技术领域

[0001] 本发明涉及体外检测领域， 尤其涉及一种前列腺特异性抗原同源异构体化 学发 光免疫检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

[0002] 前列腺癌已经成为西方世界发病率最高的肿瘤 之一， 据估计， 每年全球新患病 的前列腺癌患者有约 914， 000人， 因为前列腺癌而死亡的患者约为 258， 000人 ， 近些年中国的前列腺癌发病例在逐年攀升。 早期发现前列腺癌对前列腺癌的 治疗十分重要， 目前， 前列腺癌诊断的金标准仍旧是前列腺穿刺活检 。

[0003] 上世纪 80年代末， 人类发现了前列腺特异性抗原 (Prostate-specific Antigen,

PSA)是前列腺癌预测的重要标志物。 然而， 在多年的运用中， PSA的局限性也 日益凸显， 特异度较低的缺陷导致了临床上过度穿刺、 过度治疗的发生， 为病 人造成了心理负担， 为社会造成经济负担。 因此， 人们致力于寻找新的特异性 肿瘤标志物用于预测前列腺癌。 近年来， 随着分子生物学的飞速发展， 人们发 现了多种前列腺癌的肿瘤特异性标志物， 部分已应用于临床， 同吋随着人类基 因组学的发展， 人们相继发现了前列腺癌风险基因， 并期待将基因检测作为初 步筛査前列腺癌高危人群的工具。

[0004] 最近， 一种被称为前列腺特异性抗原同源异构体 （p2PSA) 的 PSA前体被发现 ， 研究证实 _P 2PSA及其衍生指标与前列腺癌在欧洲人群� �有着显著的关联， 对于 临床上预测前列腺癌具有重要意义。

[0005] 目前临床检测 _P 2PSA的常见方法有酶联免疫吸附法、 放射免疫分析法、 酶促化 学发光法， 但这些方法都存在着一些不足之处。

[0006] 一、 酶联免疫吸附法

[0007] 酶联免疫吸附法 (ELISA)被广泛应用， 但该方法也存在着下述的不足之处： [0008] (1)使用 12x8型、 6x8型、 8x12型或整板型 96孔专用微孔板作为抗原包被用具 和反应容器， 在使用吋只能分成 12批次、 6批次、 8批次或整板一次使用， 无法 进行独立的、 单人份的检测；

[0009] (2)定量测定所用的试剂种类较多， 每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装， 并 且每使用一种试剂吋都需要更换吸液嘴来分别 加注到微孔板的微孔中， 不但试 剂瓶种类多， 加注试剂的操作也极为繁琐；

[0010] (3)缺少对检测信息的相应标注， 只能通过査看试剂盒外包装盒的标识才能了 解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息， 而且所知悉的信息在检测过程中 不受控， 具有很大的随意性；

[0011] (4)检测试剂在检测过程中处于幵放的空间， 容易引起各种试剂之间的交叉污 染而影响检测结果的准确性；

[0012] (5)检测过程多采用手工操作， 试剂或样本的加量不很精确， 操作过程极为繁 琐和复杂， 容易发生操作差错， 检测结果的准确度和精密度较差；

[0013] (6)在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均 为项目数 X48/96人份， 如果需 要检测 10个项目， 则试剂的配置及使用数须为 10x48/96人份， 如果只有一份样 本需要检测 10个不同的项目， 也需要配置 10x48/96人份的试剂， 存在着不够经 济合理的缺点。

[0014] 二、 放射免疫分析法

[0015] 放射免疫分析方法放射性污染大、 加样步骤繁琐、 操作复杂、 操作吋间长、 测 定结果不稳定、 试剂保存吋间短、 试剂盒操作自动化程度低、 配套仪器价格昂 贵等不足之处。

[0016] 二、 化学发光法

[0017] 化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和 酶促化学发光。

[0018] 酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶 （HRP) 和碱性磷酸酶两种， 但都有一定 的局限性， 辣根过氧化物酶主要缺点为： 鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情 况下， 也会被 H202氧化自身发光， 本底相对较高， 影响信噪比， 反应动力学复 杂， 影响因素多， 结果不够稳定， 要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。 碱性磷酸酶主要缺点为： 底物达到平台期的吋间长， 底物成本高， 导致检测成 本高， 患者负担重。 技术问题

[0019] 吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化 学发光具有明细优势， 主要表现 在： 反应不需要催化剂， 只要碱性环境即可进行， 反应迅速， 背景发光低， 信 噪比高， 干扰因素少， 试剂稳定性好， 可以两点定标， 体系简单， 激发液成本 低， 吖啶酯易与蛋白质联结， 且联结后光子产率不减少。 。

问题的解决方案

技术解决方案

[0020] 基于此， 有必要提供一种检测灵敏度较高的前列腺特异 性抗原同源异构体化学 发光免疫检测试剂盒及其制备方法。

[0021] 一种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒， 包括： 前列腺特 异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化 的磁微粒和抑制素单克隆抗体标 记的化学发光标记物。

[0022] 所述前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体 包被的羧基化的磁微粒中， 所述 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体与所 述羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25 ~35。

[0023] 所述抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物 中， 所述前列腺特异性抗原同源 异构体单克隆抗体与所述化学发光标记物的比 例为 50: 1~10。

[0024] 所述羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~ 1 μηι。

[0025] 所述化学发光标记物为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。

[0026] 所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光 免疫检测试剂盒， 还包括化学发 光底物液， 所述化学发光底物液包括 Α液和 Β液。

[0027] 所述 A液为 H ₂ 0 ₂ 溶液， 所述 B液为 NaOH溶液。

[0028] 所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光 免疫检测试剂盒， 还包括前列腺 特异性抗原同源异构体定标品。

[0029] 所述前列腺特异性抗原同源异构体定标品为浓 度分别为 0pg/mL、 50pg/mL、 20

Opg/mL、 500pg/mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的 溶液。

[0030] 一种上述的前列腺特异性抗原同源异构体化学 发光免疫检测试剂盒的制备方法 ， 包括如下步骤：

[0031] 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 E DC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入前列腺特异性抗原同源 异构体单克隆抗体， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体 包被的羧基化的磁微粒； 以及

[0032] 取前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后 加入化学发光标记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抑制素单克隆 抗体标记的化学发光标记物。

发明的有益效果

有益效果

[0033] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒能够以全自动化学 发光免疫分析仪为检测工具， 完成前列腺特异性抗原同源异构体的检测这种 前 列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测 试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏 度达到 lpg/mL， 相对于传统的前列腺特异性抗原同源异构体的 检测方法灵敏度 至少提高了 10倍， 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒 的检测精度较高。

对附图的简要说明

附图说明

[0034] 图 1为一实施方式的前列腺特异性抗原同源异构� �化学发光免疫检测试剂盒的 制备方法的流程图；

[0035] 图 2为实施例 3得到的前列腺特异性抗原同源异构体标准曲� �图。

本发明的实施方式

[0036] 为使本发明的上述目的、 特征和优点能够更加明显易懂， 下面结合附图和具体 实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明 。 在下面的描述中阐述了很多具 体细节以便于充分理解本发明。 但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它 方式来实施， 本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情 况下做类似改进， 因此本发明不受下面公幵的具体实施的限制。

[0037] 一实施方式的前列腺特异性抗原同源异构体化 学发光免疫检测试剂盒， 包括： 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被 的羧基化的磁微粒和抑制素单克 隆抗体标记的化学发光标记物。

[0038] 优选的， 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被 的羧基化的磁微粒中， 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体与羧 基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35

[0039] 优选的， 抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中， 前列腺特异性抗原同源 异构体单克隆抗体与化学发光标记物的比例为 50: 1~10。

[0040] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。

[0041] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。

[0042] 在其他的实施例中， 上述前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂 盒还包括化学发光底物液。

[0043] 化学发光底物液包括 Α液和 Β液。 A液可以为 H ₂ 0 ₂ 溶液， B液可以为 NaOH溶液

[0044] 本实施例中， A液为浓度为 0.1mol/L的 H ₂ 0 ₂

溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。

[0045] 在其他的实施例中， 上述前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂 盒还包括前列腺特异性抗原同源异构体定标品 。

[0046] 前列腺特异性抗原同源异构体定标品为浓度分 别为 0pg/mL、 50pg/mL、 200pg/ mL、 500pg/mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的溶液

[0047] 具体的， 前列腺特异性抗原同源异构体定标品可以采用 标准品缓冲液将前列腺 特异性抗原同源异构体配制成浓度分别为 Opg/mL、 50pg/mL、 200pg/mL、 500pg/ mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的溶液 。

[0048] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒用于前列腺特异性 抗原同源异构体检测吋， 利用全自动化学发光免疫分析仪对前列腺特异 性抗原 同源异构体定标品进行检测， 绘制标准曲线， 内置于电脑软件； 接着测试实际 样本， 根据样本发光值计算样本浓度； 最后对前列腺特异性抗原同源异构体全 自动化学发光免疫分析系统进行性能 （灵敏度、 线性、 精密度、 干扰性） 的评 价。

[0049] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒能够以全自动化学 发光免疫分析仪为检测工具， 完成前列腺特异性抗原同源异构体的检测这种 前 列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测 试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏 度达到 lpg/mL， 相对于传统的前列腺特异性抗原同源异构体的 检测方法灵敏度 至少提高了 10倍， 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒 的检测精度较高。

[0050] 此外， 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒还具有以下 优点：

[0051] 1、 选择吖啶酯作为标记材料， 并应用于化学发光免疫分析系统， 该发光体系 为直接化学发光， 与传统的酶促化学发光相比， 该反应不需要酶的参与， 更加 节约成本；

[0052] 2、 选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围 宽， 能达到 lpg/mL~

1000pg/mL, 而传统的前列腺特异性抗原同源异构体的检测 方法的检线性范围为 10pg/mL~ 1000pg/mL;

[0053] 3、 吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高， 批内及批间差均在 5%以内， 这是 其它化学发光免疫分析系统难以达到的；

[0054] 4、 化学发光免疫分析系统已实现样本的定量， 通过内置标准曲线到测试软件

， 只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；

[0055] 5、 化学发光免疫分析系统可以实现全自动化， 试剂及样本的添加全有仪器完 成， 操作更加简便， 减少了人为的误差。

[0056] 如图 1所示的上述前列腺特异性抗原同源异构体化� �发光免疫检测试剂盒的制 备方法， 包括如下步骤：

[0057] 羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 EDC 水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入前列腺特异性抗原同源异 构体单克隆抗体， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得 到前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包 被的羧基化的磁微粒。

[0058] MES (2-(N-吗啡啉)乙磺酸） 缓冲液的浓度为 0.02M， pH为 5.5。

[0059] Tris缓冲液的浓度为 0.1M并且含有 2<¾BSA， pH为 8.0。

[0060] EDC (1-乙基 -3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺） 水溶液的浓度为 10mg/mL~20m g/mL, EDC与羧基化的磁微粒的比例为 0.05: 0.1-1 =

[0061] 优选的， 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被 的羧基化的磁微粒中， 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体与羧 基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35

[0062] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。

[0063] 取前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后 加入化学发光标记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抑制素单克隆 抗体标记的化学发光标记物。

[0064] 碳酸盐缓冲液浓度为 0.1M， pH为 9.0 9.5，

[0065] 除杂的操作为离心脱盐柱脱盐， 具体操作为： 先分别用纯净水及 TBS缓冲液 ( 40 mM Tris-HCl， 0.5% BSA, l% NaCl, pH 8.0) 处理离心脱盐柱， 最后加入得 到的前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体 包被的羧基化的磁微粒的溶液， 最后收集离心管中的液体。

[0066] 优选的， 抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中， 前列腺特异性抗原同源 异构体单克隆抗体与化学发光标记物的比例为 50: 1~10。

[0067] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。

[0068] 得到的前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗 体包被的羧基化的磁微粒和抑制 素单克隆抗体标记的化学发光标记物组合即可 得到上述前列腺特异性抗原同源 异构体化学发光免疫检测试剂盒。

[0069] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒在使用吋， 还需要 化学发光底物液和前列腺特异性抗原同源异构 体定标品。

[0070] 化学发光底物液和前列腺特异性抗原同源异构 体定标品可以自行配制得到。 [0071] 化学发光底物液包括 A液和 B液。 A液可以为 H ₂ 0 ₂ 溶液， B液可以为 NaOH溶液

[0072] 本实施例中， A液为浓度为0.1mol/L的H ₂ O ₂

溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。

[0073] 具体的， 前列腺特异性抗原同源异构体定标品可以采用 标准品缓冲液将前列腺 特异性抗原同源异构体配制成浓度分别为 0pg/mL、 50pg/mL、 200pg/mL、 500pg/ mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的溶液 。

[0074] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免 疫检测试剂盒的制备方法简单方 便， 制得的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光 免疫检测试剂盒的检测灵敏 度较高， 具有良好的应用前景。

[0075]

[0076] 以下为具体实施例。

[0077] 实施例 1 : 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒的制备

[0078] (1) 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被 的羧基化的磁微粒的制备

[0079] 取含有 50mg粒径为 0.05μηι~1μιη的羧基化的磁微粒 （MagnaBind™, 货号 21353 ) 悬浮液， 磁分离去上清， 用 0.02 M， pH为 5.5 MES缓冲液重悬， 加入 lmL新配 置的 10mg/mL的 EDC水溶液， 活化磁珠表面羧基， 加入 4mg前列腺特异性抗原同 源异构体单克隆抗体 （biorbyt, 货号 orb48780) ， 室温下混悬 6h， 磁分离， 去除 上清， 用含 2%BSA的 0.1M， pH为 8.0的 Tris缓冲液重悬到 lmg/mL， 得到前列腺特 异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化 的磁微粒， 每瓶 5mL分装保存于 4 °C备用。

[0080] (2) 抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯的制备：

[0081] 取 50μί浓度为 25mg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体单克隆� �体， 加入 150μ L浓度为 0.1M、 pH为 9.0~9.5的碳酸盐缓冲液， 混匀， 然后加入 1.5μί浓度为 5mg/ mL的吖啶酯溶液混匀， 室温下避光反应， 1.5h后取出， 用 2mL的 zeba离心脱盐柱 脱盐处理， 脱盐过程中首先分别用纯净水及 TBS缓冲液进行处理， 最后加入得到 的抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯溶液， 收集离心管中的液体至保存管得到抑 制素单克隆抗体标记的吖啶酯， 每瓶 5mL分装保存于 4°C备用。

[0082] (3) 前列腺特异性抗原同源异构体定标品的制备：

[0083] 用标准品缓冲液 （40mMTris-HCl， 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0) 将前列腺 特异性抗原同源异构体配置成浓度为 Opg/mL、 50pg/mL、 200pg/mL、 500 pg /mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL， 每瓶 0.5 mL分装冻干， 4°C保存备用。

[0084]

[0085] 实施例 2: 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测方法

[0086] 以全自动化学发光免疫分析仪 （YHLO， 货号 iFlash3000) 为检测工具， 方法学 模式为双抗体夹心法， 即仪器依次加入 50 的样品、 50 的前列腺特异性抗原 同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒 以及 50 的前列腺特异性抗原同 源异构体处理液， 反应 20min后， 再加 50 的前列腺特异性抗原同源异构体包 被的吖啶酯， 反应 20min后， 进行磁分离， 仪器将反应混合物送入暗室， 依次加 入发光底物 A液 （H ₂ 0 ₂ ) 及 B液 （NaOH) 进行发光反应， 最后记录发光值。

[0087]

[0088] 实施例 3: 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒性能评价 [0089] 采用实施例 2中的方法对前列腺特异性抗原同源异构体定� �品进行检测， 得到 绘制标准曲线如图 2所示。

[0090] 接着对接着测试实际样本， 根据样本发光值计算样本浓度。

[0091] 灵敏度的检测：

[0092] 参照 CLSI EP17-A文件推荐实验方案， 计算前列腺特异性抗原同源异构体化学 发光免疫检测试剂盒的灵敏度， 求得的灵敏度为 lpg/ mL。

[0093] 线性的检测：

[0094] 对浓度为 50pg/mL、 200pg/mL、 500pg/mL、 1000pg/mL、 1600pg/mL标准 品做线性分析， 计算线性相关系数， r=0.9996， 另外， 该试剂盒对前列腺特异性 抗原同源异构体样品检测的线性范围为 lpg/ml ~ 1000pg/mL。

[0095] 精密度测定：

[0096] 取浓度为 10pg/mL及 100pg/mL两个前列腺特异性抗原同源异构体样品� �� 每个样 本每个浓度各做 3个平行， 用三批试剂盒进行检测， 计算试剂盒批内及批间差， 结果表明该试剂盒批内及批间差均小于 5%。

[0097] 干扰性实验：

[0098] 取混合血清分别添加干扰物包括： 结合胆红素、 游离胆红素、 血红蛋白、 抗坏 血酸、 甘油酯， 添加比例按照 1 : 20进行， 分别测定混合血清及添加了各种干扰 物后混合血清的测值， 计算二者之间的偏差， 以 ±10%为可接受范围。 结果表明 ， 干扰性均达到 NCCLS的文件标准， 可用于临床实验室前列腺特异性抗原同源 异构体状况的准确评估。

[0099]

[0100] 实施例 4、 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒的对比实验 [0101] 分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸 附法对浓度为 50 pg /mL、 200pg /mL、 500 pg /mL、 1000 pg /mL、 1600 pg /mL的前列腺特异性抗原同源异构体样 品做检测， 两种方法检测灵敏度相比， 数据如下表所示：

[0102]

[0103]

[0104] 由上表可以看出， 化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法 提高了约 10倍

[0105] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方 式， 其描述较为具体和详细， 但 并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制 。 应当指出的是， 对于本领域的 普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改 进， 这些都属于本发明的保护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。