Primärsequenz der NODK-Ketolase aus No- dularia spumignea NSOR10 kodiert.

Die DNA, die für die Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 kodiert, wurde mittels PCR aus Nodularia spumignea NSOR10 amplifiziert.

Für die Präparation von genomischer DNA aus einer Suspensionskultur von Nodularia spumignea NSOR10, die 1 Woche mit Dauerlicht und konstantem Schütteln (150 rpm) at 25°C in BG 11-Medium ; (1. 5 g/l NaN03, 0.04 g/l K2PO4x3H2O, 0.075 g/l MgS04xH20, 0.036 g/l CaCI2x2H20, 0.006 g/1 citric acid, 0. 006 g/l Ferric ammonium citrate, 0.001 g/l

EDTA disodium magnesium, 0.04 g/1 Na2C03, 1ml Trace Metal Mix"A5+Co" (2.86 g/l H3BO3, 1.81 g/i MnCI2x4H20, 0. 222g/lZnS04x7H20, 0. 39 g/l NaMoO4X2H2o, 0. 079 g/l CuS04x5H20, 0.0494 g/1 Co (NO3) 2x6H20) gewachsen war, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert.

Protokoll für die DNA-Isolation aus Nodularia spumignea NSORtO : Aus einer 10 mi Flüssigkultur wurden die Bakterienzellen durch 10 minütige Zentrifuga- tion bei 8000 rpm pelletiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser zerstoßen und gemahlen. Das Zellmaterial wurde in 1 ml 10mM Tris_HCI (pH 7.5) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (2ml Vo- lumen) überführt. Nach Zugabe von 100 aul Proteinase K (Konzentration : 20 mg/ml) wurde die Zellsuspension für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 500 NI Phenol extrahiert.

Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13 000 upm wurde die obere, wässrige Phase in ein neues 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde 3mal wiederholt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5.2) und 0.6 Volumen Isopropanol gefällt und anschließend mit 70% Ethanol ge- waschen. Das DNA-Pellet wurde bei Raumtemperatur getrocknet, in 25 ul Wasser auf- genommen und unter Erhitzung auf 65°C gelöst.

Die Nukleinsäure, kodierend eine Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 wurde mittels"polymerase chain reaction" (PCR) aus Nodularia spumignea NSOR10 unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (NODK-1, SEQ ID No. 94) und eines antisense-spezifischen Primers (NODK-2 SEQ ID No. 95) amplifiziert.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem ent- halten war : - 1 ul einer Nodularia spumignea NSOR10 DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM NODK-1 (SEQ ID No. 94) - 0. 2 mM NODK-2 (SEQ ID No. 95) - 5 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0. 25 ul R Taq Polymerase (TAKARA) - 25. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X94°C 2 Minuten 35X94°C 1 Minute 55°C 1 Minuten 72°C 3 Minuten 1X72°C 10 Minuten Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 94 und SEQ ID No. 95 resultierte in einem 720 Bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz kodiert (NODK, SEQ ID No. 96). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das Ampli- fikat in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pNODK erhalten.

Sequenzierung des Klons pNODK mit dem M13F-und dem M13R-Primer bestätigte eine Sequenz, welche mit der DNA-Sequenz von 2130-2819 des Datenbank-eintrages AY210783 identisch ist (inverse orientiert zum veröffentlichen Datenbankeintrag). Die- se Nukleotidsequenz wurde in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment repro- duziert und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz im verwendeten Nodularia spu- mignea NSOR10.

Dieser Klon pNODK wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJ0 (in Beispiel 6 beschrieben) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 710 Bp Sphl-Fragmentes aus pNODK und Ligierung in den Sphl geschnittenen Vektor pJO.

Der Klon, der die NODK-Ketolase von Nodularia spumignea in der korrekten Orientie- rung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcS Transitpeptid enthält, heisst pJONODK.

Beispiel 6 : Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der NODK- Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 in Lycopersicon esculentum und Tagetes erecta.

Die Expression der NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 in L. esculen- tum und Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al.

1986, Biochem J. 240 : 709-715). Die Expression erfolgte unter Kontrolle des blütenspe- zifischen Promoters EPSPS aus Petunia hybrida (Datenbankeintrag M37029 : Nukleo- tidregion 7-1787 ; Benfey et al. (1990) Plant Cell 2 : 849-856).

Der Klon pEPSPS (in Beispiel 8 beschrieben) wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJONODK (in Beispiel 12 beschrieben) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1763 Bp Sacl-Hindlil Fragmentes aus pEPSPS und Ligierung in den Sacl-Hindlll geschnittenen Vektor pJONODK. Der Klon, der den Promoter EPSPS anstelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heisst pJOESP : NODK. Diese Expressionskassette enthält das Fragment NODK in der korrek- ten Orientierung als N-terminale Fusion mit dem rbcS-Transitpeptid.

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der EPSPS-kontrollierten NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 in L. esculentum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP115 wurde das 2.889 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP : NODK mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert.

MSP 115 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp), Fragment rbcS TP FMGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NODK KETO CDS (690 bp), kodierend für die Nodularia spumignea NSOR10 NODK-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierúngssignal von Octopin- Synthase.

Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der EPSPS-kontrollierten NODK-Ketolase aus Nodularia spumignea NSOR10 in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP116 wurde das 2.889 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOESP : NODK mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert.

MSP 116 beinhaltet Fragment EPSPS den EPSPS Promoter (1761 bp), FragmentrbcS TP FRAGMENTdas rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NODK KETO CDS (690 bp), kodierend für die Nodularia spumignea NSOR10 NODK-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin- Synthase.

Beispiel 6A : Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der NP196- Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in Lycopersicon esculentum und Tage- tes erecta.

Die Expression der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715).

Die Expression erfolgte unter Kontrolle des blütenspezifischen Promoters PDS (Phy- toendesaturase) aus Lycopersicon esculentum (Datenbankeintrag U46919).

Das DNA Fragment, das die PDS Promoterregion (SEQ ID No. 100) aus Lycopersicon esculentum beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethoden aus Lycopersicon esculentum isoliert) sowie der Primer PDS-1 (SEQ ID No. 98) und PDS-2 (SEQ ID No. 99) hergestellt.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das PDS-Promoterfragment beinhaltet, erfolgte in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten war : 100 ng genomischer DNA aus Lycopersicon esculentum 0. 25 mM dNTPs 0. 2 mM PDS-1 (SEQ ID No. 98) 0. 2 mM PDS-2 (SEQ ID No. 99) 5 ul 1 OX PCR-Puffer (Stratagene) 0. 25 ul Pfu Polymerase (Stratagene) 28. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 2 Minute 1X 72°C 10 Minuten Das 2096 Bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR- Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pPDS erhalten.

Der Klon pPDS wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJOEPS : NP196 (in Beispiel 3 beschrieben) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 2094 Bp Ec113611-Smal Fragmentes aus pPDS und Ligierung in den Ecl136II-HindIII geschnittenen Vektor pJOEPS : NP196. Die Hindlll-Schnittstelle des Vektors wurde zuvor durch Behandlung mit dem Klenow-

Enzym in eine"blunt-end"-Schnittstelle überführt. Der Klon, der den Promoter PDS anstelle des ursprünglichen Promoters EPSPS enthält, heisst pJOPDS : NP196. Diese Expressionskassette enthält das Fragment NP196 in der korrekten Orientierung als N- terminale Fusion mit dem rbcS-Transitpeptid.

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der PDS-kontrollierten NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in L. esculen- tum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP117 wurde das 3.3 KB Ec113611-Xhol Fragment aus pJOPDS : NP196 mit dem Ec113611-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert. MSP 117 beinhaltet Fragment PDS den PDS Promoter, Fragment rbcS TP FMGMENTdas rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme NP1 96-Ketolase, Fragment OCS Ter- minator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der PDS-kontrollierten NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes e- recta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP118 wurde das 3.3 KB bp Ec113611-Xhol Fragment aus pJOPDS : NP196 mit dem Ec113611-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert. MSP 118 beinhaltet Fragment PDS den PDS Promoter, Fragment rbcS TP FMGMENTdas rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Ter- minator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Beispiel 6B : Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der NP196- Ketolase aus Nostoc punctiforme ATCC 29133 in Lycopersicon esculentum und Tage- tes erecta.

Die Expression der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715).

Die Expression'erfolgte unter Kontrolle des blütenspezifischen Promoters B-GENE (chromoplastenspezifische lycopene B-cyclase) aus Lycopersicon esculentum (Daten- bankeintrag AAZ51517).

Das DNA Fragment, das die B-GENE Promoterregion (SEQ ID No. 103) aus Lycoper- sicon esculentum beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA

(nach Standardmethoden aus Lycopersicon esculentum isoliert) sowie der Primer BGEN-1 (SEQ ID No. 101) und BGEN-2 (SEQ ID No. 102) hergestellt.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das B-GENE-Promoterfragment beinhaltet, erfolgte in einem 50 gel Reaktionsansatz, in dem enthalten war : - 100 ng genomischer DNA aus Lycopersicon esculentum - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM BGEN-1 (SEQ ID No. 101) - 0. 2 mM BGEN-2 (SEQ ID No. 102) - 5 ul IOX PCR-Puffer (Stratagene) 0. 25 ul Pfu Polymerase (Stratagene) 28. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 2 Minute 1X 72°C 10 Minuten Das 1222 Bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR- Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pB-GENE erhalten.

Der Klon pB-GENE wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJOEPS : NP196 (in Beispiel 3 beschrieben) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1222 Bp Sacl-HindIII Fragmentes aus pB- GENE und Ligierung in den Sacl-Hindlil geschnittenen Vektor pJOEPS : NP196. Der Klon, der den Promoter B-GENE anstelle des ursprünglichen Promoters EPSPS ent- hält, heisst pJOBGEN : NP196. Diese Expressionskassette enthält das Fragment NP196 in der korrekten Orientierung ais N-terminale Fusion mit dem rbcS- Transitpeptid.

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der PDS-kontrollierten NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in L. esculen- tum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP119 wurde das 2.4 KB Sacl-Xhol Frag- ment aus pJOBGEN : NP196 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert.

MSP 119 beinhaltet Fragment B-GENE den B-GENE Promoter, Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Ter- minator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der PDS-kontrollierten NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes e- recta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP120 wurde das 2.4 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOBGEN : NP196 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 li- giert. MSP 120 beinhaltet Fragment B-GENE den B-GENE Promoter, Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Beispiel 6C : Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der NP196- Ketolase aus Nostoc punctiforme A TCC 29133 in Lycopersicon esculentum und Tage- tes erecta.

Die Expression der NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes erecta erfolgte mit dem Transitpeptid rbcS aus Erbse (Anderson et al. 1986, Biochem J. 240 : 709-715).

Die Expression erfolgte unter Kontrolle des blütenspezifischen Promoters CHRC (chromoplast-specific carotenoid-associated protein) aus Cucumis sativa (Datenbank- eintrag AF099501).

Das DNA Fragment, das die CHRC Promoterregion (SEQ ID No. 106) aus Lycopersi- con esculentum beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethoden aus Lycopersicon esculentum isoliert) sowie der Primer CHRC-1 (SEQ ID No. 104) und CHRC-2 (SEQ ID No. 105) hergestellt.

Die PCR-Bedingungen waren die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das CHRC-Promoterfragment beinhaltet, er- folgte in einem 50 gl Reaktionsansatz,'in dem enthalten war :

100 ng genomischer DNA aus Lycopersicon esculentum - 0. 25 mM dNTPs - 0. 2 mM CHRC-1 (SEQ ID No. 101) - 0. 2 mM CHRC-2 (SEQ ID No. 102) - 5 ut 10X PCR-Puffer (Stratagene) - 0. 25 ul Pfu Polymerase (Stratagene) - 28. 8 ul Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 50°C 1 Minute 72°C 2 Minute 1X 72°C 10 Minuten Das 1222 Bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR- Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pCHRC erhalten.

Der Klon pB-GENE wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJOEPS:NP196 (in Beispiel 2 beschrieben) verwendet.

Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 1540 Bp Sacl-HindIII Fragmentes aus pCHRC und Ligierung in den Sacl-Hindlil geschnittenen Vektor pJOEPS : NP196. Der Klon, der den Promoter CHRC anstelle des ursprünglichen Promoters EPSPS enthält, heisst pJOCHRC : NP196. Diese Expressionskassette enthält das Fragment NP196 in der korrekten Orientierung als N-terminaie Fusion mit dem rbcS-Transitpeptid.

Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der PDS-kontrollierten NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in L. esculen- tum erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN3 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP121 wurde das 2.6 KB Sacl-Xhol Frag- ment aus pJOCHRC : NP196 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN3 ligiert.

MSP 121 beinhaltet Fragment CHRC den CHRC Promoter, Fragment rbcS TP FRAG- MENTdas rbcS Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Terminator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Die Herstellung einer Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der PDS-kontrollierten NP196-Ketolase aus Nostoc punctiforme in Tagetes e- recta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (W002/00900).

Zur Herstellung des Expressionsvektors MSP122 wurde das 2.6 KB bp Sacl-Xhol Fragment aus pJOCHRC : NP196 mit dem Sacl-Xhol geschnittenen Vektor pSUN5 li- giert. MSP 122 beinhaltet Fragment CHRC den CHRC Promoter, Fragment rbcS TP FRAGMENT das rbcs Transitpeptid aus Erbse (194 bp), Fragment NP196 KETO CDS (761 bp), kodierend für die Nostoc punctiforme NP196-Ketolase, Fragment OCS Ter- minator (192 bp) das Polyadenylierungssignal von Octopin-Synthase.

Beispiel 7 : Herstellung transgener Tagetes Pflanzen Tagetessamen werden sterilisiert und auf Keimungsmedium (MS-Medium ; Murashige and Skoog, Physio. Plant. 15 (1962), 473-497) pH 5,8, 2% Saccharose) aufgelegt. Die Keimung erfolgt in einem Temperatur/Licht/Zeitintervall von 18-28°C/20-200, uE/3-16 Wochen, bevorzugt jedoch bei 21°C, 20-70, uE, für 4-8 Wochen.

Alle Blätter der sich bis dahin entwickelten in vitro Pflanzen werden geerntet und quer zur Mittelrippe geschnitten. Die dadurch entstehenden Blattexplantate mit einer Größe von 10-60 mm2 werden im Verlaufe der Präparation in flüssigem MS-Medium bei Raumtemperatur für maximal 2 h aufbewahrt.

Ein beliebiger Agrobakterium tumefaciens Stamm, bevorzugt aber ein supervirulenter Stamm, wie z. B. EHA105 mit einem entsprechenden Binärplasmid, das ein Selekti- onsmarkergen (bevorzugt bar oder pat) sowie ein oder mehrere Trait-oder Reporter- gene tragen kann wird (pS5FNR : NOST, pS5AP3 : NOST pS5FNR : NP196, pS5EPS : NP196, pS5FNR : NP195, pS5EPS : NP195, pS5FNR : NODK und pS5EPS : NODK), über Nacht angezogen und für die Co-Kultivierung mit dem Blattma- terial verwendet. Die Anzucht des Bakterienstammes kann wie folgt erfolgen : Eine Ein- zelkolonie des entsprechenden Stammes wird in YEB (0,1 % Hefeextrakt, 0,5 % Rind- fleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 % Saccharose, 0,5 % Magnesiumsulfat x 7 H20) mit 25 mg/1 Kanamycin angeimpft und bei 28°C für 16 bis 20 h angezogen. Anschließend wird die Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 6000 g für 10 min geerntet und derart in flüssigem MS Medium resuspendiert, daß eine OD6ao von ca. 0,1 bis 0,8 ent- stand. Diese Suspension wird fuer die C-Kultivierung mit dem Blattmaterial verwendet.

Unmittelbar vor der Co-Kultivierung wird das MS-Medium, in dem die Blätter aufbe- wahrt worden sind, durch die Bakteriensuspension ersetzt. Die Inkubation der Blätt-

chen in der Agrobakteriensuspension erfolgte für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Anschließend werden die infizierten Explantate auf ein mit Agar (z. B.

0,8 % Plant Agar (Duchefa, NL) verfestigtes MS-Medium mit Wachstumsregulatoren, wie beispielsweise 3 mg/I Benzylaminopurin (BAP) sowie 1 mg/1 Indolylessigsäure (IAA) aufgelegt. Die Orientierung der Blätter auf dem Medium ist bedeutungslos. Die Kultivierung der Explantate findet für 1 bis 8 Tage, bevorzugt aber für 6 Tage statt, da- bei können folgende Bedingungen angewendet werden : Lichtintensität : 30-80 , uMòl/m2 x sec, Temperatur : 22-24°C, hell/dunkel Wechsel von 16/8 Stunden. An- schließend werden die co-kultivierten Explantate auf frisches MS-Medium, bevorzugt mit den gleichen Wachstumsregulatoren übertragen, wobei dieses zweite Medium zu- sätzlich ein Antibiotikum zur Unterdrückung des Bakterienwachstums enthält. Timentin in einer Konzentration von 200 bis 500 mg/l ist für diesen Zweck sehr geeignet. Als zweite selektive Komponente wird eine für die Selektion des Transformationserfolges eingesetzt. Phosphinothricin in einer Konzentration von 1 bis 5 mg/l selektiert sehr effi- zient, aber auch andere selektive Komponenten gemäß des zu verwendenden Verfah- rens sind denkbar.

Nach jeweils ein bis drei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medi- um bis sich Sproßknospen und kleine Sprosse entwickeln, die dann auf das gleiche Basalmedium einschließlich Timentin und PPT oder alternative Komponenten mit Wachstumsregulatoren, nämlich z. B. 0,5 mg/l Indolylbuttersäure (IBA) und 0,5 mg/l Gibberillinsäure GA3, zur Bewurzelung übertragen werden. Bewurzelte Sprosse kön- nen ins Gewächshaus überführt werden.

Zusätzlich zu der beschriebenen Methode sind folgende vorteilhafte Modifikationen möglich : Bevor die Explantate mit den Bakterien infiziert werden, können sie für 1 bis 12 Tage, bevorzugt 3-4, auf das oben beschriebene Medium für die Co-Kultur vorinkubiert werden. Anschließend erfolgt die Infektion, Co-Kultur und selektive Regeneration wie oben beschrieben.

Der pH Wert für die Regeneration (normalerweise 5,8) kann auf pH 5,2 gesenkt wer- den. Dadurch wird die Kontrolle des Agrobakterienwachstums verbessert.

Die Zugabe von AgNO3 (3-10 mg/l) zum Regenerationsmedium verbessert den Zu- stand der Kultur einschließlich der Regeneration selbst.

Komponenten, die die Phenolbildung reduzieren und dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. Zitronensäure, Ascorbinsäure, PVP u. v. a. m., wirken sich positiv auf die Kultur aus.

Für das gesamte Verfahren kann auch flüssiges Kulturmedium Verwendung finden. Die Kultur kann auch auf handelsüblichen Trägern, die auf dem flüssigen Medium positio- niert werden inkubiert werden.

Gemäß der oben beschriebenen Transformationsmethode wurden mit folgenden Ex- pressionskonstrukten folgende Linien erhalten : Mit pS5FNR : NOST wurde beispielsweise erhalten : MSP102-1, MSP102-2, MSP102-3, Mit pS5AP3 : NOST wurde beispielsweise erhalten : MSP104-1, MSP104-2, MSP104-3 Mit pS5FNR : NP196 wurde erhalten : MSP106-1, MSP106-2, MSP106-3 Mit pS5EPS : NP196 wurde erhalten : MSP108-1, MSP108-2, MSP108-3 MitpS5FNR : NP195 wurde erhalten : MSP110-1, MSP110-2, MSP110-3 MitpS5EPS : NP195 wurde erhalten : MSP112-1, MSP112-2, MSP112-3 Mit pS5FNR : NODK wurde erhalten : MSP114-1, MSP114-2, MSP114-3 MitpS5EPS : NODK wurde erhalten : MSP116-1, MSP116-2, MSP116-3 Mit pS3PDS : NP196 wurde erhalten : MSP117-1, MSP117-2, MSP117-3 Mit pS5PDS : NP196 wurde erhalten : MSP118-1, MSP118-2, MSP118-3 Mit pS3CHRC : NP196 wurde erhalten : MSP119-1, MSP119-2, MSP119-3 Mit pS5CHRC : NP196 wurde erhalten : MSP120-1, MSP120-2, MSP120-3 Mit pS3BGEN : NP196 wurde erhalten : MSP121-1, MSP121-2, MSP121-3 Mit pS5BGEN : NP196 wurde erhalten : MSP122-1, MSP122-2, MSP122-3 Beispiel 8 : Enzymatische Lipase-katalysierte Hydrolyse von Carotinoidestern aus Pflanzenmateri- al und Identifizierung der Carotinoide

Allgemeine Arbeitsvorschrift a) Gemörsertes Pflanzenmaterial (z. B. Petalenmaterial) (30-100 mg Frischgewicht) wird mit 100% Aceton (dreimal 500pu ; jeweils etwa 15 Minuten schütteln) extrahiert.

Das Lösungsmittel wird evaporiert. Carotinoide werden anschließend in 495 ul Aceton aufgenommen, 4,95 ml Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH7.4) zugegeben und gut gemischt. Danach erfolgt die Zugabe von ca. 17 mg Bile-Salze (Sigma) und 149 NI ei- ner NaCI/CaCl2-Lösung (3M NaCI und 75 mM CaC12). Die Suspension wird für 30 Mi- nuten bei 37°C inkubiert. Für die enzymatische Hydrolyse der Carotinoidester wird 595 pl einer Lipaselösung (50 mg/mi Lipase Typ7 von Candida rugosa (Sigma)) zugegeben und unter Schütteln bei 37C inkubiert. Nach etwa 21 Stunden erfolgte nochmals eine Zugabe von 595, ul Lipase mit erneuter Inkubation von mindestens 5 Stunden bei 37°C.

Anschließend werden etwa ca. 700 mg Na2S04 in der Lösung gelöst. Nach Zugabe von 1800 ut Petrolether werden die Carotinoide durch kräftig Mischen in die organische Phase extrahiert. Dieses Ausschütteln wird solange wiederholt, bis die organische Phase farblos bleibt. Die Petroletherfraktionen werden vereinigt und der Petrolether evaporiert. Freie Carotinoide werden in 100-120 NI Aceton aufgenommen. Mittels HPLC und C30-reverse phase-Säule können freie Carotinoide aufgrund von Retenti- onszeit und UV-VIS-Spektren identifiziert werden.

Die verwendeten Bile-Salze oder Gallensäuresalze sind 1 : 1 Mischungen von Cholat und Desoxycholat. b) Arbeitsvorschrift für Aufarbeitung, wenn nur geringe Mengen an Carotinoidestern im Pflanzenmaterial vorhanden sind Alternativ kann die Hydrolyse der Carotinoidester durch Lipase aus Candida rugosa nach Trennung mittels Dünnschichtchromatographie erreicht werden. Dazu werden 50- 100mg Pflanzenmaterial dreimal mit etwa 750gel Aceton extrahiert. Der Lösungsmit- telextrakt wird im Vakuum einrotiert (erhöhte Temperaturen von 40-50°C sind tolera- bel). Danach erfolgt Zugabe von 300pL1 Petrolether : Aceton (Verhältnis 5 : 1) und gute Durchmischung. Schwebstoffe werden durch Zentrifugation (1-2 Minuten) sedimentiert.

Die obere Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Das verbleibende Rest wird erneut mit 200gl Petrolether : Aceton (Verhältnis 5 : 1) extrahiert und Schwebstoffe werden durch Zentrifugation entfernt. Die beiden Extrakte werden zusammengeführt (Volumen 500, ul) und die Lösungsmittel evaporiert. Der Rückstand wird in 30, u1 Petrol- ether : Aceton (Verhältnis 5 : 1) resuspendiert und auf eine Dünnschichtplatte (Silica-Gel 60, Merck) aufgetragen. Falls mehr als eine Auftragung für präparativ-analytische Zwe- cke erforderlich ist, sollten mehrere Aliquots mit jeweils 50-100 mg Frischgewicht in der

beschriebenen Weise für die dünnschichtchromatographische Trennung aufbereitet werden.

Die Dünnschichtplatte wird in Petrolether : Aceton (Verhältnis 5 : 1) entwickelt. Caroti- noidbanden können visuell aufgrund ihrer Farbe identifiziert werden. Einzelne Caroti- noidbanden werden ausgekratzt und können für präparativ-analytische Zwecke gepoolt werden. Mit Aceton werden die Carotinoide vom Silica-Material eluiert ; das Lösungs- mittel wird im Vakuum evaporiert. Zur Hydrolyse der Carotinoidester wird der Rück- stand in 495pl Aceton gelöst, 17mg Bile-Salze (Sigma), 4, 95ml 0. 1M Kaliumphosphat- puffer (pH 7,4) und 149gel (3M NaCI, 75mM Cal2) zugegeben. Nach guter Durchmi- schung wird 30min bei 37°C äquilibriert. Danach erfolgt die Zugabe von 595A1 Lipase von Candida rugosa (Sigma, Stammlösung von 50mg/ml in 5mM CaC12). Über Nacht erfolgt die Inkubation mit Lipase unter Schütteln bei 37°C. Nach etwa 21 Stunden wird nochmals die gleiche Menge an Lipase zugegeben ; für mindestens 5 Stunden wird nochmals bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Dann erfolgt die Zugabe von 700mg Na2S04 (wasserfrei) ; mit 1800gl Petrolether wird für ca. 1 Minute ausgeschüttelt und die Mischung bei 3500 Umdrehungen/Minute für 5 Minuten zentrifugiert. Die obere Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Ausschütteln so lange wie- derholt, bis die obere Phase farblos ist. Die vereinigte Petrolether-Phase wird im Vaku- um eingeengt (Temperaturen von 40-50°C sind möglich). Der Rückstand wird in 120gel Aceton, eventuell mittels Ultraschall, gelöst. Die gelösten Carotinoide können mittels HPLC unter Verwendung einer C30-Säule getrennt und anhand von Referenzsubstan- zen quantifiziert werden.

Beispiel 9 : HPLC-Analyse freier Carotinoide Die Analyse der nach der Arbeitsvorschriften in Beispiel 15 erhaltenen Proben erfolgt unter folgenden Bedingungen : Folgende HPLC-Bedingungen wurden eingestellt.

Trennsäule : Prontosil C30-Säule, 250 x 4, 6 mm, (Bischoff, Leonberg, Germany) Flussrate : 1.0 mi/min Eluente : Laufmittel A-100% Methanol Laufmittel B-80% Methanol, 0.2% Ammoniumacetat Laufmittel C-100% t-Butyl-methylether Detektion : 300-530 nm Gradientenprofii : Zeit Fiussrate % Laufmittel A % Laufmittel B % Laufmittel C 1.00 1.0 95. 0 5. 0 0 12. 00 1. 0 95. 0 5. 0 0 12. 10 1. 0 80. 0 5. 0 15. 0 22. 00 1. 0 76. 0 5. 0 19. 0 22. 10 1. 0 66. 5 5. 0 28. 5 38. 00 1. 0 15. 0 5. 0 80. 0 45. 00 1. 0 95. 0 5. 0 0 46. 0 1. 0 95. 0 5. 0 0.

Einige typische Retentionszeiten für erfindungsgemäß gebildete Carotinoide sind z. B. : Violaxanthin 11,7 min, Astaxanthin 17,7 min, Adonixanthin 19 min, Adonirubin 19,9 min, Zeaxanthin 21 min.