POLIPEPTIDO DE LA PROTEINA GP120 CAPAZ DE INHIBIR EL CICLO VITAL DEL VIRUS DEL SIDA.

La presente invención se refiere a un polipéptido correspondiente a Ia región C3-C5 de Ia proteina gp120 del virus del SIDA (el VIH) y al polinucleótido codificante por dicho polipéptido, capaz de ofrecer un efecto protector a las células frente a Ia infección por el VIH.

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

Las estrategias más comúnmente empleadas para combatir el virus del SIDA (el VIH) fueron desarrolladas a principios de los noventa. En general, estaban relacionadas con Ia capacidad inhibitoria de al menos tres diferentes moléculas que actuaban sobre una o dos enzimas vitales para el virus: retrotranscriptasas y proteasas. La combinación de fármacos basados en estas moléculas, conocida como terapia anti-retroviral altamente activa (HAART), ha mejorado el pronóstico de pacientes con SIDA. Sin embargo, Ia HAART no es capaz de erradicar al virus, que se mantiene latente en el interior celular, por Io que los distintos fármacos deben administrarse continuamente. Este hecho, junto con los efectos secundarios de dichos fármacos y Ia aparición de cepas resistentes del virus hace necesario buscar alternativas a este tratamiento.

A finales de los noventa, se ideó como tratamiento potencial para los pacientes de SIDA Ia generación de células capaces de expresar genes con actividad antiviral (Ia denominada inmunización intracelular). Así, se demostró por ejemplo que un muíante dominante del gen gag (que codifica por una proteína precursora de distintas proteínas del VIH) tenía actividad antiviral (Trono, D., et al., CeII, 1989. 59(1 ): 113-20). Se han descrito otras estrategias basadas en este enfoque, para interferir directamente en Ia replicación del virus o eliminar las células infectadas. Además, Ia terapia génica frente a VIH ha entrado en fase clínica empleando, entre otros, el gen rev (Ia proteína Rev regula Ia expresión de genes que codifican por proteínas estructurales del virus) o el gen tat (Ia proteína tat es un trans-

activador de Ia transcripción). Estas y otras terapias génicas han sido revisadas por Fanning, G. et al., J Gene Med, 2003. 5(8): 645-53.

Diversas líneas en Ia lucha contra el SIDA se han enfocado al bloqueo de las primeras fases del ciclo vital del VIH, que comienza cuando Ia glicoproteína gp120 de su envuelta reconoce al receptor CD4 de Ia superficie de membrana de algunos tipos celulares. Para el progreso de Ia infección por VIH Ia diana principal son los denominados linfocitos CD4+, aquellos que presentan dicho receptor. En este caso, gp120 reconoce además a los co-receptores CCR5 y CXCR4. La glicoproteína gp120 proviene del procesamiento del precursor g160, que es sintetizado en el retículo endoplasmático de las células infectadas yque, por Ia acción de proteasas del aparato de Golgi, produce tanto gp120 como gp41. Estas glicoproteínas de Ia envuelta del VIH se organizan formando trímeros, de forma que cada complejo de Ia envuelta del virus contiene tres unidades de Ia gp120 y otras tres de gp41. Una vez que Ia gp120 interacciona con el receptor CD4, se induce un cambio conformacional en gp41 , que inserta una región hidrofóbica en Ia membrana de Ia célula y permite fusionar Ia partícula viral con Ia membrana celular para que su carga genética pase al interior celular.

Tanto gp160, gp120, como gp41 , han sido empleadas para combatir Ia infección por VIH mediante células transformadas (WO89/05349, WO94/22477) y anticuerpos contra el virus (WO03/106496). En ciertos casos las estrategias se han concentrado en inhibir Ia entrada del virus impidiendo su fusión con Ia membrana celular, por ejemplo desarrollando moléculas que interfieren en el cambio conformacional de gp41 (Kilby, J. M., et al., Nat Med, 1998. 4(11 ): 1302-7). En otros, el enfoque se ha centrado en impedir el procesado del precursor gp160, pues éste es un paso crucial para Ia formación de las partículas virales en las células infectadas.

Dentro de estas últimas estrategias, los inventores habían diseñado anteriormente un vector retroviral que contenía en su secuencia Ia quimera denominada CD4ε10. Esta era una construcción génica que reunía Ia

secuencia de CD4 y Ia correspondiente a 10 aminoácidos de Ia señal de retención de CD3ε en el retículo endoplasmático, siendo CD3ε una de las cadenas peptídicas que forman parte del complejo receptor de los linfocitos T (Mallabiabarrena, A. et al., Nature, 1992. 357(6379): 593-6). El péptido originado por expresión de Ia quimera CD4ε10 se retenía en dicho retículo y este efecto provocaba Ia inhibición de Ia replicación de VIH-1 al interaccionar con Ia proteína viral gp160, reteniéndola en el retículo endoplasmático y evitando su exportación al aparato de Golgi y por tanto su procesamiento en gp120 y gp41 (San José, E. et al., Hum. Gene. Ther., 1998. 9(9): 1345-57). De esta manera, Ia expresión estable del gen CD4ε10 en las células T transducidas las protegió de los efectos patogénicos del virus. Además, Ia aplicación de esta estrategia a linfoblastos T de pacientes seropositivos utilizando como vector para Ia transducción partículas derivadas del virus Mo-MLV inhibió Ia depleción de las poblaciones de linfocitos CD4+. Sin embargo estos estudios no pudieron efectuarse en condiciones óptimas, pues el vector utilizado no permitía un seguimiento del progreso de Ia transducción y por otra parte el título viral de los sobrenadantes de los cultivos de células transducidas (relacionado por tanto con el número de vectores virales que se replican con éxito y son capaces de extender Ia transducción) era bajo.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

Los autores de Ia presente invención han descubierto que, sorprendentemente, Ia transducción genética estable de linfocitos T mediante vectores virales que contienen una secuencia quimera o polinucleótido quimérico de ADN, denominada CD4ε15, que codifica para el receptor de membrana CD4 y para una señal de retención en el retículo endoplasmático de Ia cadena CD3ε del complejo receptor de membrana de los linfocitos, no sólo protege a estos linfocitos transducidos de los efectos de Ia infección por VIH, sino que al mismo tiempo actúa produciendo un factor antiviral que protege a otros linfocitos T no transducidos.

Los inventores han utilizado vectores virales bi-cistrónicos, logrando en los linfocitos T transducidos Ia co-expresión de Ia quimera CD4ε15 con Ia

de Ia proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), debido a Ia inclusión en el vector de una secuencia IRES (del inglés "Infernal Ribosome Entry Site"), que permite ligar Ia expresión de Ia quimera al de Ia EGFP. La expresión de EGFP en células transducidas permite el seguimiento de su número mediante citometría de flujo y consecuentemente ha facilitado Ia demostración de que Ia expresión de Ia quimera CD4ε15 en un pequeño porcentaje de los linfocitos T de un cultivo celular es suficiente para proteger frente a Ia infección por VIH tanto a las células transducidas como a las no transducidas.

El efecto protector de las propias células transducidas se logra en parte porque Ia expresión de CD4ε15 previene Ia maduración en Ia célula infectada por VIH de Ia proteína precursora gp160, necesaria para originar las proteínas gp120 y gp41 de Ia envuelta del virus; por Io que aunque el gen del VIH que codifica por gp160 se expresa dentro de Ia célula y se producen partículas del VIH éstas no son infectivas.

Por su parte, el efecto protector sobre las otras células no transducidas se debería a que Ia expresión en las transducidas de Ia quimera conduce a Ia síntesis de un fragmento de gp120, soluble, y que es secretado al medio. Este factor competiría con Ia gp120 de Ia envuelta de las partículas de VIH en su unión al receptor CD4, impidiendo Ia unión del virus a dichos receptores y por tanto el desarrollo de su ciclo vital.

Se ha aceptado generalmente que, para que este tipo de terapia sea eficaz, es necesario que las células a proteger estén transducidas por los vectores que contienen el gen "protector", por Io que es particularmente importante lograr vectores con eficacia transductora cercana al 100%. La presente invención ha mostrado inesperadamente que aunque sólo un porcentaje minoritario (del 10% o menor) de las células de un cultivo estén transducidas con Ia quimera CD4ε15, es posible lograr una inhibición de Ia

replicación del virus VIH de más de 100.000 veces en comparación con cultivos celulares en los que los vectores virales no contenían Ia quimera.

Los análisis posteriores indicaban que el efecto protector de las células transducidas sobre las no transducidas era mediado por un factor antiviral soluble, liberado al medio por las primeras. Asimismo, se comprobó que dicho factor sólo se liberaba cuando las células transducidas eran infectadas por VIH. Este hecho, unido a que el factor antiviral se liberaba por los linfocitos T CD4+ no activados (Ia activación de los linfocitos T se produce tras el reconocimiento de los antígenos por parte del complejo receptor), y a que el efecto protector requería Ia expresión de CD4ε15, indicaba que este factor es diferente a otros factores antivirales tales como CAF (producido por linfocitos CD8), interferones, quimioquinas, y al factor producido por linfocitos CD4+ de pacientes seropositivos asintomáticos y en los que Ia enfermedad no progresa.

La producción de un factor soluble secretado por un porcentaje minoritario de células transducidas que es capaz de proteger a las no transducidas presenta muchas ventajas sobre otros métodos de terapia génica. Por tanto, los autores profundizaron en Ia caracterización de dicho factor, demostrando que se trata de un polipéptido con un peso molecular de alrededor de 30 KDa, Io que ya indicaba que no se correspondía con el polipéptido codificado por Ia quimera CD4ε15, que tiene 55 kDa.

La secuenciación parcial de este factor mostró una identidad con una región de 7 aminoácidos de gp120, y se comprobó asimismo que hibridaba con anticuerpos específicos frente a las regiones constantes C3 y C4 de gp120, pero no con anticuerpos frente a Ia región constante C1 (en gp120 se han definido 5 dominios cuya secuencia es prácticamente constante, de las que C2, C3, C4, C5 están implicadas en Ia unión de gp120 al receptor CD4, y 5 regiones cuya secuencia es muy variable entre las distintas

cepas de VIH, de las que sólo V5 está implicada en dicha unión). Teniendo en cuenta Ia posición en gp120 de Ia secuencia de 7 aminoácidos idéntica a Ia secuencia parcial del factor, los inventores consideraron probable que el mismo fuera un fragmento correspondiente al tercio C-terminal de gp120.

Se realizaron seguidamente diversas construcciones génicas para comprobar qué regiones de gp120 eran necesarias para lograr el efecto protector anti-VIH. Se pudo definir así que el factor antiviral objeto de Ia presente invención corresponde a un fragmento del extremo C-terminal de gp120 cuya secuencia polinucleotídica es Ia SEQ ID NO:2.

Así, un primer aspecto de Ia invención se refiere a un polipéptido (factor antiviral) capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA (VIH) que consiste esencialmente en una secuencia con al menos un 70% de homología con Ia región definida por los dominios C3, V4, C4, V5 y C5 (en adelante región C3-C5) de Ia proteína gp120 del virus. En realizaciones sucesivamente más preferidas de este aspecto de Ia invención el polipéptido tiene una homología de al menos el 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% con Ia región C3-C5 de Ia proteína gp120. En una realización aun más preferida de este aspecto de Ia invención el polipéptido tiene Ia SEQ ID NO:1. En adelante este polipéptido también será denominado como factor antiviral o "polipéptido de Ia invención".

Un segundo aspecto de Ia invención se refiere a un polinucleótido capaz de codificar el polipéptido de Ia invención. En una realización preferida dicho polinucleótido tiene Ia SEQ ID NO:2. Debido a Ia degeneración del código genético, por Ia que cada aminoácido puede ser codificado por distintos codones nucleotídicos, polinucleótidos distintos a SEQ ID NO:2 pueden dar lugar al péptido de Ia invención. Consecuentemente, realizaciones también preferidas de Ia invención

comprenden polinucleótidos con al menos un 50% de homología con Ia SEQ ID NO:2 y, en realizaciones sucesivamente más preferidas, con al menos el 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de homología con Ia SEQ ID NO:2. En adelante este polinucleótido también será denominado como "polinucleótido de Ia invención".

Un tercer aspecto de Ia invención se refiere a un vector que comprende al polinucleótido de Ia invención y además, preferentemente, comprende al menos una secuencia control que permita Ia expresión de dicho polinucleótido. En adelante este vector será denominado como

"vector de Ia invención".

Un cuarto aspecto de Ia invención se relaciona con una célula transfectada preferentemente adulta y más preferentemente no germinal, capaz de producir el polipéptido de Ia invención, caracterizada porque comprende al polinucleótido de Ia invención o al vector de Ia invención. En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia célula transfectada es una célula madre hematopoyética, preferentemente progenitora de células linfáticas y, más preferentemente, de linfocitos T. En una realización todavía más preferida las mencionadas células madre son de origen humano. En adelante, estas célula(s) será(n) denominada(s) como "célula(s) transfectada(s) de Ia invención".

Un quinto aspecto de Ia invención se relaciona con una composición farmacéutica para Ia elaboración de un medicamento que comprende a cualquiera de los siguientes elementos de Ia invención: i) el polipéptido de

Ia invención, ii) el polinucleótido de Ia invención, o iii) Ia célula transfectada de Ia invención. En una realización preferida Ia composición farmacéutica está dirigida al tratamiento o prevención frente al virus del SIDA (VIH). En adelante, esta composición farmacéutica será denominada como

"composición farmacéutica de Ia invención".

Un sexto aspecto de Ia invención se refiere a un método de tratamiento o prevención contra el virus del SIDA que comprende:

1 ) Transfectar células hematopoyéticas, progenitoras de células linfáticas, o linfocitos T con el polinucleótido de Ia invención o con el vector de Ia invención.

2) Injertar en un individuo diana una cantidad terapéuticamente efectiva de células hematopoyéticas, progenitoras de células linfáticas, o linfocitos T obtenidos en el paso anterior.

En una realización preferida del método de tratamiento o prevención, las células transfectadas provienen (i) de un individuo sano histocompatible con el individuo diana y, más preferentemente, (ii) del propio individuo diana, siendo éstas células preferentemente embrionarias y más preferentemente provenientes de cordón umbilical.

Un séptimo aspecto de Ia invención se refiere a un método para Ia obtención o identificación de polipéptidos capaces de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA, donde Ia transfección de células con el polinucleótido que codifica para dicho polipéptido protege tanto a células transfectadas como no transfectadas, que comprende:

1. transfectar células hematopoyéticas, preferentemente linfoblásticas, y más preferentemente linfocitos B, con un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para el receptor CD4, secuencias con al menos un 60% de homología con CD4, preferentemente al menos 70, 80, 90, 95 o 98% y una segunda que codifica para una señal de retención en el retículo endoplasmático de al menos 12 ó 13 amino ácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más preferentemente de 15

(CD4ε15),

2. infectar las células de Ia etapa (1 ) con al menos una cepa del virus del SIDA, y

3. aislar al polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA, preferentemente el polipéptido de Ia invención, de Ia fracción soluble de un extracto obtenido a partir de las células infectadas de

Ia etapa (2).

En una realización preferida de este aspecto de Ia invención Ia señal de retención es un fragmento de CD3ε, y en una realización aun más preferida el fragmento tiene Ia secuencia Ia SEQ ID NO:3, variantes alélicas de ésta SEQ ID NO:3, ó secuencias con al menos un 80% de homología con SEQ ID NO:3, preferentemente al menos el 85, 90, 92, 93 ó 95%.

Un octavo aspecto de Ia invención se refiere a un polinucleótido capaz de codificar para un polipéptido quimérico que comprende Ia secuencia de CD4 y una secuencia que codifica para una señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 ó13 aminoácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más preferentemente de 15. En una realización preferida Ia señal de retención es un fragmento de CD3ε, preferentemente dicho fragmento tiene Ia SEQ ID NO:3 ó secuencias con al menos un 80% de homología con SEQ ID NO:3, y preferentemente al menos el 85, 90, 92, 93 ó 95%.

Un noveno aspecto de Ia invención se refiere a Ia transfección de células hematopoyéticas, preferentemente linfoblásticas, y más preferentemente linfocitos B, con un polinucleótido capaz de codificar para un polipéptido quimérico que comprende al receptor CD4 y una secuencia que codifica para una señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 o 13 amino ácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más preferentemente de 15. En una realización preferida, Ia señal de retención es un fragmento de CD3ε, y preferentemente dicho fragmento tiene Ia SEQ ID NO:3 ó secuencias con al menos un 80% de homología con SEQ ID NO:3, más preferentemente al menos el 85, 90, 92, 93 ó 95%.

Un décimo aspecto de Ia invención se refiere al uso del polipéptido, polinucleótido, vector o célula transfectada de Ia invención para su uso como medicamento, preferentemente para Ia elaboración de una vacuna frente al virus del SIDA.

Definiciones:

El término "polinucleótido", tal y como se emplea en Ia descripción, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término está referido a

Ia estructura primaria de Ia molécula, incluyendo ADN y ARN tanto de cadena sencilla como de doble.

El término "replicón" hace referencia en Ia descripción a cualquier elemento génico, como por ejemplo un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación, esto es, que es capaz de replicarse bajo su propio control, aunque dicha replicación pueda ser inducida, inhibida y en definitiva regulada por agentes externos al propio replicón. El término "vector" hace referencia en esta descripción a un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleotídico, para realizar Ia replicación o expresión del segmento unido.

El término "secuencias control" se refiere en Ia descripción a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para Ia expresión de las secuencias codificantes a las que están ligadas, como por ejemplo a Ia región C3-C5. La naturaleza de las secuencias control varía en función del organismo huésped: en procariotas éstas generalmente comprenden un promotor, un sitio de unión a ribosoma y terminadores; en eucariotas, generalmente comprenden promotores, terminadores, un sitio de unión a ribosoma e inductores. Se pretende que el término "secuencias control"

incluya, como mínimo, todos los elementos necesarios para Ia expresión de las secuencias codificadas, y también pueda incluir componentes adicionales, tales como las secuencias líder.

El término "región C3-C5" se refiere en Ia descripción al fragmento de

Ia secuencia polipeptídica de Ia proteína gp120 del virus VIH que comprende los dominios comúnmente definidos en el mismo como C3, V4, C4, V5 y C5, siendo los dominios C aquellos cuya secuencia se encuentra muy conservada al comparar distintas cepas del virus, y los dominios V, aquellos cuya secuencia varía mucho al comparar distintas cepas del virus. Igualmente al referirse a Ia secuencia polinucleotídica en esta descripción el término "región C3-C5" significa el fragmento de dicha secuencia que codifica por Ia secuencia polipeptídica que comprende los dominios C3, V4, C4, V5 y C5. Preferentemente, esta secuencia abarca desde Ia posición 328 hasta Ia 516 de Ia glicoproteina gp120 del virus del SIDA.

El término "transfección", tal y como es empleado a Io largo de Ia descripción, se refiere a Ia acción de introducir material genético foráneo en una célula. Esta transfección podrá ser llevada a cabo por métodos sobradamente conocidos en el estado de Ia técnica, tales como Ia electroporación, transducción, microinyección, pistola de genes, etc.

El término "transducción", se refiere a Ia acción de introducir material genético foráneo en una célula mediante un vector derivado de un virus, siendo por tanto un tipo específico de transfección.

A Io largo de Ia descripción y de las reivindicaciones Ia palabra

"comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán

en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Las partículas virales formadas en células transducidas con Ia quimera CD4ε15 no son infectivas.

La figura 1A representa esquemáticamente los vectores retrovirales pCIE15 y pD15, conteniendo Ia quimera CD4ε15. Dicha quimera se ha representado comprendiendo los dominios extracelular (EC), transmembrana (TM) e intracelular (IC) del receptor CD4 de los linfocitos T, así como los 15 aminoácidos responsables de Ia retención en el retículo endoplasmático de Ia cadena CD3ε del complejo CD3/receptor de células T (secuencia aminoacídica SEQ ID NO:3).

La figura 1 B muestra cultivos celulares de MT2 (una línea de células T muy sensible a Ia infección con VIH) y de Ia línea celular C10 (obtenida por transducción de MT2 con el vector pCIE15), tras ser infectados con Ia cepa NL4.3 del VIH. Mediante contraste de fase, pudo observarse que a las 48 horas de Ia infección con el VIH todas las células MT2 habían formado sincitios, mientras las células C10 no habían formado ninguno.

La figura 1C izquierda muestra como Ia expresión de CD4ε15 inhibía Ia formación de partículas infectivas en Ia primera ronda de replicación del VIH. Así, en los cultivos de C10 Ia dosis infectante del 50% de los cultivos celulares, TCIDso/ml (del inglés "Tissue Culture Infective Dose") fue menos de un tercio de Ia observada en cultivos de MT2, aunque Ia liberación de Ia proteína p24 de Ia cápside del VIH fuera similar entre ambos cultivos (figura 1C derecha). A las 48 horas, cuando se había producido más de una ronda de replicación del VIH, el efecto de Ia expresión de Ia quimera CD4ε15 era más potente, de manera que el valor de TCID ₅ o/ml de los

sobrenadantes de los cultivos de las células transducidas (C10) era 60 veces menor al de los cultivos de células no transducidas (MT2), y Ia liberación de p24 era seis veces menor en los cultivos de células C10 que en los de MT2 (figura 1C derecha).

La figura 1 D muestra imágenes de microscopía electrónica que confirmaron que, tras un primer ciclo de replicación, Ia formación de partículas virales está inhibida por Ia expresión de Ia quimera CD4ε15: a las 48 horas tras Ia infección con VIH las células MT2 mostraron gran cantidad de partículas virales (puntos y círculos oscuros pequeños), mientras que no pudo detectarse ninguno en las células C10.

La figura 1 E muestra un "western blot" de las proteínas totales de células MT2 y de distintos clones provenientes de Ia transducción de MT2 (C10, Clon 2 y G11 ), infectadas a alta multiplicidad de infección con Ia cepa NL4.3 de VIH. A las 48 horas de dicha infección se usaron alícuotas de los cultivos celulares y los usados se hibridaron con un anticuerpo policlonal frente a gp160 y gp120. Pudo observarse que todas las células sintetizaban el precursor gp160, pero gp120 sólo se encontraba en las células no transducidas (MT2), indicando que en las células transducidas Ia maduración de gp160 para originar gp120 se había bloqueado.

Figura 2. La expresión de CD4ε15 inhibe Ia replicación de distintas cepas de VIH en distintas líneas celulares.

La figura 2A muestra Ia concentración de p24 de Ia cápside del VIH secretada al medio de cultivo, expresado en pg de proteína por mi, para células MT2 (barras negras) y C10 (barras blancas) infectadas con diferentes cepas de VIH (NL4.3, ME46, CLB23 y VISH 89.6).

La figura 2B muestra Ia progresión de Ia secreción de p24 (pg/ml del medio de cultivo), en células PM1 , MOLT-4, MT2 y Jurkat infectadas con Ia cepa NL4.3, para excluir el posible efecto clonal de Ia célula infectada sobre Ia replicación del virus. En cada cultivo el porcentaje de células

transducidas con Ia quimera CD4ε15, determinado mediante citometríade flujo fue distinto, según se muestra en Ia figura.

Figura 3. La expresión de CD4ε15 en un porcentaje minoritario de células ejerce un efecto protector en las células no transducidas al originar Ia secreción al medio de un factor proteico soluble.

Las figuras 3A y 3B muestran el efecto de Ia proporción de células T transducidas con Ia quimera CD4ε15 sobre Ia infección viral.

La figura 3A muestra los resultados del seguimiento a distintos días tras Ia infección con el aislado clínico 1936 del VIH (Días p.i.) de mezclas de linfocitos T transducidos con pCIE15 y no transducidos, indicándose en dicha figura el % de los transducidos en cada mezcla. El seguimiento se realizó midiendo Ia concentración (pg/ml) de Ia proteína p24 del VIH secretada al medio y el porcentaje de linfocitos CD4 respecto al total de linfocitos CD4 y CD8. Una proporción de un 30% de linfocitos transducidos es suficiente para inhibir en el cultivo el progreso de Ia infección: a los 7 días Ia concentración de p24 en el medio era 25 veces menor a Ia observada en cultivos sin linfocitos transducidos (figura 3A izquierda) y el % de linfocitos CD4 apenas había disminuido (figura 3A derecha).

La figura 3B muestra los resultados del seguimiento a distintos días tras Ia infección con Ia cepa NI4.3 del VIH (Días p.i.) de mezclas de cultivos celulares de C10 (transducidos) y MT2, indicándose en dicha figura Ia proporción de C10 en cada mezcla. El seguimiento se realizó midiendo Ia concentración (pg/ml) de Ia proteína p24 del VIH secretada al medio y el número de copias del ARN del VIH por célula. Los resultados demostraron que Ia transducción de un 10% (φ) de las células de un cultivo es suficiente para inhibir completamente el progreso de Ia infección por el VIH.

La figura 3C muestra esquemáticamente un experimento para demostrar que no es necesario el contacto célula-célula para lograr el efecto protector de las células transducidas sobre las no transducidas. Se

crecieron cultivos de células C10 o MT2 en pares de pocilios separados por membranas, que permiten Ia difusión a su través de macromoléculas pero no de células. Tras infectar cada cultivo con Ia cepa NL4.3 se evaluó el progreso de Ia infección determinando Ia secreción de p24 (ng de proteína) en cada pocilio, así como Ia formación de sincitios en las células (-, no detectados; +, detectables; ++, abundantes; +++, se observa efecto citopático extenso). Se observó que cuando el pocilio superior contenía el clon C10 (transducido) se inhibía también Ia replicación de VIH en el cultivo de MT2 del pocilio inferior, confirmando que no es necesario el contacto célula a célula.

Figura 4. El factor proteico protector es homólogo a Ia región C3- C5 de Ia proteína gp120 del VIH.

La figura 4A muestra el resultado de Ia separación electroforética de diversas fracciones de un cultivo de células T transducidas con CD4ε15 e infectadas con VIH-1 a alta multiplicidad de infección. Se señala con una flecha Ia proteína de aproximadamente 30 KDa que sólo se observó en Ia fracción con efecto protector frente a Ia infección por VIH.

La figura 4B muestra un esquema de Ia proteína gp160, indicándose las proteínas gp120 y gp41 que se originan por rotura proteolítica en Ia zona indicada por Ia flecha. Se señala Ia posición del heptapéptido SIM1 , así como las zonas de interacción con CD4 (*) y las de glicosilación (Y). Además, en esta misma figura se muestran de manera esquemática los fragmentos I, II, III, IV utilizados para demostrar Ia suficiencia de Ia expresión de Ia región C3-C5 de gp120 para lograr el efecto protector anti- VIH.

La figura 4C muestra el resultado de un ensayo de protección de cultivos de células MT2 frente a Ia infección por VIH, en el que se evaluó Ia progresión de Ia infección por VIH, según Ia concentración (pg/ml) de Ia proteína p24 de su cápside secretada al medio de cultivo por dichas células. El ensayo se realizó añadiendo los sobrenadantes de distintos cultivos de células COS transducidas con los fragmentos I, II, III, IV de

gp120 (figura 4B), observándose el mayor efecto protector para los sobrenadantes de células COS transducidas con el fragmento III.

La figura 4D muestra Ia concentración (pg/ml) de p24 en el medio de cultivo de células T Jurkat transducidas con el fragmento III de gp120 e infectadas con VIH a dos multiplicidades de infección altas (0,1 y 0,5 partículas infecciosas/célula). El progreso de Ia infección se inhibió marcadamente a los 5 días de Ia misma en las células transducidas con el fragmento III.

EXPOSICIóN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIóN

Es sabido que Ia inhibición del corte o maduración de los precursores de proteínas de Ia envuelta del virus del SIDA da lugar a que dichas proteínas sean no funcionales, esto es, sin capacidad para inducir Ia fusión a membrana celular de las partículas víricas. A partir de este conocimiento, se desarrollaron experimentos para interferir con el procesado proteolítico de dichos precursores, mediante Ia creación de una secuencia de ADN quimera (CD4ε15) que contenía Ia secuencia que codifica por el receptor de membrana CD4 y por una señal de retención del receptor de membrana CD3ε en el retículo endoplasmático, así como secuencias reguladoras de Ia expresión). La transducción mediante vectores virales que contienen dicha quimera produjo una gran reducción en Ia liberación de partículas víricas infectivas y Ia no aparición de éstas en el interior de las células infectadas, observable por microscopía electrónica. Por otro lado y después de un ciclo de infección, las células transducidas con CD4ε15 y posteriormente infectadas por VIH liberaban normalmente Ia proteína p24 de Ia envuelta del VIH (esta proteína se usa como antígeno para Ia detección del virus por el método ELISA) y sintetizaban gp160.

Este hecho confirmó Ia hipótesis de que CD4ε15 no inhibe Ia expresión de los genes del VIH pero si Ia infección de nuevas células, al bloquear el transporte y maduración de las glicoproteínas de Ia envuelta del virus. De este modo, se demuestra que Ia presencia de CD4ε15 previene Ia formación de partículas infectivas en las células infectadas por VIH y por

tanto Ia extensión de Ia infección a otras células. Asimismo, se encontró que Ia transducción con CD4ε15 tiene un efecto inhibidor de Ia replicación de VIH de amplio espectro, puesto que impide Ia replicación de diferentes cepas de VIH-1 , VIH-2 y VISH (VISH es un híbrido de laboratorio entre el virus de Ia inmunodeficiencia en simios - VIS - y el de Ia inmunodeficiencia humana, VIH), Io que incide en su potencial para Ia terapia génica.

Sin embargo, Io que resultó mucho más interesante fue descubrir que Ia expresión de CD4ε15 en células transducidas protegía también a las no transducidas. Así, se comprobó que el efecto inhibitorio sobre Ia replicación del virus en un cultivo celular se lograba incluso cuando sólo un 10% de las células había sido transducido con Ia secuencia CD4ε15. Este hallazgo es particularmente relevante porque una de las barreras más importantes para Ia aplicación de este tipo de terapias es Ia baja proporción de células transfectadas con el gen protector que es posible lograr. Por el contrario, Ia presente invención confiere un efecto protector tanto en células transducidas como en no transducidas. Esta observación, junto al hecho de que los linfocitos T conservaron normalmente su función, hizo pensar en Ia presencia de un factor protector soluble, secretado por las células transducidas, capaz de trasladarse en el medio de cultivo y de interaccionar con las células no transducidas para conferirles protección frente a Ia infección. Estas características harían que Ia presente invención pudiera emplearse como terapia génica eficaz en Ia lucha contra el SIDA.

Hasta Ia fecha se habían descrito otros factores anti-VIH, tales como CAF (del inglés "CD8 Antiviral Factor"), producido por linfocitos T CD8+ previamente activados (Barker, E., J Infecí Dis, 1999. 179(3): S485-8.35) y que se ha catalogado dentro de las defensinas, una familia de péptidos de bajo peso molecular sin relación con otros factores antivirales. También se había descrito el factor antiviral producido por células T CD4+ de los pacientes seropositivos asintomáticos en los que Ia enfermedad no progresa, o el producido por células T activadas por cepas de VIH atenuadas, tales como las cepas defectivas en el gen vif.

Ya antes de su caracterización, era evidente que el factor producido por las células transducidas con CD4ε15 no correspondía a ningún tipo de factor antiviral descrito anteriormente: al ser producido por linfocitos T CD4+ no podía tratarse del CAF, pues éste proviene de los linfocitos T CD8+, y al ser expresado únicamente por células transducidas con CD4ε15 difícilmente podía tratarse de un interferón o una quimioquina. Asimismo, el hecho de que su liberación al medio por los linfocitos T fuese independiente de Ia estimulación de éstos, sugería que el factor no es una citoquina.

Estas circunstancias, unidas al hecho de que el factor se producía sólo cuando las células T transducidas eran infectadas con VIH, hicieron suponer que debía ser inducido por el virus o incluso expresado por el genoma de éste. Por otro lado, al ser su liberación al medio de cultivo dependiente a Ia vez de Ia expresión de CD4ε15 y de Ia infección por VIH, parecía probable que CD4ε15 produjese alguna modificación en el procesado o ensamblaje de los productos génicos del virus, y que esta modificación resultase en Ia secreción del factor protector codificado por el genoma de Ia célula infectada o por el del propio virus.

Mediante el análisis de fracciones celulares de linfocitos transducidos con CD4ε15 e infectados con VIH se determinó que el factor soluble tenía un peso molecular de 30KDa, y que presentaba homología con Ia proteína gp120. La expresión de diferentes fragmentos del extremo C-terminal de gp120 llevó a Ia conclusión de que el efecto protector conferido por el factor se basaba en su homología con Ia región C3-C5 de gp120 (figura 4C).

A continuación se detallan los materiales y métodos que fueron empleados para el desarrollo de Ia presente invención, así como sus ejemplos de realización. Dichos ejemplos no limitan Ia invención, sino que su finalidad es ilustrarla, poniendo de manifiesto tanto Ia capacidad del factor para inhibir el ciclo vital del virus del SIDA como los resultados de su caracterización.

EJEMPLOS DE REALIZACIóN DE LA INVENCIóN

Materiales y métodos

Vectores retrovirales. La quimera CD4ε15 se clonó en dos vectores retrovirales (figura 1A). El denominado pCIE 15 deriva del pLZR-CMV-gfp que a su vez deriva del virus de Ia leucemia murina de Moloney, Mo-MLV (Yang, S., et al., Hum Gene Ther. 1999. 10(1 ): 123-32) y fue suministrado por el Dr. Antonio Bernad del Centro Nacional de Biotecnología del CSIC, Madrid. El vector pCIE15 incluye un promotor híbrido 5' LTR/CMV (las secuencias LTR - del inglés "Long Terminal Repeat"- facilitan Ia inserción de Ia secuencia en el genoma de Ia célula huésped y CMV designa a un promotor del citomegalovirus), un sitio de clonación múltiple donde se clona CD4ε15, un sitio IRES (del inglés " Infernal Ri bosome Entry Site") del virus de Ia encefalomiocarditis (Abad, J. L., et al., J Gene Med, 2002. 4(1 ): 27-37) para que Ia expresión de CD4ε15 vaya ligada a Ia de Ia siguiente secuencia, que codifica por Ia proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), facilitando así el seguimiento de las células que expresan dicha quimera mediante citometría de flujo, y una secuencia LTR en su extremo 3'. El correspondiente vector sin Ia quimera se denominó pCIE.

Por otro lado, el vector pD15 se generó a partir del M387 (Schambach,

A., et al., Mol Ther, 2000. 2(5): 435-45), un vector que contiene los 5'LTR y

3'LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo. Además de por dichos LTR, Ia diferencia respecto a pCIE15 fue Ia inclusión de un elemento regulador postranscripcional del virus de Ia hepatitis del castor al inicio del 3'LTR.

Para Ia proliferación de ambos vectores se cultivaron células Phoenix- Amph al 80% de confluencia en placas de 10 cm, se transdujeron por el método de precipitación en fosfato calcico empleando 16 μg de vector retroviral, 2,25 μg del plásmido pMD.G que codifica para Ia proteína G del virus de Ia estomatitis vesicular, y 16 μg del plásmido pNGVL3-MLV que contiene el gen gag y un grupo de genes del virus de Ia leucemia murina (MLV). A las 24 horas tras dicha transducción, se reemplazó el medio y a las 48 horas se filtró el sobrenadante del cultivo a través de una membrana

con un poro de 0,45 μm para obtener sobrenadantes con alta concentración de dichos vectores.

Células. Las líneas celulares de linfocitos CD4+ empleadas en los ensayos de infección (MT2, Jurkat, PM1 y MOLT-4) se obtuvieron de Ia Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas células fueron mantenidas hasta su uso en suero fetal bobino inactivado. Las células mononucleares periféricas para Ia obtención de linfocitos T fueron aisladas a partir de donantes sanos empleando Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences), resuspendidas con fitohemaglutinina P (1 μg/ml) e interleuquina-2 (IL-2) recombinante (100U/ml) a 37 ⁰ C durante 48-72 horas, propagándose posteriormente en medio de cultivo completo en presencia de 100 U/ml de IL-2. Para Ia producción de los vectores virales se utilizó Ia línea celular Phoenix™, capaz de generar retrovirus que no requieren las partículas "helper" para su proliferación, suministrada por Ia ATCC (referencia SD-3514).

Anticuerpos. El anticuerpo policlonal frente a gp160, cedido por el Dr. Gustavo del Real (Centro Nacional de Biotecnología del CSIC) se generó utilizando como antígeno toda Ia proteína. El anticuerpo frente al receptor CD4 humano acoplado a ficoeritrina se adquirió a Pharmingen.

Cepas e infección de VIH. La cepa NL4.3 del virus del SIDA (Adachi, A., et al., J Virol, 1986. 59(2): 284-91 ) fue cedida por el Dr. José Alcamí (Instituto de Salud Carlos III, Madrid). La cepa 1936 es una cepa clínica crecida en linfocitos T primarios. La cepa ME46 fue obtenida a partir del "AIDS Resarch and Reference Reagent Program", al igual que Ia cepa CBL23 de VIH-2. La cepa quimérica VISH 89.6 fue cedida por el Dr. Gerrit Koopman (Biomedical Primate Research Centre, Países Bajos). Para Ia proliferación de las cepas de laboratorio se utilizaron células MT2, determinando el título viral mediante el método de dilución del punto final, tal y como se describe en Adachi, A., et al., J Virol, 1986. 59(2): 284-91 y en San José, et al. Virology, 1997. 239(2): 303-14. Las preparaciones virales obtenidas se añadieron a los distintos cultivos celulares durante 2 horas a 37 ⁰ C a las diferentes multiplicidades de infección tal y como se

indica en cada experimento. Las células fueron entonces lavadas y cultivadas en nuevo medio. La replicación viral se determinó según Ia secreción de Ia proteína p24 de Ia cápside del VIH medida en el sobrenadante de los cultivos mediante inmunoensayo. La carga viral se determinó también por el número de moléculas del ARN codificado por el gen gag del VIH medida por PCR reversa (RT-PCR), empleando los oligonucleótidos SK431 y SK462 como cebadores de Ia reacción de PCR (Amplicor HIV-1 , Roche Diagnostics Systems).

Transducción celular. La transducción con los vectores virales se realizó plaqueando 2x10 ⁶ células diana por pocilio en placas de 6 pocilios y resuspendiéndolas en 4 mi de sobrenadante conteniendo los vectores virales obtenido según se ha descrito anteriormente, al que se Ie había añadido 4 μ/ml de polibreno. Para facilitar Ia transducción, se centrifugaron a 2000 rpm, 32 ⁰ C durante 90 minutos, y posteriormente se incubaron a 37 ⁰ C, 3 horas, diluyéndose por último en nuevo medio de cultivo. Para Ia transducción de los linfoblastos T el protocolo seguido fue esencialmente el mismo, excepto que las células se mantenían en presencia de IL-2 (100 U/ml) y que se plaqueaban 10x10 ⁶ células por pocilio con 5 mi de sobrenadante. En todos los casos, Ia transducción de las células diana se realizó en 2 o 3 rondas en intervalos de 24 horas, analizando después de Ia última ronda Ia eficiencia de Ia transducción mediante citometría de flujo.

Microscopía electrónica. Este análisis se llevó a cabo fundamentalmente según se describe en Hockley, DJ. , et al., J Gen Virol,

1988. 69 (Pt 10): 2455-69. Así, se infectaban 3x10 ⁶ células a elevada multiplicidad de infección, y 48 horas después se fijaban en glutaraldehido

(2,5%) y paraformaldehido (1 %) en tampón de cacodilato sódico al 0.1 M y pH 7.4. Se incubaban a temperatura ambiente durante 30 minutos o a 4 ⁰ C durante Ia noche, se lavaban tres veces en el mismo tampón, y posteriormente se fijaban en tetróxido de osmio al 1% en agua. Se trataban entonces con ácido tánico (0,15%) durante 1 minuto y acetato de uranilo acuoso (2%). A continuación, se deshidrataban las células en etanol a 4 ⁰ C y se embebían en resina epoxi (TAAD 812). Esta se cortaba en secciones finas con una cuchilla de diamante, que eran finalmente

fijadas en acetato de uranilo y citrato de plomo para su examen al microscopio electrónico (Modelo JEM-1010).

EJEMPLO 1. La expresión de CD4ε15 inhibe Ia formación de partículas víricas infectivas de VIH.

Para estudiar el potencial de Ia expresión de CD4ε15 (figura 1A) en el control de Ia replicación de VIH y poder hacer un seguimiento simultáneo de las células transducidas, se insertó dicha secuencia quimera en dos vectores bi-cistrónicos diferentes. El vector pCIE15 contiene un promotor híbrido de Ia expresión génica (LTR/CMV) que controla Ia expresión de Ia quimera CD4ε15, Ia cual, al estar seguida de una secuencia de señalización para entrada en el ribosoma (IRES, del inglés " Infernal Ribosome Entry Site"), y Ia secuencia de Ia proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) se expresa siempre de forma ligada a Ia EGFP. Al vector sin dicha quimera se Ie denominó pCIE. El otro vector utilizado (pD15) fue similar, excepto porque su 5'LTR proviene del virus del sarcoma mieloproliferativo y además cuenta al inicio del 3'LTR con un elemento regulador post-transcripcional del virus de Ia hepatitis de Ia marmota. Dado que este vector deriva del retrovirus M387, se utilizó dicho retrovirus como vector control de pD15 sin quimera.

Para generar células transducidas se utilizó Ia línea celular MT2, una línea de células T muy sensible a Ia infección con VIH. Tras su infección con partículas del vector pCIE15, se obtuvo el clon de células transducidas C10. La infección con VIH de células MT2 provocó Ia formación de sincitios, partículas infectivas de VIH y liberación de Ia proteína p24 de Ia cápside a las 24 horas tras Ia infección, afectando a todas las células del cultivo a las 48 horas (figura 1 B). Por el contrario, tras su infección con VIH, las células C10 transducidas no formaron sincitios (figura 1 B) y el número de partículas infectivas generadas tras un solo ciclo de replicación de VIH disminuyó a 1/3 respecto a Io observado en el cultivo de células MT2 (figura 1C). Sin embargo Ia síntesis y liberación de Ia proteína p24 al medio de cultivo no se vio afectada tras 24 horas de infección.

El efecto protector de Ia expresión de Ia quimera CD4ε15 se potenció claramente después del primer ciclo de replicación de VIH, por Io que en células C10 apenas se detectó producción de partículas virales y síntesis de p24 a las 48 horas de Ia infección por VIH (figura 1 D). Mediante lisis de las células transducidas de distintos clones originados por transducción de MT2 (C10, 2 y G11 ) infectadas con VIH, y posterior detección mediante técnicas inmunológicas ("western blot") pudo comprobarse que dichas células continuaban sintetizando el precursor gp160, pero éste no era procesado para originar gp120 (figura 1 E).

Este experimento demostró que Ia transducción con CD4ε15 impide que se extienda Ia infección por VIH al prevenir su transmisión célula a célula a través de los sincitios y virus-a-célula al inhibir Ia formación de partículas infectivas.

EJEMPLO 2. La expresión de CD4ε15 inhibe Ia replicación de distintas cepas de VIH en distintas líneas celulares.

Para excluir posibles influencias de Ia cepa viral, se infectaron cultivos de MT2 (figura 2A, barras blancas) y del clon transducido C10 (figura 2A, barras negras) a una multiplicidad de infección de 0,0001 con distintas cepas de VIH: NL4.3, ME46, Ia cepa de laboratorio CBL-23 del VIH-2 y Ia cepa VISH 86.9 (híbrido entre el VIS y el VIH). En todos los casos se apreció que Ia transducción con CD4ε15 inhibía Ia liberación de p24, siendo particularmente intensa tras varias rondas de replicación, alcanzando Ia inhibición 5 a 6 órdenes de magnitud (figura 2A).

Asimismo, para excluir posibles influencias del clon celular, se procedió a Ia transducción con pCIE15 y pD15 de células T de las líneas PM1 , MOLT4, Jurkat y MT2, y se infectaron con Ia cepa NL4.3 del VIH-1 a baja multiplicidad. Tras Ia infección con NL4.3, se midió Ia liberación de Ia proteína p24 al medio de cultivo tras Ia infección (Dias p.i) y determinó el

porcentaje de células infectadas en cada experimento fue determinado por citometría de flujo. La comparación de células transducidas con los vectores correspondientes sin Ia quimera CD4ε15 mostró que Ia inhibición de Ia replicación del VIH no dependía de Ia línea celular, ni del vector (figura 2B).

Especialmente interesante resultó Ia observación de que se lograba una protección frente a Ia infección por VIH incluso cuando sólo una minoría de las células del cultivo estaba transducida con Ia quimera. Así, cuando únicamente el 20% de las células PM1 estaban transducidas con pCIE15, se observó una reducción de 10 veces en Ia liberación de Ia proteína p24 de Ia cápside del VIH al medio. Un efecto similar se observó cuando sólo un 56% de las células Jurkat estaban transducidas con pD15. La inhibición más intensa de Ia replicación del VIH se observó en Ia línea celular MT2, en Ia que, cuando únicamente el 33% de las células del cultivo estaban transducidas (figura 2B, gráfica MT2), se observaba una reducción de 100.000 veces en Ia liberación de p24 al medio a los 7 días tras Ia infección con VIH.

EJEMPLO 3. La expresión de CD4ε15 ejerce un efecto protector en células vecinas no transducidas.

La expresión de CD4ε15, al inhibir un paso tardío en Ia replicación del VIH (Ia maduración de su envuelta) sólo debería tener efecto en las mismas células que expresan Ia quimera, sin embargo los resultados muestran que Ia expresión de CD4ε15 en un porcentaje minoritario de las células de un cultivo es suficiente para proteger a las otras células de Ia infección por VIH (ver también ejemplo 2). Así, cuando se procedió a Ia infección con VIH-1 de células T primarias transducidas con el vector pCIE15 y se mezclaron en distintas proporciones con células T no transducidas, e igualmente cuando se mezclaron células T de Ia línea MT2 (no transducidas) y del clon C10 (transducidas con pCIE15) y se infectaron las mezclas con Ia cepa NL4.3, Ia replicación del VIH se bloqueó de forma casi completa. Esta inhibición se pudo observar incluso cuando sólo un 30% del cultivo provenía de las células que expresaban Ia quimera. Del

mismo modo, el porcentaje de células T CD4+ en el cultivo primario de células T activadas con fitohemaglutinina e interleuquina-2 (que contiene tanto células T CD4 como CD8,) aumentó hasta asemejarse al de los cultivos no infectados con VIH, debido a que se redujo su mortalidad. Cuando los porcentajes de células transducidas eran menores (7% y 15%) el efecto inhibidor fue dependiente de Ia dosis, es decir a mayor porcentaje de células transducidas, mayor inhibición de Ia infección por VIH (figura 3A, derecha).

Aunque estos ensayos sugerían Ia existencia de un efecto protector en células no transducidas, podía aducirse que Ia medida mediante citometría de flujo del porcentaje de células que expresaban Ia proteína EGFP quizá estaba subestimando el número de células transducidas. Para excluir esta posibilidad se analizaron los efectos de infectar mezclas de cultivos de células C10 (transducidas) y de sus células parentales MT2 (no transducidas), con Ia cepa NL4.3 del VIH. Así, tras Ia infección de las mezclas de distintas proporciones de ambos tipos celulares, se evaluó Ia replicación del VIH analizando Ia liberación de p24 (cuantificada en pg/ml del medio) y estimando Ia carga viral (figura 3A, izquierda). Los resultados muestran como Ia expresión de Ia quimera CD4ε15 en tan sólo un 10% de Ia población celular protegió completamente frente a Ia replicación del VIH a toda Ia población, demostrando de forma evidente el efecto protector de esta expresión en las células no transducidas.

Para asegurar que Ia protección de las células no transducidas por parte del factor no requería contacto célula a célula se realizaron experimentos con placas que contienen pares de pocilios separadas por membranas con un poro de 0.4 μm y que por tanto permiten Ia difusión a su través de macromoléculas pero no de las células (figura 3C). Se crecieron cultivos de C10 o de MT2 en los pocilios superiores y sólo de MT2 en los pocilios inferiores. Posteriormente se infectaron ambos tipos de cultivos con VIH-1 y se evaluó su replicación determinando Ia liberación de Ia proteína p24 de su cápside, así como Ia formación de sincitios en las células. Se observó que cuando el pocilio superior contenía el clon C10 se reducía Ia replicación de VIH en el cultivo de MT2 del pocilio inferior de

forma muy intensa, confirmando que no es necesario el contacto célula a célula.

EJEMPLO 4. El fragmento de Ia región C3-C5 de gp120 es suficiente para conferir protección frente a Ia infección por VIH a células transducidas y a las células no transducidas en un cultivo.

Se centrifugaron cultivos de células T transducidas con CD4ε15 e infectadas con VIH-1 a alta multiplicidad de infección. El sobrenadante fue sometido a ultracentrifugación y el pellet, correspondiente a Ia fracción particulada, se sometió a nuevo fraccionamiento por ultracentrifugación en gradientes de iodixanol. En el gradiente formado, se seleccionaron las fracciones que contenían el factor soluble mediante experimentos de protección de células MT2 frente a Ia infección por VIH. Estas fracciones se fraccionaron nuevamente por ultracentrifugación en gradiente, obteniéndose 11 fracciones en las que se realizaron nuevos ensayos de protección. Mediante separación por electroforesis en geles de poliacrilamida de dichas fracciones se pudo identificar una proteína con un peso molecular de aproximadamente 30KDa que sólo aparecía en Ia fracción protectora (figura 4A, señalada por Ia flecha). Se secuenció parcialmente dicha proteína y se encontró una identidad con un heptapéptido de Ia glicoproteína gp120 del virus VIH (secuencia aminoacídica SEQ ID NO:4, que fue denominado como SIM1 -ver figura 4B). Estas mismas 11 fracciones se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, hibridándose dichas membranas con anticuerpos específicos frente a distintas regiones de gp120 y con una mezcla de sueros de pacientes seropositivos (técnica de "Western blot"). Se encontró que las proteínas que hibridaban con estos anticuerpos y sueros y que correspondían al factor protector (pues se detectaron únicamente en Ia fracción protectora), hibridaban asimismo con anticuerpos específicos que reconocen las regiones C3, C4 y V3 de gp120, respectivamente, pero no con los anticuerpos específicos para Ia región C1. Se comprobó mediante Ia misma técnica que este factor no hibridaba con anticuerpos frente a las proteínas p24 (cápside del VIH) y p17 (matriz del VIH).

Teniendo en cuenta tanto que el heptapéptido que presentaba homología con Ia secuencia SIM1 del factor se encontraba en Ia región V4 de gp120, como el peso molecular de dicho factor y su reactividad frente a anticuerpos anti-C3 y anti-C4, pero no a anticuerpos anti-C1 , se planteó Ia posibilidad de que fuera un fragmento correspondiente al tercio C-terminal de gp120. Se diseñaron por tanto diversos vectores para Ia expresión de fragmentos de gp120 que contenían toda Ia secuencia de las regiones C3 a C5 de gp120 y que se diferencian en Ia presencia o no de Ia región V3 y de Ia secuencia N-terminal de gp41 (estos fragmentos se denominaron I, II, III y IV; véase Ia figura 4B). La inclusión en ciertas construcciones de esta secuencia N-terminal se debió al hecho de que con los datos disponibles no era posible distinguir si el factor antiviral procedía del procesamiento de gp120 ó del procesamiento del precursor gp160 (en este último caso incluiría parte del extremo N-terminal de pg41 ). El vector de expresión fue el pSRα-leader HA, que contiene una secuencia líder para dirigir los distintos fragmentos (I, II, III o IV -ver figura 4B) de gp120 al retículo endoplasmático, permitiendo su secreción, y una secuencia que codifica por un epítopo HA fusionada al extremo N-terminal de dichos fragmentos, que permite su detección usando un anticuerpo anti-HA. Las construcciones se usaron para transducir células COS, recogiéndose muestras del cultivo celular a las 48 horas de Ia transducción. Estas muestras se centrifugaban y se realizaron ensayos de protección de células MT2 frente a Ia infección por VIH utilizando los sobrenadantes de dichas centrifugaciones.

El resultado fue que Ia construcción que codificaba por el fragmento III de gp120, es decir Ia correspondiente a Ia región C3-C5, fue Ia que confirió protección en el ensayo (figura 4C). La transducción de células T Jurkat con el fragmento III y posterior infección con VIH a dos multiplicidades de infección altas (0,1 y 0,5 partículas infecciosas/célula) demostró que Ia expresión de dicho fragmento era suficiente para Ia protección frente a VIH (Figura 4D). Se confirmó por tanto que el factor antiviral es un fragmento del extremo C-terminal de gp120 que corresponde a Ia secuencia C3-C5.