蛋白质复合物及其谱以及其在疾病诊断、 进展评估和药效评估中的应用 技术领域

本发明涉及蛋白质复合物及其谱以及其在慢性 疾病诊断、 进展评估和药效评 估中的应用。 具体而言， 本发明涉及人血清 /血浆蛋白质复合物及其分离谱， 及其 在炎症和 /或免疫相关慢性疾病筛查和 /或预后评估， 以及药物疗效评估中的用途， 以及利用所述蛋白质复合物谱诊断和 /或预后评估人免疫和 /或炎症相关慢性疾病 如癌症的检测方法。 背景技术

目前使用的疾病标志物主要是疾病 (如癌症)相关细胞分泌或脱落到体液或组 织中的物质， 或是宿主对体内新生物质发生反应从而产生并 进入到体液或组织中 的物质。 临床上常用的癌症标志物， 如前列腺特异性抗原 PSA (可辅助诊断前列 腺癌)； 甲胎蛋白 AFP (可辅助诊断急慢性肝炎、 原发性肝癌等）； 癌胚抗原 CEA (在结肠癌、 胰腺癌、 胃癌、 肺癌和乳腺癌中有高表达)； 糖蛋白抗原 CA125 (可 辅助诊断卵巢癌）； CA19-9 (在胰腺癌、 结肠癌、 肝癌、 胃癌、 胆囊癌、 肺癌和乳 腺癌等中有高表达）； 鳞状细胞相关抗原 SCC (可辅助诊断鳞状上皮癌)； 细胞角 蛋白 19 (与 CEA联合应用可辅助诊断肺癌）等都是单一蛋白 ， 其检测方法是利用 免疫学方法检测，其操作复杂、费用较高、敏 感性或特异性不高（Sturgeon, C. M. et al. Serum tumour markers: how to order and interpret them. BMJ. 2009, 339: 852-858. Hartwell, L. et al. Cancer biomarkers: a systems approach. Nat Biotechnol. 2006, 24(8): 905-908.)。通过测定标志物的存在或含量可辅助 诊断癌症、分析病程、指导治疗、 监测复发或转移和判断预后等。 癌症标志物应具有下列特点： 敏感性高、 特异性 好、 有器官特异性、 血清中浓度与瘤体大小和临床分期相关、 能反映癌症的动态 变化、 测定方法准确性高。 但至今为止， 还没有发现符合这些标准的癌症标志物。

蛋白质复合物是由两个或两个以上多肽链以非 共价键相互作用而形成。 在 生命活动过程中， 蛋白质多是通过分子间相互作用而发挥功能， 这种相互作用存 在于物质代谢、 转移、 信息传递等过程中， 不同的蛋白质复合物具有不同的生物 学功能 ( Babusiak, M.， et al. Native proteomic analysis of protein complexes in murine intestinal brush border membranes. Proteomics. 2007, 7 (1): 121-129. )。血液中蛋白质 复合物在调节凝血过程、 疾病发生过程中发挥着重要的生物学功能， 例如甲胎蛋 白 -IgM的复合物在原发性肝细胞癌患者血清中含� �升高， 利用免疫学方法检测此 复合物可诊断原发性肝细胞癌，其灵敏性和特 异性优于单独使用甲胎蛋白（Jingting, J., et al. Clinical evaluation of serum alpha- fetoprotein-IgM immune complexes on the diagnosis of primary hepatocellular carcinoma. J Clin Lab Anal. 2009, 23(4): 213-218.) 的检测结果。 目前， 检测血清或血浆中蛋白质复合物的方法主要是 免疫学方法， 此方法的缺点是只能用于测定已知的蛋白质复 合物。 理想的疾病标志物应该能应 用于简单、 非侵入性的方法， 利用它或它们可以预测恶性疾病的风险， 实现恶性 疾病的早期发现及病程的监测等； 其次是将标志物的变化与临床现象结合一起， 为疾病个体化治疗和药物研发提供新的思路。

因此， 如果能发现新的可用于诊断恶性疾病， 特别是癌症的蛋白质复合物及 利用所述蛋白质复合物简便地诊断和 /或辅助诊断或预后评估恶性疾病， 特别是癌 症的方法将具有重要的经济、 健康和社会效益。 发明内容

本发明的技术目的在于探讨人血清或血浆蛋白 质复合物及其谱在慢性疾病诊 断和 /或预后和 /或分子分型和 /或药物疗效评估中的用途。

因此， 本发明的第一方面涉及一组蛋白质复合物， 其具有通式 I：

[(HPT) _nl (CFH) _n2 (C3) _n3 (C4A) _n4 (C5) _n5 (C7) _n6 (IgGl) _n7 (ApoA-I) _n8 (IgAl) _n9 ]， 其中， HPT代表触珠蛋白， ApoA-I代表载脂蛋白 A-I， CFH代表补体 H， C3 代表补体 3， C4A代表补体 4A， C5代表补体 5， C7代表补体 7， IgGl代表免疫 球蛋白 Gl， IgAl代表免疫球蛋白 A1 ;

其中， nl=l、 2、 3、 4或 5， n2=0或 1， n3=0或 1， n4=0或 1， n5=0或 1， n6=0 或 1， n7=0、 1、 2、 3、 4或 5， n8=0或 1， n9=0或 1 ;

且其中该蛋白质复合物的分子量范围为 140〜1400 kDa。

优选地， 所述蛋白质复合物具有选自下述通式 Π 至通式 VII的通式， 其中： 通式 II：

[(HPT) _nl (CFH) _n2 (C3) _n3 (C4A) _n4 (IgGl) _n7 (IgAl) _n9 ]，其中 nl=l、2或 3，n2=l，n3=l， n4=l , n7=l , n9=l ;

通式 III:

[(HPT) _nl (C3) _n3 (C4A) _n4 (IgGl) _n7 (ApoA-I) _n8 (IgAl) _n9 ]， 其中 nl=l、 2或 3， n3=l , n4=l , n7=l , n8=l , n9=l ;

通式 IV:

[(HPT) _nl (C3) _n3 (C4A) _n4 (IgGl) _n7 (IgAl) _n9 ]，其中 nl=l、 2或 3， n3=l， n4=l， n7=l , n9=l ;

通式 V:

[(HPT) _nl (C3) _n3 (C4A) _n4 (C5) _n5 (C7) _n6 (IgGl) _n7 (IgAl) _n9 ]， 其中 nl=l、 2或 3， n3=l , n4=l , n5 =1 , n6=l , n7=l , n9=l ;

通式 VI:

[(HPT) _nl (C3) _n3 (ApoA-I) _n8 (IgAl) _n9 ]， 其中 nl=l、 2或 3， n3=l , n8=l , n9=l或 通式 νπ: [(HPT) _nl (CFH) _n2 (C3) _n3 (IgGl) _n7 (IgAl) _n9 ]，其中 nl=l、 2、 3、 4或 5， n2=l , n3=l , n7=l 2、 3、 4或 5， n9=l。

优选地， 上述蛋白质复合物用于制备诊断和 /或预后评估人癌症的试剂， 优选 地， 所述癌症选自肺癌、 结直肠癌、 胰腺癌、 胃癌或甲状腺癌。

本发明的第二方面涉及如上所述的蛋白质复合 物在制备诊断和 /或预后评估人 癌症的试剂中的用途， 优选地， 所述癌症选自肺癌、 结直肠癌、 胰腺癌、 胃癌或 甲状腺癌。 本发明的第三方面涉及一组人血清或血浆蛋白 质复合物， 所述蛋白质复合物 组成成分包括补体系统蛋白质、 免疫球蛋白、 急性期反应蛋白和载脂蛋白， 所述 蛋白质复合物的分子质量范围为 140〜1400 kDa， 所述蛋白质复合物的表达式由下 述表达式组成： [(HPT) (CFH) (C3) (IgGl) (IgAl)]、 [(HPT) (CFH) (C3) (C4A) (IgGl) (IgAl)]、 [(HPT) (C3) (C4A) (C5) (C7) (IgGl) (IgAl)]、 [(HPT) (C3) (C4A) (IgGl) (IgAl)]、 [(HPT) (C3) (C4A) (IgGl) (ApoA-I) (IgAl)]、 [(HPT) (C3) (ApoA-I) (IgAl)] 或 [(TF) (ApoA-I)]， 其中上述表达式与本发明说明书图 2中的蛋白质复合物条带序 号和类型的对应关系如本发明说明书表 3所示， 其中， ApoA-I代表载脂蛋白 A-I， C3代表补体 3， C4A代表补体 4A， C5代表补体 5， C7代表补体 7， CFH代表补 体 H， HPT代表触珠蛋白， IgGl代表免疫球蛋白 Gl， IgAl代表免疫球蛋白 Al， TF代表转铁蛋白。

本发明的第四方面涉及一组如本发明说明书图 1 所述的人血清蛋白质复合物 的非变性聚丙烯酰胺凝胶分离谱， 其中 a、 b、 c、 d、 e、 f和 g代表了不同人血清 中的蛋白质复合物的主要类型， 其中主要蛋白质复合物分布类型为 a、 b、 （！和^ 本发明的第五方面涉及一组如本发明说明书图 2所示的人血清蛋白质复合物 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳谱， 其中蛋白质复合物条带序号与对应的蛋白质复 合物类型及蛋白质复合物表达式的关系如本发 明说明书表 3 所示， 其中蛋白质复 合物条带序号 1~18中的主要组成成分为免疫和 /或炎症和 /或补体系统相关蛋白质， 称其为免疫炎症相关蛋白质复合物， 縮写为 IIRPC。免疫相关蛋白质与免疫系统的 变化密切相关； 炎症相关蛋白质与炎症的发生密切相关。 因此这些蛋白质复合物 量的变化可用于与免疫和 /或炎症相关慢性疾病的诊断、 预后评估及疾病进程的检 测等。 所述蛋白质复合物条带序号 19是由转铁蛋白和载脂蛋白 A-I组成， 称为转 铁蛋白质相关蛋白质复合物，縮写 TRPC,其含量、存在形式与个体的性别、年龄、 健康状况和 IIRPC的类型无关， 它可作为本发明中所述的 IIRPC定量分析的内参 昭。

优选地， 如本发明第三方面所述的人血清或血浆蛋白质 复合物用于制备个体 化诊断和 /或个体化预后评估和 /或个体化监测和 /或分子分型人免疫和 /或炎症相关 慢性疾病和 /或药物疗效评估的试剂， 优选地， 所述免疫和 /或炎症相关慢性疾病选 自肺癌、 肺部良性疾病、 结直肠癌、 结直肠良性疾病、 胰腺癌、 胰腺良性疾病、 胃癌、 胃部良性疾病、 甲状腺癌、 甲状腺良性疾病、 2型糖尿病或高血压。

本发明的第六方面涉及如上述第三方面所述的 人血清或血浆蛋白质复合物在 制备个体化诊断和 /或个体化预后评估和 /或个体化监测和 /或分子分型人免疫和 /或 炎症相关慢性疾病和 /或药物药效评估的试剂中的用途， 优选地， 所述免疫和 /或炎 症相关慢性疾病选自肺癌、 肺部良性疾病、 结直肠癌、 结直肠良性疾病、 胰腺癌、 胰腺良性疾病、 胃癌、 胃部良性疾病、 甲状腺癌、 甲状腺良性疾病、 2型糖尿病或 高血压。

本发明的第七方面涉及一种诊断和 /或预后评估人癌症的方法， 其包括以下步 骤：

A)获取患者或健康状况未知的人血液，经离心� ��得到血清或血浆，作为样本;

B ) 分别取 0.5〜10(^L 样本和等体积的 0.5〜100 μL 外参照血清， 进行 native-PAGE电泳， 所述外参照血清为混合的健康人血清， 其中 native-PAGE电泳 的条件按本领域的常规条件进行， 分离胶的浓度为 4%-10 %质量体积比；

C) 电泳完毕后， 用本领域已知的凝胶染色方法将凝胶染色， 然后扫描凝胶， 获得凝胶电泳图， 优选地， 所述凝胶染色方法为银染或考马斯亮蓝染色；

D)根据上述步骤 C ) 电泳图中的凝胶条带， 对照本发明说明书图 1中的条带 类型， 将样本血清归类， 其中标记凝胶条带时按条带分子量从大到小的 顺序从 1 开始进行；

E ) 利用 Quantity One软件分析上述步骤 C ) 凝胶电泳图中样本和对照的目标 条带， 以代表转铁蛋白质相关复合物的第 19个凝胶条带为内参照， 将其含量归一 化， 利用软件， 输出归一化后每个凝胶条带的光密度值， 记为 NQ _n ， 其中 n为凝 胶条带的标记；

F) 利用下面的公式依次计算样本中每个凝胶条带 的相对表达量， 记为 ratio, ratio _n =[NQ _n ] / [NQ _n ] 其中 n为凝胶条带的标记；

G)根据上述步骤 D) 中样本血清的类型， 利用本发明说明书实施例 4中的综 合检测得分的方程计算分值， 然后与本发明说明书表 13中的癌症的阈值比较， 判 断样本是否为癌症或其它慢性疾病， 优选地， 所述癌症选自肺癌、 结直肠癌、 胰 腺癌、 胃癌或甲状腺癌。 本发明的第八方面涉及一种诊断和 /或预后评估人免疫和 /或炎症相关慢性疾 病 （如癌症） 患者血清或血浆中 IIRPC和 TRPC的检测技术方法， 包括下述步骤：

A) 获取人血液， 经离心后得到血清或血浆， 作为样本；

B)分别取 0.5〜100 L样本， 进行非变性聚丙烯胺凝胶电泳， 分离胶的浓度为 4%~10%质量体积比；

C) 考马斯亮蓝或银染染色， 扫描凝胶， 获得凝胶电泳图； D)根据步骤 C)电泳图中的凝胶条带，对照本发明说明书图 1中的条带类型， 将样本归类， 标记凝胶条带时按条带分子量从大到小的顺序 从 1开始标记；

E) 利用 Quantity One软件分析步骤 C) 凝胶电泳图中样本的目标条带， 以第 19个凝胶条带为内参照， 获得每个 IIRPC的相对量；

F)根据步骤 E)中样本每个 IIRPC的量，按照本发明说明书表 7〜12中的 IIRPC 量的倍数变化值判断受试者的健康状况。 换言之， 本发明在人的血清或血浆中发 现了新的蛋白质复合物 (IIRPC)及其谱， 所述蛋白质复合物组成成分包括补体系统 蛋白质、 免疫球蛋白、 急性期反应蛋白和载脂蛋白。 所述 IIRPC 的分子质量范围 为 140〜1400 kDa， 其谱如本发明说明书表 3和图 1所示。

所述蛋白质复合物条带序号 1~18 中的主要组成成分为免疫和 /或炎症相关蛋 白质， 因此称其为免疫炎症相关蛋白质复合物（immuno inflammation-related protein complex, IIRPC )o 免疫相关蛋白质与免疫系统的变化密切相关； 炎症相关蛋白质 与炎症的发生密切相关。 因此这些蛋白质复合物量的变化可用于与免疫 和 /或炎症 相关慢性疾病的诊断、 预后评估及疾病进程的检测等。

所述 IIRPC谱可将人群分为 Ί大类， Ί类 IIRPC谱约占总人群的 99%， 其中 c 类型人群中没有所述 IIRPC，其约占总人群的 13%，如本发明说明书图 1和表 1 (续） 所示。 利用所述 IIRPC谱的类型可将人群进行分子分型、 免疫炎症相关慢性疾病 的个体化诊断、 个体化治疗和疾病进程的个体化监测。

所述蛋白质复合物条带序号 19是由转铁蛋白和载脂蛋白 A-I组成， 称为转铁 蛋白质相关蛋白质复合物 （transferrin-related protein complex, TRPC), 其含量、 存 在形式与个体的性别、 年龄、 健康状况和 IIRPC 的类型无关， 它可作为本发明中 所述的 IIRPC定量分析的内参照。

所述 IIRPC谱有所述慢性疾病选自肺癌及其良性疾病� �� 结直肠癌及其良性疾 病、 胰腺癌及其良性疾病、 胃癌及其良性疾病、 甲状腺癌及其良性疾病、 2型糖尿 病和高血压得到验证。

所述 IIRPC量的存在形式及其含量变化可以区分五种� ��症（肺癌、 结直肠癌、 胰腺癌、 胃癌、 甲状腺癌）、 2型糖尿病、 高血压等患者和健康对照； 可以区分癌 症和与其对应的良性疾病。 因此， 本发明中的 IIRPC及其谱可用于炎症和 /或免疫 相关的慢性疾病的筛查、 早期发现和早期诊断。

所述 IIRPC谱有所述癌症选自肺癌在预后评估或疾病� ��程监测和药物疗效评 估中得到验证。 因此， 利用所述 IIRPC量的变化可进行免疫和 /或炎症相关疾病的 预后评估、 进程监测和药物疗效的评估。

本发明还涉及一种诊断和 /或预后评估人癌症等免疫和 /或炎症相关慢性疾病 患者血清或血浆中 IIRPC及其谱和 TRPC的检测技术方法， 包括下述步骤：

A) 获取人血液， 经离心后得到血清或血浆， 作为样本；

B ) 分别取 0.5〜100 μΐ 样本， 进行非变性聚丙烯胺凝胶电泳 （native polyacrylamide gel electrophoresis, Native-PAGE), 分离胶的浓度为 4%~10%质量 体积比；

C) 考马斯亮蓝或银染染色， 扫描凝胶， 获得凝胶电泳图；

D)根据步骤 C)电泳图中的凝胶条带，对照本发明说明书图 1中的条带类型， 将样本归类， 标记凝胶条带时按条带分子量从大到小的顺序 从 1开始标记；

E)利用 Quantity One软件（Bio-Rad)分析步骤 C)凝胶电泳图中样本的目标 条带， 以第 19个凝胶条带为内参照， 获得每个 IIRPC的相对量；

F) 根据步骤 E) 中样本每个 IIRPC的量， 判断受试者的健康状况。 附图说明

图 1 : 显示了非变性聚丙烯酰胺凝胶分离血清中蛋白 质复合物的结果， 并给 出了蛋白质复合物主要存在的主要 7类型谱。

图 2: 显示了非变性聚丙烯酰胺凝胶上待分离和鉴定 的蛋白质复合物条带。 图 3: 显示了血清中 a类型分布的蛋白质复合物的变性聚丙烯酰胺� �胶分离结 果。

图 4: 显示了血清中 b、 e类型分布的蛋白质复合物的变性聚丙烯酰胺� �胶分 离结果。

图 5 : 显示了血清中 d类型分布的蛋白质复合物和 TRPC的变性聚丙烯酰胺凝 胶分离结果。

图 6: 显示了蛋白质复合物组成成分的鉴定条带。

图 7: 显示了标志物在所分析样本中的表达量及区分 癌症患者的能力。

图 8: 显示了非小细胞肺癌患者治疗过程中所述部分 复合物的变化趋势。 具体实施方式

本发明利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （Native-PAGE) 分离血清或血浆中的 蛋白质复合物， 结合变性的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分离 Native-PAGE中的蛋白 质复合物， 用质谱技术鉴定复合物中的蛋白质成分。 以转铁蛋白质相关蛋白质复 合物 （TRPC) 为内参照， 将其含量归一化后， 获得每个免疫炎症相关蛋白质复合 物 ( immunoinflammation-related protein complex, IIRPC ) 的相对含量。

本发明的方法可简述如下：

( 1 ) 将人血清或血浆进行 Native-PAGE分离， 然后染色， 根据蛋白质复合物 (IIRPC) 条带分布特征可将人群主要分为 7种类型 （图 1 );

(2) 本发明发现附图 2 中的转铁蛋白复合物 （TRPC) 的表达相对稳定， 与 年龄、 性别、 健康状况和条带类型等无关， 可作为 Native-PAGE中 IIRPC定量分 析的内参照； ( 3 ) 将每个人的 Native-PAGE凝胶中第 19个条带 （TRPC, 图 2) 光密度值 归一化， 分别除以每个 IIRPC凝胶条带的光密度值， 即为该蛋白质复合物的相对 表达量；

(4)通过数据处理和统计分析， 本发明根据不同的蛋白质复合物表达谱类型 及 IIRPC 的相对表达量， 筛选相应的复合物进行分析， 提供了肺癌、 结直肠癌、 胰腺癌、 胃癌、 甲状腺癌、 2型糖尿病和高血压等慢性疾病筛查、 早发现、 辅助诊 断和 /或预后评估的标志物量值的变化范围。

本发明每次所用样本血清体积少 （2 μυ， 操作方法简单、 易行， 价廉。 本发 明筛选了与肿瘤等慢性疾病相关的蛋白质复合 物标志物， 并针对肿瘤患者血清中 不同的蛋白质复合物分布类型， 选择相应的 IIRPC, 可以有效提高肿瘤等慢性疾病 诊断的敏感性、 特异性和准确性， 且可以用于病情进展监测、 预后评估和指导临 床合理用药等。

为了理解本发明， 下面以实施例进一步说明本发明。 以下实施例仅用于说明 本发明， 而不用于限定本发明的范围， 本领域技术人员公知， 在不背离本发明精 神的情况下， 可以对本发明做出许多修改， 这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明， 均为常规方法， 所使用的实验材料如无特别说 明， 均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例 1 (制备实施例）

蛋白质复合物分离方法、 蛋白质复合物谱的发现、 蛋白质复合物成份分离及 鉴定

研究对象为 5523例血清样本， 其中包括 3707例健康对照、 410例肺癌、 300 例结直肠癌、 237例胰腺癌、 212例胃癌和 207例甲状腺癌患者； 与肺癌、 结直肠 癌、 胰腺癌、 胃癌和甲状腺癌相对应的良性疾病患者分别为 60、 31、 52、 54和 53 例； 糖尿病和高血压患者各 100例。 见表 1所示。

1、血清中蛋白质复合物的 Native-PAGE分离方法

Native-PAGE组成成分及电泳条件如下：

梯度分离胶 [4%-10% (质量体积比）， 丙烯酰胺 / 甲叉双丙烯酰胺 =37.5: 1(质 量比)]成分由重液和轻液经梯度混匀器制备而� ��。 重液 [10% (质量体积比）， 丙烯 酰胺 / 甲叉双丙烯酰胺 =37.5: 1(质量比)] 成分为： TBM [90 mM三羟甲基氨基甲烷 /90 mM硼酸 /1.5 mM氯化镁]， 0.05% (体积比） 四甲基乙二胺和 0.001 g/mL过硫 酸铵； 轻液 [4% (质量体积比）， 丙烯酰胺 / 甲叉双丙烯酰胺 =37.5: 1(质量比)] 成 分为： TBM， 0.05% (体积比） 四甲基乙二胺和 0.001 g/mL过硫酸铵。

浓縮胶 [4% (质量体积比）， 丙烯酰胺 / 甲叉双丙烯酰胺 =37.5: 1(质量比)] 成 分为： 20 mM三羟甲基氨基甲烷 -盐酸 （pH 7.5)， 5 mM氯化镁， 0. 1% (体积比） 四甲基乙二胺和 0.001 g/mL过硫酸铵。 电泳缓冲液成分为： 含 25 mM三羟甲基氨基甲烷和 192 mM甘氨酸溶液。 电泳设备： 北京市六一仪器厂 DYCZ-24DN 型垂直电泳仪器， 此例中配制 Native-PAGE的玻璃板参数为 130mmx l00mmx l .5mm。

样本处理方法： 全血在 4°C 3000xg， 离心 10分钟， 用移液器吸取上清到新的 离心管中； 12000xg，离心 10分钟，将上清小体积分装于新的离心管中，� ��存于 -80 °〇冰箱中。 Native结 s良-PAGE电泳前每个样本取 2 与 8 1.25x上样缓冲液 [25 mM

直性

三羟甲基氨基甲烷 -盐肠病 υ酸 (pH 6.8)， 12.5%甘油 （体积比）， 二甲苯青痕量] 混合后加 入到每个加样孔中。 每块凝胶中均加入同一个混合的健康人血清作 为外参照。

电泳条件： 设置恒流方式， 按每块胶通过电流 10 mA， 持续分离 2小时， 之 后按每块胶通过电流 25 mA， 持续分离 3.5小时， 整个分离过程在 4°C下进行。

电泳结束后， 进行考马斯亮蓝 G-250染色， 之后用水脱色。 根据不同人血清 中的蛋白质复合物在 Native-PAGE中的位置分布不同， 可将其主要分为 7类， 约 占总人群的 99% (图 1 )。 其主要蛋白质复合物分布类型为 a、 b、 c、 d和 e， 约占 研究人群的 94%， 其中 c类型约占研究人群的 13%， f和 g约占研究人群的 6%， 其它少数类型小于研究人群的 1%， 一并将它们归为其它类。 见表 1所示。

表 1研究样本中 IIRPC的类型分布 *

结直肠癌 胰腺癌 甲状腺癌 类型 （w=3707) (w=410) (w=300) (w=237) (w=212) (w=207)

a 1228 (33) 197 (48) 127 (42) 104 (44) 85 (40) 82 (40) b 854 (23) 132 (32) 85 (28) 95 (40) 69 (33) 65 (31) c 481 (13) 46 (1 1) 58 (19) 19 (9) 18 (9) d 600 (16) 13 (3) (2) (1) (8)

e 290 (8) 6 (2) (<1) 0 (3)

其它 15 (<1) 2 (<1) (2) (2) (<1)

* 数值代表的是人数 （百分比） 。 表 1 续

胰腺 胃 甲状腺 2型

肺良性病 良性病 良性病 良性病 糖尿病 高血压 总数 类型 （„=60) (n=52) (n=54) (n=53) (n=100) (n=100) (n=5523)

2、 SDS-PAGE分离蛋白质复合物组成成分 ( 1 ) 取 a、 b、 d、 e类型血清各 5 μL按上述 1中方法进行操作；

(2) 将含目标蛋白质复合物（图 2)的凝胶条带切下，分别放入不同的 0.6 mL 离心管中， 水洗胶块 5分钟， 重复洗涤 3次；

( 3 ) 在每管中加入 0.3 mL含 0.03 g/mL二硫苏糖醇的平衡溶液 （配方： 1.5 M三羟甲基氨基甲烷 -盐酸 (pH6.8) 25 mL， 甘油 40 mL， SDS 8 g， 18.2 ΜΏ水定容 至 400 mL)， 室温反应 40分钟， 弃上清， 水洗胶块 5分钟， 重复洗涤 3次；

(4) 在每管中加入 0.3 mL含 0.12 g/mL碘乙酰胺的平衡溶液， 室温避光反 应 35分钟， 弃上清， 水洗胶块 5分钟， 重复洗涤 3次；

( 5 ) 配制 SDS-PAGE分离胶 [11% (质量体积比）， 丙烯酰胺 / 甲叉双丙烯 酰胺 =37.5: 1(质量比)]， 自然凝固后， 将上述步骤 （4) 中所得的胶块分别放在分离 胶上的不同泳道中， 覆盖浓縮胶 [4% (质量体积比）， 丙烯酰胺 / 甲叉双丙烯酰胺 =37.5: 1(质量比)]， 进行电泳分离。 电泳条件为恒压方式， 50伏， 分离 1.5小时， 之后改为恒压 100伏， 再分离 2小时；

( 6) 电泳分离结果见图 3〜5。

3、 蛋白质复合物组成成分的鉴定

( 1 )分别切下上述步骤 2 ( 5 ) 中分离得到的蛋白质凝胶条带（如图 6所示）， 并切成约为 2 mm ³ 大小的碎胶块， 分别在 0.6 mL离心管中水洗胶块 5分钟， 重复 洗涤 3次；

(2) 每个离心管中加入 0.3 mL含 25 mM碳酸氢铵 /50%乙腈 （体积比） 的溶 液， 在旋转混合仪中脱色 10〜12小时后， 离心， 弃上清， 再加入 0.3 mL上述脱 色液， 直至完全脱去胶块中的蓝色；

( 3 )将每个离心管中加入 0.3 mL乙腈， 可看到胶块体积縮小， 由无色透明变 为半透明最后变为白色。 震荡 1分钟左右， 室温静置 10分钟， 弃上清， 将胶块放 于洁净处， 自然干燥；

(4)根据胶块体积将适量 （3〜4 L)测序级胰酶（Roche公司）加入到每个 离心管中， 4°C放置 1小时后， 加入适量 （4〜6 L) 25 mM碳酸氢铵， 于 37°C水 浴中酶解 12〜16小时；

( 5 ) 分别从不同离心管中取 Ι μί酶解液分别点在不同靶点上， 自然干燥后， 再添加 1 μί α-氰基 -4-羟基肉桂酸基质 （1 mg/mL)， 自然干燥；

( 6) 使用布鲁克 (Bruker)公司生产的质谱仪 (Apex ultra MALDI-FTICR MS)进 行质谱鉴定， 激光波长 355 nm。质谱参数设置： 正离子模式， 采集范围 800〜4000 m/z (质量电荷比）；

( 7 ) 将所得肽质量指纹图谱在 SwissProt 数据库搜索匹配蛋白质， 结合 SDS-PAGE上提示的蛋白质分子量信息， 共鉴定了 16个蛋白质成分， 分别属于 10 种不同的蛋白质， 即补体 C3、 补体 H、 补体 C4A、 补体 C5、 补体 C7、 免疫球蛋 白质 Al、 免疫球蛋白质 Gl、 触珠蛋白质、 载脂蛋白质 A-I和血清转铁蛋白质。 条 带 2、 3和 6分别为补体 C3的 α和 β链； 条带 4、 5和 10分别为 C4A的 α、 β和 γ链； 条带 8和 11分别为免疫球蛋白 （Ig) G1的重链和轻链； 条带 9和 12分别是触珠 蛋白的 β和 oc2链； 条带 13为补体 C5的 α链。 具体鉴定结果见表 2。 2 蛋白质复合物组成成分的鉴定结果 序号 蛋白质名称 理论标准 理论 序列 得分 * 分子量 等电点 覆盖率 *

1 补体 H (Complement factor H) 143680 6.21 50.00% 147

2 补体 C3 (Complement C3)-a 112956 6.02 62.00% 179

3 补体 C3 (Complement C3)-a 112956 6.02 53.40% 80

4 补体 C4A (Complement C4-A)-a 84131 6.65 49.70% 93

5 补体 C4A (Complement 04-Α)-β 71634 6.65 49.10% 87

6 补体 C3 (Complement C3)- 71272 6.02 52.30% 107

7 免疫球蛋白 Al(Ig alpha- 1 chain C region) 38486 6.08 41.00% 88 免疫球蛋白 Gl(Ig gamma- 1 chain C

8 region) 36596 8.46 44.00% 91

9 触珠蛋白 (Haptoglobin)-p 27248 6.13 79.50% 99

10 补体 C4A (Complement C4-A)-y 33052 6.65 22.70% 23

11 免疫球蛋白 Gl(Ig kappa chain C region) 11773 5.58 86.00% 82

12 触珠蛋白 (Haptoglobin) -α2 15837 6.13 31.40% 26

13 补体 C5 (Complement C5)-a 112429 6.11 36.50% 91

14 补体 C7 (Complement C7) 96650 6.09 37.00% 111

15 载脂蛋白（Apolipoprotein) A-I 30759 5.56 63.00% 139

16 血清转铁蛋白（Serotransferrin) 79280 6.81 57.00% 150 序号对应为图 6中标注 条带的蛋白质鉴定结果。 表中均为鉴定蛋白质条带与对应的多肽链的比 较。

( 8 )确定附图 2中各蛋白质复合物的组成成分。 根据表 2鉴定结果和各蛋白 质复合物的 SDS-PAGE分离结果， 见图 3〜5。 蛋白质复合物组成成分见表 3。 所 述蛋白质复合物 1~18中的主要组成成分为免疫和 /或炎症相关蛋白质，因此称其为 免疫炎症相关蛋白质复合物 ( immunoinflammation-related protein complex, IIRPC )。0 免疫相关蛋白质和补体系统相关蛋白质与免疫 系统的变化密切相关； 炎症相关蛋 白质与炎症的发生密切相关。 因此这些 IIRPC量的变化可用于与免疫和 /或炎症相 关慢性疾病的诊断、 预后评估及疾病进程的检测等。 表 3 蛋白质复合物的条带序号、 类型、 组成成分及其表达式

蛋白质复合物条带序号 蛋白质复合物类型 表达式

1 a9， d7

2 a8， d6 [(HPT) (CFH) (C3) (IgGl)

3 a7， d5 (IgAl)]

4 a6， d4

5 al， bl， dl [(HPT) (CFH) (C3) (C4A)

6 el (IgGl) (IgAl)]

7 b2 8 a2

9 b3， d2

10 e2

11 a3

[(HPT) (C3) (C4A) (C5) (C7)

12 b4

(IgGl) (IgAl)l

[(HPT) (C3) (C4A) (IgGl)

13 d3

(IgAl)]

14 a4

[(HPT) (C3)(C4A)(IgGl)

15 e3

(ApoA-I)(IgAl)]

16 b5

17 a5

[(HPT) (C3)(ApoA-I)(IgAl)] 18 b6

19 TRPC [(TF) (ApoA-I)]

蛋白质复合物条带序号和类型分别对应于图 2中蛋白质复合物序号和类型。 其它 IIRPC分布类型中蛋白质复合物的组成与 a、b、d、e位置相对应条带 IIRPC 的组成成分相同。 实施例 2 (应用实施例 1)

蛋白质复合物的内参照确认。

1、 制备实施例中的 1820例血清样本用于内参照 （TRPC) 的含量变化分析， 见表 4所示。

表 4用于 TRPC含量分析的研究人群的统计学特征†

肺癌 结直肠癌 胰腺癌 胃癌 甲状腺癌 健康对照 特征 (n=388) (n=298) (n=213) (n=210) (n=201) (n=510) 男性 /女性 235/153 161/137 105/108 159/51 60/141 272/238 年龄 * 62 (54到 69) 62 (53到 71) 58 (47到 67) 63 (56到 72) 46(34到 54) 53 (43到 63) 年龄组 （岁）

<49 52(13) 51 (17) 63 (30) 33(16) 129 (64) 210(41)

50-59 115 (30) 80 (27) 54 (25) 58 (28) 45 (22) 123 (24)

60-69 133 (34) 84 (28) 63 (30) 49 (23) 19(10) 119(23)

>70 88 (23) 83 (28) 33(15) 70 (33) 8(4) 58(11) 类型

a 190 (49) 125 (42) 93 (44) 85 (41) 80 (40) 180 (35) b 125 (32) 85 (28) 86 (40) 68 (32) 62 (31) 116(23) c 42(11) 58 (20) 26(12) 19(9) 18(9) 68(13) d 12(3) 7(2) 2(1) 15(7) 19(10) 68(13) e 6(2) 1 (<1) 0 7(3) 0 30 (6) f 3(1) 6(2) 2(1) 5(2) 13(6) 12(2) g 9(2) 10(3) 0 10(5) 9(4) 36 (7) 其它 1 (<1) 6(2) 4(2) 1 (<1) 0 0

† 除注明外， 数值代表的是人数 （百分比） 。 * 数值代表的是中位数（四分位数间距)

2、 用 Quantity One (Bio-Rad) 软件 volume功能分析得出 TRPC的光密度值， 用样本中 TRPC的光密度值除以外参照中 TRPC的光密度值， 此比值即为样本中 TRPC的相对量。

3、 将样本编号、 性别、 年龄、 条带类型、 健康状况 (具体是肺癌、 结直肠癌、 胰腺癌、 胃癌、 甲状腺癌、 对照组)以及 TRPC的相对量用 SPSS 12.0软件进行数 据的统计分析， 正态分布的数据两组间比较采用 t检验， 正态分布且方差齐性的数 据多组间比较采用方差分析。 非正态分布数据组间比较采用 Mann-Whitney U或 Kruskal-Wallis H等非参数检验。 所有统计分析均为双侧检验。 析因设计方差分析 判断所选择的因素间对 TRPC的相对含量有无交互作用，以 Ρ<0.05为显著性检验 的标准， 将年龄按≤49岁、 50-59岁、 60-69岁和≥70岁分为 4组。 分别统计分析不 同癌症和对照组中 TRPC相对含量， 分析性别、 年龄组、 健康状况和条带类型等 对 TRPC 的影响， 并分析这些因素的交互作用 （以 "X "表示）。 结果发现肺癌、 结 直肠癌、胰腺癌、 胃癌、 甲状腺癌和对照组的 TRPC值均无显著性差异（Ρ〉0.05， 见表 5 )。 该结果表明性别、 年龄、 健康状况、 条带类型等对所有血清中 TRPC的 相对含量无显著差异， 且这些因素的交互作用对血清中的 TRPC 也没有显著差异 (P>0.05 ) o 因此 TRPC可作为 IIRPC定量分析的内参照。 表 5癌症组、 对照组中 TRPC含量变化比较结果

P值

变量 肺癌 结直肠癌 胰腺癌 胃癌 甲状腺癌 对照 健康状况卞 0.394 0.401 0.836 0.105 0.129

性别间† 0.739 0.648 0.095 0.987 0.275 0.971 年龄 § 0.974 0.333 0.723 0.085 0.353 0.240 类型 § 0.200 0.057 0.181 0.175 0.108 0.475 性别 年龄 * 0.221 0.244 0.057 0.774 0.472 0.212 性别 类型 * 0.956 0.328 0.937 0.882 0.991 0.253 年龄 类型 * 0.926 0.614 0.275 0.924 0.162 0.773 性别 年龄 类型 * 0.151 0.595 0.461 0.744 0.871 0.833

1 代表的是相互作用。

† 正态分布的数据用 Student's t检验， 偏态分布的数据用 Mann-Whitney U检验。 健康状况的尸值是由病例组 与对照组相比得出的。

§ 正态分布的数据用方差分析， 偏态分布的数据用 Kruskal-Wallis H检验。

* 交互作用的统计采用方差分析。 实施例 3 (应用实施例 2)

以 TRPC归一化后 （设为 100) 的含量为内参照， 得到 IIRPC ( 1-18, 图 2) 的相对含量， 统计分析其在癌症、 癌症对应的良性疾病、 其它慢性疾病 （2型糖尿 病和高血压） 患者和健康对照中的含量差异。

1、本步骤中所用的样本均来自于上述应用实� �例 1中所用的样本，经过筛选， 去除经过治疗的癌症样本后， 具体所用的样本例数为 1620例， 包括 378例健康对 照、 200例肺癌、 171例结直肠癌、 139例胰腺癌、 157例胃癌和 125例甲状腺癌 患者； 与癌症相对应的良性疾病患者共 250例； 糖尿病和高血压患者各 100例。 由于 d、 e、 f、 g和其它类型样本数较少， c类型几乎无目标 IIRPC条带， 所以本 发明中主要统计分析的是 a和 b类型中 IIRPC的含量， 见表 6。 表 6研究样本在不同类型中性别和年龄统计特征 *

年龄（岁） ，

类型 健康状况 男性 /女性 P值卞 P值§ 平均值 ±标准差

a 健康对照 （《=148) 84/64 60.1 ± 12.6

(n =663)

肺癌 （《=97) 54/43 0.867 62.2 ± 9.8 0.153 结直肠癌 （《=72) 41/31 0.979 62.7 ± 12.9 0.165 胰腺癌 （《=59) 32/27 0.742 58.2 ± 13.3 0.337 胃癌 （《=62) 44/22 0.054 60.6 ± 13.2 0.783 甲状腺癌 （《=44) 9/35 < 0.001 47.2 ± 14.6 < 0.001 肺良性病 （《=20) 14/7 0.260 62.1 ± 19.1 0.663 结直肠良性病 （《=6) 4/2 0.631 52.8 ± 14.3 0.170 胰腺良性病 （《=26) 15/1 1 0.929 49.7 ± 17.8 0.008 胃部良性病 （《=13) 7/6 0.839 49.9 ± 19.1 0.082 甲状腺良性病 （《=25) 3/23 < 0.001 48.8 ± 15.0 0.001

2型糖尿病 （《 =46) 24/22 0.585 55.7 ± 13.1 0.043 高血压 (n =45) 21/24 0.234 55.3 ± 18.1 0.101

B 健康对照 （" =104) 49/55 61.3 ± 1 1.5

(n =523)

肺癌 (《=66) 38/28 0.184 60.7 ± 1 1.3 0.727 结直肠癌 （《=61) 30//31 0.798 61.3 ± 12.5 0.990 胰腺癌 （《=63) 2934 0.892 61.1 ± 14.5 0.938 胃癌 （" =54) 42/12 < 0.001 69.5 ± 12.2 < 0.001 甲状腺癌 =36) 1 125 0.084 49.5 ± 13.4 < 0.001 肺良性病 （《=19) 12/7 0.198 64.4 ± 14.3 0.301 结直肠良性病 (« =17) 6/11 0.364 48.0 ± 13.7 < 0.001 胰腺良性病 （《=13) 9/4 0.133 40.8 ± 20.1 0.003 胃部良性病 （《=1 1) 6/5 0.639 50.3 ± 20.9 0.1 15 甲状腺良性病 （《=15) 7/8 0.974 39.3 ± 12.4 < 0.001

2型糖尿病 (n =27) 10/17 0.348 57.4 ± 12.9 0.132 高血压 (n =37) 21/16 0.314 62.4 ± 15.7 0.682

* 除注明外， 数值代表的是人数 （百分比）

† Pearson χ ² 检验用于性别的统计分析。

§ Student's t检验用于年龄的统计分析。

Mann-Whitney U检验表明， 目标 IIRPC的含量在病例组和健康对照组中性别 和年龄中没有显著差异。 统计分析 a和 b类型中， IIRPC的含量在健康对照、 癌症 组及相应的良性疾病组中的差异。 受试者操作特征曲线评价蛋白质复合物的诊断 效能， 计算 95%可信区间（95% confidence interval, 95%CI)内的曲线下面积（area under the curve， AUC )。

2、 IIRPC在健康对照、 肺部良性疾病和肺癌患者中的含量分析

( 1 )在 a和 b类型中， 各 IIRPC的含量在肺部良性疾病和肺癌患者中均显� �� 高于健康对照组（Ρ<0.01， 表 7)。 良性疾病患者 IIRPC的含量是健康对照 1.54〜 3.42倍； 肺癌患者 IIRPC的含量是健康对照 4.33〜18.60倍。

(2) 在 a类型中 al〜a9复合物， b类型中 b2〜b6复合物具有较高的诊断性 能， 可以较好的把肺癌与健康对照和肺部良性疾病 区分开 （ROC 曲线下面积在 0.95〜0.99之间， 表 7)。

3、 IIRPC在健康对照、 结直肠良性疾病和结直肠癌患者中的含量分析

( 1 )在 a和 b类型中， 各 IIRPC的含量在结直肠良性疾病和结直肠癌患者� �� 均高于健康对照组（表 8)。 良性疾病患者 IIRPC的含量是健康对照 1.14〜2.35倍； 结直肠癌患者 IIRPC的含量是健康对照 3.79〜18.14倍。

(2) 在 a类型中 al〜a9复合物， b类型中 b2〜b6复合物具有较高的诊断性 能， 可以较好的把结直肠癌与健康对照和结直肠良 性疾病区分开 （ROC 曲线下面 积在 0.93〜1.00之间， 表 8)。

4、 IIRPC在健康对照、 胰腺良性疾病和胰腺癌患者中的含量分析

( 1 )在 a和 b类型中， 各 IIRPC的含量在胰腺良性疾病和胰腺癌患者中均� �� 著高于健康对照组（Ρ<0.01，表 9)。良性疾病患者 IIRPC的含量是健康对照 1.72〜 3.67倍； 胰腺癌患者 IIRPC的含量是健康对照 1.58〜17.23倍。

(2) 在 a类型中 al〜a9复合物， b类型中 b2〜b6复合物具有较高的诊断性 能， 可以较好的把胰腺癌与健康对照和胰腺良性疾 病区分开 （ROC 曲线下面积在 0.92〜0.99之间， 表 9)。

5、 IIRPC在健康对照、 胃部良性疾病和胃癌患者中的含量分析

( 1 )在 a和 b类型中， 各 IIRPC的含量在胃部良性疾病和胃癌患者中均高� �� 健康对照组（表 10)。 良性疾病患者 IIRPC的含量是健康对照 1.11〜1.93倍； 胃癌 患者 IIRPC的含量是健康对照 2.26〜28.29倍。

(2) 在 a类型中 al〜a9复合物， b类型中 b2〜b6复合物具有较高的诊断性 能， 可以较好的把胃癌与健康对照和胃部良性疾病 区分开 （ROC 曲线下面积在 0.92〜0.99之间， 表 10)。

6、 IIRPC在健康对照、 甲状腺良性疾病和甲状腺癌患者中的含量分析

( 1 )在 a和 b类型中， 各 IIRPC的含量在甲状腺良性疾病和甲状腺癌患者� �� 均高于健康对照组（表 11 )。良性疾病患者 IIRPC的含量是健康对照 1.02〜1.89倍； 甲状腺癌患者 IIRPC的含量是健康对照 2.01〜3.99倍。

(2) 在 a类型中 al〜a9复合物， b类型中 b2〜b6复合物具有较高的诊断性 能， 可以较好的把甲状腺癌与健康对照和甲状腺良 性疾病区分开 （ROC 曲线下面 积在 0.74〜1.00之间， 表 11 )。

7、 IIRPC在健康对照、 2型糖尿病和高血压患者中的含量分析

( 1 )在 a和 b类型中， 各 IIRPC的含量在 2型糖尿病患者中均显著高于健康 对照组， 是健康对照含量的 1.44〜3.00倍（表 12)。 高血压患者 IIRPC的含量高于 健康对照组， 是健康对照 1.23〜3.87倍。 (2)在糖尿病患者中， a类型中 al〜a8复合物， b类型中 b2〜b6复合物具有 一定的诊断准确性， 可以区分患者和健康对照； 高血压患者中， a类型中 al〜a9 复合物， b类型中 b2、 b5和 b6复合物具有一定的诊断准确性， 可以区分患者和健 康对照 （表 12)。

表 7 IIRPC在健康对照、 肺部良性疾病和肺癌患者中的含量比较 *

健康对照 肺部良性疾病 肺癌 受试者操作特征曲线下面积 变量 含量 含量 P值 倍数变化§ 含量 P值 倍数变化§ (95% 可信区间） (P值) 类型 a

a l 4.31 (2.94-5.64) 10.10 (6.59-15.25) <0.001 2.34 25.93 (16.42-40.75) <0.001 6.02 0.97 (0.95-0.99) (<0.001) a 2 5.59 (3.63-7.44) 12.33 (10.46-18.38) <0.001 2.21 39.09 (25.24-66.17) <0.001 6.99 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) a 3 13.57 (9.70-16.50) 25.22 (19.92-31.15) <0.001 1.86 67.43 (48.49-109.08) <0.001 4.97 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) a 4 17.30 (1 1.73-22.15) 28.35 (19.87-34.02) <0.001 1.64 76.83 (52.76-107.44) <0.001 4.44 0.99 (0.99-1.00) (<0.001) a 5 1.00 (0.52-1.77) 1.98 (0.98-3.56) 0.002 1.98 18.60 (7.96-33.84) <0.001 18.60 0.97 (0.95-0.99) (<0.001) a 6 1.41 (0.77-2.16) 3.13 (2.05-4.92) <0.001 2.22 10.43 (6.38-19.65) <0.001 7.41 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) a 7 0.90 (0.58-1.42) 3.08 (1.08-3.91) <0.001 3.42 8.41 (4.52-15.5) <0.001 9.34 0.98 (0.97-0.99) (<0.001) a 8 0.69 (0.41-1.01) 1.59 (0.83-1.95) <0.001 2.33 5.86 (3.10-10.55) <0.001 8.56 0.98 (0.97-0.99) (<0.001) a 9 0.45 (0.24-0.76) 0.99 (0.49-1.68) 0.001 2.19 4.20 (2.28-8.19) <0.001 9.32 0.95 (0.93-0.98) (<0.001) 类型 b

b 1 0.76 (0.36-1.25) 1.57 (0.71-2.93) <0.001 2.07 3.30 (0.93-5.49) <0.001 4.33

b 2 2.86 (1.70-4.16) 5.94 (2.92-8.36) 0.001 2.08 18.49 (10.41-27.16) <0.001 6.47 0.97 (0.95-0.99) (<0.001) b 3 5.93 (3.39-7.64) 12.58 (6.37-18.28) <0.001 2.12 37.38 (23.19-50.64) <0.001 6.30 0.98 (0.97-1.00) (<0.001) b 4 10.93 (8.65-14.98) 17.90 (10.07-27.21) 0.009 1.64 55.67 (37.57-87.17) <0.001 5.09 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) b 5 19.66 (12.42-24.43) 30.24 (16.47-39.86) 0.002 1.54 95.71(62.71tol29.57) <0.001 4.87 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) b 6 13.85 (4.83-20.00) 24.34 (10.75-53.25) 0.001 1.76 72.37(49.19tol07.25) <0.001 5.23 0.97 (0.95-0.99) (<0.001)

* 除注明外， 数值代表的是中位数 （四分位数间距） 。

† P值由 Mann- Whitney U检验计算得出。

§ 倍数变化是把肺部良性疾病和肺癌患者中的各 IIRPC含量的中位数除以健康对照含量的中位数� ��

表 8 IIRPC 在健康对照、 结直肠良性疾病和结直肠癌患者中的含量比较 *

健康对照 结直肠良性疾病 受试者操作特征曲线下面积 变量 含量 含量 P值 倍数变化§ 含量 P值 倍数变化§ (95% 可信区间） (P值) 类型 a

a 1 4.31 (2.94-5.64) 6.34 (3.47-7.68) 0.167 1.47 25.08 (14.35-38.09) <0.001 5.82 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) a 2 5.59 (3.63-7.44) 7.66 (3.45-13.82) 0.194 1.37 37.36 (20.00-54.25) <0.001 6.68 1.00 (0.99-1.00) (<0.001) a 3 13.57 (9.70-16.50) 15.50 (8.84-25.02) 0.360 1.14 55.32 (38.62-89.04) <0.001 4.08 1.00 (0.99-1.00) (<0.001) a 4 17.30 (11.73-22.15) 20.88 (15.89-24.78) 0.211 1.21 59.97 (45.29-101.27) <0.001 3.47 0.98 (0.97-1.00) (<0.001) a 5 1.00 (0.52-1.77) 2.22 (1.62-4.19) 0.005 2.22 18.14 (3.77-35.36) <0.001 18.14 0.93 (0.89-0.96) (<0.001) a 6 1.41 (0.77-2.16) 1.91 (1.47-2.6) 0.102 1.36 9.97 (5.67-17.32) <0.001 7.09 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) a 7 0.90 (0.58-1.42) 1.27 (1.00-1.83) 0.148 1.41 7.97 (4.24-13.50) <0.001 8.85 0.99 (0.99-1.00) (<0.001) a 8 0.69 (0.41-1.01) 1.15 (0.57-1.39) 0.116 1.69 5.56 (2.65-9.58) <0.001 8.12 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) a 9 0.45 (0.24-0.76) 0.69 (0.39-1.19) 0.273 1.53 2.99 (1.48-6.40) <0.001 6.62 0.94 (0.91-0.97) (<0.001) 类型 b

b 1 0.76 (0.36-1.25) 1.41 (0.85-3.43) 0.001 1.85 3.39 (0.98-9.63) <0.001 4.46

b 2 2.86 (1.70-4.16) 4.61 (3.47-7.06) 0.001 1.61 11.68 (7.83-20.68) <0.001 4.09 0.95 (0.91-0.98) (<0.001) b 3 5.93 (3.39-7.64) 11.04 (7.43-16.66) <0.001 1.86 24.47 (17.48-44.21) <0.001 4.12 0.96 (0.94-0.99) (<0.001) b 4 10.93 (8.65-14.98) 17.61 (12.76-24) <0.001 1.61 46.62 (30.07-65.37) <0.001 4.27 0.97 (0.95-1.00) (<0.001) b 5 19.66 (12.42-24.43) 32.85 (22.30-43.89) <0.001 1.67 74.57 (54.84-104.36) <0.001 3.79 0.98 (0.96-1.00) (<0.001) b 6 13.85 (4.83-20.00) 32.49 (13.87-44.16) <0.001 2.35 72.37 (50.37-106.83) <0.001 5.23 0.96 (0.92-0.99) (<0.001)

* 除注明外， 数值代表的是中位数 （四分位数间距） 。

卞 P值由 Mann- Whitney U检验计算得出。

§ 倍数变化是把结直肠良性疾病和结直肠癌患者 中的各 IIRPC含量的中位数除以健康对照含量的中位数� ��

表 9 IIRPC在健康对照、 胰腺良性疾病和胰腺癌患者中的含量比较 *

健康对照 胰腺良性疾病 受试者操作特征曲线下面积 变量 含量 含量 值 倍数变化§ 含量 值 倍数变化§ (95% 可信区间） CP值) 类型 a

a l 4.31 (2.94-5.64) 12.70 (8.50-16.50) <0.001 2.95 18.85 (12.17-32.8) <0.001 4.38 0.92 (0.88-0.96) (<0.001) a 2 5.59 (3.63-7.44) 18.13 (11.89-23.31) <0.001 3.24 35.57 (20.41-58.88) <0.001 6.36 0.97 (0.94-0.99) (<0.001) a 3 13.57 (9.70-16.50) 32.49 (21.47-43.75) <0.001 2.39 62.94 (45.99-103.01) <0.001 4.64 0.98 (0.97-0.99) (<0.001) a 4 17.30 (11.73-22.15) 29.75 (19.71-35.76) <0.001 1.72 78.48 (48.98-111.75) <0.001 4.54 0.99 (0.98-1.00) (<0.001) a 5 1.00 (0.52-1.77) 3.67 (1.35-6.11) <0.001 3.67 17.23 (9.51-32.72) <0.001 17.23 0.97 (0.95-1.00) (<0.001) a 6 1.41 (0.77-2.16) 4.14 (3.43-6.2) <0.001 2.94 11.84 (5.78-18.87) <0.001 8.42 0.98 (0.96-0.99) (<0.001) a 7 0.90 (0.58-1.42) 2.80 (1.91-3.85) <0.001 3.11 8.60 (5.40-14.98) <0.001 9.55 0.97 (0.95-0.99) (<0.001) a 8 0.69 (0.41-1.01) 2.27 (1.27-2.91) <0.001 3.32 5.26 (3.01-8.98) <0.001 7.67 0.95 (0.91-0.99) (<0.001) a 9 0.45 (0.24-0.76) 1.35 (0.72-1.74) <0.001 2.98 4.93 (2.19-7.79) <0.001 10.93 0.94 (0.9-0.98) (<0.001) 类型 b

b 1 0.76 (0.36-1.25) 2.75 (1.78-4.01) <0.001 3.61 1.20 (0.53-3.17) 0.002 1.58

b 2 2.86 (1.70-4.16) 7.98 (5.53-12.06) <0.001 2.79 15.06 (8.89-30.05) <0.001 5.27 0.95 (0.91-0.99) (<0.001) b 3 5.93 (3.39-7.64) 14.33 (10.8-20.41) <0.001 2.41 32.19 (20.88-55.44) <0.001 5.42 0.96 (0.93-0.99) (<0.001) b 4 10.93 (8.65-14.98) 24.24 (16.45-33.12) <0.001 2.22 49.49 (31.60-81.5) <0.001 4.53 0.96 (0.92-0.99) (<0.001) b 5 19.66 (12.42-24.43) 35.40 (25.40-58.88) <0.001 1.80 109.81 (69.71-155.4) <0.001 5.58 0.99 (0.99-1.00) (<0.001)

143.79

b 6 13.85 (4.83-20.00) 30.05 (19.41-43.37) <0.001 2.17 <0.001 10.38 0.95 (0.91-1.00) (<0.001)

(76.40-216.36)

* 除注明外， 数值代表的是中位数 （四分位数间距） 。

† P值由 Mann- Whitney U检验计算得出。

§ 倍数变化是把胰腺良性疾病和胰腺癌患者中的 各 IIRPC含量的中位数除以健康对照含量的中位数� ��

表 10 IIRPC在健康对照、 胃部良性疾病和胃癌患者中的含量比较 *

受试者操作特征曲线下 健康对照 胃部良性疾病

面积 变量 含量 含量 P值卞 倍数变化§ 含量 P值卞 倍数变化§ (95% 可信区间） 值） 类型 a

a l 4.31 (2.94-5.64) 5.85 (4.96-15.27) 0.001 1.36 23.63 (11.88-34.73) <0.001 5.49 0.97 (0.94-1.00) (<0.001) a 2 5.59 (3.63-7.44) 7.02 (5.15-13.33) 0.017 1.26 33.76 (15.79-51.05) <0.001 6.04 0.98 (0.96-0.99) (<0.001) a 3 13.57 (9.70-16.50) 16.75 (11.01-28.36) 0.071 1.23 55.92 (32.35-78.69) <0.001 4.12 0.98 (0.96-1.00) (<0.001) a 4 17.30 (11.73-22.15) 20.14 (12.49-29.87) 0.093 1.16 65.4 (45.33-92.16) <0.001 3.78 0.98 (0.96-1.00) (<0.001) a 5 1.00 (0.52-1.77) 1.41 (0.81-4.29) 0.042 1.41 28.29 (9.11-40.87) <0.001 28.29 0.98 (0.95-1.00) (<0.001) a 6 1.41 (0.77-2.16) 1.56 (1.19-4.15) 0.182 1.11 10.42 (4.78-17.03) <0.001 7.40 0.98 (0.96-1.00) (<0.001) a 7 0.90 (0.58-1.42) 1.58 (0.70-3.76) 0.023 1.75 9.94 (4.9-15.14) <0.001 11.04 0.98 (0.96-1.00) (<0.001) a 8 0.69 (0.41-1.01) 1.02 (0.68-1.32) 0.05 1.50 5.78 (2.51-8.96) <0.001 8.44 0.97 (0.94-0.99) (<0.001) a 9 0.45 (0.24-0.76) 0.61 (0.53-1.34) 0.017 1.35 4.76 (2.35-8.09) <0.001 10.55 0.97 (0.94-0.99) (<0.001) 类型 b

b 1 0.76 (0.36-1.25) 1.26 (0.83-2.41) 0.006 1.66 1.72 (0.66-5.09) <0.001 2.26

b 2 2.86 (1.70-4.16) 3.82 (1.51-8.40) 0.313 1.34 13.44 (8.12-26.66) <0.001 4.70 0.97 (0.94-1.00) (<0.001) b 3 5.93 (3.39-7.64) 7.99 (5.86-14.99) 0.046 1.35 31.79 (19.33-47.87) <0.001 5.36 0.97 (0.94-1.00) (<0.001) b 4 10.93 (8.65-14.98) 14.45 (12.8-24.35) 0.01 1.32 49.85 (28.86-74.19) <0.001 4.56 0.97 (0.95-1.00) (<0.001) b 5 19.66 (12.42-24.43) 23.92 (20.78-46.29) 0.017 1.22 83.34 (52.23-110.43) <0.001 4.24 0.99 (0.97-1.00) (<0.001) b 6 13.85 (4.83-20.00) 26.69 (16.24-54.20) <0.001 1.93 103.43 (62.55-154.7) <0.001 7.47 0.98 (0.95-1.00) (<0.001)

* 除注明外， 数值代表的是中位数 （四分位数间距） 。

† P值由 Mann- Whitney U检验计算得出。

§ 倍数变化是把胃部良性疾病和胃癌患者中的各 IIRPC含 t的中位数除以健康对照含量的中位数。

表 11 IIRPC在健康对照、 甲状腺良性疾病和甲状腺癌患者中的含量比较 *

健康对照 甲状腺良性疾病 甲状腺癌 受试者操作特征曲线下面积 变量 含量 含量 尸值卞 倍数变化§ 含量 尸值卞 倍数变化§ (95% 可信区间） CP值) 类型 a

a l 4.31 (2.94-5.64) 5.91 (3.65-8.60) 0.011 1.37 10.47 (8.36-14.54) <0.001 2.43 0.93 (0.88-0.97) (<0.001) a 2 5.59 (3.63-7.44) 8.47 (4.95-13.82) 0.001 1.52 15.21 (10.37-20.21) <0.001 2.72 0.90 (0.85-0.96) (<0.001) a 3 13.57 (9.70-16.50) 15.76 (9.80-22.63) 0.075 1.16 30.51 (22.32-38.79) <0.001 2.25 0.93 (0.88-0.98) (<0.001) a 4 17.30 (11.73-22.15) 17.66 (13.53-23.80) 0.263 1.02 44.38 (34.02-55.07) <0.001 2.57 0.95 (0.92-0.99) (<0.001) a 5 1.00 (0.52-1.77) 1.13 (0.64-2.14) 0.328 1.13 2.60 (1.12-11.00) <0.001 2.60 0.74 (0.64-0.83) (<0.001) a 6 1.41 (0.77-2.16) 1.90 (0.87-2.83) 0.101 1.35 3.74 (2.43-6.35) <0.001 2.66 0.89 (0.84-0.95) (<0.001) a 7 0.90 (0.58-1.42) 1.47 (0.79-2.18) 0.008 1.63 3.15 (2.04-4.75) <0.001 3.50 0.92 (0.87-0.96) (<0.001) a 8 0.69 (0.41-1.01) 0.73 (0.42-1.47) 0.192 1.07 2.03 (1.24-3.67) <0.001 2.96 0.89 (0.84-0.95) (<0.001) a 9 0.45 (0.24-0.76) 0.67 (0.35-1.09) 0.023 1.48 2.48 (1.52-3.77) <0.001 5.49 0.95 (0.92-0.99) (<0.001) 类型 b

b 1 0.76 (0.36-1.25) 1.33 (0.60-2.29) 0.014 1.75 1.89 (1.05-3.26) <0.001 2.48

b 2 2.86 (1.70-4.16) 4.74 (2.53-6.81) 0.009 1.66 6.66 (4.89-9.04) <0.001 2.33 0.86 (0.79-0.94) (<0.001) b 3 5.93 (3.39-7.64) 11.21 (5.55-13.95) 0.002 1.89 15.56 (12.70-19.58) <0.001 2.62 0.96 (0.93-0.99) (<0.001) b 4 10.93 (8.65-14.98) 14.63 (8.25-19.07) 0.173 1.34 27.54 (20.12-30.91) <0.001 2.52 0.93 (0.88-0.98) (<0.001) b 5 19.66 (12.42-24.43) 24.74 (15.36-27.44) 0.154 1.26 39.52 (29.98-47.33) <0.001 2.01 0.93 (0.89-0.97) (<0.001) b 6 13.85 (4.83-20.00) 14.87 (6.80-19.98) 0.442 1.07 55.29 (37.82-66.77) <0.001 3.99 1.00 (0.99-1.00) (<0.001)

* 除注明外， 数值代表的是中位数 （四分位数间距） 。

† P值由 Mann- Whitney U检验计算得出。

§ 倍数变化是把甲状腺良性疾病和甲状腺癌患者 中的各 IIRPC含量的中位数除以健康对照含量的中位数� ��

IIRPC在健康对照、 2型糖尿病和高血压患者中的含量比较 *

2型糖尿病 高血压

健康对照 倍数变 曲线下面积 倍数变 曲线下面积

P值卞 P值卞

含量 化§ (95% 可信区间）（P值) 化§ (95% 可信区间） 类型 a

a 1 4.31 (2.94-5.64) 7.86 (5.14-12.68) <0.001 1.82 0.78 (0.69-0.87) (<0駕) 7.78 (4.62-11.39) <0.001 1.81 0.76 (0.67-0.84) (<0.001 a 2 5.59 (3.63-7.44) 12.03 (6.93-17.55) <0.001 2.15 0.81 (0.73-0.90) (<0.001) 10.27 (6.75-19.99) <0.001 1.84 0.81 (0.74-0.89) (<0.001 a 3 13.57 (9.70-16.50) 25.17 (16.9-33.77) <0.001 1.86 0.83 (0.75-0.91) (<0.001) 25.41 (14.48-37.25) <0.001 1.87 0.81 (0.72-0.90) (<0.001 a 4 17.30 (11.73-22.15) 31.14 (20.78-43.24) <0.001 1.80 0.84 (0.77-0.92) (<0.001) 35.94 (25.63-56.25) <0.001 2.08 0.88 (0.82-0.95) (<0.001 a 5 1.00 (0.52-1.77) 5.13 (2.91-8.54) <0.001 5.13 0.93 (0.89-0.97) (<0.001) 3.51 (2.36-6.56) <0.001 3.51 0.88 (0.82-0.94) (<0.001 a 6 1.41 (0.77-2.16) 3.35 (2-4.83) <0.001 2.38 0.84 (0.76-0.91) (<0.001) 2.86 (1.89-5.24) <0.001 2.03 0.81 (0.74-0.89) (<0.001 a 7 0.90 (0.58-1.42) 2.00 (1.25-2.82) <0.001 2.22 0.77 (0.68-0.85) (<0.001) 2.05 (0.86-3.64) <0.001 2.27 0.76 (0.68-0.85) (<0.001 a 8 0.69 (0.41-1.01) 1.51 (0.63-2.62) <0.001 2.20 0.72 (0.62-0.83) (<0.001) 1.50 (0.69-2.30) <0.001 2.19 0.77 (0.69-0.86) (<0.001 a 9 0.45 (0.24-0.76) 0.89 (0.37-1.55) <0.001 1.97 0.69 (0.59-0.79) (<0.001) 1.06 (0.65-1.73) <0.001 2.34 0.79 (0.71-0.87) (<0.001 悉开'」 h

b 1 0.76 (0.36-1.25) 1.09 (0.52-2.02) 0.022 1.44 0.93 (0.15-1.96) 0.608 1.23

b 2 2.86 (1.70-4.16) 7.38 (4.25-10.10) <0.001 2.58 0.85 (0.76-0.95) (<0.001) 4.82 (3.28-7.96) <0.001 1.69 0.74 (0.63-0.85) (<0.001 b 3 5.93 (3.39-7.64) 11.70 (6.71-16.32) <0.001 1.97 0.84 (0.74-0.94) (<0.001) 7.43 (3.48-11.72) 0.106 1.25 0.59 (0.46-0.72) (0.106) b 4 10.93 (8.65-14.98) 22.22 (17.16-34.79) <0.001 2.03 0.87 (0.77-0.97) (<0.001) 14.80 (9.10-27.36) 0.004 1.35 0.66 (0.54-0.78) (0.004) b 5 19.66 (12.42-24.43) 42.16 (31.58-63.08) <0.001 2.14 0.92 (0.84-0.99) (<0.001) 34.13 (22.43-53.57) <0.001 1.74 0.80 (0.70-0.90) (<0.001 b 6 13.85 (4.83-20.00) 41.53 (27.93-65.87) <0.001 3.00 0.89 (0.80-0.99) (<0.001) 53.59 (27.59-81.96) <0.001 3.87 0.91 (0.84-0.98) (<0.001

* 除注明外， 数值代表的是中位数 （四分位数间距） 。

† P值由 Mann- Whitney U检验计算得出。

§ 倍数变化是把 2型糖尿病和高血压患者中各 IIRPC含量的中位数除以健康对照含量的中位数� ��

8、 IIRPC在健康对照、 良性疾病、 癌症、 2型糖尿病和高血压患者中的含量 比较

由上述 2〜7中可见 IIRPC可用于区分癌症等慢性疾病和健康对照、� ��症和良 性疾病、 良性疾病和健康对照、 癌症和其它慢性疾病如 2 型糖尿病和高血压。 根 据 IIRPC的含量在不同组间的倍数变化及 ROC曲线下面积， 本发明选择复合物类 型 a中的 a2和 a7， 类型 b中的 b3和 b4标志物为例。

在类型 a中， 复合物 a2的含量在良性疾病、 2型糖尿病、 高血压和癌症患者 中分别是健康对照的 2.14、 2.15、 1.84、 5.74倍； a7在上述病例组中的含量是健康 对照的 2.18、 2.22、 2.27禾 B 8.22倍； a2和 a7能较好的把癌症患者与健康对照、 良 性疾病、 2型糖尿病和高血压患者区分开 （ROC曲线下面积分别为 0.91和 0.93 )

(图 7)。 在类型 b中， 复合物 b3的含量在良性疾病、 2型糖尿病、 高血压和癌症 患者中分别是健康对照的 1.96、 1.97、 1.25、 4.74倍； b4在上述病例组中的含量是 健康对照的 1.54、 2.03、 1.35和 4.07倍； b3和 b4能较好的把癌症患者与健康对照、 良性疾病、 2型糖尿病和高血压患者区分开 （ROC曲线下面积均为 0.92) (图 7)。

由此可见， IIRPC标志物能较好的区分疾病与健康对照， 癌症与良性疾病及其 它慢性疾病。 实施例 4 (利用实施例 3中健康对照和癌症样本采用多因素回归判别 IIRPC 的诊断能力）

1、 将图 2中第 19个条带 TRPC的光密度值归一化后， 其余的 18个凝胶条带 的光密度值与外参照对应凝胶条带的比值即作 为目标 IIRPC在凝胶中的相对含量 ( _ra tiol〜 _ra ti ₀ 18)， 将病例编号、 性别、 年龄、 条带类型、 健康状况（对照组和疾病 类型） 以及 ratiol〜ratiol8输入 excel表， 建立数据库。

2、利用 SPSS 17.0软件统计分析数据以筛选与不同疾病类型� �关的危险因素， 建立风险评估模型。 分析比较不同癌症与对健康照组之间的异同， 先对不同样本 的 18个比值（ratio)进行正态性检验， 根据数据的分布特征采用合适的统计方法， 所用统计学方法主要有 Mann- Whitney U或 Kruskal-Wallis H检验， Chi-Square检 验， Spearman rank-order相关分析禾口 Binary logistic regression等。

3、 将年龄按≤60岁和 >60岁分为两组。 Mann- Whitney U检验表明， IIRPC分 布类型 a中， 肺癌 （LC)、 结直肠癌 （CC)、 胰腺癌 （PC)、 胃癌 （SC) 和甲状腺 癌 （TC) 患者血清中 IIRPC 1-5、 8、 10、 11、 14、 17的相对表达量显著高于对照 组 （Ρ<0.001 )。 IIRPC分布类型 b中， LC、 CC、 PC、 SC和 TC患者血清中 IIRPC 5、 7、 9、 12、 14、 16、 18 的相对表达量显著高于对照组 （Ρ<0.01 )。 不同肿瘤与 对照组相比进行单因素逻辑回归分析， 再进行多因素逻辑回归分析筛选与不同肿 瘤患者对应的风险因素。

4、 多因素逻辑回归分析： 根据不同肿瘤的 IIRPC分布类型（type), 将经过上 述步骤 2和 3初步筛选后的差异凝胶条带相对含量进行回� �分析， 进一步筛选风 险因素， 建立不同肿瘤与对照组相比的回归模型。 下面各方程均已考虑性别和年 龄的影响。

肺癌 （LC) 中各指标综合检测得分的方程为：

Score (LC, type=a) = 1/ {1+exp [-(-8.112+1.442 X ratio2+l .092 X ratio8)]} Score (LC, type=b) = 1/ {1+exp [-(-4.603+0.044 X ratio9+0.044 X ratiol2+0.024 X ratio 18)]}，

结直肠癌 （CC) 中各指标综合检测得分的方程为：

Score (CC, type=a) = 1/ bo {1+exp [- (-6.994+1.656 X ratio2+0.495 X ratio3) ]} Score (CC, type=b) = 1/ {1+exp [-(-4.792+0.069 X ratio9+0.027 X ratiol 8)]} , 胰腺癌 （PC) 中各指标综合检测得分的方程为：

Score (PC, type=a) = 1/ {1+exp [-(-9.291+2.347 X ratio2+0.760 X ratio8)] } Score (PC, type=b) = 1/ {1+exp [-(-4.313+0.065 Xratio9+0.036 X ratio 18)]} , 胃癌 （SC) 中各指标综合检测得分的方程为：

Score (SC, type= a) = l/{ 1+exp [-(-12.700+3.432 Xratio2 +0.526 X ratio 17)]} Score (SC, type= b) = 1/ {1+exp [-(-2.632+0.044 X ratio9+0.034 X ratiol 8-1.934 X gender 2)]} ,

甲状腺癌 （TC) 中各指标综合检测得分的方程为：

Score (TC, type= a) = 1/ {1+exp [-(-7.040+1.559 X ratio2+0.846 X ratio8)]} Score (TC, type= b) = l/{ 1+exp [-(-3.847+0.056 Xratio9+0.032 Xratiol8)]} _; 具体每个模型均有意义 （Ρ>0.05， Hosmer and Lemeshow检验）， 各参数均有 意义 （ <0.01 )。

5、 利用 SPSS软件绘制单个 IIRPC及综合使用各 IIRPC相对含量的受试者操 作曲线（ROC)。根据 4中的方程， 绘制 ROC曲线， 计算 ROC曲线下面积（AUC) 及 95%可信区间 （95%CI)、 检查的阈值（cut-off值）、 敏感性 (； sensitivity)和特异性 (specificity)等。 分析结果表明肺癌、 结直肠癌、 胰腺癌、 胃癌、 甲状腺癌分别与健 康对照组相比， 敏感性及特异性均大于 80.00%。 将各相关的目标 IIRPC的相对含 量联合检测时诊断的敏感性和特异性高于任何 一种单一的目标 IIRPC,相关因素联

表 13 判别癌症的阈值、 敏感性和特异性参数 阈值 敏感性 特异性 曲线下面积 (95% CI) P值 类型 a

肺癌 0.35 93.80% 95.20% 0.989(0.981-0.997) <0.001 结直肠癌 0.35 94.30% 0.966(0.943-0.989) <0.001 胰腺癌 0.32 91.40% 91.10% 0.981(0.967-0.994) <0.001 冃 ¾5 0.20 93.50% 92.40% 0.992(0.985-0.999) <0.001 甲状腺癌 0.23 86.70% 90.40% 0.950(0.918-0.983) <0.001 类型 b

肺癌 0.40 90.90% 90.40% 0.961(0.935-0.987) <0.001 结直肠癌 0.26 93.40% 85.50% 0.956(0.927-0.984) <0.001 胰腺癌 0.45 82.10% 89.20% 0.953(0.922-0.984) <0.001 冃 ¾5 0.29 90.70% 80.70% 0.930(0.889-0.970) <0.001 甲状腺癌 0.34 83.30% 86.70% 0.918(0.870-0.967) <0.001 总之， 利用不同的判别方法获得数据也可以作为辅助 诊断五种肿瘤的指标， 且具有较高的敏感性、 特异性和准确性。 实施例 5 (应用实施例 3 )

IIRPC在癌症患者预后或疾病进展评估中的应用

1、研究对象为 EGFR靶向药物治疗的 41例非小细胞肺癌患者（表 14)， 收集 不同治疗时间点的血浆样本， 平均每两周收集一次， 从靶向治疗初治截止到病人 发生组织学确诊的疾病进展 （progressive disease, PD ) 之时。

表 14 EGFR靶向药物治疗的非小细胞肺癌患者的基本� �征 特征

男性 /女性人数 18/23

年龄 （岁） ： 平均值 （范围) 56 (35-74)

疾病分期一人数 （％)

IIIB 6 (15)

IV 35 (85)

E

组织学分类一人数 （％)

腺癌 35 (85)

非腺癌 6 (15)

前期治疗方案一人数 （％)

1 31 (76)

>2 10 (24)

吸烟史一人数 （％)

从未吸烟 26 (63)

现在或曾经吸烟 15 (37)

2、 按上述实施例 1 (制备实施例） 步骤 1的方法进行 Native-PAGE电泳， 每 个样本取 2 μL, 每块凝胶中均加入同一个混合的健康人血浆作 为外参照。

3、 41例肺癌患者中， IIRPC分布类型主要为 a、 b和 c， 其中 a类型 25例、 b 类型 11例和 c类型 5例。将同一患者不同治疗时间点的 TRPC光密度值用 SPSS 12.0 软件进行单因素方差分析， 结果发现 TRPC的含量在治疗过程中无显著性差异 P 〉0.05 )。

4、 将条带 TRPC的光密度值归一化后， 得到不同类型中 IIRPC的含量。 每个 患者不同时间点样本的凝胶条带的光密度值除 以该患者入组后服药前血浆样本对 应的相同位置的凝胶条带过密度值。 将不同时间点的比值连成平滑曲线， 可以得 出患者血浆中 IIRPC变化趋势（图 8A和 B为 IIRPC在疾病进展中两种表现形式）。 当比值大于 1.5或小于 0.6时， 对应的时间点一般发生在由临床组织学证实的 疾病 进展之前的 2~22周。 综上所述， 本发明所提供的以血清或血浆中蛋白质复合物 在 Native-PAGE凝 胶中的相对量为指标， 可早发现、 辅助诊断和 /或预后评估癌症等炎症和 /或免疫相 关的慢性疾病和药效评估， 并且可以区分健康状况。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明的 ， 但是不能认为是对本发明范 围的限制， 本发明的范围由所附权利要求书限定。 毫无疑问， 本发明的方法可以 推广至其它免疫和 /或炎症相关慢性疾病的早发现、 个体化诊断、 个体化治疗、 病 情进展监测、 药物疗效的评估、 临床合理用药和 /或预后评价。 因此， 本领域的技 术人员可以在所附权利要求书限定的范围内对 本发明进行各种改动或修饰， 这些 改动或修饰的形式同样也落在本发明的保护范 围内。 例如， 本领域技术人员明白， 可以将本发明中所使用的常规凝胶电泳更换为 毛细管凝胶电泳， 并按毛细管电泳 的条件制备反映人类血清或血浆中蛋白质复合 物概况的图片等， 将患者样品的蛋 白质复合物的毛细管凝胶电泳图谱与该图片比 较后获得受试者的健康状况等。 同 时， 本领域技术人员明白， 本发明所述的血清或血浆中的蛋白质复合物的 条带由 于电泳条件的差异或血清或血浆的存放时间等 因素的影响而呈现不同的数目或在 凝胶上的迁移距离， 但可至少根据本发明上述内容中指出的标志物 如 a2或 b3获 得所需的技术信息， 从而进一步实现本发明的技术目的， 这样的情况也落入本发 明要求保护的范围。