Titel : Protein-Biochip zum differentiellen Screenen von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung von Proteinbindern enthaltend mindestens einen Proteinbinder präsentiert in mindestens einer nativen oder natürlichen Form und mindestens einer nicht-nativen und dessen Verwendung oder Verfahren zur Diskriminierung bzw. differentiellen Screenen von geeigneten Proteinbindern, welche die native oder nicht native Form von Proteinbindern erkennen. Protein-Biochips gewinnen eine zunehmende industrielle Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der Pharmaentwicklung.

Insbesondere konnten mit Hilfe von Protein-Biochips bei der Analyse des Genoms und der Genexpression ein großer Informationsgewinn erzeugt werden. Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von Protein-Biochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsatz-Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine Möglichkeit (Heyman, J.A. , Cornthwaite,

J., Foncerrada, L., Gilmore, J. R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, CL. , Hood, R., HuIl, H.M., Lee, W. Y., Marcil, R., Marsh, E. J., Mudd, K.M., Patino, M. J., Purcell, T. J., Rowland, J. J., Sindici, M. L. and Hoeffler, J. P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392; Kersten, B., Feilner, T., Krämer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., ¹ Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A., Kreutzberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2003) Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum

Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J. F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong, CM. , Li, S., Jacotot, L., Bertin, N., Janky, R., Moore, T., Hudson, J. R., Jr., Hartley, J. L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,

Papasotiropoulos, V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R-, Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill, D.E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome Version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet, 34, 35-41.; Walhout, A. J., Temple, G. F., Brasch, M.A., Hartley, J. L., Lorson, M.A. , van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methode Enzymol, 328, 575-592) . Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA-

Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic äcids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C, Lehrach, H. and Walter, G. (2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C, Lueking, A., Bovekamp, L., Gutjahr, C, Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C, Gotthold, C, Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A system for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr. Purif. , 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen Hefe-Expressionsvektor einkloniert.

Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für sogenannte Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht.

Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Anti ^' körpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine dieser Bibliothek konnten darüber hinaus im Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, ξ. and LaBaer, J. (2002) Proteome- scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl äcad Sei U S A, 99, 2654-2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Hörn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening. änalytical Biochemistry, 270, 103-111) . Solche Protein-Biochips auf der Basis von cDNA- Expressionsbibliotheken sind insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312.

Ferner sind als Proteinbiochips Antigen-Antikörper präsentierende Anordnungen beschrieben (LaI et al (2002)

Antibody arrays : An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143-149; Kusnezow et al . (2003), Antibody microarrays: An evaluaution of produetion parameters, Proteomics, 3, 254- 264) .

Beispielsweise konnte mittels Proteinbiochips in Einzelmessung die Bindungsspezifität verschiedener monoklonaler Antikörper wie anti-HSP90ß, anti-GAPDH oder anti-α-Tubulin auf einem Protein-Microarray, bestehend aus 96 humanen rekombinant exprimierten Proteinen analysiert werden (Lueking (1999) ) . Zudem konnte die Kreuzreaktivität zweier monoklonaler Antikörper gegen ungefähr 2500 unterschiedliche Proteine untersucht werden (Lueking, A., Possling, A., Huber, 0., Beveridge, A., Hörn, M., Eickhoff, H., Schuchardt, J., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2003) A Nonredundant Human

Protein Chip for Antibody Screening and Serum Profiling. Mol Cell Proteomics, 2, 1342-1349) .

Allerdings besteht ein großes Bedürfnis, zwischen nicht- nativen Formen und nativen Formen von Proteinbindern zu unterscheiden und diese Unterschiede zu identifizieren, die z.B. aufgrund synthetischer / rekombinanter Herstellung oder Isolation / Aufreinigung geänderte Proteinstrukturen erzeugt werden.

Zum Beispiel weisen rekombinante Proteine (beispielsweise therapeutische Proteine) zumeist spezifische Unterschiede zu den physiologischen bzw. nativen Homologen auf, sei es beispielsweise in der Faltung, im Vorhandensein von Hilfssequenzen sog. Tags, N-bzw. C-Terminale Veränderungen, posttranslationaler Modifikationen wie z.B. Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acylierungen, Alkylierungen, Oxidationen etc. oder in der Präsentation einer Bindungsstelle, die zur Veränderungen in der Protein-Protein-Wechselwirkung (zu bindendes Protein an einen Proteinbinder) führen.

Daher betrifft die Erfindung die Aufgabe ein differentielles Screenen von Proteinbindern zur Unterscheidung der nativen Form von einer nicht-nativen Form zu ermöglichen, und dabei geeignete native und nicht-native Formen zu selektionieren.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine Anordnung von Proteinbindern enthaltend mindestens einen Proteinbinder

präsentiert in mindestens einer nativen Form und mindestens einer nicht-nativen Form bereitgestellt wird, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist, samt Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges.

Der Bindungserfolg erlaubt eine Aussage über die Eignung oder Differenzierung der nicht-nativen Form im Vergleich zur nativen Form eines Proteinbinders.

Besonders vorteilhaft ist die Erfindung zur Qualitätskontrolle und -überwachung von (nicht-nativen) Proteinen einzusetzen, die beispielsweise einem beliebigen nicht natürlichen (Auf) Reinigungsprozess oder Herstellungsmethode (wie einem rekombinanten Verfahren) unterliegen und dessen Homogenität, Bioäquivalenz, Chargen-Gleichheit, Aktivität und Funktion im Vergleich zur nativen Form des Proteins bestimmt werden soll.

Daher ist eine solche erfindungsgemäße Anordnung zum differentiellen Screenen oder Auswahl und Selektion mindestens einer nativen bzw. nicht-nativen Form geeignet.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Erkennungssignal ein Epitop und / oder Paratop.

Im Rahmen dieser Erfindung ist die native Form eines Proteinbinders eine solche, die dem Proteinbinder seiner Funktion entspricht (z.B. Immunglobuline, therapeutische Proteine, Strukturproteine, Membranproteine, u.v.a.). Hierbei ist die ursprüngliche Funktion durch die Proteinstruktur in ihrer Sequenz, Konformation oder Konfiguration (Primär-, Sekundär-, Tertiär-, Quartärstruktur) gewährleistet. Der Proteinbinder verfügt beispielsweise über ein Epitop (Paratop) , welches in seiner nativen Form sicher von einem Antikörper oder einem in Bindungsaffinität und Selektivität ähnlichem Molekül (Antigen) erkannt werden kann. Insbesondere ist die native Form eine solche, wie sie aus einem lebenden Organismus (in vivo) erhalten werden kann oder bekannt ist.

Darüber hinaus kann die native Form eine angenommene standardisierte Form eines Proteins sein, beispielsweise für eine bestimmte Funktion. Eine solche Funktion ist nicht abschließend eine diagnostische oder physiologische Funktion eines Proteins.

Im Rahmen dieser Erfindung ist die nicht-native Form eines Proteinbinders eine solche, wobei im Vergleich zum nativen Proteinbinders die Funktion geändert, gar beeinträchtigt oder modifiziert sein kann. Hierbei ist die ursprüngliche Funktion durch die geänderte oder modifizierte Proteinstruktur in ihrer Sequenz, Konformation oder Konfiguration oder Modifikation nicht gewährleistet. Beispielsweise verfügt der Proteinbinder über ein verändertes Epitop (Paratop) , welches in seiner nicht-nativen Form nicht von einem Antikörper oder einem in Bindungsaffinität und Selektivität ähnlichem Molekül (Antigen) im Vergleich zur nativen Form erkannt werden kann.

Eine nicht-native Form eines Proteinbinders ist insbesondere eine solche, wobei der Proteinbinder synthetisch oder rekombinant hergestellt worden ist oder der native Proteinbinder physykalisch oder chemisch denaturiert wurde, und Unterschiede insbesondere in der Konformation und Konfiguration gegenüber der nativen Form aufweist. Insbesondere ist die Faltung des Proteinbinders in seiner nicht-nativen Form im Vergleich zur nativen Form maßgebend.

Insbesondere bei änderung der Konformation und Konfiguration eines Proteinbinders, nämlich in nicht-nativer Form, kann das Erkennungssignal (z.B. Epitop, Paratop) für ein zu bindendes Protein gestört/verändert oder ganz aufgehoben sein, so dass die Adressierung des zu bindenden Proteins fehlgeleitet ist.

Daher ist in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die nicht-native Form die denaturierte Form eines Proteins. Erfindungsgemäß wird diese denaturierte Form eines Proteins im Vergleich zu der nicht-denaturierten Form (oder: native Form) gesetzt. Zur Herstellung denaturierter Formen bedarf es

beispielsweise Denaturierungsmittel (Harnstoff, Säuren, Basen, SDS, Guanidin Hydrochlorid, Salz u.v.a.) oder physikalische Denaturierung, z.B. hohe Temperaturen, γ-Strahlen, UV-Strahlen, Laser etc.

In einer weiteren Ausführungsform ist die native Form eine nicht-modifizierte Form und die nicht-native Form eine modifizierte Form. Die modifizierten Formen weisen gegenüber der nicht-modifizierten Strukturänderungen auf, z.B. nicht abschließend Entfernung von Phosphaten bei phosphorylierten Proteinen, Entfernung von Kohlenhydraten bei glykolisierten

Proteinen, oder Entfernung von Lip(o)iden bei lip (o) idisierten Proteine, oder Entfernung der posttranslationellen Strukturen im Protein. Ferner können, die Modifikationen darin bestehen, dass die native Form beliebig chemisch verändert wird (z.B. Phosphorylierung, Glykolisierung, Lip (o) idisierung,

Derivatisierungen) . Ferner kann die Modifikation darin bestehen, dass die native Form (nicht-modifizierte Form) mit einem weiteren Protein zu einem Fusionsprotein (modifizierte Form) ligiert wird.

In einer weiteren Ausführungsform ist die native Form (nicht- modifizierte Form) , dahingehend modifiziert, dass die native Form in Fragmente gespalten ist. Sei es z.B. durch enzymatische oder chemische oder physikalische Spaltung.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die native Form beispielsweise ein natürlich vorkommendes Target oder Marker, insbesondere ein Biomarker, die zur Diagnose oder Therapie von Krankheiten bei Mensch und Tier geeignet sind und im Vergleich zu einer denaturierten (nicht nativen) Form oder modifizierten Form vergleichend untersucht werden sollen. Solche zu vergleichende denaturierte oder modifizierte Formen können beispielsweise durch ein Aufreinigungsverfahren, Isolationsverfahren entstehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Proteinbinder ein Antigen (Epitop) oder Antikörper (Paratop) , insbesondere

monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Ferner sind solche Proteinbinder bevorzugt, die Teile eines Antikörpers enthalten, wie Fab- oder Fc- Fragmente. Darüber hinaus, sind ebenfalls Affibody ® (Affibody, Schweden) umfasst.

Der Begriff „Proteinbinder" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass ein zu bindendes Protein in Gegenwart eines Proteinbinders diesen kontaktiert oder an diesen bindet oder zumindest in Wechselwirkung tritt. Im weitesten Sinne ist das zu bindende Protein an den Proteinbinder adressiert bzw. das zu bindende Protein erkennt den Proteinbinder bzw. der Protein-Binder hat das Potential mit einem Protein in Wechselwirkung zu treten (z.B. Antigen (Epitop) / Antikörper (Paratop) Wechselwirkung) .

Proteinbinder können Proteine, Peptide, modifizierte Proteine / Peptide, rekombinante Proteine / Peptide, Antikörper oder einem in Bindungsaffinität und Selektivität ähnlichem Molekül oder Antigene sein, oder sonstige Proteine die auf einem erfindungsgemäßen Proteinbiochip repräsentiert werden können.

Geeignete zu bindende Proteine an einen Proteinbinder im Sinne dieser Erfindung können nicht abschließend sein: Proteine, Peptide, modifizierte Proteine / Peptide, rekombinante Proteine / Peptide, Antikörper oder Antigene sein, oder sonstige Proteine, Proteide.

Die zu bindende Proteine können in (auf) gereinigter Form sowie gemischt oder gar in einer heterogenen Proteinmischung, wie ein Lysat oder Aufschluss (z.B. Lysate von Mikroorganismen oder Pflanzen, Gewebelysat, Säugerzellysat) vorliegen. Dies spiegelt die Qualität des Binders in komplexen Gemischen, wie sie beispielsweise in der Immunohistochemie auftreten, wieder.

Insbesondere betrifft die Erfindung eine solche Anordnung von einem oder mehreren Proteinbindern, wobei ein erster Bereich mindestens eine native Form eines Proteinbinders aufweist und ein zweiter Bereich mindestens eine nicht-native Form eines

Proteinbinders aufweist und diese Bereiche eine Einheit bilden, wobei diese Einheit mindestens einem zu bindenden Protein, vorzugsweise zeitgleich unter standardisierten Bedingungen, zugänglich ist.

In einer weiteren Ausführungsform kann der Proteinbinder in der jeweiligen Form, nativ oder nicht-nativ, in unterschiedlichen Mengen im ersten und / oder zweiten Bereich repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Der erste und zweite Bereich kann jeweils eine Gesamtheit von Proteinbindern aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an verschiedenen Proteinbindern. Diese können ebenfalls in einer nicht-nativen oder nativen Form vorliegen. Bevorzugt sind mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen Proteinbindern. Bevorzugt jedoch mehr als 2.500, besonders bevorzugt 10.000 oder mehr Proteinbinder, die beispielsweise aus einer Expressionsbibliothek resultieren.

Daher betrifft die Erfindung eine solche Anordnung von Proteinbindern ebenfalls ein diagnostische Vorrichtung oder einen Protein-Biochip bzw. Protein-Microarray. Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von zu bindenden Proteinen an Proteinbindern verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung repräsentierten Protein-Binder in Form eines Gitters vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density) Anordnung von Proteinbindern erlauben. Solche hochdichte Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart.

Die Proteinbinder können in der Anordnung auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert sein.

In einer weiteren Ausführungsform liegen die Proteinbinder als Clone vor. Solche Clone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden

(Büssow et al . 1998 (supra) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer exprimierenden cDNA Bibliothek erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare

Promotoren. Die Induktion der Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie z.B. IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60 (5) : 523-33) .

Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989) , CSH press, CoId Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden.

Weiterhin bevorzugt sind Protein-Biochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (sogenannte: Uniclone®-Bibliothek) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen eine hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.

Im Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.

Die Clone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert.

Zusätzlich können die Proteinbinder in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches beispielsweise mindestens ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT- tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S-transferase oder lacZ enthalten.

In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches Kügelchen, ein Silizium-Wafer, Glas, Metall, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix.

Als Filter ist PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Hybond N+ Amersham) .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium-Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.

Nachdem das zu bindende Protein einen Proteinbinder kontaktiert, erfolgt die Auswertung, die beispielsweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgt.

Die Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an Proteinbinder, wie Antigen/Antikörper) oder „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels

Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung oder Radio-Isotopen- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners .

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum differentiellen Screenen von geeigneten Proteinbindern in nicht-nativer Form, wobei der Nachweis eines Bindungserfolges eines Proteins an einen Proteinbinder in nicht-nativer Form hinreichend ist. Entsprechende Proteinbinder in nicht-nativer Form werden selektioniert .

Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zum differentiellen Screenen oder Diskriminierung von Proteinbindern, die mindestens eine native Form und mindestens eine nicht-nativen Form aufweisen bzw. erkennen, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist, mit

Inkontaktbringen der nativen Form und nicht-nativen Form mit mindestens einem bindenden Protein und Nachweis des Bindungserfolges. Ein Bindungserfolg liegt vor mit positivem Nachweis des bindenden Proteins an ein Erkennungssignal des Proteinbinders. Insbesondere dann, falls sowohl die native Form und die nicht-native Form des Proteinbinders von dem zu bindenden Protein einen Bindungserfolg aufweist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft eine Diskriminierung von solchen Proteinbindern mit einem Epitop, Paratop, wobei eine vergleichende Untersuchung der nativen Form mit der nicht nativen Form erfolgt. Hierbei ist es wesentlich, ob die jeweilige Sequenz von einem Epitop, Paratop für das zu bindende Protein relevant ist oder ob Nicht-Epitop, Nicht-Paratop Sequenzen der nicht-nativen Form relevant sind.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Proteinbindern, die mindestens eine native Form und mindestens eine nicht-native Form präsentieren, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist, mit Inkontaktbringen der nativen Form und nicht- nativen Form mit mindestens einem bindenden Protein und Nachweis des Bindungserfolges. Ein Bindungserfolg liegt vor

mit positivem Nachweis des bindenden Proteins an ein Erkennungssignal des Proteinbinders. Insbesondere dann, falls sowohl die native Form und die nicht-native Form des Proteinbinders von dem zu bindenden Protein einen Bindungserfolg aufweist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der oben beschriebenen Ausführungsformen, insbesondere Anordnungen, durchgeführt, insbesondere ist die native Form eine nicht- modifizierte oder nicht-denaturierte Form und die zu vergleichende nicht-native Form eine denaturierte oder modifizierte Form.

Die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben solche nicht-native Formen, die einen Bindungserfolg aufweisen, sicher zu selektionieren.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verfahren zum Screenen geeigneter Epitope/Paratope eingesetzt.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung zum differentiellen Screenen geeigneter Proteinbinder zur Unterscheidung der nicht-nativen Form von der nativen Form.

Das differentielle Screenen erlaubt insbesondere die Selektion oder Diskriminierung solcher Proteinbinder in nicht-nativer Form, die daher eine oder keine homologe Funktion hinsichtlich Protein-Protein-Wechselwirkungen aufweisen . Beispiel und Figuren:

Dieses Beispiel dient ausschließlich zur Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf dieses Beispiel zu begrenzen.

In Figur 1 ist das differentielle Screenen des Proteinbinders Galectin 10 in nativer Form (nicht-denaturiert) und nicht- nativer Form (denaturiert (Denaturierungsmittel: Harnstoff)),

mit verschiedenen zu bindenden Antikörper dargestellt. Anhand der Bindungskurven (Signalintensitäten vs .

Konzentrationen/Spot) , kann der Bindungserfolg vergleichend festgestellt werden.

Beispielsweise erkennt Diaclone 503.18Hl die native Form des Galectin 10 im Vergleich zu den anderen Antikörpern schlechter, und die denaturierte Form des Galectin 10 besser.

Der Antikörper MOR Aby491.3 erkennt die native Form des Galectin 10 am besten, jedoch dafür die denaturierte Form des Galectin 10 deutlich schlechter als die anderen Antikörper.