La présente invention concerne la détermination, la détection et la quantification dans un échantillon biologique d'un facteur protéique associé à une maladie neuro-dégérative et/ou auto-immune et/ou inflammatoire. En particulier, la présente invention concerne l'utilisation d'un polypeptide ou d'un ligand spécifique dudit polypeptide, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie telle que précédemment citée.

Par"maladie neuro-dégénérative", on entend une maladie dans laquelle un processus de mort cellulaire ou de destruction cellulaire est associé à des troubles physiologiques et/ou cliniques.

Par"maladie auto-immune", on entend une maladie dans laquelle se manifeste une hyperréactivité du système immunitaire vis à vis d'un ou plusieurs auto-antigène (s).

On classe notamment parmi les maladies auto-immunes la SEP (slérose en plaques), la PR (polyarthrite rhumatoïde) et le lupus érythémateux.

Par"maladie inflammatoire", on entend généralement toute maladie résultant d'une réaction de l'organisme à un ou des agent (s) agressant (s).

Par"échantillon biologique"on entend notamment un prélèvement du type fluide biologique, tissu vivant, fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe, ou tout surnageant de culture obtenu à l'aide d'un prélèvement.

Par"fluide biologique", on entend notamment le sérum, le plasma, l'urine ou le liquide céphalo-rachidien (LCR).

Par"cellules du système nerveux central"on entend notamment les cellules neuronales et non

neuronales, telles que les cellules gliales ou les cellules de type neurogliales.

Selon l'invention, le polypeptide présente une séquence qui correspond au moins à la séquence primaire d'au moins un fragment d'une protéine, ladite protéine présentant à l'état natif une séquence primaire en acides aminés correspondant à la séquence identifiée SEQ ID N° : 1, en fin de description, ou une séquence équivalente de ladite séquence de référence SEQ ID N° : 1, ledit polypeptide présentant une activité apoptique vis à vis des cellules du système nerveux central.

Particulièrement, le polypeptide présente une séquence qui correspond au moins à la séquence primaire d'au moins un fragment de ladite protéine, cette dernière présentant à l'état natif une séquence primaire en acides aminés correspondant à la séquence identifiée SEQ ID N° : 2, en fin de description, ou une séquence équivalente de ladite séquence de référence SEQ ID N° : 2.

Le polypeptide selon l'invention présente une séquence qui correspond à la séquence primaire de la protéine identifiée sous l'une quelconque des références SEQ ID N° : 1 et SEQ ID N° : 2, ledit fragment comprenant au moins 6 résidus d'acides aminés, avantageusement au moins 8 résidus d'acides aminés, consécutifs ou non consécutifs, compris dans SEQ ID N° : 1 ou SEQ ID N° : 2, ou ses séquences équivalentes.

En particulier, le polypeptide selon l'invention présente une séquence qui correspond au moins à la séquence primaire d'un fragment d'environ 16 KD de la protéine telle qu'identifiée selon l'une quelconque des SEQs ID N° : 1 et 2.

Le polypeptide est choisi parmi les polypeptides comprenant la séquence en acides aminés commençant à l'acide aminé 95 et se terminant à l'acide aminé 233,

telle qu'identifiée sous la référence SEQ ID N° : 3 ou une séquence équivalente.

Préférentiellement, ledit polypeptide consiste en la SEQ ID N° : 3, ou une séquence équivalente de SEQ ID N° : 3.

Le polypeptide présente une séquence en acides aminés comprenant la séquence identifiée sous l'une quelconque des références SEQ ID N° : 1 et SEQ ID N° : 2.

Le polypeptide selon l'invention présente de manière préférentielle une activité antigénique.

D'autre part, le polypeptide selon l'invention présente de manière préférentielle une activité de reconnaissance spécifique du récepteur de surface de la protéine TRAIL.

L'invention a notamment pour objet l'utilisation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique.

Par polypeptide selon l'invention on désigne un polypeptide à l'état isolé présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion et leurs fragments, un peptide de fusion ou de synthèse et leurs fragments.

Le polypeptide selon l'invention peut tre un fragment d'une protéine native obtenu par digestion enzymatique ou coupure chimique ou analogue, ou un polypeptide défini obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme de l'art, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique.

Par séquence équivalente du polypeptide selon 1'invention on désigne toute addition et/ou substitution et/ou délétion par rapport à une séquence primaire en acides aminés de référence. Ces addition, substitution ou délétion peuvent tre générées par des mutations spontanées ou induites au niveau du gène codant pour ledit polypeptide, ou encore tre introduites lors de la

production dudit polypeptide par synthèse chimique ou recombinaison génétique.

Ainsi, on entend par"séquence équivalente", notamment les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acides aminés sont substitués par un ou plusieurs autres acides aminés ; les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un ou plusieurs acides aminés de la série D ; les séquences dans lesquelles on a introduit une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions amines, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques, une substitution d'un atome d'oxygène par un atome de soufre, ou autres ; une modification des liaisons peptidiques, telles que les liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy ; et l'addition d'une ou plusieurs chaînes glycosylées.

Par fragment d'une protéine, on entend un enchaînement d'au moins 6 acides aminés, avantageusement au moins 8 acides aminés, consécutifs ou non consécutifs, définissant un épitope, un site actif ou un domaine d'interaction spécifique, compris dans la séquence de ladite protéine ou d'une protéine de structure et/ou d'activité équivalente.

Par séquence de la protéine à l'état natif, on entend la succession d'acides aminés telle que retrouvée dans la structure primaire de la protéine native.

Ladite protéine est une protéine dénommée TRAIL ou Apo-2L qui est un membre de la famille des TNFs (Tumor Ne'cross Factors). La protéine TRAIL est connue pour induire une apoptose rapide des lignées de cellules transformées d'origines diverses (S R Wiley et al., Immunity, 3 : 673-682 (1995) et R M Pitti et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, n°22,12687- 12690 (1996)).

Une composition diagnostique comprend notamment au moins un polypeptide tel que défini ci-dessus pour détecter et/ou quantifier des ligands spécifiques dudit polypeptide dans un échantillon biologique, notamment récepteur.

Par ailleurs, une composition prophylactique ou thérapeutique comprend notamment au moins un polypeptide présentant une séquence équivalente, telle que définie précédemment, en vue de bloquer l'accès au récepteur dudit polypeptide présent naturellement ou la cascade physiologique conduisant à une mort cellulaire par apoptose.

La présente invention a également pour objet un ligand spécifique d'un polypeptide tel que défini précédemment et son utilisation pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune et/ou inflammatoire.

Par ligand selon l'invention, on entend notamment un anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments, ou un mélange desdits anticorps ou fragments, susceptibles de former avec ledit polypeptide un complexe immunologique.

Un tel anticorps monoclonal ou polyclonal ou ses fragments peut tre obtenu par des techniques bien connues, telles que l'immunisation d'un animal ou les techniques de recombinaison génétique.

Ainsi, une composition diagnostique comprend notamment au moins un anticorps polyclonal ou monoclonal ou ses fragments pour détecter et/ou quantifier un polypeptide présent naturellement dans un échantillon biologique.

Par ligand selon l'invention, on entend également un facteur protéique, tel qu'un récepteur, ses fragments

ou molécules dérivées, susceptibles de former avec ledit polypeptide un complexe récepteur/polypeptide.

Comme décrit plus en détail ci-après, les présents inventeurs ont mis en évidence l'existence d'un tel facteur protéique, sous la forme d'un récepteur soluble, présent dans le fluide biologique de patients affectés par au moins une des maladies précédemment décrites.

Ledit récepteur est une protéine soluble qui présente une masse moléculaire moyenne de 47769 D (Pan G et al., Sciences, Vol. 276,111-113 (1997), retrouvée par les présents inventeurs dans le liquide céphalo-rachidien et le sérum de patients SEP.

Aussi, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un tel récepteur au moins sous une de ses formes solubles, de ses fragments ou de molécules dérivées dans une composition thérapeutique ou prophylactique.

Par fragment du récepteur selon la présente invention, on entend notamment un fragment soluble dudit récepteur présentant une masse moléculaire moyenne de 19938 D.

Par molécule dérivée, on entend un récepteur, tel que défini ci-dessus ou un fragment dudit récepteur, modifié en structure mais qui conserve sa capacité de se lier au polypeptide, présent naturellement dans un échantillon biologique pour former le complexe récepteur modifié/polypeptide ou fragment de récepteur modifié/polypeptide.

Un tel récepteur, ses fragments, ou dérivés peuvent tre obtenus par des techniques connues, telles que la synthèse chimique ou la technique de recombinaison génétique.

Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation dudit récepteur, au moins sous une des formes solubles, ledit récepteur présentant une masse moléculaire moyenne de 47769 D, ou un fragment dudit

récepteur, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune et/ou inflammatoire, telle que définie précédemment, caractérisée en ce que le ligand est choisi parmi le récepteur sous forme soluble de la protéine TRAIL, les fragments sous forme soluble dudit récepteur et les molécules dérivées dudit récepteur ou desdits fragments.

Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'un récepteur soluble présentant une masse moléculaire moyenne de 47769 D, ou un fragment dudit récpeteur présentant une masse moléculaire moyenne de 19938 D, ou leurs molécules dérivées.

L'invention a également pour objet, une composition thérapeutique ou prophylactique de l'invention comprenant ledit récepteur, ses fragments ou leurs molécules dérivées, dans une quantité prédéterminée, de telle manière à ce qu'il soit susceptible de se lier au polypeptide présent naturellement dans un échantillon biologique, pour interagir avec ce dernier et bloquer, par un phénomène de compétition, l'interaction entre ledit polypeptide et son récepteur naturellement présent ou influer sur la cascade physiologique conduisant à une mort cellulaire par apoptose.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anti-ligand spécifique d'un ligand lui mme spécifique d'un polypeptide tel que défini précédemment pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune et/ou inflammatoire, caractérisée en ce que l'anti-ligand est choisi parmi les anticorps dirigés contre le récepteur de la protéine TRAIL, les fragments dudit récepteur et les molécules dérivées dudit récepteur ou desdits fragments.

Dans un mode de réalisation préférentiel selon l'invention, les anticorps sont dirigés contre la forme soluble du récepteur, de ses fragments ou des molécules dérivées dudit récepteur ou desdits fragments.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un fragment nucléotidique pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique.

Par fragment nucléotidique, on entend notamment un fragment dont la séquence d'ADN code pour le polypeptide tel que défini précédemment ou la séquence d'ARN messager correspondante et leurs séquences complémentaires, ainsi qu'un fragment dont la séquence d'ADN code pour le récepteur tel que défini précédemment, ou la séquence d'ARN messager correspondante et leurs séquences complémentaires.

Par ailleurs, selon l'invention un fragment nucléotidique est un enchaînement de monomères, ou un biopolymère, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à tout autre fragment nucléotidique dans des conditions prédéterminées, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures chimiques différentes et tre obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique.

Ainsi un monomère peut tre un nucléotide naturel d'acide nucléique, dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans lrARN le sucre est le ribose, dans 1'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose ; selon qu'il s'agit de l'ADN ou 1'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou le nucléotide peut tre modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir au niveau des bases, générant des bases

modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5- désoxyuridine et toute autre base modifiée favorisant l'hybridation ; au niveau du sucre, la modification peut consister dans le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide, et au niveau du groupement phosphate, la modification peut consister dans son remplacement par des esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate, d'alkyl et arylphosphonate et de phosphorothioate.

Par"séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de monomères, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence, constituent ou non une information fonctionnelle de mme qualité que celle des acides nucléiques naturels, Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions opératoires appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires, s'apparient pour former une structure complexe, notamment double ou triple.

Un mode de réalisation préférentiel selon l'invention comprend l'utilisation d'au moins un fragment nucléotidique pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune et/ou inflammatoire, selon laquelle ledit fragment nucléotidique présente une séquence nucléique d'ADN ou ARNm codant pour au moins un fragment d'une protéine selon SEQ ID N°1 ou SEQ ID N° : 2, ou une séquence équivalente desdites séquences de référence SEQ ID N° : 1 et SEQ ID N° : 2, ou une séquence nucléique complémentaire de ladite séquence d'ADN ou d'ARN, ledit fragment codant pour un polypeptide présentant une activité apoptique vis à vis des cellules du système nerveux central.

Dans un mode préférentiel selon l'invention, le fragment nucléotidique code pour un polypeptide présentant une séquence qui correspond au moins à la séquence d'un fragment de ladite protéine, ledit fragment comprenant au moins 6, et avantageusement au moins 8 résidus d'acides aminés, consécutifs ou non consécutifs, de la séquence SEQ ID N° : 1 ou SEQ ID N° : 2, ou leurs séquences équivalentes.

Dans un mode de réalisation encore plus préférentiel selon l'invention, le fragment nucléotidique présente une séquence nucléique codant pour au moins un fragment de 16 KD de la protéine selon SEQ ID N° : 1 ou SEQ ID N° : 2, ou la séquence nucléotidique complémentaire dudit fragment.

Dans un autre mode de réalisation plus préférentiel selon l'invention, le fragment nucléotidique comprend une séquence nucléique choisie parmi les séquences nucléotidiques codant pour la séquence en acides aminés commençant à l'acide aminé 95 et se terminant à l'acide aminé 233, ou la séquence nucléotidique complémentaire dudit fragment.

Dans encore un autre mode de réalisation selon l'invention, le fragment nucléotique présente une séquence qui code pour la séquence SEQ ID N° : 1 ou SEQ ID N° : 2, ou la séquence complémentaire dudit fragment.

L'invention concerne également un procédé pour détecter une protéine associée à une maladie dégnérative et/ou auto-immune et/ou inflammatoire, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon biologique avec un ligand, tel que défini précédemment, spécifique d'un polypeptide en premier objet selon l'invention.

L'invention concerne également un procédé pour détecter un anticorps associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune et/ou inflammatoire, dans un échantillon

biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon biologique avec un polypeptide tel que défini en premier objet selon l'invention.

Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la maladie dégénérative ou auto-immune est la sclérose en plaques et ses formes éventuellement associées.

Dans un autre mode de réalisation préférentiel selon l'invention, l'échantillon biologique est choisi parmi le liquide céphalo-rachidien, l'urine et le sérum.

L'invention concerne également une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique comprenant un polypeptide tel que défini selon l'invention.

L'invention concerne également une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique comprenant un ligand tel que défini précédemment ou un anti-ligand tel que défini précédemment.

L'invention concerne encore une composition diagnostique comprenant un fragment nucléotique complémentaire d'un fragment tel que défini précédemment.

Enfin, l'invention concerne une composition thérapeutique comprenant un fragment nucléotidique antisens susceptible de s'hybrider au moins partiellement à l'ADN ou l'ARNm codant pour l'expression d'un polypeptide tel que défini selon le premier objet selon lrinvention, ou d'un récepteur tel que défini dans un mode préférentiel selon l'invention.

Les présents inventeurs ont trouvé de manière tout à fait inattendue qu'au moins un fragment de cette protéine ou la protéine était impliqué dans des maladies

de type neuro-dégénérative et/ou auto-immune et/ou inflammatoire.

Par ailleurs, les présents inventeurs ont mis en évidence l'existence d'un récepteur soluble, tel que défini précédemment, dans le fluide biologique de patients affectés par au moins une des maladies décrites ci-dessus et l'implication dudit récepteur ou de ses fragments dans les pathologies associées.

Exemple : Les inventeurs ont réalisé la séparation et le fractionnement des différents composés contenus dans un pool de LCR de patients SEP, selon les techniques habituelles bien connues de l'homme du métier (élimination des IgG humaines par la protéine G, fractionnement par la charge sur colonne de chromatographie DEAE et séparation par la taille par électrophorèse sur gel SDS-PAGE en une dimension).

Une des fractions provenant de cette analyse systématique a permis de visualiser sur gel en une dimension une bande protéique d'une masse moléculaire apparente comprise entre 15 et 20 KD. Cette bande a été découpée et analysée après électro-transfert sur une membrane de Western-blot. La bande protéique de 15-20 KD a été soumise à digestion par la trypsine et les profils de digestion par la trypsine des protéines contenues dans cette bande ont été analysés par spectrométrie de masse.

L'analyse a été effectuée à l'aide de logiciels calibrés sur des profils peptidiques de protéines connues répertoriées dans les banques de données. Les résultats obtenus montrent que l'un des constituants protéiques de la fraction de 15-20 KD analysée présente un profil de digestion trysique identifiable avec une grande probabilité (probabilité inférieure à 1 pour mille déterminée à partir de l'analyse de données de

spectroscopie de masse) à une région d'environ 16 KD (masse moléculaire moyenne de 16165 D) incluse dans la protéine native TRAIL, laquelle présente une masse moléculaire moyenne de 32507 D. Ces éléments ont permis de conclure qu'un fragment d'environ 16 KD de la protéine TRAIL est présent dans le LCR de patients atteints de SEP, voire la protéine TRAIL dans son entier, car ces fragments peuvent tre générés par un phénomène de protéolyse naturelle ou induits par une protéolyse post- traductionnelle physiologique ou liée à une pathologie.

Il ressort clairement des éléments qui précèdent qu'un fragment de 16 KD de la protéine TRAIL ou la protéine TRAIL inductrice d'apoptose est présent dans le LCR de patients SEP en phase active de la maladie, ce qui en fait un marqueur potentiel de la maladie mais également une cible thérapeutique en vue de contrer les effets toxiques. Il est ainsi possible de marquer l'antigène TRAIL avec un anticorps anti-TRAIL agoniste. Il est par ailleurs possible de bloquer le phénomène d'apoptose avec un anticorps antagoniste anti-TRAIL ou anti-fragment TRAIL ou de bloquer l'apoptose à l'aide d'un équivalent de la protéine TRAIL ou d'un équivalent d'un fragment de ladite protéine résultant d'une délétion gnomique, ledit équivalent se fixant sur le récepteur de surface de la cellule ou son fragment, défini ci-après, en inhibant la formation du complexe naturel.

Les inventeurs ont par ailleurs mis en évidence la présence du récepteur soluble de la protéine TRAIL dans le LCR de patients SEP.

Les inventeurs ont réalisé la séparation et le fractionnement des différents composés contenus dans le LCR de patients SEP à partir du mme pool que celui utilisé pour la mise en évidence de la protéine TRAIL, selon les techniques habituelles. Une des fractions provenant de cette analyse systématique a permis de

visualiser sur gel une bande protéique de masse moléculaire apparente comprise entre 47 et 48 KD.

L'analyse par spectrométie de masse de cette protéine, selon la technique décrite par Jens S. Andersen et al.

(Electrospray ionization and matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry : Powerful analytical tools in recombinant protein chemistry, Nature Biotechnology, Vol. 14,449-457 1996)) a permis de montrer qu'il s'agissait d'une protéine transmenbranaire de surface présentant une masse moléculaire moyenne de 47769 D, correspondant à la protéine décrite par Pan G et al., Sciences, Vol. 276,111-113 (1997). La bande protéique de 47-48 KD a ensuite été soumise à digestion par la trypsine et les produits de digestion ont été analysés selon la technique de Jens S. Andersen et al. citée précédemment.

Les résultats montrent que l'un des constituants protéiques de la fraction de 47-48 KD correspond à un fragment soluble de 19938 D, identifié comme un fragment du récepteur de la protéine TRAIL. Ces résultats ont permis de conclure que ledit récepteur de la protéine TRAIL ou son fragment de 19938 D sont présents, à l'état soluble, dans le LCR de patients atteints de SEP.

Il ressort des éléments qui précèdent que ledit récepteur au moins dans une de ses formes solubles ou son fragment est utilisable dans une composition thérapeutique ou prophylactique en vue de contrer l'effet toxique de la protéine TRAIL ou de ses fragments dans une maladie telle que décrite précédemment. Il est ainsi possible de bloquer le phénomène d'apoptose à l'aide d'un anticorps anti- récepteur ou anti-fragment du récepteur qui se fixe sur le récepteur libéré dans le milieu, ou exprimé à la surface de la cellule, et empche ainsi la formation du complexe naturel. Il est également possible de bloquer l'apoptose à l'aide d'une molécule dérivée dudit récepteur ou de son fragment, résultant d'une délétion gnomique, ladite molécule dérivée se fixant alors sur la protéine TRAIL ou son fragment et inhibant la formation du complexe naturel.