CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção encontra-se no campo da imunologia. A presente invenção se refere a uma proteína do tipo scFv. A presente invenção se refere ainda a um polinucleotídeo. A presente invenção se refere ainda a um vetor. A presente invenção se refere ainda a uma célula hospedeira. A presente invenção se refere ainda a uma composição. A presente invenção se refere ainda a um método para tratar uma doença ou condição que resulta direta ou indiretamente da atividade da integrina α4β1. A presente invenção se refere ainda a um método in vitro para prognosticar doenças inflamatórias crônicas. A presente invenção se refere ainda ao uso de uma proteína ou composição para preparar um medicamento para tratar ou prognosticar doenças inflamatórias crônicas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A esclerose múltipla é uma doença neurológica autoimune caracterizada pela ação de linfócitos T citotóxicos contra células saudáveis que constituem a bainha de mielina. Segundo a Federação Internacional de esclerose múltipla, em 2013, 2,3 milhões de pessoas no mundo foram acometidas por essa doença.

[003] Para que ocorra a desordem funcional caracterizada pelo ataque ao tecido saudável é necessário que haja uma etapa de migração dos linfócitos em direção ao alvo. Esse procedimento de migração, conhecido como diapedese, envolve mecanismos moleculares que irão permitir a passagem desses leucócitos através do endotélio. Uma das proteínas de grande importância nesse processo são as integrinas tipo α4β1, que estão presentes nas membranas dos linfócitos e irão mediar o processo de adesão dessas células ao endotélio, para que ocorra a diapedese.

[004] Devido a seu papel na migração dos linfócitos, a integrina a4p i tem sido alvo para o tratamento de esclerose múltipla, pois a sua inibição impediria o extravasamento dessas células que iriam destruir a bainha de mielina. Um dos tratamentos atualmente realizados consiste no uso do Natalizumab, um anticorpo monoclonal que interage com essas integrinas. Porém, esse anticorpo não é específico para integrinas α4β1, sendo capaz de interagir também com integrinas α4β7. Além disso, alguns pacientes que realizaram esse tratamento apresentaram um quadro de Leucoencefalopatia Progressiva Multifocal (do inglês: PML), uma doença cerebral fatal (HAANSTRA et al., 2013). O surgimento desse quadro foi associado à aplicação do Natalizumab.

[005] As ferramentas de Bioinformática têm contribuído intensivamente na promoção de novos fármacos e biofármacos por viabilizar a engenharia de proteínas in silico. Técnicas como Modelagem Molecular, Docking e Dinâmica Molecular têm promovido o desenvolvimento e o aperfeiçoamento de moléculas, além de realizar testes preliminares para avaliação de seu comportamento e eficácia.

[006] Diante do contexto da ausência comercial de um anticorpo específico para integrinas α4β1 que possa ser utilizado para o tratamento de esclerose múltipla, com riscos de efeitos colaterais relacionados a PML reduzidos, ou para fins prognósticos, o presente trabalho visa desenvolver um anticorpo do tipo scFv específico para essas integrinas, através de ferramentas in silico, tais como modelagem, docking e Dinâmica Molecular.

[007] Integrinas são receptores proteicos transmembranares que participam dos processos de modulação de vias de sinalização e adesão celular. Essas proteínas são heterodiméricas constituídas de uma subunidade a e outra β. Cada monômero constituinte possui uma porção extracelular, transmembranar e intracelular (HYNES, 2002). [008] Em mamíferos, são notificados 18 tipos de subunidades α e 8 tipos de subunidades 0. Existem 24 tipos de integrinas formadas pela combinação de diferentes subunidades a e 0 (HYNES, 2002). As diferentes combinações de subunidades tomam as integrinas específicas para um tipo de componente da Matriz Extracelular ou outros receptores celulares, o que permite diferenciar essa classe de proteínas de acordo com a sua afinidade e função. Por exemplo, integrinas α3β1, α6β1, α6β4 e α7β1 são receptores de laminina (TASHIRO et al., 1999)

[009] A porção extracelular da estrutura de uma integrina é de extrema importância para o desempenho de sua função e possui algumas características peculiares. Parte da subunidade a extracelular é constituída de folhas beta que formam uma estrutura denominada beta propeller (XIONG, 2001). Alguns tipos dessa subunidade contêm uma espécie de domínio adicional constituído de 200 aminoácidos, o domínio I. A ligação a integrinas que possuem o domínio I se dá através deste, o que o toma uma porção estrutural determinante para o reconhecimento da integrina e seu ligante. A subunidade β é estmturalmente parecida com o domínio I (SRICHAI; ZENT, 2010).

[0010] A presença de íons na porção mais externa das subunidades constitui o chamado sítio MIDAS (Metal-Ion-Dependent-Adhesie-Site). O MIDAS é um ponto forte de ligação da integrina e seus alvos, coordenando a interação entre ambas as moléculas. Esse reconhecimento ocorre em um pequeno espaço entre as subunidades α e β. Portanto, as duas subunidades exercem importância na ligação das moléculas alvos, por isso, uma mesma subunidade pode combinar- se com várias outras, resultando em integrinas de diferentes funções e alvos.

[0011] As integrinas em estado fisiológico podem assumir duas conformações diferentes: ativada e inativada. Na forma inativada, a integrina assume uma conformação que diminui a sua afinidade ao ligante. Na forma ativada, a estrutura encontra-se num estado exposto, tomando mais acessível seu sítio de ligação e, portanto, aumentando a afinidade ao ligante (SRICHAI; ZENT, 2010).

[0012] A sinalização mediada por integrinas pode ser do tipo do meio extracelular para intracelular (outside-in) ou do meio intracelular para extracelular (inside-out). A sinalização tipo outside-in refere-se à interação do domínio extracelular da integrina com algum ligante que resulta em sinais intracelulares que afetam o crescimento e diferenciação celular ou apoptose (SRICHAI; ZENT, 2010). Esses sinais são iniciados a partir da formação de um complexo multiproteico chamado FA, responsável pelo início da cascata de sinais.

[0013] A sinalização tipo inside-out é característica de processos de migração celular, onde a interação com o ligante ocorre após a ativação da integrina. Esse tipo de sinalização é importante para processos fisiológicos, em especial, inflamações. Proteínas como as talinas, se ligam ao domínio intracelular da integrina e promovem sua ativação (RATNIKOV; PARTRIDGE; GINSBERG, 2005).

[0014] A distribuição de integrinas do tipo α4β1, também chamadas de VLA-4, no organismo é bastante ampla, de forma que ela pode ser expressa em diferentes tipos celulares, tais como: células NK (do inglês, Natural Killers) (GISMONDI et al. 1991), linfócitos B (RYAN et al, 1991), linfócitos T (SATO et al, 1995), monócitos (CHULUYAN & ISSEKUTZ, 1993), eosinófilos, basófilos (SCHLEIMER et al, 1992), células do músculo liso (DUPLAA et al, 1997), mioblastos e miotubos do músculo esquelético (MCDONALD et al, 1995), células epiteliais tímicas (NIETO et al, 1996) e células dendríticas. Apesar da gama de células que expressam a integrina α4β1, linfócitos T e monócitos são os principais tipos celulares relacionados à expressão de VLA-4 no contexto inflamatório e de doenças vinculadas a α4β1 , devido a transmigração dessas células mediada por tal integrina. [0015] Sete ligantes extracelulares são reconhecidos por VLA-4, sendo esses: trombospondina, MAd-CAM-1 (do inglês, Mucosal vascular addressin Cell Adhesion Molecule 1), osteopontina, ADAM-28 (do inglês, A Disintegrin And Metalloproteinase-28), ICAM-4 (do inglês, Intercellular Adhesion Molecule 4 ), VCAM-1 (do inglês, Vascular Cell Adhesion Molecule 1) e fibronectina (TAKEDA et al, 2007). Dentre esses ligantes, os dois últimos são os mais relevantes quanto a função de VLA-4 e seu envolvimento com diferentes doenças. VCAM-1 é um dos dois principais ligantes de VLA-4, sendo este a molécula chave pelo qual essa integrina medeia a migração transendotelial de linfócitos T e monócitos para o tecido alvo durante um processo inflamatório. A fibronectina (FN), por sua vez, é uma proteína de ECM que constitui também um dos principais ligantes de VLA-4. A interação mediada por VLA-4 e fibronectina é importante para diferentes processos celulares, tais como migração, sobrevivência e diferenciação. Esse ligante possui diferentes sítios de interação para α4β1, e é também reconhecido pela integrina α5β1 (ROSEMBLATT et al., 1991).

[0016] Em doenças crônicas o processo inflamatório ocorre de forma recorrente e na ausência esse de um patógeno ou dano que induza, primariamente, essa resposta. A inflamação crônica ocorre em diferentes sistemas do organismo e, consequentemente, diversas doenças são caracterizadas, de acordo com o local da inflamação. As principais doenças inflamatórias crônicas com etapas mediadas por VLA-4 são: Esclerose Múltipla (EM), asma, artrite reumatoide, Acidente Vascular Cerebral (AVC), Doenças Inflamatórias Intestinais (DII), tais como doença de Crohn, (HYUN et al., 2009) e Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). Outras doenças inflamatórias também relacionadas à α4β1 são doença do olho seco, uveíte e conjuntivite alérgica (ECOIFFIER et al, 2008). Apesar da associação das proteínas VLA-4 com processos inflamatórios, elas também estão relacionadas com outros fenômenos fisiológicos. Por exemplo, é descrito seu papel na hematopoiese (LOBB; HEMLER, 1994) e no desenvolvimento do coração (WINGERD et al., 2002). Trabalhos recentes têm buscado avaliar o potencial teratogênico dessas integrinas (SAKURAI et al., 2014), devido ao seu envolvimento com miócitos cardíacos. Além disso, a associação dessas proteínas com alguns tipos de câncer e suas etapas de desenvolvimento, vem sendo investigados. Em decorrência dessas investigações, novas associações foram feitas, como a descoberta de que a heparina é capaz de inibir a metástase de melanomas por bloquear as integrinas α4β1 (SCHLESINGER et al., 2014).

[0017] Anticorpos são proteínas produzidas pelos linfócitos B em resposta protetora a um determinado antígeno. As funções de um anticorpo para o organismo são: neutralização e opsonização do antígeno, ativação do sistema complemento e citotoxicidade mediada por células (ABBAS, 2015). [0018] A estrutura de um anticorpo é constituída de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Cada cadeia é formada por regiões constantes e variáveis, de forma que as cadeias pesadas são formadas por três ou quatro regiões constantes (Ch) e uma região variável (Vh). As cadeias leves são formadas por uma região constante (Cl) e outra variável (VI). A conformação das quatro cadeias confere ao anticorpo um formato de “Y” (figura 1).

[0019] As diferentes regiões que compõem os anticorpos são chamadas domínios Ig, ou seja, uma molécula de imunoglobulina. Um domínio Ig é formado por folhas beta que são ligadas por uma ponte dissulfeto, formando uma estrutura que lembra um cilindro. A dobra característica de um domínio Ig é denominada dobra de imunoglobulina (MURPHY; TRAVERS; WALPORT, 2010).

[0020] As regiões variáveis, VI e Vh, representam a porção do anticorpo responsável pelo reconhecimento do antígeno, portanto, apresentam composições diferenciadas para garantir a especificidade de reconhecimento. As regiões constantes, Cl e Ch, funcionam como sinalizadoras para outras moléculas do sistema imune, desencadeando as funções efetoras dos anticorpos. Logo, a composição dessas regiões é preservada (MURPHY; TRAVERS; WALPORT, 2010).

[0021] A porção do anticorpo responsável pelo reconhecimento do antígeno é denominada Fab enquanto a porção responsável pelas funções efetoras é chamada Fc (figura 1). A porção Fab é constituída das regiões variáveis e uma região constante de cada cadeia. A porção Fc é constituída apenas de regiões constantes.

[0022] Anticorpos podem ser divididos em classes ou isotipos de acordo com as diferenças das regiões constantes da cadeia pesada e sua conformação. De acordo com esses critérios, os anticorpos podem ser do tipo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgA é um anticorpo característico de defesa de mucosas, circula na forma de dímero e apresenta três regiões constantes na cadeia pesada. IgD é um anticorpo presente apenas na membrana dos linfócitos B. IgE está relacionado à defesa contra helmintos e processos alérgicos, circula na forma monomérica e possui quatro regiões constantes na cadeia pesada. IgG é o isotipo mais abundante, está relacionado aos processos de opsonização, ativação do complemento, imunidade neonatal e citotoxicidade mediada por células, circula na forma monomérica e apresenta três regiões constantes na cadeia pesada. O isotipo IgM pode estar presente na membrana de linfócitos B naive, como receptores, e podem circular no organismo na forma pentamérica. IgM está relacionada à ativação do complemento e sua cadeia pesada é formada por quatro regiões constantes (MURPHY; TRAVERS; WALPORT, 2010).

[0023] Além do seu papel no sistema imunológico, os anticorpos são ferramentas biotecnológicas de amplo uso. Essas biomoléculas podem ser utilizadas para identificação de marcadores fenotípicos, como ferramentas de imunodiagnóstico, na detecção de tumores, terapias e análise funcional de células e moléculas (ABBAS, 2015). [0024] Dentro das regiões variáveis dos anticorpos, há porções hipervariáveis que irão realizar efetivamente a ligação ao antígeno. Essa porção é chamada CDR, Complementarity Determining Region. Cada cadeia possui três CDRs, e cada anticorpo é altamente polimórfico nessas regiões de hipervariabilidade, maximizando a especificidade de reconhecimento (figura 1).

[0025] Existe um formato de anticorpo constituído apenas das regiões VI e Vh conectadas por um peptídeo ligante, mantendo todos os CDRs de cada cadeia, totalizando seis CDRs (três da cadeia pesada e três da cadeia leve) (figura 1). Esse é o menor tipo de anticorpo que consegue manter sua função de reconhecimento e especificidade e é chamado scFv, Single-Chain Fragment Variable (SHEN et al., 2005).

[0026] A utilização desses fragmentos de anticorpo apresenta vantagens em comparação ao uso de anticorpos inteiros como: melhor penetração de tumores, redução da imunogenicidade, menor tempo de retenção em tecidos indesejáveis e facilidade de expressão em bactérias (AHMAD et al., 2012).

[0027] Os scFvs possuem utilidade para diversas áreas, indo desde aplicações médicas a atuação em biossensores. E descrito o uso desse tipo de anticorpo na terapia de artrite, doença de Chron e câncer de mama (AHMAD et al., 2012). Há, também, trabalhos que demonstram a aplicação de scFvs como ferramentas para detecção de antígenos específicos (SPAIN et al., 2016). Além disso, outros estudos exploram as aplicações farmacológicas e de drug delivery dos scFvs (LU et al., 2016).

[0028] A elucidação das estruturas tridimensionais de proteínas fornece informações importantes para o desenvolvimento de algumas áreas da Ciência, em especial, a Biotecnologia. O conhecimento da estrutura tridimensional de proteínas permite que sejam descobertos e explorados alvos moleculares para a obtenção de fármacos, regiões propensas a mutações para obtenção de enzimas e anticorpos com maior eficácia em suas aplicações, e auxilia no entendimento do papel de determinada proteína em uma via bioquímica, tomando-a um alvo de Engenharia Metabólica.

[0029] A obtenção da estrutura terciária de uma proteína experimentalmente ocorre principalmente pelas tecnologias de difração de raio-X - Biocristalografia - e Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Apesar de sua eficácia, essas técnicas são laboriosas e caras, constituindo um fator limitante para a aquisição de novas estruturas proteicas. Portanto, outras ferramentas para obtenção dessas estruturas foram requeridas, o que levou ao início do desenvolvimento e uso dos métodos de modelagem molecular.

[0030] A modelagem molecular consiste na predição in silico da estrutura tridimensional de uma biomolécula, geralmente proteínas. Existem três formas para a obtenção da estrutura tridimensional de proteínas por modelagem molecular: modelagem comparativa, threading e ab initio (KHAN et al., 2016).

[0031] A modelagem comparativa é o método mais preciso para predição in silico de estruturas, em comparação com os outros métodos (KHAN et al., 2016). Essa forma de modelagem consiste no uso de um modelo sequencialmente similar a proteína alvo para a montagem de sua estrutura. O molde utilizado tem sua estrutura tridimensional elucidada e depositada em bancos de dados, e é utilizado como referência para modelagem de acordo com o grau de identidade entre as proteínas envolvidas. As etapas da modelagem comparativa consistem em: alinhamento local para identificação de modelos candidatos e seleção do melhor modelo, alinhamento global com a sequência molde e construção e validação da estrutura (SÁNCHEZ; 1ALI, 1997).

[0032] A escolha da proteína referência para a modelagem depende, principalmente, da quão idêntica essa proteína será comparada a sequência a ser modelada. Portanto, para a descoberta de modelos candidatos é necessário que seja feito alinhamento local da sequência alvo contra bancos de dados de proteínas com estrutura tridimensional conhecida, como por exemplo, o Protein Data Bank, PDB, (BERMAN et al., 2000). A escolha do modelo leva em consideração fatores como: possuir identidade acima de 30% com a sequência alvo, parâmetros relacionados às proteínas - tais como pH e ligantes -, e a qualidade da estrutura depositada através da avaliação de critérios como resolução, fator R e número de restrições por resíduos (KHAN et al., 2016).

[0033] Após a escolha do molde, é necessário que seja feito o alinhamento global das duas sequências proteicas. O alinhamento global irá permitir que haja um pareamento de toda a extensão das duas sequências, o que será importante para a construção do modelo.

[0034] Após o alinhamento global é iniciada a fase de obtenção da estrutura tridimensional da proteína, que será posteriormente validada. Existem três estratégias adotadas para a construção do modelo: montagem por corpo rígido, por correspondência de segmentos e satisfação por restrições espaciais (KHAN et al., 2016).

[0035] A primeira estratégia utiliza corpos rígidos gerados a partir do alinhamento das proteínas para formar um modelo tridimensional. E um método que se baseia na conservação das regiões centro e das cadeias laterais que constituem o enovelamento das proteínas (BLUNDELL et al., 1987).

[0036] A montagem por correspondência de segmentos fundamenta- se no princípio que existem cem classes de hexâmeros (peptídeos com seis resíduos) que funcionam como blocos para a montagem da estrutura. A modelagem ocorre utilizando os hexâmeros como base, que são substituídos pelos segmentos da proteína a ser sequenciada, de acordo com a similaridade conformational (UNGER et al., 1989).

[0037] A última estratégia de modelagem comparativa utiliza restrições obtidas a partir do alinhamento entre as sequências. O fundamento da técnica consiste em que os ângulos e distâncias equivalentes entre resíduos alinhados levam a geração de restrições, ou seja, as coordenadas espaciais de um resíduo obedecem a um limite, uma restrição, que é imposto baseado nos fundamentos bioquímicos e no alinhamento feito. O modelo é então construído respeitando essas restrições (KHAN et al., 2016).

[0038] Independente da estratégia de modelagem utilizada é necessário que a estrutura obtida seja validada. Com essa finalidade, existem servidores, como SAVES e Molprobity, que avaliam parâmetros físicos, estereoquímicos e estatísticos para os modelos construídos, fornecendo informações sobre a qualidade e confiabilidade da estrutura.

[0039] Existem situações em que a modelagem comparativa não é indicada, por exemplo, quando a proteína molde tem identidade inferior a 30%. Nesse caso, a obtenção da estrutura tridimensional pode ocorrer por threading ou ab initio. A modelagem tipo threading não requer uma similaridade entre sequências, mas baseia-se no princípio que proteínas podem possuir um enovelamento similar ainda que suas sequências sejam distintas. Já a modelagem ab initio utiliza algoritmos que irão predizer as coordenadas espaciais sem que haja um referencial como modelo, baseando- se em fundamentos físicos.

[0040] A Modelagem Molecular é, portanto, uma metodologia potencial para a obtenção da estrutura tridimensional de anticorpos e construção de scFvs, possibilitando o uso de suas estruturas em outras ferramentas computacionais.

[0041] Os avanços nas áreas de drug discovery e drug design proporcionados pela necessidade de novos fármacos e biofármacos gerou a demanda por uma ferramenta rápida e eficaz para a avaliação da capacidade de interação entre biomoléculas e determinados ligantes. Diante dessa demanda, plataformas de docking molecular tornaram-se ferramentas importantes corriqueiramente utilizadas nessas áreas (JUG; ANDERLUH; TOMAEIc, 2015).O docking molecular é utilizado para delinear interações entre determinadas moléculas e uma proteína alvo em níveis atômicos, acompanhando o comportamento dessas moléculas no sítio de ligação da proteína e esclarecendo o processo bioquímico envolvido (MCCONKEY; SOBOLEV; EDELMAN, 2002). Existem duas etapas básicas nesse processo: a predição da conformação do ligante e a sua orientação no sítio de ligação e a avaliação da afinidade de ligação (MENG et al., 2011). Essas duas etapas são feitas diferentemente entre as plataformas existentes, havendo, portanto, diferentes algoritmos para o ajuste espacial dos ligantes e para o cálculo da afinidade.

[0042] Existem vários algoritmos para a fase de orientação espacial do ligante, os quais pode-se destacar os Algoritmos de Matching (MA), de Construção Incrementai (IC), Monte Cario (MC) e os Algoritmos Genéticos (GA). Os algoritmos tipo MA baseiam-se na forma molecular do ligante e em suas propriedades químicas para indicar a melhor pose dentro do sítio de ligação. Os algoritmos IC buscam inserir o ligante no sítio de ligação de maneira fragmentada e refinada para estabelecer a orientação. Já os tipos MC originam posições a partir da rotação e/ou translação de corpos rígidos e ligações. Os GA transformam graus de liberdade do ligante em códigos binários que são ditos como genes, a organização desses genes constitui um cromossomo que representa a posição do ligante (MENG et al., 2011).

[0043] O cálculo da afinidade de ligação é feito por funções de escores, que podem ser divididas em três tipos: baseadas em campo de força, empíricas e baseadas em conhecimento. As funções de escore baseadas em campo de força fundamentam- se na soma das energias de interação e energia interna do ligante. As funções empíricas utilizam dados experimentais das moléculas envolvidas para obtenção do escore, resultando em uma soma de vários parâmetros. Já as funções baseadas em conhecimento utilizam potenciais de interação entre átomos (KITCHEN et al., 2004).

[0044] As duas etapas do docking são comuns aos programas e servidores que o realizam, entretanto, diferentes metodologias de desempenho são empregadas. Essas metodologias diferem nas opções de fixar ou flexibilizar os componentes do docking, proteína e ligante, para sua realização. Existem, portanto, três metodologias: proteína e ligante rígidos, adotada pelos por programas como DOCK e FLOG, proteína rígida e ligante flexível, utilizada por programas como AutoDock e FlexX, e com ambos componentes flexíveis, como no caso dos programas IFREDA e QXP (MENG et al., 2011).

[0045] A produção de anticorpos, enzimas engenheiradas ou outras proteínas com fins comerciais possuem como uma de suas limitações o gasto com recursos na fase de teste e desenvolvimento. E necessário que essas biomoléculas sejam testadas em diferentes condições de acordo com a sua aplicação para que possuam eficiência no seu uso, justificando, portanto, a sua comercialização. Entretanto, esses ensaios requerem tempo, reagentes e equipamentos e, no caso de resultados negativos, há uma perda desses recursos, o que é indesejável para a instituição ou empresa que se propõe a desenvolver esse processo. Portanto, é de grande interesse para pesquisadores, empresários e cientistas da área que haja uma forma de simular computacionalmente a atuação de suas moléculas, através de um algoritmo que proporcione essas condições in silico. Essa demanda é atendida através das ferramentas de Dinâmica Molecular (DM).

[0046] As técnicas de DM utilizam fundamentos da Mecânica Clássica para prever o comportamento de cada átomo de um determinado sistema ao longo do tempo (NAMBA; SILVA; SILVA, 2008). Durante o processo, são levados em consideração diversos fatores como as coordenadas dos átomos, composição do sistema, velocidades iniciais e potenciais que quando combinados ao algoritmo adequado para o sistema, e suas condições, irão fornecer os resultados (PINEIRO, 2009).

[0047] Para a execução da dinâmica molecular é necessário que seja feito um tratamento dos arquivos que correspondem às moléculas que serão submetidas a esse processo. Esse tratamento irá originar o sistema apropriado para que ocorra a simulação, já que, inicialmente, conta-se apenas com o arquivo das coordenadas dos átomos no espaço da molécula ou complexo que será foco da simulação.

[0048] O primeiro passo para a obtenção de um sistema apropriado para DM é a geração da topologia, que dará início à criação do sistema. O arquivo de topologia irá conter todas as informações a respeito de quais átomos compõem as moléculas, quais suas posições, forças, velocidades, quais os tipos de ligação estão presentes, os ângulos entre os átomos e todos os atributos a respeito da molécula organizados para a interpretação do programa de forma que todas essas condições sejam levadas em consideração no momento da simulação (GROMACS, 2016).

[0049] Para a criação da topologia é necessário que se defina um campo de força, que irá designar termos para a inclusão e organização das informações, tais como propriedades das ligações e energias potenciais (GROMACS, 2016). Existem vários tipos de campos de força, que vão variar na forma de combinação dos parâmetros considerados. O campo de força é fundamental para a sumarização e integração de todos os dados a respeito do alvo da DM. A escolha do uso de um tipo de campo de força vai depender do tipo de simulação e da natureza das moléculas envolvidas.

[0050] Após a geração do arquivo de topologia, é aplicada a chamada Condição Periódica de Contorno (PBC). A PBC consiste na delimitação do sistema através da adição da construção de uma caixa, aonde dentro dela ocorrerá a DM (figura 4). A aplicação dessa condição serve para reduzir o efeito de superfície. Além disso, essa condição garante que o número de átomos do sistema seja conservado durante a simulação, pois a caixa que contém o sistema é replicada em várias direções do espaço, garantindo assim que quando um átomo saia por um lado da caixa seja capaz de retomar pelo outro lado (NAMBA; SILVA; SILVA, 2008). A caixa delimitadora pode ter diferentes formas, como cúbica e triclínica.

[0051] É necessário que as moléculas estejam imersas em um solvente para que a simulação seja fiel às condições reais, portanto, o próximo passo é a adicionar um solvente ao sistema (figura 4). Normalmente, o solvente utilizado é a água. Existem vários modelos de água que variam quanto a sua difusividade, distribuição radial e outros fatores (KHAN et al., 2016). Assim como a escolha do campo de força, a escolha do tipo de modelo de água varia com o tipo de simulação e a natureza do sistema. Uma vez que o sistema está imerso em um solvente, é necessário que ocorra a neutralização de cargas através da adição de íons, como sódio ou cloro ao meio.

[0052] Uma vez que o sistema está solvatado e neutralizado, é necessário que haja uma minimização de energia antes que seja feita a simulação para interações irreais (PINEIRO, 2009) e assim adaptar o sistema a um estado termodinamicamente favorável. Os principais algoritmos para minimização utilizados são: steepest descent, gradientes conjugados e Newton-Raphson (NAMBA; SILVA; SILVA, 2008).

[0053] Os algoritmos de minimização de energia variam na forma de obtenção de um estado energeticamente mais favorável. O método steepest descent faz correções nas geometrias desfavoráveis das moléculas do sistema. O método dos gradientes conjugados é uma derivação do steepest descent, com as vantagens de ser mais rápido e incluir arranjos de direção. O método de Newton-Raphson baseia-se no uso da função hessiana (KHAN et al., 2016).

[0054] Após a minimização, recomenda-se que seja feita uma fase de equilíbrio ou termalização do sistema. Essa termalização é uma curta simulação de DM. Após esse estado de equilíbrio realiza-se a simulação propriamente dita, também chamada de dinâmica de produção.

[0055] As técnicas de DM consistem na integração das equações de movimento newtonianas, de modo que as forças atuantes sobre os átomos do sistema sejam supervisionadas ao longo do tempo, bem como a trajetória de cada átomo. Os principais algoritmos utilizados que conduzem a DM, responsáveis pela integração das equações de movimento, são os algoritmos de Verlet, de Beeman e o método leap-frog (NAMBA; SILVA; SILVA, 2008).

[0056] Durante a fase de integração, o sistema deve encontrar-se em um estado onde determinados atributos mantêm-se constantes. Esse estado é referido como ensemble e é classificado de acordo com as propriedades que são mantidas constantes (REBOUÇAS, 2015). Os ensembles mais utilizados são do tipo NVT (Número de mols, Volume e Temperatura constantes) e NPT (Número de mols, Pressão e Temperatura constantes).

[0057] Uma vez definido o ensemble e o algoritmo para DM, a simulação de produção ocorre. Diferentes resultados são obtidos a partir dos arquivos de saída da simulação. Podem ser avaliados parâmetros como: energia, RMSD (Root Mean Square Deviation), RMSF (Root Mean Square Fluctuation), ligações hidrogênio, pontes salinas, estrutura secundária de proteínas, raio de giro, ângulos e diedros, além de itens relacionados a proteínas e interfaces (GROMACS, 2016).

[0058] A Dinâmica Molecular, portanto, pode ser utilizada para a avaliação do comportamento de um scFv isolado e em contato com o antígeno, permitindo a análise da interação entre anticorpo e antígeno.

[0059] Devido ao envolvimento de VLA-4 em diversos processos patológicos, o desenvolvimento de inibidores tomou-se uma importante estratégia terapêutica. Apesar de diversos estudos voltados para o desenvolvimento de moléculas anti- VLA-4, segundo o banco de dados da empresa Biocentury® apenas três medicamentos inibidores dessa integrina encontram-se já comercializados ou em estudo clinico 2 ou 3: o Firategrast, o AJM300 e o Natalizumabe. [0060] O Firategrast (C ₂₇ H ₂₇ F ₂ NO ₆ ) é uma pequena molécula antagonista à α4β1 e α4β7 (LPAM-1) (GROVE RA et al, 2013) e tem sido investigado para o tratamento de EM, apresentando vantagens como disponibilidade oral e baixa meia vida (2 a 5 horas) (MILLER et al, 2012). A administração por via oral facilita a aplicação e aceitação do medicamento, enquanto a baixa meia vida diminui riscos associados a segurança de moléculas anti-VLA-4, reduzindo assim as chances de o paciente desenvolver uma doença oportunista durante o tratamento. Esse fármaco foi submetido à avaliação clínica fase 2, em que doses de 900 mg ou 1200 mg aplicadas duas vezes ao dia demonstraram significante redução do número de lesões causadas por EM, mostrando-se um potencial fármaco a ser utilizado no tratamento dessa doença (MILLER et al, 2012).

[0061] O AJM300 (C ₂₅ H ₁₉ C ₁₂ N ₃ O ₅ ), assim como o Firategrast, é uma pequena molécula antagonista à integrinas α4, atualmente em avaliação clínica fase 3. Esse medicamento possui disponibilidade oral, baixa meia- vida e vem sendo investigado para o tratamento de DII (SUGIURA T et al, 2013). Durante a avaliação fase 2, foi demonstrado que doses de 960 mg aplicadas três vezes ao dia em pacientes com colite ulcerativa levou a um significante aumento nos escores de respostas clínicas, remissão clínica e cicatrização da mucosa, sendo este fármaco, portanto, um inibidor de VLA-4 com potencial utilização para tratamento dessa doença (YOSHIMURA et al, 2015).

[0062] O Natalizumabe, ou Tysabri, é um medicamento composto de anticorpos monoclonais humanizados, que contêm CDRs (do inglês, Complementarity-Determining Regions) derivados de um anticorpo anti- CD49d (anti-a4) murino inserido em uma estrutura de IgG4 humana (SCHWAB N et al, 2015). É capaz de ligar-se às integrinas VLA-4 e LPAM- 1 através do reconhecimento da subunidade α4, e é aprovado para utilização no tratamento de doença de Crohn e EM.

[0063] Atualmente, o Natalizumabe é utilizado em casos de EMRR (Esclerose Múltipla Recidivante Remitente), que consiste na reincidência de episódios clínicos agudos da doença. Essa forma é normalmente caracterizada por surtos sintomáticos que duram de dias a semanas, e podem levar a formação de novas lesões cerebrais durante o período de surto, seguidos de um período de melhora. A indicação de uso de Natalizumabe é voltada para pacientes que apresentam frequência de pelo menos um a dois surtos em doze meses após o início do uso de algum tratamento (tais como IFN-γ e acetato de glatiramer), apresentam lesões facilmente detectáveis e aumento do número dessas lesões em 6 ou 12 meses após o início de um tratamento prévio. Nesses casos, o Natalizumabe é aplicado uma vez a cada quatro semanas em uma dose de 300 mg (SCHWAB N et al, 2015).

[0064] Apesar da eficácia da utilização do Natalizumabe no tratamento de EMRR, chegando a reduzir a frequência de surtos em até 68 % (POLMAN CH et al, 2006), uma das limitações relacionadas ao uso desse medicamento é a sua associação com o risco de progressão de uma doença cerebral grave, a LPM (Leucoencefalopatia Progressiva Multifocal). A LPM é uma infecção cerebral oportunista causada pelo vírus JC (vírus John Cunningham). Durante a fase de avaliação clínica 3 do Natalizumabe, três pacientes submetidos ao tratamento de EMRR manifestaram a doença, após o início do uso do medicamento, e vieram a falecer devido a progressão da LPM, levando à retirada do fármaco em 2005 e a sua reintrodução em 2006 (BLOOMGREN et al, 2012). Estudos demonstram que alguns fatores influenciam no risco do desenvolvimento de LPM pelos pacientes, tais como o uso prévio de imunossupressores, presença de anticorpos anti-vírus JC e aumento da duração do tratamento com Natalizumabe (BLOOMGREN et al, 2012), que também causa efeitos de imunossupressão.

[0065] Atualmente, um frasco de 15 mL de Natalizumabe 20 mg/mL, referente a uma dose, é comercializado a um preço entre R$ 6.200,00 a 7.163,65 (https://consultaremedios.com.br/tysabri/p). Em 2013, o Ministério da Saúde publicou um relatório referente à distribuição e uso desse medicamento como tratamento de segunda linha da EMRR. O custo de uma dose de Natalizumabe para o SUS (Sistema Único de Saúde) é de R$ 2.245,00, de forma que durante a fase de implementação, a empresa Biogen - responsável pela produção e comercialização do Natalizumabe - estimou impacto orçamentário, relativo ao fornecimento de Natalizumabe, avaliado em 8 milhões de reais em 5 anos (www.saude.gov.br/sctie). Portanto, o custo do tratamento de EMRR utilizando esse fármaco é extremamente elevado, tanto para o seu fornecimento através do governo como para a aquisição particular.

[0066] Apesar de os atuais medicamentos anti-VLA-4 serem voltados para o tratamento de EM e DII, o bloqueio de VLA-4 por diversos inibidores tem se mostrado promissor em diferentes doenças. Estudos em camundongos demonstram que a aplicação de anticorpos anti-a4 inibiu o crescimento de mielomas, ressaltando seu potencial na terapia anti-câncer (Olson et al, 2005). Outros trabalhos, utilizando modelo ovino, demonstraram a aplicação promissora de moléculas inibidoras de VLA-4 no tratamento de asma (SINGH J et al, 2004). Além disso, diversos trabalhos apresentam o uso de inibidores dessa integrina no tratamento de doenças menos evidentes, tais como doença do olho seco (ECOIFFIER et al, 2008) e doença falciforme (WHITE et al, 2016).

[0067] CHAVES, B. (2016 (1)) objetivou a construção de um anticorpo cadeia única variante dedicado a ter afinidade apenas com a integrina α4β1. Todo o trabalho foi feito in silico, e as cadeias foram modeladas e testadas em programas diversos (Modeller, EMBOSS, BLAST, Molprobity, Verify 3D, Coot, PyMol, e servidores GetArea, Robetta Alanine Scaning, Haddock, PDBePISA, pacote Gromacs 5.1,). Seis possíveis scFvs foram modelados e avaliados e, após etapa de mutagênese, apenas duas potenciais sequências e a sequências controle dos scFvs foram selecionadas para simulação de dinâmica molecular (scFv B, scFv X e scFv nativo). Importante ressaltar o item 4.9 sobre mutagênese dirigida dos scFvs, direcionadas aos hotspots interatuantes para tomar o entorno um ponto forte de interação. Foi concluído que o scFv 257898 modificado teve melhores simulações. Não foi revelada sequência scFv específica, mas códigos das sequências nativas (anterior das etapas de bioinformática) obtidas do Integrity (Ex: 257898 - Takedas’s Vedozulimab).

[0068] CHAVES, B. et al. (2016 (2)) divulgou três fontes de sequência do Integrity usadas para modificações genéticas (257898, 670484, 725144). Um ligante GGGGS também foi revelado. Todo o desenvolvimento é in silico e destaca o potencial de uma molécula específica não divulgada.

[0069] YUAN Q et al. (1996) descreve o uso de um anticorpo cadeia única (sFv) preparado a partir do anticorpo HP1/2, com efeito anti integrina a4 já conhecido (YEDNOCK et al., 1992). Foi feita a adição de um ligante intercadeia (GGGGS)3 e sequência de retenção no retículo endoplasmático (KDEL). A sequência humanizada do mAb HP 1/2 de camundongo foi desenhada, denominado hHPl/2, e usado para a construção do anticorpo (sFv- 195). Foi então modificado por PCR e inserido oligonucleotídeos fita-dupla sintéticos. Os dois domínios (porção pesada - VH - e porção leve - VL), ligantes (GGGGS)3 , sequências KDEL, e os sítios de restrição convenientes, estão representados no esquema abaixo (figura 1). O constructo acima foi verificado, inserido em plasmídeo (pUC19) usados para transformar bactérias. Após confirmação, foi incluído em plasmídeo de expressão de mamíferos usando o vetor de expressão pMHneo e transfectados em células de Jurkat. Foi possível observar a diminuição de pelo menos 65% até 100%, em algumas amostras, da expressão da integrina α4β1 em células Jurkat, além de praticamente extinguir a mobilidade celular em testes in vitro.

[0070] CLARK, L. A. et al. (2006) divulga a otimização da afinidade de um anticorpo monoclonal, dito AQC2, e a integrina α1β1 (VLA-1), especificamente, com o objetivo de inibir a transmigração de linfócitos T e monócitos nas regiões de inflamação remediando artrite. A estratégia utilizada foi a mutação de pontual de locais estratégicos (single-point mutations), p.ex. periferia da interface anticorpoantígeno. A sequência de anticorpo com maior otimização foram as mutacionadas nos sítios S28Q e N52E da cadeia pesada, e em T50V e K64E da cadeia leve. A afinidade final obtida foi 10 vezes superior.

[0071] O documento US 2018/0369330 aponta proteínas para inibir a ligação de uma integrina, através da estabilização da conformação proteica “E-H+”, aumentando sua ocorrência e/ou duração, usando proteínas terapêuticas (anticorpo, fragmento de anticorpo, anticorpo sintético, proteína de fusão, pequena molécula proteica) baseadas em integrinas para fins de tratamento de doenças inflamatórias e/ou moduladas pelo sistema imune. O fragmento inclui a concretização de scFv. A partir do problema técnico apresentado, relacionado à ocorrência de PML em tratamentos com medicamentos direcionados às integrinas α4β1 e α4β7, i.e., natalizumab, é proposto pela presente invenção compostos estabilizadores e/ou modificadores. Tal proteína é terapêutica, como descrita acima, e é capaz de inibir uma das integrinas, incluindo α4β1.

[0072] O documento US 10,335,485 lista anticorpo específicos para VLA-4, com vantagem inovadora com afinidade incrementada pela integrina α4β1 quando comparado ao natalizumabe (p.11, 1. 57) gerando diminuição da ocorrência de PML. O ganho de afinidade é possível através da humanização da sequência parental murina HP 1/2 já conhecido no estado da técnica (HANF et al., 2014). A terapia descrita tem como doenças alvo a esclerose múltipla, asma (moderada a severa), artrite reumatoide, diabetes e doença de Crohn. Descreve, também, que a sequência proteica se trataria de uma molécula de cadeia simples Fv (scFv).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0073] Atualmente, o único anticorpo monoclonal terapêutico disponível comercialmente que interage com integrinas α4β1 é o Natalizumab, utilizado nos tratamentos de esclerose múltipla. Entretanto, esse anticorpo não é específico apenas para α4β1, interagindo também com α4β7. Além disso, a sua aplicação em alguns pacientes proporcionou a recrudescência de uma doença cerebral, a Leucoencefalopatia Progressiva Multifocal. Portanto, seu uso é limitado. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar a construção in silico de um scFv específico para integrinas α4β1. Foram testados anticorpos do tipo scFv, Single Chain Fragment Variable, que constituem um pequeno formato de anticorpo, conservando as regiões hipervariáveis das cadeias leve e pesada e preservando, portanto, a sua especificidade. Dentre as principais vantagens da utilização terapêutica desses fragmentos de anticorpos, destaca-se a capacidade de penetração em tecidos inacessíveis a anticorpos completos, menor custo de produção associado, pois esses fragmentos podem ser produzidos em sistemas heterólogos mais simples, tais como bactérias e leveduras, ausência da porção Fc, menor imunogenicidade e menor tempo de retenção em tecidos indesejados.

[0074] Em um aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína do tipo scFv compreendendo uma primeira cadeia de polipeptídeos e uma segunda cadeia de polipeptídeos unidas por um ligante, apresentando a fórmula como segue: (domínio VH) - (ligante) - (domínio VL), em que o domínio VH compreende pelo menos os aminoácidos N173, Y176, K181, Y217, Y222 da SEQ ID NO: 3 e o domínio VL compreende pelo menos os aminoácidos K31, Y33, N35 da SEQ ID NO: 3. Em uma concretização, o domínio VH compreende as regiões determinantes de complementariedade (CDR1, CDR2, CDR3) que consistem das SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 e o domínio VL compreende as regiões determinantes de complementariedade (CDR1, CDR2, CDR3) que consistem das SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9. Em outra concretização, o domínio VH compreende os aminoácidos Q117 a S237 da SEQ ID NO: 3 e o domínio VL compreende os aminoácidos Dl a 1111 da SEQ ID NO: 3. Em outra concretização, o ligante apresenta de 5 a 15 aminoácidos de comprimento. Em outra concretização, o peptídeo ligante compreende pelo menos a sequência GGGGS. Em outra concretização, a proteína se liga seletivamente à integrina α4β1. Em outra concretização, a proteína é para uso em um método para o prognóstico ou tratamento de doenças inflamatórias crônicas, preferencialmente esclerose múltipla.

[0075] Em outro aspecto, a invenção se refere a um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1.

[0076] Em outro aspecto, a invenção se refere a um vetor compreendendo o polinucleotídeo como anteriormente definido.

[0077] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo o vetor como anteriormente definido. Em uma concretização, a célula hospedeira é uma célula bacteriana. Em outra concretização, a célula bacteriana é uma célula de E. coli.

[0078] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição, compreendendo a proteína anteriormente mencionada e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma concretização, a composição é para uso no tratamento de ou prognóstico de doenças inflamatórias crônicas, preferencialmente esclerose múltipla.

[0079] Em outro aspecto, a invenção se refere a método para tratar uma doença ou condição que resulta direta ou indiretamente da atividade da integrina α4β1, compreendendo administrar a um ser humano uma proteína uma composição, como anteriormente definidas. Em uma concretização, a doença ou condição é uma doença inflamatória crônica, preferencialmente esclerose múltipla.

[0080] Em outro aspecto, a invenção se refere a método in vitro para prognosticar doenças inflamatórias crônicas compreendendo contatar pelo menos uma proteína como anteriormente definida ou uma composição como anteriormente com uma célula, tecido ou amostra de um indivíduo, detectar a ligação da proteína à célula, tecido ou amostra, quantificar a expressão de VLA-4 e indicar um tratamento mais adequado para o paciente.

[0081] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso da proteína ou composição anteriormente definida para preparar um medicamento para tratar ou prognosticar doenças inflamatórias crônicas, preferencialmente esclerose múltipla .

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0082] O objetivo da invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma, poderá ser melhor entendido mediante referência às figuras em anexo e às seguintes descrições:

Figura 1 - Conformação das cadeias de um anticorpo e de um fragmento de anticorpo scFv. Rosa: CDR1; Amarelo: CDR2; Azul: CDR3

Figura 2 - Estruturas obtidas das cadeias leves dos anticorpos;

Figura 3 - Estruturas obtidas das cadeias pesadas dos anticorpos;

Figura 4 - Gráficos de Ramachandran gerados pelo Molprobity para as cadeias modeladas. Os pontos representam os resíduos de aminoácidos de cada cadeia de anticorpo. As regiões delimitadas em azul claro representam as regiões favoráveis, em azul escuro as regiões permitidas e as não delimitadas representam regiões não permitidas

Figura 5 - Estruturas de todos os scFvs obtidos

Figura 6 - Valores de Haddock Score dos dockings dos scFvs nativos e modificados com as integrinas α4β1 e α5β1;

Figura 7 - Valores de Cluster size dos dockings dos scFvs nativos e modificados com as integrinas α4β1 e α5β1

Figura 8 - RMSD em A dockings dos scFvs nativos e modificados com as integrinas α4β1 e α5β1

Figura 9 - Valores de RMSD das simulações do scFv nativo com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 10 - Valores de RMSD das simulações do scFv B com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 11 - Valores de RMSD das simulações do scFv X com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 12 - Valores de RMSF das simulações do scFv nativo, B e X com as integrina α4β1

Figura 13 - Valores de RMSF das simulações do scFv nativo, B e X com a integrina α4β7

Figura 14 - Valores de RMSF das simulações do scFv nativo, B e X com a integrina α5β1

Figura 15 - Valores de raio de giro das simulações do scFv nativo com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 16 - Valores de raio de giro das simulações do scFv B com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 17 - Valores de raio de giro das simulações do scFv X com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 18 - Número de ligações hidrogênio durante as simulações do scFv nativo com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 19 - Número de ligações hidrogênio durante as simulações do scFv B com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 20 - Número de ligações hidrogênio durante as simulações do scFv X com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 21 - Pontes salinas entre o scFv nativo e integrina α4β1 durante a simulação

Figura 22 - Pontes salinas entre o scFv nativo e integrina α4β7 durante a simulação Figura 23 - Pontes salinas entre o scFv nativo e integrina α5β1 durante a simulação

Figura 24 - Pontes salinas entre o scFv B e integrina α4β1 durante a simulação

Figura 25 - Pontes salinas entre o scFv B e integrina α4β7 durante a simulação

Figura 26 - Pontes salinas entre o scFv B e integrina α5β1 durante a simulação

Figura 27 - Pontes salinas entre o scFv X e integrina α4β1 durante a simulação

Figura 28 - Pontes salinas entre o scFv X e integrina α4β7 durante a simulação

Figura 29 - Pontes salinas entre o scFv X e integrina α5β1 durante a simulação

Figura 30 - Valores de energia total das simulações do scFv nativo com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 31 - Valores de energia total das simulações do scFv B com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 32 - Valores de energia total das simulações do scFv X com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 33 - Valores do Potencial de Coulomb das simulações do scFv nativo com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 34 - Valores do Potencial de Coulomb das simulações do scFv B com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figuras 35 - Valores do Potencial de Coulomb das simulações do scFv X com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 36 - Valores do Potencial de Lennard- Jones das simulações do scFv nativo com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 37 - Valores do Potencial de Lennard-Jones das simulações do scFv B com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 38 - Valores do Potencial de Lennard- Jones das simulações do scFv X com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

Figura 39 - Passo a passo para lise, lavagem e obtenção dos corpos de inclusão formados pelo scFv

Figura 40 - Passo a passo para lise, lavagem e obtenção dos corpos de inclusão formados pelo scFv em produção escalonada

Figura 41 - Clonagem molecular: construção do vetor recombinante pET28a+scFv. P - Padrão DNA ladder 1 kb Invitrogen®; G.A - gene scFv-anti-VLA-4 amplificado; C.N - controle negativo; 11 a 21 - identificação dos clones recombinantes; C.P - controle positivo

Figura 42 - Avaliação da expressão do scFv antes e após a adição de IPTG 0,5 mM, por SDS-PAGE e Western blotting. Pl - BenchMark™ Protein Ladder; P2 - padrão Pre-stained Bio-Rad 1610305®; 12, 15 e 20 - identificação dos clones; NI - fração total de proteínas antes da indução da expressão; I - Fração total de proteínas após a indução da expressão

Figura 43 - Avaliação inicial da solubilidade do scFv em soluções tampão base e aditivadas. P - BenchMark™ Protein Ladder; NI - fração total de proteínas antes da indução da expressão; I - Fração total de proteínas após a indução da expressão; a. - Tris 20 mM Triton™ X-100 0,1 %; b. - Tris 20 mM Triton X-100™ 0,5 %; c. Cell Lytic ®; Sol - Fração solúvel de proteínas na solução indicada; Ins - Fração insolúvel de proteínas na solução indicada; b.l - Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % NaCl 150 mM; b.2 - Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % NaCl 300 mM; b3. - Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % L-arginina 0,2 M; b4. - Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % L-arginina 0,4 M; b5. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % Glicerol 10 %; b6. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % MgCl ₂

Figura 44 - Avaliação da solubilidade do scFv após expressão em temperaturas reduzidas (30, 23 e 16°C). P - BenchMark™ Protein Ladder; NI - fração total de proteínas antes da indução da expressão; I - Fração total de proteínas após a indução da expressão; stb - solução tampão base Tris 20 mM Triton™ X-100 0,1 %; sta - solução tampão aditivada Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % L-arginina 0,4 M NaCl 50 mM; EB - Fração total de proteínas na solução indicada; Sol - Fração solúvel de proteínas na solução indicada; Ins - Fração insolúvel de proteínas na solução indicada

Figura 45 - Avaliação da solubilidade do scFv em soluções contendo ureia 1, 4 e 8 M. P - BenchMark™ Protein Ladder; i - Tris 20 mM Triton™ X 100 0,5 % Ureia 1 M; ii - Tris 20 mM Triton™ X 100 0,5 % Ureia 4 M; iii - Tris 20 mM Triton™ X 100 0,5 % Ureia 8 M; EB - Fração total de proteínas na solução indicada; Sol - Fração solúvel de proteínas na solução indicada; Ins - Fração insolúvel de proteínas na solução indicada

Figura 46 - Expressão do scFv em diferentes condições. A esquerda, geis de SDS-PAGE demonstrando o perfil de proteínas produzidas durante a expressão, antes e após a adição de IPTG. As setas roxas apontam para banda proteica correspondente ao scFv. A direita, gráfico com a porcentagem de scFv relativo a cada gel SDS-PAGE demonstrado. A porcentagem referente a TB, 30 °C em biorreator corresponde a média de três experimentos distintos. A barra de erro para essa condição refere-se ao desvio padrão calculado

Figura 47 - Concentração de glicose e biomassa bacteriana durante os processos de expressão do scFv em batelada simples (à esquerda) ou alimentada com glicose (à direita). No gráfico, a concentração de glicose no inóculo (g/L) é mostrada no eixo y e a biomassa (g/L) é mostrada no eixo secundário versus o tempo no eixo x. O crescimento foi realizado por 2 h e indução da expressão, por 4 h no processo de expressão a 30 °C, meio TB, em micro biorreator FOGALE BIOPOD F800

Figura 48 - Expressão do scFv em batelada simples e alimentada com glicose. A esquerda, gel SDS-PAGE demonstrando as frações não induzidas e induzidas de cada processo. P - Padrão de peso molecular Bench Marker Protein ladder Invitrogen®; b.s - batelada simples; b.a - batelada alimentada; NI - fração total de proteínas antes da indução da expressão; I - Fração total de proteínas após a indução da expressão. No meio, imagem de gel gradiente com as frações de proteínas após indução da expressão para batelada simples (esquerda) e alimentada (direita). As marcações numéricas de porcentagem foram geradas pelo programa QuantityOne. A esquerda, representação gráfica das porcentagens de scFv expresso em ambos os processos

Figura 49 - Etapas de purificação do scFv. P - BenchMark™ Protein Ladder; EB1, Fsoll, EB2, Fsol2, EB3, Fsol3 - Frações totais e solúvel de proteínas de acordo com a etapa de lavagem com ureia, sendo 1 e 2 lavagens com Tris 20 mM Triton™ X 100 2 % NaCl 0,5 M e ureia 0,5 M, e 3 a lavagem com Tris 20 mM Triton™ X 100 2 % NaCl 0,5 M ureia 1 M; C.I - corpos de inclusão; Fsol - fração de proteínas solúveis em Tris 50 mM NaCl 0,5 mM ureia 8 M imidazol 1 mM, aplicada na coluna IMAC para purificação; Void - fração de proteínas que não ligaram a resina de níquel; F1 - frações de proteínas eluídas com Tris 50 mM NaCl 0,5 mM ureia 8 M imidazol 1 mM; F2 - frações de proteínas eluídas com Tris 50 mM NaCl 0,5 mM ureia 8 M imidazol 5 mM; El a E4 - frações de proteína recombinate eluídas com Tris 50 mM NaCl 0,5 mM ureia 8 M imidazol 1 M; scFv - proteína recombinante após renaturação

Figura 50 - Gráfico da pureza do scFv ao longo das etapas de purificação. Os resultados são demonstrados como média de dois experimentos independentes. As barras de erros representam o desvio padrão calculado referente aos valores obtidos nos experimentos. P < 0,05 (one-way ANOVA)

Figura 51 - Etapas do aumento de produção do scFv (1 a 6). P - BenchMark™ Protein Ladder; NI - fração total de proteínas antes da indução da expressão; I - fração total de proteínas após a indução da expressão; stb - solução tampão base Tris 20 mM Triton™ X-100 0,1 %; EB

- fração total de proteínas na solução indicada; Sol - fração solúvel de proteínas na solução indicada; Ins - fração insolúvel de proteínas na solução indicada. EB2, Fsol2, EB3, Fsol3, EB4, Fsol4 - frações totais e solúveis de proteínas de acordo com a etapa de lavagem com ureia, sendo 2 a lavagem com Tris 20 mM Triton™ X 100 2 % NaCl 0,5 M ureia 0,5 M, 3 a lavagem com ureia 1 M e 4 com ureia 2 M; C.I - corpos de inclusão; Fsol 8M - fração de proteínas solúveis em Tris 50 mM NaCl 0,5 mM ureia 8 M, aplicada na coluna IMAC para purificação; Void - fração de proteínas que não ligaram a resina de níquel; El a E4 - frações de proteína recombinante eluídas com Tris 50 mM NaCl 0,5 mM ureia 8 M e gradiente de imidazol 1 M; Pool - junção das frações de scFv após a eluição; D - amostra após a diálise; LPS free - amostra após redução de endotoxinas; scFv - proteína recombinante reconstituída após liofilização; P2 - Padrão Precision Plus Protein™ Dual Color Standards

Figura 52 - Cromatograma de purificação do scFv em IMAC com gradiente linear de imidazol. O eixo Y representa a absorbância em mAU (1 = 280 nm) e o eixo x indica o volume de líquido que é inserido no sistema. A linha azul representa a absorbância, de forma que o pico formado corresponde a eluição do scFv e a coleta de frações. A linha verde representa o gradiente de imidazol, de 0 a 1 M. A linha laranja representa a pressão do sistema e a linha marrom representa condutividade. As marcações em vermelho abaixo da linha azul as coletas das frações de 1 mL correspondentes ao scFv durante o processo de eluição. O gráfico é representativo de um experimento, num total de três, e foi gerado automaticamente pelo programa UNICORN®

Figura 53 - Número de células Jurkat aderidas em superfícies com concentrações crescentes de scFv. Cada ponto corresponde ao número de células observadas em uma área de 1 mm2 recoberta com a respectiva concentração de scFv. Os experimentos são demonstrados como média e desvio padrão. Cada experimento foi realizado em triplicata. N = 3. P < 0,05 (one-way ANOVA)

Figura 54 - ELISA de reconhecimento de VLA-4 pelo scFv. O gráfico é representado como média e desvio padrão dos valores referentes a um experimento (n= I ), representativo de um total de 3 experimentos, realizado em triplicata técnica. P < 0,05 (one-way ANOVA)

Figura 55 - Redução da transmigração de células Jurkat sobre ligantes de VLA-4. A esquerda, é demonstrado o gráfico do experimento de transmigração utilizando VCAM-1, e BSA como controle negativo da transmigração. Os resultados são apresentados como média e desvio padrão relativos a três experimentos (n = 3), com exceção do scFv, cujo gráfico representa dois experimentos (n = 2). A direita, está o gráfico do experimento de transmigração utilizando fibronectina e BSA. Os resultados são apresentados como média e desvio padrão relativos a três experimentos (n =3), com exceção do Natalizumabe, cujo gráfico representa dois experimentos (n =2). P < 0,05 (one-way ANOVA)

Figura 56 - Frequência de adesão de linfócitos T de memória sobre VCAM-1, tratadas com diferentes concentrações de scFv, sob diferentes condições de fluxo (0,13; 0,06 e 0,03 dyn/cm ² ). O eixo y de cada gráfico demonstra a frequência de adesão calculada em pm-1. Cada ponto apresentado nos gráficos representa a frequência calculada em um experimento. Os resultados são demonstrados como média e desvio padrão. N = 5 experimentos em geral, exceto para a condição de 0,2 μg/mL de scFv, pois n = 3 experimentos. P < 0,05 (one-way ANOVA)

Figura 57 - Perfil de migração de linfócitos T de memória sobre VCAM-1, tratados com diferentes concentrações de scFv sob fluxo de 1 dyn/cm ² durante 10 minutos. Cada ponto apresentado nos gráficos representa os valores de um experimento. Os resultados são demonstrados como média e desvio padrão. N = 5 experimentos em geral, exceto para a condição de 0,2 μg/mL de scFv, pois n = 3 experimentos. P < 0,05 (one-way ANOVA)

Figura 58 - Trajetórias de linfócitos T de memória sobre VCAM-1, tratados ou não com 20 μg/mL de scFv, sob fluxo de 1 dyn/cm ² . Cada linha representa a trajetória de uma célula. O eixo x de cada gráfico representa o tempo em segundos. O eixo y representa a distância percorrida pm/min. Cada gráfico é representativo de um único experimento, em que n=3 por condição (não tratado ou tratado com scFv)

Figura 59 - Frequência de adesão de linfócitos T de memória sobre FN, tratadas com scFv 2 μg/mL e Fab, sob diferentes condições de fluxo (0,13; 0,06 e 0,03 dyn/cm ² ). O eixo y de cada gráfico demonstra a frequência de adesão calculada em pm-1. Cada ponto apresentado nos gráficos representa a frequência calculada em um experimento. Os resultados são demonstrados como média e desvio padrão. N = 5 experimentos em geral, exceto para a condição de tratamento com Fab, pois n = 3 experimentos. P < 0,05 (one-way ANOVA)

Figura 60 - Perfil de migração de linfócitos T de memória sobre FN, tratados scFv 2 μg/mL e Fab sob fluxo de 1 dyn/cm ² durante 10 minutos. Cada ponto apresentado nos gráficos representa os valores de um experimento. Os resultados são demonstrados como média e desvio padrão. N = 5 experimentos em geral, exceto para a condição de tratamento com Fab, pois n = 3 experimentos. P < 0,05 (one-way ANOVA)

Figura 61 - Trajetórias de linfócitos T de memória sobre FN, tratados com scFv e Fab, sob fluxo de 1 dyn/cm ² . Cada linha representa a trajetória de uma célula. O eixo x de cada gráfico representa o tempo em segundos. O eixo y representa a distância percorrida pm/min. Cada gráfico é representativo de um único experimento, em que n=3 por condição (não tratado ou tratado com scFv ou Fab)

Figura 62 - Visualização de linfócitos T CD8+ tratados ou não com scFv 2 μg/mL. Em verde está representado a marcação da subunidade α4 de integrinas, em vermelho observamos as macromoléculas de actina e em rosa pontos de tirosina fosforilada. As células demonstradas são independentes e fotografadas a partir de um experimento (n=1 ). Aumento de 63X

Figura 63 - Visualização da distribuição de actina de linfócitos T CD8+ tratados ou não com scFv 2 μg/mL. As células demonstradas são independentes e fotografadas a partir de um experimento (n=1 ). Aumento de 63X

Figura 64 - Quantificação de focos de actina presentes em linfócitos T CD8+ tratados ou não com scFv 2 μg/mL. Cada ponto representa uma célula, em um total de 40 células por condição a partir de um único experimento (n=1 ). Os resultados são demonstrados como média e desvio padrão dos focos de actina quantificados para cada condição. P < 0,05 (T- student)

Figura 65 - Visualização de focos de tirosina fosforilada de linfócitos T CD8+ tratados ou não com scFv 2 μg/mL. As células demonstradas são independentes e fotografadas a partir de um experimento (n=1 ). Aumento de 63X

Figura 66 - Quantificação de focos de tirosina fosforilada presentes em linfócitos T CD8+ tratados ou não com scFv 2 μg/mL. Cada ponto representa uma célula, em um total de 40 células por condição a partir de um único experimento (n= 1 ). Os resultados são demonstrados como média e desvio padrão dos focos quantificados para cada condição. P < 0,05 (T- student)

Figura 67 - Explicação detalhada de como as sequências SEQ ID NO: 3 e 5 a 12 se relacionam. Na SEQ ID NO: 3, a região em amarelo corresponde à SEQ ID NO: 5 (Dl a 1111 da SEQ ID NO: 3) e a região em azul corresponde à SEQ ID NO: 6 (QI 17 a S237 da SEQ ID NO: 3).Na SEQ ID NO: 3, as regiões em amarelo sublinhadas, correspondem respectivamente às SEQ ID NO: 7, 8 e 9; e as regiões em azul sublinhadas, correspondem respectivamente às SEQ ID NO: 10, l i e 12. Os aminoácidos em negrito na SEQ ID NO: 3 são os principais resíduos de interação: K31, Y33, N35, N173, Y176, K181, Y217 e Y222.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0083] Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes concretizações, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma concretização preferida com o entendimento de que a presente descrição deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

Proteína do tipo scFv

[0084] Em uma primeira concretização, a presente invenção se refere a uma proteína do tipo scFv compreendendo uma primeira cadeia de polipeptídeos e uma segunda cadeia de polipeptídeos unidas por um ligante, apresentando a fórmula como segue:

(domínio VH) - (ligante) - (domínio VL), em que o domínio VH compreende pelo menos os aminoácidos N173, Y176, K181, Y217, Y222 da SEQ ID NO: 3 e o domínio VL compreende pelo menos os aminoácidos K31, Y33, N35 da SEQ ID NO: 3. Em uma concretização, o domínio VH compreende as regiões determinantes de complementariedade (CDR1, CDR2, CDR3) que consistem das SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: l i e SEQ ID NO: 12 e o domínio VL compreende as regiões determinantes de complementariedade (CDR1, CDR2, CDR3) que consistem das SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9. Em outra concretização, o domínio VH compreende os aminoácidos Q117 a S237 da SEQ ID NO: 3 e o domínio VL compreende os aminoácidos Dl a 1111 da SEQ ID NO: 3. Em outra concretização, o ligante apresenta de 5 a 15 aminoácidos de comprimento. Em outra concretização, o peptídeo ligante compreende pelo menos a sequência GGGGS. Em outra concretização, o ligante pode ser GGGGSGGGGS ou GGGGSGGGGSGGGGS. Em outra concretização, a proteína se liga seletivamente à integrina α4β1. Em outra concretização, a proteína é para uso em um método prognóstico ou para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas.

[0085] Em uma forma alternativa, a proteína pode ser para uso em um método para o tratamento de esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide, Acidente Vascular Cerebral (AVC), Doenças Inflamatórias Intestinais (DII), tais como doença de Crohn, Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), doença do olho seco, uveíte ou conjuntivite alérgica.

Polinucleotídeo

[0086] Em uma segunda concretização, a invenção se refere a um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1.

[0087] A SEQ ID NO: 1 é a sequência nucleotídica. A SEQ ID NO: 2 é a sequência nucloetídica otimizada para expressão em E. coli. E SEQ ID NO: 4 é a sequência proteica com cauda de histidina.

Vetor

[0088] Em uma terceira concretização, a invenção se refere a um vetor compreendendo o polinucleotídeo como anteriormente definido. Em ainda outra concretização, o vetor consiste em um pET28a clonado com a sequência do scFv (SEQ ID NO: 1) nos sítios de restrição Ncol e Xhol.

Célula hospedeira

[0089] Em uma quarta concretização, a invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo o vetor como anteriormente definido. Em outra concretização, a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou célula de mamífero. Em uma concretização preferencial, a célula hospedeira é uma célula bacteriana. Em ainda outra concretização, a célula bacteriana é uma célula de E. coli.

Composição

[0090] Em uma quinta concretização, a invenção se refere a uma composição, compreendendo a proteína anteriormente mencionada e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outra concretização, a composição é para uso no tratamento ou prognóstico de doenças inflamatórias crônicas.

[0091] Em uma forma alternativa, a composição pode ser para uso no tratamento de esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide, Acidente Vascular Cerebral (AVC), Doenças Inflamatórias Intestinais (DII), tais como doença de Crohn, Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), doença do olho seco, uveíte ou conjuntivite alérgica.

[0092] Em certas formas de realização, os excipientes podem incluir, mas não são limitados a, diluentes inertes, tal como carbonato de cálcio, carbonato de sódio ou bicarbonato, lactose, ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tal como amido, gelatina, ou acácia; ou agentes lubrificantes tal como estearato de magnésio, ácido esteárico, talco; ou ainda L-arginina.

Método para tratar uma doença ou condição

[0093] Em uma sexta concretização, a invenção se refere a um método para tratar uma doença ou condição que resulta direta ou indiretamente da atividade da integrina α4β1, compreendendo administrar a um ser humano uma proteína ou uma composição como anteriormente definidas. Em outra concretização, a doença ou condição é esclerose múltipla. [0094] Em uma concretização alternativa, a doença ou condição é asma, artrite reumatoide, Acidente Vascular Cerebral (AVC), Doenças Inflamatórias Intestinais (DII), tais como doença de Crohn, Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), doença do olho seco, uveíte ou conjuntivite alérgica.

Método in vitro para prognosticar uma doença inflamatória crônica [0095] Em uma sétima concretização, a invenção se refere a um método in vitro para prognosticar doenças inflamatórias crônicas compreendendo: contatar pelo menos uma proteína como anteriormente definida ou uma composição como anteriormente definida com uma célula, tecido ou amostra de um indivíduo, detectar a ligação da proteína à célula, tecido ou amostra, quantificar a expressão de VLA-4, e indicar um tratamento mais adequado para o paciente.

[0096] Em uma forma alternativa, o medicamento pode ser para o tratamento de esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide, Acidente Vascular Cerebral (AVC), Doenças Inflamatórias Intestinais (DII), tais como doença de Crohn, Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), doença do olho seco, uveíte ou conjuntivite alérgica.

[0097] Em uma concretização alternativa, a amostra pode ser sangue ou soro. O tecido pode ser ainda líquido cefalorraquidiano (liquor).

Uso da proteína

[0098] Em uma oitava concretização, a invenção se refere ao uso da proteína ou composição anteriormente definidas na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas.

[0099] Em uma forma alternativa, o medicamento pode ser para o tratamento de esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide, Acidente Vascular Cerebral (AVC), Doenças Inflamatórias Intestinais (DII), tais como doença de Crohn, Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), doença do olho seco, uveíte ou conjuntivite alérgica.

EXEMPLOS

1. Prospecção

[00100] Utilizou-se o banco de dados Integrity, para a obtenção de sequências de anticorpos que reconhecem integrinas compostas pelas subunidades α4 ou β1.

2. Modelagem comparativa [00101] A partir das sequências obtidas, realizou-se um alinhamento local através do BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et al., 1990) contra o banco de dados PDB para a escolha e seleção das proteínas moldes. A seleção dos modelos foi baseada nos seguintes parâmetros: identidade das sequências moldes com as sequências das cadeias leves e pesadas dos anticorpos, cobertura dessas sequências, no E-value e na resolução das estruturas modelos. A identidade, cobertura e E-value foram informadas pelo BLAST como resultado do alinhamento. A resolução das estruturas foi informada pelo PDB.

[00102] De posse das proteínas moldes, foi realizado o alinhamento global de todas as proteínas a serem modeladas com suas respectivas sequências referência. Os alinhamentos foram feitos através do servidor EMBOSS Needle.

[00103] Para a construção do modelo, foi utilizado o programa Modeller. Esse programa utiliza o método de satisfação de restrições espaciais para a construção da estrutura terciária das proteínas. Para cada cadeia modelada, 200 estruturas foram feitas.

3. Avaliação e refinamento das estruturas modeladas

[00104] Para as cadeias leves e pesadas de cada anticorpo, houve uma série de 200 estruturas geradas. A escolha da melhor estrutura dentro da série foi feita a partir da função objetivo do Modeller, de forma que o modelo que apresentasse menor valor de função objetivo seria o melhor modelo dentre os 200. Portanto, para cada cadeia, um modelo dentre os 200 gerados foi selecionado.

[00105] Os modelos selecionados foram submetidos aos servidores Molprobity (HINTZE et al., 2016) e Verify 3D (LÜTHY; BOWIE; EISENBERG, 1992) para avaliação. Após a avaliação preliminar fornecida pelos servidores, as estruturas foram refinadas através da correção de rotâmeros ruins e conformações dos ângulos phi e psi desfavoráveis segundo o gráfico e Ramachandran. Esse refinamento foi feito através do programa Coot (EMSLEY et aí., 2010). Após os ajustes, as estruturas foram novamente submetidas aos servidores para validação.

4. Obtenção dos scFvs

[00106] De posse das estruturas de cadeias leves e pesadas, foram construídos dois formatos de scFv para cada anticorpo. O primeiro formato une as cadeias leve e pesada através de um peptídeo ligante curto do tipo GGGGS. O segundo formato utiliza um peptídeo ligante longo de sequência GGGGSGGGGSGGGGS. A inserção do peptídeo ligante foi feita com auxílio do programa Modeller. A utilização de diferentes tamanhos de peptídeos ligantes visa a obtenção do melhor scFv, uma vez que o tamanho do mesmo interfere na performance do scFv.

5. Mapeamento de CDRs e resíduos ativos

[00107] Os CDRs de cada anticorpo foram definidos através da comparação com outros anticorpos de CDRs mapeados, com auxílio do programa PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrodinger, LLC).

[00108] O servidor GetArea (HAYRYAN et al., 2005) foi utilizado para elucidação dos resíduos expostos de cada scFv. Os resíduos expostos nas regiões dos CDRs foram então definidos como resíduos ativos.

6. Docking molecular com integrina α4β1

[00109] Foi realizado o docking de cada scFv com a integrina α4β1, através do servidor Haddock. O Haddock (High Ambiguity Driven proteinprotein Docking) é um servidor que realiza dockings proteína-proteína e proteína-DNA/RNA, utilizando o algoritmo de Monte Cario para orientação e encaixe das moléculas envolvidas e função de escore baseada em campo de força. O Haddock utiliza três etapas principais para realização do docking'. 1 - randomização de orientações e minimização de energia dos corpos rígidos, também referido como docking de corpo rígido; 2 - recozimento semirrígido simulado em torções ângulo espaço, também referido como refinamento semiflexível; 3 - Refinamento final no espaço cartesiano com solvente explícito, também referido como refinamento de água (DOMINGUEZ; BOELENS; BONVIN, 2003) (VAN DIJK, 2006).

[00110] Os melhores complexos integrina-scFv fornecidos pelo Haddock foram selecionados de acordo com os parâmetros Haddock score, RMSD e cluster size. O Haddock score representa uma soma ponderada de energias intermoleculares, tais como eletrostática, de Van de Waals e de dessolvatação (VAN DIJK, 2006). Quanto mais negativo o valor de Haddock score mais energeticamente favorável é a interação entre as duas moléculas, e, de certa forma, maior a afinidade, por conta do favorecimento termodinâmico. O Cluster size indica numericamente o quanto aquela posição de interação entre as proteínas foi preferível, portanto, quanto maior esse valor, melhor. O RMSD, Root Mean Square Deviation, representa o desvio da distância média entre os átomos, e é recomendado que seu valor não ultrapasse 2 A (VAN DIJK, 2006). Quanto mais próximo de zero for esse valor, melhor e mais confiável será o resultado do docking.

7. Busca de hotspots a partir dos melhores complexos

[00111] Os melhores complexos resultantes do docking - um complexo para cada conjunto scFv-integrina - , de acordo com os parâmetros mencionados, foram submetidos à análise e busca de hotspots, através do servidor Robetta Alanine Scaning. Essa análise permite observar os resíduos chaves na estabilidade e interação das proteínas, de forma que a retirada ou substituição de um desses resíduos hotspots causa uma variação na energia livre do sistema de pelo menos Ikcal/mol (KORTEMME, 2004).

8. Análise de interações dos complexos e identificação dos hotspots interatuantes

[00112] Os complexos foram submetidos ao servidor PDBePISA Interfaces (KRISSINEL; HENRICK, 2007), que informa todas as ligações de hidrogênio e pontes salinas realizadas entre resíduos da integrina e do scFv. Os dados fornecidos pelo PDBePISA foram comparados qualitativamente com os resultados do Robetta Alanine Scaning, resultando na identificação dos resíduos cruciais para a interação entre ambas proteínas, os chamados hotspots interativos.

9. Mutagênese dirigida dos scFvs

[00113] Utilizando o programa Coot, foram feitas mutações em resíduos de aminoácidos próximos aos hotspots interativos. Foram realizadas modificações nos resíduos no entorno desses hotspots para tomar essa região do scFv um ponto forte de interação, ou seja, uma região onde são realizadas várias interações entre o scFv e a integrina.

10. Docking dos scFvs modificados contra integrina α4β1

[00114] Foram realizados novos dockings com cada scFv modificado e a integrina α4β1, a fim de avaliar se as modificações foram efetivas para melhorar a interação com α4β1. Os resultados dos scFvs nativos e modificados foram comparados.

11. Docking dos scFvs contra integrina α5β1 e α4β7

[00115] A fim de verificar a especificidade dos scFvs, foram feitos dockings de cada scFv, nativos e modificados, com a integrina α5β1. Foi escolhido o melhor scFv dentre todos, ou seja, aquele que apresentou valores satisfatórios de Haddock Score e Cluster size - baseando-se em valores confiáveis de RMSD - para α4β1 e, segundo os mesmos parâmetros, não apresentou afinidade com α5β1. Com esse scFv, nativo e modificado, foram realizados novos dockings com a integrina α4β7.

12. Aumento da especificidade do melhor scFv e repetição do docking

[00116] Para tomar o scFv específico para α4β1 frente a α4β7, duas novas séries de mutações foram realizadas, visando enfraquecer a interação do scFv com a integrina α4β7. Os resíduos escolhidos para serem modificados foram aqueles que eram importantes para a interação scFv-α4β7, mas não interagiam com resíduos de α4β1. Diferentemente da primeira série de mutações, buscou-se eliminar interações realizadas através da modificação de resíduos. Dessa forma a afinidade do scFv com α4β7 foi reduzida.

13. Dinâmica Molecular

[00117] Três scFvs foram escolhidos para serem submetidos à simulação de DM: o scFv 257898 nativo de peptídeo ligante curto, chamado scFv nativo, o melhor scFv com duas séries de mutações, chamado scFv B, e o mesmo scFv com três séries de mutações, chamado scFv X. Foram realizadas nove simulações de dinâmica com os seguintes complexos: 1 - scFv nativo com integrina α4β1, 2 - scFv nativo com integrina α5β1, 3 - scFv nativo com integrina α4β7, 4 - scFv B com integrina α4β1, 5 - scFv B com integrina α5β1, 6 - scFv B com integrina α4β7, 7 - scFv X com integrina α4β1, 8 - scFv X com integrina α5β1 e 9 - scFv X com integrina α4β7. O mesmo protocolo foi aplicado para a seis simulações e o programa utilizado foi o pacote Gromacs 5.1.

[00118] Para a geração das topologias foi utilizado o programa pdb2gmx, com o campo de força gromos9653a6. Foi inserida uma caixa cúbica com raio de corte de Inm para a delimitação do sistema, por meio da opção editconf. O sistema foi solvatado pela adição de molécula de água pelo gmx solvate e neutralizado com auxílio de gmx grompp e gmx genion.

[00119] Duas minimizações foram feitas seguindo o algoritmo steepest descent sendo a primeira uma minimização à vácuo e a segunda com o solvente. Antes da dinâmica de produção foram necessárias duas dinâmicas de restrição e a termalização para garantir o equilíbrio do sistema. A primeira dinâmica de restrição utilizou ensemble do tipo NVT, e a segunda utilizou NPT, com auxílio do barostato de Parrinello-Rahman. Por fim, foi feita a dinâmica de termalização de 10 nanos segundos, na condição de NPT. Para o controle de pressão em todas essas etapas foi utilizado termostato v-rescale.

[00120] A DM de produção foi feita com 200 nanossegundos, seguindo as mesmas condições. Todas essas etapas de DM de restrição, termalização e produção utilizaram algoritmo de Verlet.

14. Análise dos dados das simulações de DM

[00121] Para todas seis simulações, oito parâmetros foram avaliados: RMSD, RMSF, raio de giro, ligações hidrogênio, pontes salinas, energia total, potencial de Coulomb e potencial de Lennard- Jones.

15. Clonagem do gene scFv-anti-VLA-4 em plasmídeo pET28a

Obtenção do gene sintético e dos oligonucleotídeos para amplificação do gene scFv-anti-VLA-4

[00122] A sequência do gene scFv-anti-VLA-4 foi previamente desenvolvida através de metodologias computacionais, tais como modelagem, docking e dinâmica molecular e mutagênese sítio dirigida (Chaves, 2016). A síntese do gene scFv anti-VLA-4 e inserção do mesmo em um vetor plasmidial pUCIDT (pUCIDT+scFv) foram realizados pela empresa IDT (Integrated DNA Technology).

[00123] Oligonucleotídeos complementares às extremidades 5’ -3’ (senso) e 3’ -5’ (anti-senso) do gene foram sintetizados pela mesma empresa e possuíam sítios de restrição para as enzimas Ncol (CCATGG) e Xhol (GAGCTC), respectivamente, de modo a permitir a construção do vetor recombinante. Os oligonucleotídeos sintetizados foram ressuspensos em um volume em μL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM pH 8 EDTA 0,1 mM, Thermo Fisher Scientific) correspondentes ao valor numérico de suas massas molares, ficando a uma concentração final de 1 nmol/μL. Soluções de trabalho a 10 pM foram preparadas diluindo o estoque 1:100 em água ultrapura.

16. Amplificação do gene scFv-anti-VLA-4 e inserção dos sítios de restrição em suas extremidades

[00124] Utilizou-se a metodologia de PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificação do gene a partir do plasmídeo sintético e inserção dos sítios de restrição. A amplificação foi realizada com a enzima Platinum® Taq DNA polymerase High Fidelity (Life Technologies), em reações de 25 μL, seguindo as recomendações do fabricante, a partir de 8 ng de DNA molde.

[00125] As reações foram realizadas em termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems), com a seguinte ciclagem: 94 °C por 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 56 °C por 30 segundos e 68 °C por 1 minuto além de uma extensão final a 68 °C por 5 minutos.

17. Visualização, purificação e quantificação do gene scFv-anti-VLA-4 após amplificação

[00126] Os produtos da reação de amplificação foram visualizados através da técnica de eletroforese horizontal em gel de agarose 1% (m/v). Um volume de 3 μL dos produtos de PCR foram diluídos em tampão de amostra (azul de bromofenol) e aplicados individualmente no gel de agarose. A eletroforese foi realizada a 90 V durante aproximadamente 30 minutos. O gel foi submetido à coloração com solução GelRed™ (Biotium), seguindo as recomendações do fabricante e visualizado no fotodocumentador Lpix Image (Loccus) sob luz UV (ultravioleta).

[00127] A purificação do gene scFv-anti-VLA-4 amplificado foi feita utilizando o kit Wizard SV gel and PCR clean Up System (Promega), de acordo com as instruções descritas no manual do fabricante. Após a purificação, realizou-se a quantificação do material, utilizando o kit Molecular probes Qubit dsDNA HS Assay, 500 assays (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante.

18. Construção do vetor recombinante pET 28a+scFv

[00128] O plasmídeo utilizado para clonagem e expressão do gene scFv-anti-VLA-4 foi o vetor de expressão pET 28a (pET Expression System 28, Merck, Darmstadt, Alemanha). Inicialmente, aproximadamente 500 ng do inserto, gene scFv amplificado, e 630 ng do vetor, pET 28a, foram submetidos à primeira digestão, com a endonuclease Xhol (Life Technologies) durante 90 minutos a 37°C, conforme as recomendações do fabricante. Após a primeira digestão, os produtos foram purificados e quantificados, segundo a metodologia mencionada no item 3.1.3. Em seguida, o plasmídeo e gene digeridos com Xhol foram submetidos à reação enzimática com a endonuclease Ncol (Life Technologies), também durante 90 minutos a 37°C. Da mesma forma, os produtos da digestão foram submetidos a purificação e quantificação.

[00129] A reação de ligação do vetor e inserto foi realizada utilizando T4 DNA ligase (Life Technologies), na proporção molar inserto: vetor de 3:1 a partir de 60 ng de vetor. O seguinte cálculo foi utilizado para obtenção precisa das quantidades de DNA necessárias para a reação:

[00130] Os reagentes foram adicionados de acordo com as instruções do fabricante e a reação foi incubada durante 16 h a 4°C.

[00131] A clivagem e ligação do vetor e do inserto nas regiões correspondentes aos sítios de restrição Ncol e Xhol é estratégica para a expressão do scFv. Essa forma de inserção permite que o gene scFv esteja em uma posição após a região promotora T7 e antes da região terminadora T7, no sentido 5’ -3’. Dessa forma, essa proteína poderá ser expressa por bactérias que contém a polimerase que reconhece o promotor e terminador T7. Além disso, essa inserção permitiu que o scFv seja expresso fusionado a uma sequência de seis histidinas em sua porção C-terminal. Essa cauda de histidinas é importante para as etapas de avaliação da expressão e purificação do scFv.

19. Transformação de células de Escherichia coli DH5α com o plasmideo recombinante pET28a+scFv

[00132] Células de E.coli DH5α eletrocompetentes (http ://mcb .berkeley.edu/labs/krantz/protocols/electrocomp_cells .pdf) foram utilizadas para transformação da reação de ligação. Para tanto, 3 μL da reação de ligação foram adicionados à 50 μL de células, esse conteúdo foi transferido para uma cu-β apropriada e levado ao eletroporador Micropulser™ (BioRad). Após o pulso elétrico (configuração Eco02), 450 μL de meio de cultura SOC (do inglês, Super Optimal broth with Catabolite repression, Thermo Fisher Scientific) foram adicionados à cubeta, e o conteúdo da mesma foi, cuidadosamente e rapidamente, transferido para um tubo Falcon® de 15 mL. As células transformadas foram então incubadas a 37°C, em meio SOC sem a presença de antibiótico, a uma agitação de 200 rpm (Rotações Por Minuto) por um período de 1 hora.

[00133] Após o período de incubação, 100 e 50 μL das células foram individualmente espalhados sobre superfícies de meio LB-ágar (Luria Bertani) suplementados com canamicina 50 μg/mL. As placas foram então incubadas a 37°C por um período de 16 h.

20. Seleção de clones de E. coli DH5-a contendo o vetor pET28a+scFv [00134] Para selecionar um clone recombinante, dez colônias foram aleatoriamente selecionadas e inoculadas em microtubos de 0,2 mL contendo 15 μL de água ultrapura. Os microtubos foram homogeneizados e 3 μL desse inóculo foram transferidos para microtubos de 1,5 mL contendo 300 μL de meio LB suplementado com canamicina. Os microtubos foram identificados de acordo com a colônia de origem, sendo numerados de 11 a 20, e então incubados a 37°C durante aproximadamente 24 h, sem agitação.

[00135] Os inóculos em água foram submetidos à lise térmica em termociclador a 95°C por 5 minutos. Após esse período, os microtubos foram centrifugados à 12000 rpm (13523 x g) por 5 minutos em centrífuga Eppendorf 5424R. O sobrenadante foi então transferido para outro microtubo e utilizado em PCR para identificação dos clones recombinantes.

[00136] Para realização da PCR utilizou-se oligonucleotídeos senso e anti-senso respectivamente complementares às regiões promotora e terminadora T7, presentes no plasmídeo pET28a. Para esse procedimento foram utilizados um controle positivo, o vetor pET28a íntegro, e água como controle negativo. A reação foi realizada conforme item 3.1.2. Os produtos dessas reações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose, como descrito no item 3.1.3, e a identificação dos clones recombinantes foi feita através da visualização dos tamanhos dos segmentos de DNA.

[00137] Os inóculos em meio LB das colônias identificadas como recombinantes por PCR foram então selecionados para extração do plasmídeo recombinante. Vinte microlitros desses inóculos foram transferidos para 10 mL de meio LB canamicina 50 μg/mL em tubos falcon® de 50 mL. Os tubos foram identificados de acordo com a colônia de origem e incubados durante 16 h, 37°C, com rotação de 200 rpm.

[00138] Após o período de incubação, foram preparados estoques em glicerol 25% dos clones, que foram armazenados a -80°C. O restante das culturas foi submetido à purificação dos plasmídeos recombinantes, através do kit High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche), de acordo com as instruções contidas no manual do fabricante. Após a purificação os vetores foram quantificados de acordo com a metodologia descrita no item 3.1.3 e armazenados a -20°C.

21. Avaliação do plasmídeo pET28a+scFv por PCR e digestão enzimática [00139] Os vetores recombinantes extraídos foram submetidos, cada um, à quatro diferentes PCRs, com as seguintes combinações de oligonucleotídeos senso e anti-senso e controles de reação: a. Oligonucleotídeos para regiões promotora e terminadora T7. Plasmídeo pET28a íntegro como controle de reação positivo b. Oligonucleotídeos para regiões 5’ e 3’ do gene scFv-anti- VLA-4, anteriormente descritos. Plasmídeo pUCIDT+scFv íntegro como controle de reação positivo c. Oligonucleotídeo senso para região promotora T7 e anti- senso para região 3’ do gene scFv d. Oligonucleotídeo senso para 5’ do gene scFv e anti-senso para região terminadora T7.

[00140] Em todas as condições, foi utilizada água ultrapura como controle negativo. As reações foram preparadas conforme item 3.1.2.

[00141] Além da realização de PCRs com diferentes combinações de oligonucleotídeos, os vetores recombinantes foram submetidos à digestão com enzima Xhol, de acordo com a metodologia descrita no item 3.1.4. Como controle da reação, utilizou-se plasmídeo pET28a íntegro.

[00142] Os produtos das PCRs e da digestão com Xhol foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose 1% (m/v) e visualizados conforme item 3.1.3.

22. Sequenciamento dos plasmídeos recombinantes pET28a+scFv

[00143] Para confirmação da inserção correta e integridade da sequência do gene scFv-anti-VLA-4 nos plasmídeos recombinantes, realizou- se, inicialmente, a reação de sequenciamento utilizando BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific), seguindo as recomendações do fabricante. Para cada clone recombinante obtido, foram preparadas cada uma das reações abaixo, utilizando aproximadamente 80 ng de plasmídeo recombinante: a. Oligonucleotídeo senso para região promotora T7 b. Oligonucleotídeo anti-senso para região terminadora T7 c. Oligonucleotídeo senso para região 5’ do gene scFv-anti- VLA-4 d. Oligonucleotídeo anti-senso para região 3’ do gene scFv- anti-VLA-4

[00144] Ao final da reação, a placa foi encaminhada para a etapa de precipitação, conforme protocolo sugerido pelo fabricante e então levada para o sequenciador automático ABI 3500 XL (Life Technologies) para realização do sequenciamento. Após esse procedimento, os dados gerados pelo sequenciador foram coletados e analisados através do programa DNAstar.

23. Expressão do scFv em Escherichia coli SHuffle®

[00145] Transformação de células de E.coli SHuffle® com o plasmídeo pET28a+scFv

[00146] A cepa bacteriana E. coli SHuffle® (Lobstein et al, 2012) foi utilizada para a expressão do scFv anti-VLA-4. Para tanto, 1 μL de cada clone de plasmídeo recombinante na concentração de 5 ng/μL foi adicionado a 50 μL de células eletrocompetentes. As etapas seguintes de eletroporação prosseguiram de acordo com a metodologia anteriormente descrita. Após o período de incubação, 20 e 40 μL das células transformadas foram semeadas em meio LB-ágar canamicina 50 μg/mL e então incubadas a 37°C por 16 h.

[00147] Para o preparo dos pré-inóculos necessários para a expressão, colônias isoladas foram inoculadas em 10 mL de meio TB (Terrific-Browth) suplementado com canamicina 50 μg/mL e glicose 1% (m/v) incubadas a 37°C, por 16 h sob agitação orbital de 200 rpm. Após o período de incubação, foram preparados estoques em glicerol 25% dos clones, que foram armazenados a -80°C. O restante das culturas foi utilizado em novo inoculo, para verificação da expressão do scFv.

24. Expressão do scFv

[00148] Os pré-inóculos crescidos overnight tiveram suas DOs (Densidade Ótica) medidas através da leitura em espectrofotômetro U-5100 (Hitachi) em um comprimento de onda de 600 nm. Para o preparo dos inóculos, calculou-se o volume de pré-inóculo a ser adicionado ao meio de expressão para uma DO inicial de 0,15.

[00149] Os inóculos foram feitos, então, em meio de expressão, TB canamicina 50 μg/mL glicose 1%, a um volume final de 5 mL, com crescimento em tubos falcon® de 50 mL a 37°C, sob agitação de 200 rpm. As DO.s dos inóculos foram avaliadas em intervalos de 60 e 30 minutos, até atingirem valores entre 0,6 e 0,8, quando induziu-se a expressão do scFv.

[00150] Para a indução da expressão da proteína recombinante, foi adicionado indutor IPTG (Isopropil-b-D-galactosídeo) 0,5 rnM. Após a adição do indutor, os inóculos permaneceram a 37°C, sob agitação orbital de 200 rpm, por um período de 4 h. Antes da adição do IPTG, duas alíquotas de 400 μL de cada inóculo foram coletadas, centrifugadas (160 g, 10 minutos), o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi armazenado a -20°C para posterior avaliação.

[00151] Após o período de expressão, mediu-se a D.O. final dos inóculos. Dez alíquotas de 250 μL de cada inóculo foram coletadas, centrifugadas, o precipitado foi mantido e armazenado a -20°C para análise posterior.

[00152] Para avaliar viabilidade das células desde o pré-inóculo até o final da expressão, alíquotas foram retiradas e diluídas seriadamente de 10-5 a 10-9. Essas diluições foram semeadas em placas de LB-ágar canamicina 50 μg/mL em um padrão de três gotas de 10 μL por diluição. As placas foram incubadas a 37°C por 16 h e, após esse período, o número de células viáveis foi calculado através da média do número de colônias obtidas dividido pelo menor fator de diluição em que se observou a formação de colônias.

25. Avaliação da expressão do scFv anti-VLA-4 por SDS-PAGE e Western Blotting

[00153] Para avaliar a expressão do scFv pelos clones recombinantes de E. coli SHuffle®, as alíquotas contendo precipitados do inóculo antes e depois da indução da expressão foram suspensas em tampão de amostra (50 mM Tris-HCl, 2% (m/v) dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,1% (m/v) azul de bromofenol, 10% (v/v) glicerol, 100 mM 2-mercaptoetanol), de acordo com a fórmula abaixo: Volume de tampão de amostra

[00154] Após a adição e homogeneização do tampão de amostra, as amostras foram submetidas à fervura, a 100°C por 5 minutos para avaliação da expressão do scFv por SDS PAGE e/ou Western Blotting. Para tanto, 15 μL de cada amostra foram adicionadas em dois géis de poliacrilamida 12 % e a corrida foi realizada a uma amperagem de 0.02 A por gel durante aproximadamente 60 minutos. Após lavagens exaustivas em água, o primeiro gel foi fixado em solução de ácido acético 10 % etanol 50 % por no mínimo 30 minutos. Em seguida, esse gel foi brevemente lavado com água e submerso no corante GelCode™ Blue Stain Reagent (Thermo Fisher Scientific), aquecido em micro-ondas em três intervalos de 10 segundos e então posto em agitação, a TA por aproximadamente 30 minutos. O corante foi então descartado e o gel, incubado em água, até que o excesso de corante seja eliminado. Após esse procedimento é possível visualizar as bandas proteicas e registrar o gel utilizando densitômetro Bio-Rad GS-800.

[00155] O segundo gel, após a migração, foi encaminhado para a realização do Western Blotting. Esse gel foi posto em contato com uma membrana de nitrocelulose e através do equipamento Semi-Dry (BioRad) foi realizada a transferência de proteínas do gel para a membrana, de acordo com as instruções disponíveis no manual do fabricante. Após a transferência, a membrana foi submersa em solução contendo PBS-T 0,05% (do inglês, Phosphate Buffered Saline Tween® 20 0,05%, Sigma- Aldrich) suplementado com leite desnatado Moliço™ 4 % (m/v) por um período de 50 minutos, sob agitação orbital leve à TA. A membrana foi então lavada três vezes com 50 mL de PBS-T 0,05% e submersa em uma solução de PBS-T 0,05 % contendo anticorpo anti-cauda de histidina conjugado com fosfatase (6x-His Tag Monoclonal Antibody (3D5), AP, 46-0284, Invitrogen,) na diluição 1:750 por 1 hora. A membrana foi novamente lavada e utilizou-se o AP conjugate substrate Kit (BioRad), segundo as instruções do fabricante, para a revelação do scFv disposto na membrana.

[00156] A realização da eletroforese SDS-PAGE e do Western Blotting permitiu visualizar a expressão do scFv pelas bactérias transformadas com cada clone recombinante obtido na etapa de clonagem. Para as etapas seguintes, utilizou-se apenas bactérias transformadas e proteínas derivadas de um dos clones, o que apresentou melhor resultado no sequenciamento.

25. Avaliação da solubilidade do scFv

[00157] Solubilidade do scFv em soluções de Tris Triton™ X-100 [00158] Para avaliar a solubilidade do scFv, três alíquotas obtidas durante a expressão do scFv após a indução com IPTG, contendo o precipitado do inóculo, foram individualmente suspensas com essas respectivas soluções: a. Tris 20 mM Triton™ X-1000,1 % pH 8,0 b. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % pH 8,0 c. Solução de Cell Lytic® B (Sigma-Aldrich) 100 mg/mL [00159] Os volumes das soluções a. e b. seguiram o cálculo demonstrado no item 3.2.3. Já a solução c. foi adicionada de acordo com as instruções do fabricante. As amostras a. e b. foram colocadas em um recipiente contendo gelo e submetidas à lise por ultrassonicação, utilizando sonicador Qsonica. Para esse procedimento, foram realizados três ciclos de sonicação, com a duração de 10 segundos cada, em potência de 0,08 em média, com intervalos de 30 segundos entre os ciclos. Após a lise, as amostras foram submetidas à centrifugação (Eppendorf 5424R), por 10 minutos, a 14000 rpm (18407 g). A amostra preparada com solução c. foi também centrifugada após um período de incubação de 20 minutos em TA. em sequência da adição do reagente.

[00160] Alíquotas de 20 μL de cada amostra antes da centrifugação, correspondentes ao extrato bruto da amostra, foram separadas. Após a centrifugação, os sobrenadantes, contendo a fração solúvel de proteínas, foram coletados e dispostos em microtubos diferentes. Os sobrenadantes, bem como as amostras de extrato bruto, foram preparados para SDS PAGE adicionando-se igual volume de tampão de amostra 2x. Já os precipitados resultantes da centrifugação, contendo a fração insolúvel de proteínas, foram suspensos em tampão de amostra 1x nos mesmos volumes iniciais anteriores à lise. Todas as amostras foram então submetidas à eletroforese SDS PAGE, conforme descrito no item 3.2.3. A banda proteica correspondente ao scFv foi identificada, e sua presença na fração solúvel ou insolúvel forneceu o indicativo para o caráter de solubilidade da expressão dessa proteína.

26. Solubilidade do scFv em Tris Triton™ X-100 na presença de aditivos [00161] Para observar se a presença de aditivos, tais como sais e aminoácidos, foi capaz de incrementar a solubilidade da molécula de scFv, seis alíquotas obtidas durante a expressão do scFv após a indução com IPTG, contendo o precipitado do inóculo, foram individualmente ressuspensas com estas respectivas soluções: b1. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % NaCl 150 mM b2. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % NaCl 300 mM b3. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % L-arginina 0,2 M b4. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % L-arginina 0,4 M b5. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % Glicerol 10 % b6. Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5 % MgC12

[00162] Todas as amostras foram submetidas à lise por sonicação, centrifugadas e submetidas à eletroforese por SDS -PAGE, tal como descrito no item 3.3.1.

27. Expressão do scFv a 16, 23 e 30°C e avaliação da solubilidade

[00163] Para avaliar se a redução da temperatura de expressão é capaz de aumentar a solubilidade do scFv, realizou-se expressão do mesmo em três diferentes temperaturas utilizando o micro biorreator airlift Fogale Biopod f800. Para o preparo do pré-inóculo, aproximadamente 5 μL do clone recombinante selecionado, estocado em glicerol (item 3.2.2) foram adicionados à 50 mL de meio TB canamicina 50 μg/mL glicose 1 %. O pré- inóculo, disposto em um frasco Erlenmeyer estéril de 200 mL, foi incubado a 37°C, sob agitação orbital de 200 rpm por 16 h.

[00164] Três vasos estéreis do biorreator contendo meio (TB canamicina 50 μg/mL glicose 1 %) foram preparados para receber o pré- inóculo de acordo com o cálculo descrito no item 3.2.2. O volume de cada inóculo foi de 70 mL. Após a medição da D. O inicial, os inóculos ficaram em crescimento e monitoramento da DO durante 1,5 h a 37°C com aeração 1 vvm (Voulume do ar/Volume do meio/Minuto) constante de acordo com o sistema air-lift do equipamento. Durante todo o processo realizado no biorreator, houve adição de automática anti-espumante a medida que o sistema identificava formação excessiva de espuma induzida pela aeração.

[00165] Após o período de crescimento, a D. O foi medida, alíquotas de 500 μL de cada inóculo foram coletadas e adicionado IPTG 0,5 rnM. Após a adição do indutor de expressão, as temperaturas de cada inóculo foram reduzidas para 30, 23 e 16°C. Os inóculos permaneceram na fase de expressão por, respectivamente: 7,5; 11,5 e 15,5 horas. As DOs foram então medidas e foram coletadas nove alíquotas de 100 μL ou 200 μL para avaliações posteriores. As alíquotas foram centrifugadas, os sobrenadantes, descartads e os precipitados, armazenados a -20°C para análise. O restante do conteúdo de cada vaso, cerca de 25 a 30 mL, foi centrifugado e também armazenado a -20°C. Foi realizado teste de viabilidade celular para o pré- inóculo e para os três inóculos, conforme descrito no item 3.2.2.

[00166] Duas alíquotas de cada um dos inóculos (30, 23 e 16°C) foram suspensas, de acordo com o cálculo descrito no item 3.2.3, individualmente e respectivamente nas seguintes soluções:

- Solução tampão base: Tris 20 mM Triton™ X-100 0,5%

- Solução tampão aditivada: Tris 20 rnM Triton™ X-100 0,5% L-arginina 0,4 M NaCl 50 mM

[00167] As amostras foram lisadas por sonicação, centrifugadas, preparadas com tampão de amostra e submetidas à eletroforese SDS-PAGE, tal como descrito no item 3.3.1, para análise do perfil de expressão e solubilidade do scFv após a expressão em diferentes temperaturas.

28. Avaliação da solubilidade do scFv em diferentes concentrações de ureia [00168] Para avaliar a solubilidade do scFv em ureia utilizou-se três alíquotas contendo precipitados correspondentes ao inóculo produzido em micro biorreator Fogale a 30°C. As alíquotas foram ressuspensas e lisadas por sonicação em solução tampão base (item 3.3.3), de acordo com item 3.2.3. Amostras de 20 μL desse conteúdo foram obtidas e centrifugadas, os sobrenadantes foram descartados e os precipitados foram ressuspensos, individualmente em 100 μL das seguintes soluções: i. Tris 20 mM Triton™ X 100 0,5 % Ureia 1 M ii. Tris 20 mM Triton™ X 100 0,5 % Ureia 4 M iii. Tris 20 mM Triton™ X 100 0,5 % Ureia 8 M

[00169] Após 15 minutos de incubação em gelo sob agitação leve, as amostras foram centrifugadas, e os sobrenadantes foram separados dos precipitados. As frações solúvel e insolúvel de cada amostra foram submetidas à eletroforese SDS-PAGE conforme item 3.3.1.

29. Avaliação dos meios de expressão

Expressão em meio TB a 30°C

[00170] Os géis de SDS-PAGE referentes à expressão do scFv em meio TB canamicina 50 μg/mL glicose 1% a 37°C em frasco Erlenmeyer e a 30°C em micro biorreator foram submetidos à análise de rendimento por densitometria no programa Quantity One (BioRad). Para essa análise, cada amostra foi identificada automaticamente como uma lane, o background da imagem do gel foi retirado, e as bandas proteicas foram automaticamente detectadas (sensitividade 100, noiser filter 5). A intensidade relativa da banda proteica correspondente ao scFv foi medida.

[00171] Para analisar a influência da temperatura na quantidade de proteína produzida, repetiu-se as etapas de expressão descritas no item 3.2.2, utilizando bactérias transformadas derivadas de um único clone, com realização de todas as etapas a 30°C. Após realização de eletroforese SDS- PAGE com as amostras resultantes dessa expressão, a intensidade relativa da banda correspondente ao scFv foi medida e comparada com a expressão a 37°C.

30. Expressão do scFv em meio Enpresso

[00172] Como estratégia para aumentar a quantidade de proteína recombinante produzida, realizou-se a expressão do scFv utilizando o meio de cultivo comercial Enpresso® B 500 (BioSilta, Sigma-Aldrich) (138). Seguiu- se as etapas contidas no manual de instruções do fabricante, para realização da expressão. A etapa de expressão é feita a 30°C e o agente indutor utilizado foi IPTG, na concentração final de 0,5 mM. O principal diferencial desse meio consiste na adição de uma enzima que permite a liberação gradativa e contínua de glicose no meio de cultura. Durante as etapas de pré-inóculo, indução da expressão e finalização realizou-se testes de viabilidade celular.

[00173] O perfil de expressão antes e após a indução foi avaliado por eletroforese SDS-PAGE, conforme descrito nos itens anteriores. O gel referente a esse procedimento também foi avaliado quanto a intensidade relativa, conforme descrito no item 3.4.1.

31. Expressão em meio TB a 30°C com e sem alimentação contínua de glicose

[00174] Para tentar simular a expressão realizada com o meio comercial Enpresso, como estratégia para aumentar a quantidade de proteína produzida, realizou-se uma expressão em meio TB canamicina 50 μg/mL e alimentação contínua de glicose durante o processo. Para o preparo do pré- inóculo, aproximadamente 5 μL do estoque E.coli SHuffle® pET28a+scFv foram coletados e adicionados à 50 mL de meio TB canamicina 50 μg/mL glicose 1%. O pré-inóculo, disposto em um frasco Erlenmeyer estéril de 200 mL, foi incubado a 30°C, sob agitação orbital de 200 rpm por 16 h.

[00175] Dois inóculos foram preparados para expressão em micro biorreator Fogale f800. O primeiro inóculo consistiu na expressão em batelada simples, ou seja, sem adição de glicose durante o procedimento. Esse procedimento foi iniciado com meio TB canamicina 50 μg/mL glicose 1%, DO inicial de 0,15 (adição do pré-inóculo segundo item 3.2.2) e volume final de 70 mL. O crescimento foi realizado a 30°C durante 2 horas. A DO após o crescimento foi medida, duas alíquotas de 500 μL foram coletadas, centrifugadas e o precipitado foi armazenado para avaliação posterior. A indução foi realizada através da adição de IPTG 0,5 mM a 30°C por 4 h. Ao final do processo, dez alíquotas de 100 μL foram coletadas, centrifugadas e armazenadas para avaliação posterior e o conteúdo restante foi igualmente centrifugado e o precipitado foi armazenado a -20°C.

[00176] O segundo inóculo consiste na expressão em batelada alimentada de glicose. Para tanto, o volume de pré-inóculo foi calculado, como descrito anteriormente, e adicionado a um volume final de 50 mL de TB canamicina 50 μg/mL. O volume no início do processo foi de 50 mL. O sistema foi programado para adicionar 0,04 mL de solução de glicose 10% a cada 1 minuto, por um período de 360 minutos (2 horas de crescimento e 4 horas de expressão). Ou seja, o inóculo iniciou-se sem adição de glicose, e a cada minuto são injetados 4 mg de glicose no meio. Dessa forma a fase de crescimento obedeceu ao sistema de alimentação e teve duração de duas horas. Para a indução da expressão e coleta de alíquotas ao final do processo, realizou-se o mesmo procedimento da expressão em batelada simples.

[00177] Durante os processos de crescimento e expressão do scFv, com e sem alimentação, alíquotas de 500 μL de ambos os inóculos foram coletadas à cada meia hora para determinação da biomassa e da quantidade de glicose no meio. Para determinação da biomassa, foi preparada uma curva de correlação entre DO e biomassa. Para tanto, 20 mL de um pré-inóculo (30°C, 16 h, 200 rpm, TB canamicina 50 μg/mL) foram divididos pela metade em dois tubos falcon® de 15 mL. Os tubos foram centrifugados em centrífuga Eppendorf 5810R a 12000 rpm (18514 g) por 10 minutos. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados foram suspensos em 10 mL de PBS e novamente centrifugados. Após descarte do sobrenadante e suspensão do precipitado em 10 mL de PBS, as amostras foram transferidas para um tubo falcon® de 50 mL e 30 mL de PBS foram adicionados. A partir dessa solução inicial foram feitas diluições de 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20 e 1:40. Cada diluição foi analisada em triplicata a 600 nm e 5 mL da mesma solução inicial foi filtrado em membranas de nitrocelulose millipore 0,2 micra previamente taradas a massa constante. As membranas foram então levadas para a mufla, aonde ficaram secando a 100°C até massa constante. As diferenças entre as massas das membranas antes e após a adição e secagem da biomassa foram calculadas. Os valores encontrados foram multiplicados pelos volumes de solução inicial utilizados na filtragem, em litros. O valor médio desses valores foi obtido e dividido pelos fatores de diluição. Foi feito então o gráfico da média das DOs obtidas x o fator de biomassa dividido pelos fatores de diluição, obtendo-se uma função linear. O valor correspondente a constante de interceptação com o eixo vertical do gráfico é o fator de conversão da DO para a biomassa em g/L.

[00178] Para determinação da glicose, as alíquotas coletadas em intervalos de 30 minutos foram centrifugas e os sobrenadantes foram utilizados para quantificação. Utilizou-se o kit Glicose método enzimático (Megalab) para esse procedimento. Seguiu-se as instruções fornecidas pelo fabricante.

[00179] A viabilidade celular ao longo do procedimento, a avaliação do perfil de expressão do scFv e a quantificação da intensidade relativa da banda proteica no programa QuantityOne foram realizados conforme itens anteriores.

32. Purificação do scFv

Lise celular e recuperação de corpos de inclusão

[00180] Para a purificação do scFv, utilizou-se uma estratégia de ciclos de lavagens com ureia para concentrar o scFv, expresso na forma de corpos de inclusão, na fração proteica insolúvel e reduzir a quantidade de proteínas solúveis presentes na amostra. Essa estratégia visa diminuir o número de contaminantes da amostra antes da solubilização em ureia 8 M e da consequente aplicação na coluna de cromatografia de afinidade.

[00181] A primeira etapa para a purificação consiste na lise celular da biomassa bacteriana. Para tanto, utilizou-se o conteúdo resultante da expressão em micro biorreator Fogale f800 a 30°C, por 4 h em batelada simples. A amostra foi previamente centrifugada e o precipitado armazenado, como descrito no item 3.4.3. Esse precipitado correspondente a biomassa bacteriana equivale a 25 a 30 mL de inoculo obtido. Para a lise celular, o precipitado foi suspenso em 4 mL (4mL/mg de biomassa) de Tris 20 mM Triton™ X 100 2 % Ureia 0,5 M NaCl 0,5 M. A amostra foi então colocada em recipiente com gelo e submetida a lise por sonicação. Para a lise, foram aplicados 4 ciclos de 10 segundos de sonicação, com potência média de 0,11 e intervalos de 30 segundos entre os ciclos. Após a lise celular, a amostra foi centrifugada a 12000 rpm (18514 g) por 10 minutos e o precipitado foi resuspenso em 3 mL da mesma solução tampão anterior e novamente levada para sonicação, nas mesmas condições. Após essa segunda centrifugação, o precipitado foi ressuspenso em 3 mL de Tris 20 mM Triton™ X 100 2 % Ureia 1 M NaCl 0,5 M. Os precipitados, contendo o scFv em forma de forma de inclusão, foram armazenados a 4°C. Durante os ciclos de lise celular e lavagens, alíquotas de 20 a 100 μL do extrato bruto foram coletadas para posterior corrida em SDS PAGE. [00182] As etapas para realização da recuperação do scFv na forma de corpos de inclusão estão demonstradas na Figura 3.1:

33. Purificação do scFv por cromatografia de afinidade IMAC (do inglês, Immobilized metal affinity chromatography)

[00183] A purificação do scFv foi realizada utilizando cromatografia de afinidade em resina com níquel imobilizado, capaz de interagir com a cauda de histidina fusionada ao scFv.

[00184] A primeira etapa para a realização dessa purificação foi a solubilização dos corpos de inclusão, adicionando-se 5 mL de Tris 50 mM NaCl 0,5 mM Ureia 8 M Imidazol 1 mM. A amostra foi incubada em gelo, sob agitação leve durante 20 minutos, para permitir a solubilização da proteína recombinante. A amostra foi então centrifugada, o sobrenadante foi coletado para purificação do scFv e o precipitado foi desprezado. Uma alíquota de 20 μL do sobrenadante foi coletada para aplicação no gel SDS- PAGE.

[00185] A purificação foi realizada manualmente utilizando 1 mL de resina Ni-NTA (Qiagen) previamente equilibrada com 10 mL de Tris 50 mM NaCl 0,5 mM Ureia 8 M Imidazol 1 mM. A aplicação da amostra foi realizada com recirculação pela resina durante 16 h a 4°C, para prolongar o contato com a resina de forma dinâmica e assim promover a adesão do maior número de moléculas de scFv. Após o período de recirculação, coletou-se o líquido contendo as proteínas que não interagiram com a resina (void) e realizou-se duas lavagens, por fluxo de gravidade: 5 mL de Tris 50 mM NaCl 0,5 mM Ureia 8 M Imidazol 1 mM (Fl) e 4 mL de Tris 50 mM NaCl 0,5 mM Ureia 8 M Imidazol 5 mM (F2). Para a eluição do scFv, adicionou-se 2 mL e Tris 50 mM NaCl 0,5 mM Ureia 8 M Imidazol 1 M. A eluição ocorreu durante 30 minutos, sob agitação leve à TA e as frações (E) foram coletadas em quatro microtubos, cada um com 500 μL de amostra eluída. A coluna foi lavada com 20 mL de água e armazenada em etanol 20%. 34. Renaturação do scFv

[00186] Para retirar o excesso de imidazol e ureia presentes nas amostras após a purificação, e assim promover a renaturação do scFv, utilizou-se a metodologia de troca de soluções tampão utilizando três filtros Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filters 3 K (Merck).

[00187] Inicialmente, os filtros foram submetidos a 2 ciclos de lavagem com 500 μL de água, através de centrifugação a 7000 g (7049 rpm, centrífuga Eppendorf 5810R, rotor de ângulo fixo para seis tubos) por 10 minutos. Os tubos foram então equilibrados por meio de 4 ciclos de lavagem com solução tampão padrão: Tris 20 mM L-arginina 0,4 M NaCl 100 mM. Durante cada lavagem, os volumes de líquidos que ultrapassaram os filtros para os compartimentos inferiores de cada Amicon® foram medidos. Para definir os ciclos de centrifugação e adição de solução tampão padrão com as amostras, calculou-se as médias dos volumes de líquido medidos em cada ciclo para os três Amicons®.

[00188] Após as lavagens, 500 μL do scFv purificado foram aplicados em cada filtro e, a cada ciclo de centrifugação, foram adicionados volumes de solução tampão padrão equivalentes ao valor mensurado através da média calculada durante as lavagens. Pelo menos 16 ciclos de centrifugação e adição de tampão à amostra foram realizados, até que a concentração teórica de ureia presente na amostra atingisse um valor inferior a 0,6 M. Após os ciclos, a amostra foi então coletada e armazenada a 4°C para os ensaios posteriores.

35. Quantificação de proteínas, avaliação da pureza e cálculo do rendimento [00189] Após a purificação e renaturação, realizou-se a quantificação do scFv com o Pierce™ BCA Protein Assay Kit, seguindo as instruções contidas no manual do fabricante. Para avaliação da pureza, as amostras foram submetidas à eletroforese SDS PAGE em gel gradiente 4 a 17% de acrilamida, seguida de análise por densitometria. Os géis foram preparados com o sistema Gradient former Modelo 485 (Bio-Rad), seguindo as instruções do fabricante. As amostras coletadas durante todas as etapas de purificação do item 3.5 foram preparadas para a eletroforese, como descrito nos itens anteriores. A migração ocorreu em uma amperagem de 0.02 A por gel por um período de 16 h.

[00190] Para a revelação dos geis, os mesmos foram lavados com água após a migração e submersos em solução de metanol 10 % ácido acético 50 %, para fixação das proteínas. Os geis foram aquecidos por 3 minutos em placa aquecedora e ficaram sob agitação branda por 20 minutos. A solução foi descartada, e o ciclo de submersão, aquecimento e agitação foi repetido três vezes. Após essas etapas, foi adicionado aos geis uma solução contendo 50 mL de etanol 5 % ácido acético 7,5 % e 1 mL de solução de azul brilhante (Comassie Brilliant Blue R250, BioRad). Os géis foram aquecidos durante 6 minutos em placa aquecedora e levados para agitação branda por 20 minutos. Esse ciclo foi repetido até o aparecimento das bandas proteicas. Para a descoloração dos géis, as soluções de coloração foram descartados e foram adicionados 50 mL de metanol 5% ácido acético 7%. Os géis foram aquecidos e levados para agitação, e as soluções foram renovadas até completa descoloração. Após a descoloração, os géis foram registrados e analisados no programa QuantityOne, como descrito no item 3.4.1. Dessa forma, a porcentagem de pureza de cada etapa do processo de purificação foi obtida.

[00191] Para o cálculo do rendimento, amostras provenientes das expressões em meio TB a 30°C em Erlenmeyer, em meio Enpresso® e meio TB a 30°C em micro biorreator foram submetidas a todas as etapas de purificação contidas no item 3.5, com exceção da avaliação em gel gradiente. Após a quantificação de proteínas ao final de cada procedimento, a quantidade em mg de proteína obtida foi dividida pelo volume de biomassa correspondente utilizado para a purificação. Os valores foram ajustados para o volume total de cultura e obteve-se o valor do rendimento em miligramas de proteína purificada para cada litro de cultura utilizado no processo de expressão.

36. Aumento do volume de produção do scFv anti-VLA-4

Expressão do scFv em biorreator de 2 L

[00192] A primeira etapa para uma produção do scFv anti-VLA-4 em maior quantidade e mais controlada foi a expressão em biorreator de 2 L. Para tanto, realizou-se uma expressão em batelada simples utilizando-se biorreator BioFLOl lO. Para o preparo do pré-inóculo, aproximadamente 250 μL do estoque de células transformadas foram coletados, rapidamente e antes do descongelamento da alíquota estoque, e adicionados à 250 mL de meio TB canamicina 50 μg/mL glicose 1 %. O pré-inóculo, disposto em um fraco Erlenmeyer estéril de 1 L, foi incubado a 30°C, sob agitação orbital de 200 rpm por 16 h.

[00193] Para o preparo do inóculo, a DO do pré-inóculo foi medida, o volume de pré-inóculo foi calculado para uma DO inicial de 0,15, e TB suplementado com antibiótico canamicina 50 μg/mL e glicose 1% para um volume final de 2 L. O período de crescimento foi realizado a 30°C durante 2 horas. A DO após o crescimento foi medida, duas alíquotas de 250 μL foram coletadas, centrifugadas e o precipitado foi armazenado para avaliação posterior. A indução foi realizada através da adição de IPTG 0,5 mM e a expressão do scFv teve duração de 4 h, a 30°C com cascata de ar/oxigênio puro na vazão de 1 vvm e agitação de 300-500 rpm mantendo-se a concentração de oxigênio dissolvido superior a 80%. Ao final do processo, dez alíquotas de 100 μL foram coletadas, centrifugadas e armazenadas para avaliação posterior. O conteúdo restante foi divido em 12 tubos falcon® de 50 mL que foram centrifugados e os precipitados foram armazenados a -20°C.

37. Lise celular e recuperação de corpos de inclusão

[00194] A lise celular foi realizada em homogeneizador GEA panda 2k. Para esse procedimento, 3 precipitados foram ressuspensos em Tris 20 mM Triton X-100 2 % obedecendo a proporção de 4 mL por mg de biomassa úmida. Após a suspensão, as três amostras foram unidas em uma proveta de 200 mL e completou-se o volume de amostra para 200 mL. A amostra foi inserida no homogeneizador previamente resfriado a 4°C e equilibrado com Tris 20 mM Triton X-100 2%. Uma pressão de 800 bar foi aplicada durante 10 minutos, para permitir a lise celular. Após esse período, a amostra, com aspecto clarificado, foi centrifugada a 4000 rpm (2057 g centrífuga Eppendorf 5810R) por 30 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi encaminhado para a etapa de recuperação do scFv na forma de corpos de inclusão.

[00195] Os ciclos de lavagem com ureia para recuperação dos corpos de inclusão, nesse caso, dispensaram as etapas de lise por sonicação. Entretanto, devido a maior quantidade de proteínas, um ciclo de lavagem a mais, com ureia 2 M, foi adicionado. Além disso, os volumes de solução para a suspensão dos precipitados foram 10 vezes maiores em comparação com a produção não-escalonada. As etapas para realização da recuperação do scFv na forma de corpos de inclusão, na produção em maior escala, estão demonstradas na figura Figura 32:

[00196] 38. Purificação em cromatografia IMAC com gradiente linear de eluição e renaturação

[00197] Para a purificação por cromatografia de afinidade, utilizou-se coluna HisTrap™ de 1 mL (GE Healthcare) em cromatógrafo ÃKTA pure Chromatography System (GE Healthcare). Os corpos de inclusão foram ressuspensos e solubilziados em 40 mL de Tris 50 mM NaCl 0,5 M Ureia 8 M. A amostra permaneceu em agitação branda sobre gelo por 20 minutos e foi então centrifugada em centrífuga Eppendorf 5810R a 12000 rpm (18514 g) por 10 minutos. O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi filtrado e transferido para um tubo falcon® de 50 mL. O sistema foi equilibrado com 10 mL de Tris 50 m NaCl 0,5 M Ureia 8 M e a amostra foi aplicada a um fluxo de 1 mL/min em recirculação por 2 h. A eluição do scFv ocorreu através da aplicação de um gradiente linear de imidazol, que variou de 0 a 1 M em um volume de 20 CV (Column volume), permanecendo em 1 M por mais 3 CV. Após o gradiente de imidazol, o sistema foi lavado com água e armazenado em etanol 20 %.

[00198] As frações coletadas correspondentes a altas concentrações de scFv são unidas em uma única amostra, que é destinada a renaturação. Para essa etapa, utilizou-se a metodologia de diálise, através de dispositivos Slide- A-Lyzer™ Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 3 mL (Thermo Fisher Scientific). Inicialmente, 667 μL de solução tampão padrão (Tris 20 mM L- arginina 0,4 M NaCl 100 mM) foram adicionados a 2 mL de amostra, fazendo com que a concentração de ureia diminuísse de 8 para 6 M. Em seguida, preparou-se 1,2 L de solução de imersão Tris 20 mM L-arginina 0,4 M NaCl 100 mM Ureia 4 M e 2 L de solução tampão padrão. O cassete de diálise foi cuidadosamente lavado com água e equilibrado com solução de imersão. Após o equilíbrio do cassete, a amostra foi cuidadosamente injetada.

[00199] O cassete com a amostra foi colocado na solução de imersão a e permaneceu em incubação por 2 horas, sob agitação leve com auxílio de dispositivo magnético, a 4°C. Após esse período, determinado volume de tampão de imersão foi substituído pelo menos volume de tampão de troca. O cassete foi novamente incubado, após a troca de soluções, sob as mesmas condições. As três primeiras trocas e volumes correspondentes foram realizadas para diminuir a concentração de ureia em 1 M a cada troca. As quatro últimas trocas e volumes diminuíram a concentração de ureia em 0,5 M por troca. Esse procedimento foi adotado para reduzir a perca de proteína por precipitação. A solução final após a última troca foi solução tampão 0,5x. 39. Processamentos finais: quantificação, redução de endotoxinas, liofilização e reconstituição

[00200] Após a diálise a amostra foi quantificada por BC A e submetida a redução do teor de endotoxinas bacterianas utilizando-se o kit Pierce™ High Capacity Endotoxin Removal Resin 88274 (Thermo Fisher Scientific), de acordo com as instruções disponibilizadas no manual do fabricante. Para a quantificação do nível de endotoxinas, utilizou-se o kit Endosafe® Cartridge Technology (Charles River), também conforme instruções disponíveis no manual do fabricante.

[00201] Após os processamentos anteriores, a amostra foi dividida em microtubos rosqueados, numa proporção de 100 μL por tubo e submetidas à liofilização. Uma vez liofilizadas, as amostras foram armazenadas a longo prazo a -20°C. Para utilização, o conteúdo de cada tubo foi hidratado com 50 μL de água ultrapura, sem homogeneização por pipetagem ou vórtex. Após a reidratação as amostras foram novamente quantificadas por BCA e armazenadas a 4 ou -20° C.

[00202] Todas as etapas de produção, purificação e processamento do scFv realizadas foram monitoradas através da coleta de alíquotas durante as etapas de cada processo. As alíquotas foram preparadas com tampão de amostra e submetidas a eletroforese SDS-PAGE para a visualização do perfil proteico em cada procedimento.

40. Avaliação da interação do scFv imobilizado com VLA-4 na superfície celular de células Jurkat

[00203] Para avaliar a capacidade de ligaço do scFv com seu alvo, foi realizado um experimento simples de avalição do número de células que expressam VLA-4 aderidas sobre superfícies recobertas com scFv. Inicialmente, placas Nunc MaxiSorp™ flat-bottom de 96 poços foram sensibilizadas, em triplicata, com 0, 1, 10, 100, 200, 400 e 800 ng de scFv em 100 μL de solução tampão carbonato-bicarbonato 0,05 M pH 9,6 (Sigma- Aldrich) por um período de 1 hora a 37°C. Após a incubação, a placa foi lavada quatro vezes através da adição e descarte de 150 μL de PBS-T 0,05 % em cada poço, seguida de bloqueio por adição de 300 μL de solução de leite desnatado Moliço™ 4 %, BSA (do inglês, Bovine Albumin Serum) 0,5 % PBS-T 0,05% a 37°C por 1 hora e então lavados com PBS-T 0,05 %.

[00204] Para a realização do experimento, foram utilizadas células da linhagem Jurkat, Clone E6-1 (ATCC® TIB- 152™). Essa linhagem consiste em linfócitos T humanos imortalizados derivados do sangue de um paciente com leucemia aguda, com alta expressão de VLA-4. As células foram descongeladas e cultivadas em 15 mL de meio RPMI-1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific) suplementado com 10 % de FBS (Fetal Bovin Serum), Gibco, Thermo Fisher Scientific) e solução antibiótica-antimicótica (A5955, Sigma-Aldrich) em garrafa de cultura com filtro (Nunc™ Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, Thermo Fisher Scientific), na concentração de 5x105 células/mL. A cultura foi mantida a 37°C com CO2 5 % sempre com a concentração celular mantida na faixa de 105 a 106 células/mL, sendo essa também a faixa de concentração aceitável para o uso das células em experimentos. A utilização de culturas com mais de 20 passagens foi evitada durante todos os experimentos.

[00205] Um volume de cultura celular correspondente a 8x105 células/mL foi coletado e centrifugado em centrífuga Eppendorf 5810R a 400 g (12000 rpm em rotor horizontal) por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi suspenso em meio RPMI sem FBS. Em seguida, 100 μL da suspensão celular, na concentração de 105 células/100 μL, foram adicionados aos poços da placa tratada com scFv. A placa foi incubada por 1 hora a 37°C. Em seguida, os poços foram lavados três vezes com meio aquecido a 37°C. A placa foi levada para visualização em microscópio de inversão Olympus CKX53. Com auxílio de uma câmera acoplada a ocular do microscópio, três fotos foram adquiridas de cada poço em diferentes campos. Cada foto adquirida corresponde a uma área de 1 mm2 da superfície do poço. [00206] O número de células em cada foto foi contabilizado com auxílio da ferramenta Cell Counter disponível no programa ImageJ. As contagens foram feitas às cegas sem que a identificação da condição fosse conhecida no momento da análise. Não foram contadas células que apareciam em outro plano da foto. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas, resultando em um número de nove contagens por condição.

40. Avaliação da interação direta entre scFv e VLA-4 por ELISA

[00207] Para avaliar a interação entre o scFv anti- VLA-4 e a integrina α4β1, utilizou-se a técnica de ELISA (do inglês, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizando 400 ng de integrina α4β1 recombinante (R&D Systems) imobilizada em placa e diferentes concentrações de scFv. A sensibilização e o bloqueio das placas foram realizados conforme descrito no item 3.7.

[00208] Três diferentes concentrações de scFv foram avaliadas, em triplicata, em incubações a 37 °C por 30 minutos. A placa foi então lavada, e adicionou-se anticorpo anti cadeia leve K conjugado com peroxidase (Anti- Human Kappa Light Chains (Bound and Free) - Peroxidase antibody produced in goat, A7164, Sigma Aldrich) na diluição de 1:1000.. Após um período de incubação de 1 hora a 37°C, a placa foi lavada e 100 μL de Single Component TMB Peroxidase® (BioRad) foram adicionados para revelação por 20 minutos, a 37°C, ao abrigo da luz Após esse período, 50 μL de H2SO4 2 N foram adicionados em cada poço. A placa foi submetida a análise em leitor de ELISA Spectra Max 190 (Molecular Devices), num comprimento de onda de 450 nm.

41. Avaliação da redução da transmigração de células Jurkat sobre superfícies recobertas com VCAM-1 e FN tratadas com scFv anti- VLA-4

Preparo das câmaras de Trans well® com VCAM-1 e fibronectina

[00209] Câmaras de Transwell® de 6,5 mm de diâmetro, com poros de 5 pm (Corning, 3421) dispostas em placas de 24 poços (oito insertos por placa) foram utilizadas para os experimentos de transmigração sobre VCAM- 1 e FN. Para tal, 70 μL de VCAM-1 2,5 μg/mL ou FN 10 μg/mL foram adicionados aos poços, formando uma gota no centro dos mesmos. Os insertos correspondentes de cada poço foram colocados sobre a gota, e 60 μL da solução de VCAM-1 ou FN foram adicionados a cada inserto, cobrindo também a parte inferior da membrana contendo os poros. Em pelo menos um inserto de cada placa foi adicionado uma solução de BSA 1% em PBS (m/v) utilizada como controle negativo da transmigração. A placa ficou em incubação por um período de 16 h, a 4°C.

[00210] Os insertos foram lavados três vezes através da disposição de 300 μL de PBS na parte exterior da membrana do inserto. Cada inserto foi disposto em um novo poço. Para o bloqueio, repetiu-se o procedimento anterior utilizando BSA 1 %, em um período de incubação de 1 hora a 37°C. Após a incubação, os insertos foram lavados e dispostos em um outro poço, contendo 600 μL de meio RPMI BSA 0,5 % a aquecido a 37°C.

42. Preparo das células e transmigração

[00211] Células Jurkat mantidas em cultura na faixa de concentração entre 5x105 e 106 células/mL foram utilizadas para o experimento de transmigração. Um milhão de células foram separadas para as seguintes condições: tratamento com scFv 20 μg/mL, tratamento com Natalizumabe 20 μg/mL, controle positivo (migração sobre VCAM-1 ou FN sem tratamento) e controle negativo (migração sobre BSA). As células foram incubadas com seus respectivos tratamentos num volume de 20 μL, durante 30 minutos a 37°C. Após esse período, as suspensões celulares foram ajustadas para 100 μL e dispostas para transmigração em seus respectivos insertos.

[00212] A placa com os insertos e as células foi incubada a 37°C, 5 % CO2 por 3 horas. Após esse período, os exteriores dos insertos foram lavadas utilizando o conteúdo de cada poço respectivo. Esse conteúdo foi centrifugado, o sobrenadante foi cuidadosamente descartado, e o precipitado foi ressuspenso em 100 μL de meio. O número de células presente em cada suspensão celular, referente a diferentes tratamentos, foi quantificado através de câmara de Neubauer. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes para realização da análise de média e desvio padrão.

43. Avaliação do bloqueio da adesão e da migração de células T de memória tratadas com scFv anti-VLA-4 a superfícies recobertas com VCAM-1 e FN sob fluxo

Preparo das superfícies com VCAM-1 e fibronectina

[00213] Para avaliar o potencial da molécula de scFv inibir a adesão de linfócitos T de memória em superfícies recobertas com os dois principais ligantes de VLA-4, sob estresse de cisalhamento, utilizou-se placas de Ibidi® p-Slide VI 0.1. Inicialmente, preparou-se uma solução de proteína A, que reconhece os domínios Igs da molécula de VCAM-1, na concentração de 40 μg/mL, e quimiocina CXCL12 2 μg/mL. Em cada canal da câmara foram adicionados 40 μL dessa solução, com auxílio de uma seringa de 1 mL para distribuir homogeneamente o líquido no interior dos canais, evitando a formação de bolhas. A placa foi incubada a 37°C por 30 minutos.

[00214] Após a incubação, os canais foram lavados três vezes através da adição e descarte de PBS. Para o bloqueio dos canais, 40 μL de BSA 2 % foram adicionados em cada canal. A placa ficou em incubação por 10 minutos a TA. Após esse período os canais foram lavados e adicionou-se 30 μL de VCAM-1 10 μg/mL. A placa ficou em incubação por 16 h a 4°C.

[00215] Para o tratamento dos canais com fibronectina, preparou-se uma solução de FN 25 μg/mL CXCL12 2 μg/mL. Em cada canal foi adicionado 20 μL da solução. A placa foi incubada a 37°C por 30 minutos. Os canais foram lavados e foi realizado o bloqueio com BSA 2 %. Os canais foram novamente lavados e armazenados em PBS.

44. Preparo das células

[00216] O preparo de células para esse experimento foi realizado a partir de PBMCs (do inglês, Periferal Blood Mononuclear Cells) derivados de bolsas de sangue provenientes de doadores saudáveis, obtidas no Hôpital de la Conception - Marseille, França. As PBMCs foram previamente separadas através de gradiente de separação utilizando meio LSM (Lymphocyte Separation Medium, Coming®), segundo instruções do fabricante. As células foram então congeladas ou cultivadas em 15 mL de meio RPMI-1640 suplementado com 10 % de FBS, solução antibiótica antimicótica e GlutaMAX™ (Gibco, Thermo Fisher Scientific). As culturas de PBMC foram mantidas na concentração de 1 a 5x106 células/mL por um período não superior a uma semana.

[00217] Os linfócitos T de memória foram separados da cultura de PBMCs através da combinação dos kits Pan T Cell Isolation Kit, human e CD45RA MicroBeads, human (MACS, Miltenyi Biotec). Essa combinação permite a separação de linfócitos T que não expressam CD45R, ou seja, já foram ativados. A cultura de PBMCs foi centrifugada a 300 g por 15 minutos, suspensa em solução tampão MACS e sua concentração foi determinada através de câmaras KOVA® Slide II. A suspensão celular foi novamente centrifugada, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspenso em solução tampão MACS na proporção de 40 μL/107 células. A solução Pan T Cell Biotin Antibody Cocktail foi adicionada e homogeneizada à suspensão celular, na proporção de 10 μL/107 células, e incubada a 4°C por 10 minutos. Após esse período as soluções de CD45RA microbeads e Pan T cell microbeads foram adicionadas na proporção de 20 μL/107 células. A amostra foi então incubada a 4°C por 15 minutos e em seguida foi transferida para uma coluna com esferas magnéticas descartável, acoplada ao dispositivo de campo magnético, equilibrada com tampão MACS. O tubo aonde foi realizado o preparo da suspensão celular com os anticorpos e as microesferas foi lavado com 1 mL de tampão MACS, e esse conteúdo também foi colocado na coluna. O líquido que atravessa a coluna, contendo células T de memória, foi coletado em um novo tubo falcon®, aonde o volume foi completado para 20 mL. O tubo foi centrifugado, o sobrenadante foi descartado e as células foram suspensas em meio RPMI-1640 suplementado com 10 % de FBS, solução antibiótica antimicótica e GlutaMAX™ na proporção de 106 células/mL. As células foram utilizadas em experimento no mesmo dia, após um período de recuperação de no mínimo 1 hora a 37°C, ou mantidas em cultura por 5 dias no máximo.

45. Preparo do sistema para experimento sob fluxo

[00218] Para a realização e monitoramento do experimento, utilizou-se um microscópio invertido (Olympus France, Rungis, France) em campo claro, equipado com lentes de aumento de 10 x e uma câmera Sony CCD vídeo acoplada. Para a aplicação do fluxo, utilizou-se duas bombas de seringa (A- 99; Razel, St. Albans, VT) com seringas de 1 e 5 mL. O microscópio e as bombas são dispostos em uma grande caixa de acrílico com controle de temperatura, de forma que a temperatura do sistema durante o experimento deve ser mantida em 36 e 37°C.

[00219] Inicialmente, as seringas e mangueiras foram preenchidas com meio de cultura a 37°C e acopladas às bombas. As mangueiras foram conectadas ao primeiro canal da placa Ibidi® com o cuidado para não formar bolhas. Para evitar a formação de bolhas as mangueiras e o canal devem estar totalmente preenchidos com líquido. Após a conexão das mangueiras, a placa foi fixada na platina do microscópio, de maneira a permitir a visualização do canal. O canal foi brevemente lavado com até 1 mL de meio, com auxílio de uma seringa conectada a uma das válvulas da mangueira.

[00220] Para a injeção das células no canal, uma seringa de 1 mL foi preenchida com 400 μL de linfócitos T de memória. A seringa foi colocada na válvula, conectada às mangueiras, mais próxima da entrada do canal. A cada aquisição para avaliação da adesão, 100 μL de células foram injetadas.

[00221] O experimento foi monitorado e gravado através do programa VirtualDubMod, que permitiu a aquisição de vídeos relativos às diferentes condições do experimento. O sinal de vídeo foi digitalizado e comprimido utilizando a opção “ffdshow”. [00222] Em cada canal foi utilizado um determinado tratamento das células. A performance de cada tratamento foi avaliada através da aquisição de seis vídeos por canal, cada um com um diferente fluxo, ou estresse de cisalhamento, aplicado, medido em dyn/cm2. Além disso, cada aquisição difere no seu objetivo, injeção de células, tempo de aquisição, utilização da seringa de 1 ou 5 mL e velocidade configurada na bomba, que corresponde ao valor correspondente ao estresse de cisalhamento de acordo com a seringa utilizada. As condições das seis aquisições por canal estão dispostas na Tabela 1:

Tabela 1 Condições de aquisição por canal.

46. Tratamento das células e experimentos em VCAM-1 e FN

[00223] Para os experimentos realizados em superfícies recobertas com VCAM-1, os linfócitos T foram tratados na ausência e na presença de três diferentes concentrações de scFv. Na condição controle, as células foram diretamente injetadas nos canais, sem tratamento prévio. As concentrações de scFv avaliadas foram 0,2, 2 e 20 μg/mL. Para cada concentração, avaliada individualmente em um canal, as células foram incubadas por um período de 15 a 30 minutos com o scFv nas concentrações mencionadas, a 37°C. Após esse período, as células puderam ser injetadas em seus respectivos canais.

[00224] Para os experimentos realizados em fibronectina, as células foram tratadas na ausência e na presença de scFv 2 μg/mL e Fab de Natalizumabe 3 μg/mL. As células foram incubadas com tais anticorpos por um período de 15 a 30 minutos, a 37°C, anterior a sua aplicação no canal. [00225] Cada tratamento mencionado foi avaliado e repetido pelo menos 5 vezes para posterior análise e obtenção do valor médio.

47. Análise das aquisições

[00226] As três primeiras aquisições visam observar a redução frequência de adesão de linfócitos T de memória aos ligantes de VLA-4 na presença de anticorpos bloqueadores dessa integrina, tais como o scFv em estudo. Os vídeos adquiridos nas três primeiras condições referente a esses objetivos (quadro 3.10.3.1) foram então submetidos a identificação e mapeamento da trajetória das células, e posterior cálculo da frequência de adesão.

[00227] Para o mapeamento da trajetória, utilizou-se o plug-in Trajectoires 3_2 desenvolvido pelo Laboratório de Adesão e Inflamação (INSERM 1067, Marseille, França). Para o cálculo da frequência de adesão, utilizou-se o plug-in Arrests 3_2 desenvolvido pelo mesmo laboratório. Ambos plug-ins foram instalados no programa ImageJ. A primeira análise possui como arquivo de entrada pastas contendo os vídeos adquiridos. Já a segunda análise utiliza os arquivos de saída da primeira análise como arquivos de entrada para análise das trajetórias.

[00228] As três últimas aquisições, visam avaliar o perfil de migração das células que foram capazes de aderir às superfícies, mesmo na presença de anticorpos bloqueadores. Para avaliação dos vídeos adquiridos referentes à migração (quadro 3.10.3.1), utilizou-se o plug-in Redeucter para converter os vídeos em imagens correspondentes a seus frames. O perfil de migração foi avaliado através do uso do programa MATLAB 7.13 e três scripts desenvolvidos pelo Laboratório de Adesão e Inflamação. O primeiro script foi utilizado para retirar o background das imagens e normalizá-las seguindo o padrão de células como pontos brancos em um fundo preto. O segundo script foi utilizado para rastrear o número de células e suas posições em cada imagem. O último script, foi utilizado para calcular as velocidades, direções, e outros parâmetros relativos às células, a partir do arquivo de saída anterior.

48. Avaliação da interferência do scFv na ativação celular

[00229] Preparo das células

[00230] Para avaliar a interferência do scFv na ativação de linfócitos T utilizou-se células T CD8+. Essas células foram purificadas via sistema EasySep™ Human CD8+ T Cell Enrichment Kit (seguindo as instruções do fabricante) a partir de PBMCs mantidos em cultura por 10 dias em placas de 24 poços, em meio RPMI-1640 suplementado com 10 % de SBF, solução antibiótica antimicótica, GlutaMAX™ e IL-2 50 U/mL. As células purificadas foram mantidas em cultura nas mesmas condições iniciais, numa concentração de aproximadamente 107 células/mL.

49. Preparo das lâminas

[00231] Para a ativação das células e visualização dos efeitos do tratamento com scFv em microscópio utilizou-se lâminas recobertas com fibronectina e/ou anticorpo anti-CD3. Inicialmente, soluções de FN 10 μg/mL, anti-CD3 10 μg/mL e uma solução mix (FN 10 μg/mL anti-CD3 10 μg/mL) foram preparadas. Cada solução foi adicionada em um poço de uma lâmina de 76x26x1 mm, com 10 poços de área de 7 mm2 (Marienfeld, 1216824) previamente limpas. A lâmina com as soluções ficou em incubação por 16 h, a 4°C em câmara úmida.

[00232] As células foram tratadas na presença e ausência do scFv para realização do experimento. Para tanto, 750 μL de células na concentração de 5x104 células/50 pl foram lavadas e suspensas em RPMI BSA 1 %. As células foram divididas em dois tubos falcon® de 15 mL. Em um dos tubos, foi adicionado 200 ng de scFv e a suspensão celular foi delicadamente homogeneizada na presença do scFv. Ambos tubos foram incubados por 30 min a 37°C. Após esse período, as células foram centrifugadas a 1500 rpm (190 g) por 5 min. Os precipitados foram suspensos em 700 μL de RPMI BSA 1% e os sobrenadantes foram descartados. [00233] Os poços das lâminas foram lavados três vezes, através da adição de 50 μL de PBS, incubação por 3 min a TA e remoção do mesmo. Após a lavagem, 50 μL das suspensões de células, tratadas e não tratadas com scFv, foram dispostos sobre os poços nas diferentes condições (FN, anti-CD-3 e mix FN+anti-CD3). A lâmina ficou em incubação por 20 min a 37°C. Após esse período, o meio dos poços foi delicadamente removido.

[00234] Para fixação das células nos poços, 50 μL de para-formaldeído (PFA) foram adicionados a cada poço, por incubação por 10 min a 37°C. O PFA foi removido e os poços, lavados duas vezes, com 50 μL de BSA 3 % Hepes 10 mM, por 2 min à TA.

[00235] Para permeabilização das células fixadas, foram adicionados 50 μL de BSA 3 % saponina 0,1 % em cada poço, por 15 min à TA. O meio de permeabilização foi removido e os poços foram lavados três vezes com 50 μL de BSA 3 % saponina 0,1 %, por 3 min à TA.

[00236] Para a marcação de alvos moleculares para avaliação do efeito do scFv na ativação, foram utilizados anticorpos primários anti-CD49d (Purified Mouse Anti-Human CD49d, Mouse IgGl, K, 555502, BD Biosciences, diluição 1:50), para o reconhecimento da subunidade a4 de integrinas, e anti-tirosina fosforilada (p-Tyr Antibody PY99: sc-7020, mouse monoclonal IgG2b kappa light chain, diluição 1:50), para reconhecimento de regiões de tirosina fosforilada, relativos a vias de sinalização. Ambos os anticorpos foram incubados por 1 hora à TA. Após esse período, os poços foram lavados com BSA 3 % saponina 0,1 %.

[00237] Os anticorpos secundários utilizados foram anti-IgGl de camundongo conjugado com Alexa Fluor® 488 (Goat anti-Mouse IgGl Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, A-21121, Invitrogen, diluição 1:200) e anti-IgG2 de camundongo conjugado com Alexa Fluor® 647 (Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, A-21242, Invitrogen, 1:200), respectivamente, para o revelação do anti-CD49d e do p-Tyr. Para a marcação de actina foi utilizada faloidina (Alexa Fluor® 555 phalloidin, A34055, Thermo Fisher Scientific, diluição 1:40). Os anticorpos secundários e a faloidina foram incubados por 1 hora, à TA ao abrigo da luz

[00238] Os poços foram lavados com PBS três vezes e todo o líquido residual foi cuidadosamente aspirado, evitando ao máximo qualquer líquido restante. Rapidamente, uma gota de meio de montagem DABCO mounting medium (Abeam) foi adicionada em cada poço, a lâmina foi coberta com uma lamínula e selada com esmalte transparente. As lâminas foram armazenadas a 4°C ao abrigo da luz.

50. Visualização e análise dos tratamentos

[00239] As lâminas foram visualizadas em microscópio confocal LSM 710 (Zeiss). Cerca de 20 imagens por tratamento foram obtidas. Para quantificação dos pontos focais de tirosina fosforilada nas células, foi utilizado um plug-in desenvolvido para análise do experimento e instalado no programa ImageJ. O plugin consistiu na seleção da imagem contendo apenas o canal correspondente à visualização de tirosina fosforilada, subtração do background, aplicação de um Threshold de 0 e 135 e quantificação das partículas com mínimo de 0,1 pm de diâmetro. O número de partículas de tirosina fosforilado está relacionado à ativação celular.

[00240] Para quantificação de estruturas de empacotamento de actina, utilizou-se um plug-in, com o mesmo principio do anterior. Entretanto, o tamanho mínimo dos diâmetros das estruturas de actina foi de 0,5 pm.

51. Avaliação estatística dos experimentos de avaliação do scFv

[00241] Para avaliar os dados referentes aos experimentos de avaliação do scFv (itens 3.7 a 3.11) utilizou-se o programa GraphPad Prism 7. As médias e desvios-padrão referentes a cada conjunto de experimentos foram calculadas pelo programa. Além disso a significância de cada efeito observada foi calculada utilizando o teste one-way ANOVA em relação ao controle ou T-student de acordo com o número de condições avaliadas.

EXEMPLO 1

Prospecção

[00242] Três sequências de cadeias leves e pesadas de anticorpos foram obtidas a partir do Integrity, com os códigos de identificação: 257898, 670484 e 725144.

Modelagem comparativa

[00243] Os moldes obtidos do PDB utilizados como referência para a montagem da estrutura tridimensional dos anticorpos apresentaram valores de identidade e cobertura acima de 80%, com E value igual ou abaixo de zero, confirmando que o alinhamento foi confiável e apropriado para a realização da modelagem comparativa (tabela 2).

Tabela 2 - Moldes utilizados para a construção de cada anticorpo e seus parâmetros.

[00244] As cadeias leves e pesadas foram obtidas, apresentando as estruturas apresentadas nas Figuras 2 e 3.

EXEMPLO 2

Avaliação e refinamento das estruturas modeladas

[00245] Após o refinamento das cadeias modeladas feitos no Coot, as estruturas foram avaliadas pelos servidores Molprobity e Verify 3D. As estruturas apresentaram os seguintes parâmetros (tabela 3) nas avaliações:

Tabela 3 - Parâmetros de qualidade da estrutura pelo servidor Molprobity e

Verify 3D

[00246] Os rotâmeros correspondem a torsões e combinações de ângulos relativos à cadeia lateral dos aminoácidos que correspondem a posição de mínima energia (SCHRAUBER; EISENHABER; ARGOS, 1993). Nesse contexto, um rotâmero favorável está em sua conformação de torsões e ângulos energeticamente apropriados, enquanto rotâmeros ruins correspondem a conformações energeticamente improváveis. O Molprobity considera como adequadas aquelas que apresentam acima de 98% de rotâmeros favoráveis e menos de 0,3% de rotâmeros ruins. Todas as cadeias modeladas atenderam a esses requisitos.

[00247] O Verify 3D avalia a compatibilidade de um modelo 3D com sua estrutura primária. O servidor considera aprovadas estruturas com valor igual ou maior que 80%. Os valores obtidos pelas cadeias modeladas foram superiores a esse valor.

[00248] Os ângulos diédricos T (psi) e (phi) de um resíduo de aminoácido possuem limites para suas conformações, de forma que existem ângulos que são permitidos, favoráveis e não permitidos. O gráfico de Ramachandran mostra as combinações desses ângulos, diferenciando as regiões favoráveis, permitidas e não permitidas. Os resíduos são plotados e é possível observar em que região eles se encaixam. O Molprobity considera que deve haver um mínimo de 99 % de resíduos permitidos, de acordo com o gráfico. Os gráficos de Ramachandran das cadeias (figura 4) apontaram nenhum ou apenas um resíduo em regiões não permitidas, com exceção da cadeia leve 670484. Essa proporção é observada em porcentagens na tabela 3.

EXEMPLO 3

Obtenção dos scFvs

[00249] Para cada anticorpo foi obtido um scFv com peptídeo ligante longo e outro com peptídeo ligante curto (figura 5).

Mapeamento de CDRs e resíduos ativos

[00250] Os CDRs de cada scFv foram definidos. Quantidades diferentes de resíduos ativos foram encontradas nos CDRs de cada scFv (tabela 4). ScFvs de mesma sequência, com diferentes peptídeos ligantes, apresentaram números de resíduos ativos diferentes. Entretanto, esses valores não demonstraram relação direta com o tamanho dos peptídeos ligantes.

Tabela 4 - Quantidade de resíduos ativos nos CDRs de cada scFv

Docking molecular com integrina «4β1

[00251] A partir do conhecimento dos resíduos ativos dos scFvs e da integrina α4β1 foi possível a realização do docking utilizando o Haddock. Os resultados gerados estão demonstrados nas figuras 6, 7 e 8.

Busca de hotspots a partir dos melhores complexos

[00252] Todos os complexos α4β1-scFv apresentaram hotspots importantes para a estabilidade das proteínas envolvidas e para a interação scFv-integrina. Assim como os resíduos ativos, a quantidade de hotspots foi variável para cada complexo (tabela 5).

Análise de interações dos complexos e identificação dos hotspots interatuantes

[00253] A partir dos resultados do PDBePISA observou-se que quase todos os scFvs, com exceção do scFv 725144 de peptídeo ligante curto, apresentaram hotspots realizando interações do tipo ligação de hidrogênio ou ponte salina com resíduos da integrina. O número de hotspots interatuantes foi maior para scFvs de peptídeo ligante longo (tabela 6).

Tabela 6 - Quantidade de hotspots interatuantes de cada scFv

Mutagênese dirigida dos scFvs

[00254] Diferentes mutações foram feitas em cada scFv. O número de mutações feitas em cada scFv baseou-se na quantidade de resíduos propensos a substituição nas regiões próximas aos hotpots interatuantes (tabela 7). Não foram feitas mutações no scFv 725144 de peptídeo ligante curto, pois o mesmo não apresentou hotspots interatuantes que serviriam como base para tomar seu entorno um ponto forte de interação.

Tabela 7 - Quantidade de mutações feitas em cada scFv

Docking dos scFvs contra integrina α4β1, α5β1 e α4β7

[00255] Comparando os resultados dos dockings do scFvs nativos e modificados com as integrinas α4β1 e α5β1 foi possível avaliar o efeito das mutações realizadas em comparação com os scFvs nativos.

[00256] Observa-se que o scFv 257898 modificado com peptídeo ligante curto apresentou uma diminuição do valor de Haddock score para α4β1 e um aumento desse valor para α5β1 (figura 9), em comparação com sua forma nativa (sem mutações). Esse mesmo scFv apresentou um aumento do valor de Cluster size para α4β1 e uma diminuição do mesmo para α5β1 (figura 10). Apenas os dockings dos scFvs 670484 e 725144 nativos de peptídeo longo com a integrina α5β1 apresentaram valores de RMSD superiores a 2 A (figura 11). O scFv 257898 modificado de peptídeo curto apresentou valor de RMSD igual a 0,6 e 1,1 A, respectivamente, para as integrinas α4β1 e α5β1. Portanto, esse scFv foi selecionado como melhor.

[00257] O docking do melhor scFv com a integrina α4β7 apresentou valor de Haddock Score superior ao valor para α4β1 (tabela 8). Porém, o valor de Cluster size para α4β7 foi muito acima do valor para α4β1 (tabela 8), o que levou a realização de novas mutações.

Tabela 8 - Resultados dos dockings do scFv 257898 modificado de peptídeo curto com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7

EXEMPLO 4 - Mutagênese dirigida do melhor scFv e repetição do docking

[00258] A segunda série de mutações realizadas gerou um scFv modificado com três resíduos modificados em comparação ao scFv original (257898 de peptídeo ligante curto nativo). Esse novo scFv, foi denominado scFv B. Após a terceira série de mutações, o novo scFv gerado conteve oito resíduos modificados em comparação ao scFv original. Esse scFv foi denominado scFv X.

[00259] Observou-se pelo resultado do docking dos scFvs B e X com as integrinas α4β1, α5β1 e α4β7 que a segunda série de mutações não foi suficiente para diminuir efetivamente o valor de Cluster size, mas, a terceira série de mutações foi capaz de surtir esse resultado (tabelas 9 e 10).

Tabela 9 - Resultados dos dockings do scFv B com as integrinas α4β1, α5β1 e α.4β7 Tabela 10 - Resultados dos dockings do scFv X com as integrinas α4β1, α5β1 e a4p7

EXEMPLO 5 - Dinâmica Molecular

[00260] As simulações de DM ocorreram normalmente para todos os complexos integrina-scFv. Os arquivos de saída de cada simulação descrevem a trajetória dos átomos do sistema, os dados de estrutura, topologia e parâmetros de simulação, as informações de energia ao longo da simulação e as coordenadas atômicas.

Análise dos dados das simulações de DM

Análise de RMSD (Root Mean Square Devitation)

[00261] O valor de RSMD refere-se ao desvio médio de um átomo, de forma que esse valor deve se manter o menor possível e constante ao longo do tempo. A avaliação do RMSD ao longo do empo resulta em um valor médio de oscilação (DINÂMICA, 2016). Pequenas oscilações são normais e são refletidas em pequenos valores de RMSD. Portanto, quanto maiores os valores de RMSD menos aquele sistema estará em equilíbrio. Nessa análise, os átomos utilizados para o cálculo foram os carbonos alfa dos resíduos de aminoácidos.

[00262] Observa-se que os resultados de RMSD para o scFv nativo para as três integrinas foram similares (figura 9). O RMSD nos três casos se manteve baixo e constante. Para o scFv B, os valores foram similares, mas não tão uniformes quanto para o scFv nativo (figura 10). Para o scFv X o RMSD do complexo scFv- α4β1 foi o menor e o mais estável (figura 11), enquanto os outros dois complexos apresentaram valores maiores e inconstantes, especialmente, o complexo scFv- α4β7.

Análise de RMSF (Root Mean Square Flutuation)

[00263] O valor de RMSF representa a flutuação ou flexibilidade de um resíduo a partir da comparação das estruturas ao longo da simulação com a estrutura anterior a DM. Valores baixos de RMSF também indicam estabilidade, de forma que uma região contendo resíduos com alta flutuação será uma região menos estável em comparação àquelas de baixa flutuação. Logo, estruturas secundárias de proteínas formadas por loops tendem a apresentar uma alta flutuação. No caso dos CDRs, apesar de constituírem regiões de alta flexibilidade, o seu RMSF não deve ser alto devido a estabilização adquirida resultante da interação com a integrina.

[00264] Os resultados de RMSF para os complexos scFv - integrina mostrou que o scFv X nos três casos apresentou a maior flutuação, comparado ao nativo e ao B (figuras 12, 13 e 14). Entretanto, a flutuação desse scFv foi consideravelmente menor com a integrina α4β1, que para α5β1 e α4β7.

Análise de Raio de giro

[00265] O raio de giro é uma medida referente à compactação do sistema proteico ao longo do tempo. A variação desse parâmetro ao longo do tempo indica uma expansão ou contração no sistema proteico. O ideal, é que esse valor se mantenha pequeno e constante ao longo do tempo.

[00266] Os valores de raio de giro para o scFv nativo foram praticamente iguais e constantes para todas as integrinas (figura 15). Para o scFv B os valores para cada integrina apresentam uma leve distinção, mas os três se mantém constantes (figura 16). Já o scFv X obteve um valor pequeno e constante para a integrina α4β1, um valor mais elevado e inconstante para α5β1 e um valor constante para α4β7, porém maior em comparação a α4β1 (figura 17).

[00267] A constatação que o raio de giro se manteve constante para o scFv X e a integrina α4β1 durante toda a simulação certifica que o complexo formado pelas três cadeias peptídicas (alfa 4, beta 1 e scFv) se manteve estável, sem afastamento de nenhuma das cadeias.

Ligações Hidrogênio [00268] As ligações Hidrogênio são interações intermoleculares entre dois grupos polares que ocorrem entre um átomo de Hidrogênio e um átomo de Oxigênio, Flúor ou Nitrogênio. A interação entre proteínas normalmente conta com ligações hidrogênio como componentes dessa interação. Quanto maior o número de ligações, mais favorável será esse contato.

[00269] O número de ligações Hidrogênio entre o scFv nativo e as três integrinas foi similar, de forma que todos apresentaram uma média entre 4 e 5 ligações (figura 18). Para o scFv B, o número de ligações com a integrina α4β1 foi o maior, com média 7, seguido do número para α5β1, com média 6 e o menor número foi para α4β7, com média 3 (figura 19). Para o scFv X, o número de ligações para α5β1 foi o maior, com média 6, e para α4β1 e α4β7 obteve média de 3 ligações (figura 20).

Pontes salinas

[00270] As interações do tipo pontes salinas são observadas entre aminoácidos com cargas opostas. Logo, os únicos resíduos capazes de formar pontes salinas são argininas, lisinas, histidina (aminoácidos positivos) interagindo com aspartato e glutamato (aminoácidos negativos). Assim como as ligações hidrogênio elas são determinantes para interação entre proteínas. Nessa análise, as pontes salinas foram observadas com auxílio do programa VMD, seguindo o critério geométrico de até 3,2 angstrons de distância entre os resíduos para consideração de uma ponte salina.

[00271] O scFv nativo apresentou um maior número de pontes salinas para α4β1, seguido de α5β1 e, por fim, α4β7 (tabela 11, figuras 21, 22 e 23). O scFv B apresentou número maior de pontes salinas para α4β1, e a mesma quantidade para α5β1 e α4β7 (tabela 11, figuras 24, 25 e 26). Entretanto, a ponte salina entre esse scFv e a integrina α5β1 aparenta se desfazer ao final da simulação (figura 27). O número de pontes salinas se manteve constante para o scFv X em comparação com o scFv B (tabela 11). Porém, as duas pontes salinas que se formam com α4β1 começam após aproximadamente 30ns de simulação.

Tabela 11 - Quantidade de pontes salinas entre scFv e integrina observadas na simulação

Energia Total

[00272] A energia total refere-se a soma de todas as interações não- ligadas do sistema e tende a se manter constante ao longo da simulação, confirmando o estado de equilíbrio. Quanto menor a energia de um sistema, mais termodinamicamente favorável ele é.

[00273] O scFv nativo apresentou um valor de energia baixo para a integrina α4β7, e valores semelhantes de energia para as outras integrinas (figura 30). Para o scFv B, observa-se que o valor de energia para α4β7 ainda é o menor, porém a energia para α5β1 torna-se maior em comparação com α4β1 (figura 31). Com o scFv X, observa-se uma diminuição da energia para α4β7, e seu valor se toma aproximado para α4β1 (figura 32). O valor para α5β1 é o maior nesse caso.

Potencial de Coulomb

[00274] O potencial de Coulomb refere-se ao valor de energia potencial correspondente às interações eletrostáticas. Esse tipo de interação ocorre entre duas cargas elétricas, de forma que a lei de Coulomb irá descrever o grau de dificuldade para separar essas cargas (MONTANARI et al., 1998).

[00275] O potencial de Coulomb para os scFvs e as integrinas apresentou o mesmo comportamento observado na análise de energia total (figuras 33, 34 e 35). Potencial de Lennard-Jones

[00276] O potencial de Lennard-Jones trata da energia relativa às interações do tipo Van der Waals. Essas interações ocorrem com todos os tipos atômicos e são associadas ao momento de dipolo induzido. A distribuição de densidade eletrônica que caracteriza os dipolos leva a uma atração que resulta nas interações de Van der Waals que somadas são descritas pelo potencial de Lennard-Jones (ANDRICOPULO, 2016).

[00277] O scFv nativo apresentou valores positivos para o potencial de Lennard-Jones para todas as integrinas (figura 36). Esse tipo de ligação, portanto, não contribuiu para o estado de baixa energia do sistema. O scFv nativo apresentou um decaimento desse potencial, que permaneceu negativo por volta dos 10ns para as três integrinas (figura 37). Nesse caso, o valor energético mais baixo foi para α4β7, e para α4β1 e α5β1 foi praticamente igual. Já para o scFv X, observou-se também o decaimento do potencial, na mesma faixa de tempo, entretanto o valor energético para α4β1 foi praticamente igual ao valor para α4β7, enquanto para α5β1 esse valor foi consideravelmente maior (figura 38).

EXEMPLO 6 - Clonagem do gene scFv-anti-VLA-4 em plasmídeo pET28a

[00278] Os plasmídeos pET28a e PUCIDT+scFv foram visualizados no gel de agarose 1 %, (Figura 41A). Tais pesos moleculares relativos correspondem ao esperado, de acordo com os dados do fabricante. Após a PCR de amplificação e inserção de sítios de restrição do gene scFv-anti-VLA- 4, o fragmento nucleotídico resultante apresentou peso relativo de 743 pb (Fig. 41A)

[00279] A reação enzimática do plasmídeo pET28a com as enzimas de restrição Xhol e Ncol, individualmente, resultou na linearização do vetor (Figura 41B). Essa avaliação foi importante para a certificação da ação de ambas enzimas antes da digestão dupla para clonagem, possibilitando a reação de ligação do plasmídeo linearizado ao gene amplificado.

[00280] Após a transformação de células de E.coli DH5α com o plasmídeo recombinante (pET28a+scFv), e realização do procedimento de PCR de colônia, foi possível visualizar uma banda nucleotídica correspondente ao inserto nos clones 12, 15 e 20 (Figura 41C). Clones que contêm os plasmídeos recombinantes possuem 743 pb entre as regiões T7, enquanto os plasmídeos íntegros possuem 239 pb entre essas regiões. Portanto, foi possível identificar os clones recombinantes através da visualização de segmentos de DNA de maior peso molecular, após a amplificação, quando comparados com os plasmídeos íntegros em gel de agarose a 1%.

[00281] Após a extração dos plasmídeos recombinantes, a presença do inserto foi confirmada por diferentes PCRs, feitos a partir de combinações de oligonucleotídeos específicos para o vetor e para o scFv (Figura 41 D). A reação a. indicou a presença das regiões promotora e terminadora T7 nos três clones, além do peso molecular cerca de 500 pb maior em comparação ao vetor íntegro (Figura 41D). A reação b. confirmou a presença do inserto no plasmídeo recombinante dos três clones, apresentando peso molecular de aproximadamente 743 pb. As reações c. e d. ratificaram os resultados observados nas reações anteriores. Além disso, a digestão do vetor recombinante e visualização do mesmo em uma região de peso molecular maior, em comparação ao pET28a _i foi coerente com os resultados anteriores (Figura 41 D).

[00282] Após a análise do sequenciamento nucleotídico, observou-se que apenas os clones 15 e 20 não apresentaram inconsistências ao comparar com a sequência nucleotídica do scFv. Portanto, apesar dos três clones serem avaliados quanto à expressão do scFv, apenas o clone 20 foi selecionado para o prosseguimento das etapas de produção e avaliação do scFv anti-VLA-4.

EXEMPLO 7 - Expressão do scFv em E. coli SHuffle® [00283] A avaliação da expressão do scFv por células de E.coli SHuffler® transformadas com os clones recombinantes 12, 15 e 20 foi observada pelas técnicas de SDS-PAGE e Western Blotting. As frações proteicas induzidas, após a adição do IPTG, apresentam uma banda proteica de cerca de 27 kDa, correspondente ao scFv fusionado à cauda de histidinas (Figura 42). Tal banda proteica não é detectada nas frações não induzidas, indicando que essa proteína foi expressa após a adição do indutor de expressão para promotor T7.

EXEMPLO 8 - Avaliação da solubilidade do scFv

[00284] A avaliação da solubilidade do scFv, após a confirmação da expressão, foi fundamental para definir as estratégias de purificação. Observou-se que o scFv é expresso de forma insolúvel quando as células são rompidas em Tris 20 mM Triton X- 100 0,1 e 0,5 % (condições a. e b.) ou na solução comercial Cell Lytic® B, pois em todos os casos, a proteína recombinante foi observada inteiramente na fração insolúvel “Ins” (Figura 43.1).

[00285] A adição de agentes que promovem um aumento na solubilidade de proteínas - nesse caso, NaCl, L-arginina, glicerol e MgC12 - não alterou o caráter de insolubilidade do scFv (Figura 43.2). Entretanto, adição de L-arginina 0,4 M foi capaz de induzir uma pequena solubilização do scFv, visualizada pela presença de uma fraca banda proteica na respectiva fração solúvel. Porém, a quantidade de proteína insolúvel nessa condição é predominante.

[00286] Após a confirmação do caráter insolúvel da proteína recombinante produzida, mesmo na presença de substâncias potencialmente solubilizadoras, realizou-se a expressão do scFv em temperaturas menores como nova estratégia de solubilização. A expressão a 30 °C apresentou o mesmo perfil de insolubilidade observado, tanto após a lise em solução tampão base (Tris 20 mM Triton™ X-100 0,1 %) como em solução tampão aditivada (Tris 20 mM Triton™ X-1000,5 % L-arginina 0,4 M NaCl 50 mM), sendo visualizado sempre nas frações insolúveis de ambas as soluções. A expressão a 23 °C apresentou uma solubilização parcial do scFv na presença da solução aditivada, sendo possível visualizar uma fraca banda proteica na fração solúvel “sta.Sol”. Entretanto, a quantidade de proteína produzida foi muito inferior à observada em temperaturas mais elevadas, dificultando a realização das etapas seguintes devido à baixa quantidade de proteína. A expressão a 16 °C foi ineficaz, de forma que não foi possível detectar a expressão da proteína recombinante. Os perfis de expressão e solubilidade nessas temperaturas estão demonstrados na Figura 44.

[00287] Após a realização de estratégias de solubilização a partir da adição de substâncias solubilizadoras e redução da temperatura de expressão verificou-se que ambas foram ineficazes. Adotou-se, portanto, a metodologia de solubilização da proteína recombinante através da adição de um agente caotrópico, a ureia. Observou-se que apenas a adição de ureia na concentração 8 M foi capaz de promover uma solubilização parcial das moléculas de scFv (Figura 45).

EXEMPLO 9 - Avaliação dos meios de expressão

[00288] Para aumentar a produção de proteína recombinante por células de E.coli SHuffle® transformadas com pET28a+scFv, realizou-se a avaliação do perfil de expressão de scFv em meio TB, a 37 e 30 °C em Erlenmeyer, microbiorreator, meio Enpresso, e Erlenmeyer a 30°C. A expressão do scFv realizada em meio TB em Erlenmeyer, a 30 ou 37 °C apresentou o mesmo perfil de produção de scFv (Figura 46). Além disso, a D0.600nm do inóculo, ao final do período de expressão, foi de 7 e 8,. Para a produção em biorreator, optou-se pela expressão a 30°C por ser a temperatura recomendada para a produção de proteínas utilizando o sistema heterólogo adotado. Para a produção em biorreator, optou-se pela expressão a 30 °C por ser a temperatura recomendada para a produção de proteínas utilizando o sistema heterólogo adotado.

[00289] A expressão em biorreator apresentou o dobro de proteínas produzidas em comparação com a expressão em Erlenmeyer (Figura 46) bem como o dobro da DO6OOnm (14,3) ao final da expressão. Esse resultado sugere que a influência de diferentes fatores, como formato do recipiente, aeração promovida pelo sistema air-lift e outros parâmetros foram mais eficazes para a produção do scFv e crescimento bacteriano que a mudança da temperatura.

[00290] Dentre as condições avaliadas, o uso do meio Enpresso apresentou o melhor perfil de expressão do scFv (Figura 46), bem como a DOóOOnm final de 19,1. A produção de scFv em meio Enpresso, portanto, em uma avaliação preliminar, aparenta demonstrar melhor desempenho para o crescimento bacteriano e produção de proteína recombinante. Entretanto, esse meio é de difícil escalonamento e manipulação em biorreatores por apresentar alto custo, maior tempo de produção, em comparação os outros métodos.

[00291] Para simular o efeito de liberação de glicose gradativo proporcionado pelo meio Enpresso e contornar as limitações de seu uso em biorreatores, utilizou-se a estratégia de produção do scFv com alimentação linear de glicose, batelada alimentada, em comparação com a produção com adição de glicose no início do processo, batelada simples. O consumo de glicose na batelada simples decaiu conforme o tempo de produção, enquanto na batelada alimentada a concentração de glicose aumentou gradativamente, conforme previsto (Figura 47). O perfil de crescimento bacteriano, medido através da biomassa em mg/mL, foi idêntico para ambos processos, visualizado pela curva correspondente a biomassa, sugerindo nesse ensaio preliminar que a alimentação linear de glicose ao meio não influenciou no crescimento bacteriano (Figura 47).

[00292] Em concordância com o perfil de crescimento bacteriano, idêntico para os dois tipos de processo, a porcentagem total de proteína recombinante expressa foi equivalente tanto na batelada simples, como na batelada alimentada (Figura 48). Portanto, a expressão do scFv anti-VLA-4 foi padronizada em meio TB, a 30 °C, em biorreator, com 2 horas de fase de crescimento do inóculo e 4 h de expressão e indução com IPTG 0,5 m , sem alimentação, pois é um procedimento de menor complexidade, em comparação com a batelada alimentada, e de produção equiparável.

EXEMPLO 10 - Purificação do scFv

[00293] Os resultados demonstraram o perfil insolúvel das moléculas de scFv produzidas, portanto, essas proteínas foram expressas na forma de corpos de inclusão. Os ciclos de lavagem e sonicação com soluções contendo baixas concentrações de ureia foram capazes de reduzir a quantidade de proteínas presentes na amostra total, de acordo com as lavagens (Figura 49.1). A pureza do scFv a partir do extrato bruto de proteínas resultante da lise celular, até a obtenção dos corpos de inclusão aumentou, em média, o dobro do valor inicial (Figura 50).

[00294] Os ensaios de purificação demonstraram que as proteínas recombinates ligaram- se à matriz contendo níquel, pela cauda de histidinas na porção C-terminal do scFv. A eluição das proteínas da matriz foi possível através da adição de imidazol 1 M. Entretanto, pode-se observar uma pequena quantidade de scFv que foi eluída durante as lavagens com imidazol 1 rnM e 5 mM (Figura 49.2).

[00295] O processo de purificação iniciou-se com uma pureza média de 6 %, calculada na etapa de lise celular inicial. Ao longo das etapas de purificação - incluindo as lavagens de ureia, a solubilização da proteína recombinante com ureia 8 M, a purificação por cromatografia de afinidade e a renaturação das proteínas - a porcentagem de scFv na amostra aumentou, em consonância com as metodologias de purificação adotadas, de forma que a pureza final foi superior a 90 % (Figura 50). O rendimento do processo de expressão e purificação doi de 24,6 mg/mL de proteína por litro de inóculo de expressão.

EXEMPLO 11 - Aumento do volume de produção do scFv anti-VLA-4

[00296] A expressão do scFv em biorreator de 2 L apresentou o mesmo perfil de produção de proteína recombinante que no micro biorreator anterior, ou seja, não apresentou aumento ou diminuição da expressão do scFv detectável no gel (Figura 51.1). Em confirmação, observou-se que cerca de 12 % das proteínas totais visualizadas em gel de SDS-PAGE correspondem à proteína recombinante, enquanto o processo anterior apresentava cerca de 10 %. Esse resultado sugere que a mudança do sistema de aeração - de air lift para stirred tank - e o aumento do volume de produção e crescimento bacteriano não alterou a relação de proteínas expressas por volume de inóculo. Entretanto, devido ao volume do inóculo mais de duas vezes superior, a produção nesse sistema resulta numa quantidade de scFv obtido proporcionalmente maior.

[00297] A lise realizada em homogeneizador permitiu o processamento de uma quantidade maior de biomassa, em comparação ao uso do sonicador. Além da maior eficácia e controle da lise celular. Ressalta-se que esse método foi combinado com o uso de detergente Triton™ X 100, que contribui para o rompimento da membrana plasmática das células, aumentando, portanto, a eficiência do processo.

[00298] Devido a maior quantidade de proteínas produzidas, em concordância com o aumento do volume de produção, o número de contaminantes na amostra também foi maior. A inclusão de uma lavagem com ureia 2 M permitiu uma redução de proteínas contaminantes, presentes nas frações solúveis, como observado nos géis de SDS-PAGE (Figura 51.2) [00299] A purificação do scFv por cromatografia IMAC utilizando HPLC e eluição em gradiente linear apresentou diferenças em comparação a estratégia adotada anteriormente. O contato de duas horas, em recirculação, a TA foi suficiente para que a maior parte das proteínas recombinante se ligasse a resina, ainda que algumas proteínas residuais fossem observadas no void (Figura 51.3). Através do gradiente linear, o scFv foi eluído a partir da concentração de 300 mM de imidazol. No cromatograma de controle da purificação, a eluição do scFv apresenta a formação de um pico, correspondente a absorbância UV a 280 nm, de 60 a 580 mAU (unidade de absorbância) (Figura 52). Frações de 1 mL foram coletadas durante a eluição da proteína monitorada pelo cromatograma (Figura 51.4), unidas e encaminhadas para renaturação das proteínas por diálise.

[00300] Após a diálise, a concentração de endotoxinas presentes na amostra era de 36932 EU/mL (unidade de endotoxina por mililitro). Em decorrência do procedimento de redução de endotoxinas, a concentração dessas substâncias foi reduzida para 2909 EU/mL. O perfil de visualização do scFv em SDS-PAGE foi novamente verificado após esse procedimento (Figura 51.5).

[00301] A etapa de liofilização da amostra foi importante para o armazenamento e conservação da proteína recombinante. Entretanto, a reconstituição da amostra liofilizada levou a uma perda de 50 % de proteínas, de forma que para atingir a concentração de scFv inicial (antes da liofilização) foi necessário suspender a amostra na metade do volume de líquido inicial. Entretanto, após a suspenção a amostra apresentou um perfil íntegro, de acordo com o esperado (Figura 51.6).

[00302] A pureza final do processo foi, tal como a metodologia anterior, superior a 90 %. O rendimento total foi de 3 mg/L e 6 mg de scFv foram obtidos ao final do processo. O rendimento do processo como um todo foi afetado principalmente pelas etapas de diálise e liofilização da proteína, aonde foram observadas as maiores percas de massa.

EXEMPLO 12 - Avaliação da interação do scFv imobilizado com VLA-4 na superfície celular de células Jurkat

[00303] O primeiro experimento de avaliação do scFv consistiu na verificação de sua capacidade de interação com a proteína alvo. Para tal, células Jurkart, que sabidamente expressam o receptor VLA-4, foram adicionados a superfícies recobertas com concentrações crescentes de scFv. As concentrações de 1 e 2 μg/mL de scFv induziram aumento significativo no número de células aderidas, em comparação ao controle (Figura 53). As concentrações superiores e inferiores avaliadas não apresentaram aumento expressivo nesse número, com exceção da concentração de 8 μg/mL. Esse resultado fornece um indício de que o scFv é capaz de interagir com determinado componente da superfície celular, provavelmente a integrina VLA-4. Porém uma interação inespecífica com outros componentes da superfície celular não pode ser descartada.

EXEMPLO 13 - Avaliação da interação direta entre scFv e VLA-4 por ELISA

[00304] Para verificar a interação entre scFv e VLA-4 realizou-se o experimento de ELISA. A partir da concentração ótima definida de 2 μg/mL, concentrações dez vezes menor e maior foram avaliadas frente a 400 ng de VLA-4 imobilizada. Os ensaios demonstraram que 0,2 μg/mL de scFv não apresentaram reconhecimento do antígeno. Já a concentração de 2 μg/mL apresenta um aumento do sinal, em comparação com o controle negativo. Entretanto, a concentração onde foi possível determinar o reconhecimento de VLA-4 pelo scFv foi de 20 μg/mL (Figura 54). Essa concentração apresentou significativo aumento da absorbância frente ao controle. Esse resultado, portanto, indica que o scFv é capaz de reconhecer a integrina α4β1, sugerindo que, o aumento aproximadamente 50 % de células aderidas foi consequência da interação do scFv com VLA-4.

[00305] Apesar da interação entre o scFv e a integrina, visualizados no ensaio de ELISA, esse valor é inferior ao controle positivo do experimento, o Fab do Natalizumabe.

EXEMPLO 14 - Avaliação da redução da transmigração de células Jurkat sobre superfícies recobertas com VCAM-1 e FN tratadas com scFv anti-VLA-4

[00306] Após a visualização da interação do scFv com VLA-4 através dos experimentos anteriores, buscou- se avaliar a funcionalidade dessa molécula quanto à redução da transmigração de linfócitos. Optou-se por manter a utilização de células Jurkat devido ao seu padrão de transmigração bem estabelecido nesse tipo de sistema, seu nível de expressão de VLA-4, além de finalizar com essa linhagem um conjunto de resultados iniciais relativos a interação e efeito funcional.

[00307] Utilizando a concentração de 20 μg/mL, que apresentou melhor performance no item 4.8, foi possível observar que o scFv reduz o número de células transmigrantes sobre VCAM-1 frente ao controle. Como esperado, a inibição da transmigração pelo scFv foi inferior em comparação com o Natalizumabe (Figura 55)

[00308] A transmigração sobre fibronectina apresentou flutuações ao longo dos experimentos, de forma a observar um grande desvio dos valores (Figura 55). Entretanto, a média dos experimentos sugere que, tanto scFv como Natalizumabe, apresentam algum efeito de inibição da transmigração sobre fibronectina.

[00309] Esses resultados, em concordância com os resultados anteriores, sugerem que o scFv é capaz de interagir com a integrina VLA-4 na superfície celular e apresenta um efeito funcional de redução da transmigração de células Jurkat frente ligante de VLA-4. Entretanto, para averiguar a funcionalidade dessa molécula, ensaios realizados com células primárias são necessários.

EXEMPLO 15 - Avaliação do bloqueio da adesão e da migração de células T de memória tratadas com scFv anti-VLA-4 a superfícies recobertas com VCAM-1 e FN sob fluxo

[00310] Após os experimentos de interação e transmigração utilizando células Jurkat, VLA-4 recombinante e scFv, ensaios utilizando linfócitos primários em sob estresse de cisalhamento foram realizados, visando aproximar a condução do experimento ao contexto fisiológico. Dessa forma, linfócitos T de memória obtidos de doadores saudáveis (item 3.10) foram utilizados. A escolha desse tipo célula é referente ao seu estado, que não necessita ativação com citocinas e anticorpos anti-CD3, a sua expressão de VLA-4 e a sua resposta à exposição a quimicinas CXCL12, essencial para promover a ativação da integrina e a adesão das células sobre ligantes de VLA-4.

[00311] A frequência de adesão de células T, a 0,13 dyn/cm ² sobre VCAM-1 não é afetada pelo uso de diferentes concentrações de scFv (Figura 56.1). Entretanto, é possível observar que esse índice de frequência para células não tratadas com scFv é menos expressivo em comparação com as outras condições de fluxo. A partir dos fluxos de 0,06 e 0,03 dyn/cm ² é possível constatar a redução da frequência de adesão das células a medida que a concentração de scFv aumenta e o estresse de cisalhamento diminui (Figura 56.2 e Figura 56.3). Esses resultados sugerem que há interação entre scFv e VLA-4 na superfície celular dos linfócitos T de memória levando a redução do número de células que aderem na superfície através da interação entre VLA-4 e VCAM-1.

[00312] Após as aquisições relativas a observação da frequência de adesão celular, os perfis de migração, ou motilidade, das células que permaneceram aderidas aos ligantes de VLA-4 sob fluxo foram avaliados. Ressalta-se que nesse experimento não houve adição de novas células e que um estresse de cisalhamento maior é necessário para observar a permanência dessas células nas superfícies com VCAM-1 ou FN sob fluxos maiores, como será melhor abordado no item 5. Observou-se que o número de células aderidas, após a aplicação de um fluxo de 1 dyn/cm ² , não apresentou diferenças relativas ao tratamento com diferentes quantidades de scFv (Figura 57.1). Ou seja, o tratamento não influenciou na capacidade das células permanecerem em contato com a superfície após a aplicação de um estresse de cisalhamento maior. O número de células imóveis ou não migrantes também não apresentou alteração (Figura 57.2). Igualmente, a velocidade das células que migrantes sobre a superfície coberta com VCAM-1 não foi afetada com a aplicação do scFv em diferentes concentrações (Figura 57.3). Esses resultados sugerem que o tratamento com tais concentrações de scFv reduz a frequência da adesão de células T sobre VCAM-1, mas não interfere na migração das células.

[00313] Em concordância com os resultados anteriores, a trajetória, ou distância percorrida, das células com e sem tratamento não apresentou diferenças detectáveis pelo perfil de trajetória (Figura 58). Algumas células sem tratamento conseguem percorrer uma distância de até 500 pm/min, entretanto, a maioria das células apresenta uma distância percorrida de cerca de 300 pm/min, tal como observado nos experimentos com linfócitos tratados com 20 μg/mL de scFv.

[00314] Os experimentos que avaliam frequência de adesão e migração das células sobre FN, em fluxo, foram realizados apenas com a concentração de 2 μg/mL de scFv e com o Fab do Natalizumabe na concentração de 3 μg/mL. A concentração de scFv escolhida foi determinada pelos experimentos sob fluxo em VCAM-1, enquanto a de Fab do Natalizumabe foi determinada previamente. Esses valores de concentração para scFv e Fab apresentam capacidade mínima de reduzir a frequência de adesão sobre VCAM-1, portanto foram selecionadas.

[00315] Tais experimentos demonstraram que a adesão dos linfócitos T sobre FN (Figura 59) é inferior aos valores observados em VCAM-1 (Figura 56). O tratamento com scFv foi capaz de diminuir a adesão de modo significativo apenas em fluxo 0,03 dyn/cm ² , enquanto o Fab não reduziu esse valor em nenhum dos fluxos aplicados (Figura 59). Os perfis de migração e trajetória para ambos tratamentos demonstrou valores bastante dispersos para todos os parâmetros avaliados, como pode ser observado pelos dados de porcentagem de adesão (Figura 60.1) e velocidade de migração (Figura 60.3), em que os valores variam de 0 a 100. Em consequência, a visualização das trajetórias foi afetada, de forma que em alguns gráficos é possível observar apenas o perfil de uma ou duas células remanescentes. Devido a observação de padrões randômicos de migração, ou seja, com parâmetros bastante variáveis, sugere-se que o scFv e o Fab de Natalizumabe não interferem na migração celular sobre fibronectina.

EXEMPLO 16 - Avaliação da interferência do scFv na ativação celular

[00316] O envolvimento da integrina VLA-4 em diversas funções celulares e patologias, bem como sua participação em vias de sinalização, levou a verificação de uma possível interferência do tratamento com scFv na ativação celular, causado pelo bloqueio de VLA-4. Células T CD8+ primários foram utilizadas devido a sua expressão de VLA-4, e a possibilidade de ativação dessas células através do tratamento com IL-2 e anticorpo anti-CD3 para a visualização dos efeitos do scFv na ativação celular.

[00317] Linfócitos T CD8+ tratados sobre fibronectina e anti-CD3 apresentam uma distribuição de VLA-4 na periferia celular, mas também visualizada em pontos centrais na célula (Figura 62). A distribuição de actina nessas células tem uma tendência uniforme, e devido ao contato com o anticorpo anti-CD3, diversos focos de tirosina fosforilada são identificados, sugerindo ativação de vias de sinalização. Alguns desses focos são adjacentes a VLA-4 localizada no centro, ou seja, longe da periferia celular. O tratamento com scFv 2 μg/mL induz alterações na distribuição de actina e quantidade de focos de tirosina fosforiladas (Figura 62).

[00318] A visualização da distribuição de actina, independente da visualização de VLA-4 e tirosina fosforilada, demonstra que linfócitos T tratados com scFv apresentam a formação randômica de focos de actina. Esses focos consistem numa concentração de actina em determinadas regiões da célula, diferente da distribuição homogênea observada nas células não tratadas com scFv (Figura 63). A quantificação desses focos de actina em ambos os tratamentos confirmaram que o número de células com esse perfil de distribuição de actina é superior em células tratadas com scFv (Figura 64). [00319] A fosforilação dos resíduos de tirosinas de diferentes receptores celulares é uma etapa fundamental para o início de diferentes vias de sinalização e processos celulares (SCHLESSINGER, 2000). A visualização independente de focos de tirosina fosforilada sugere que o número de pontos relacionados à ativação de vias de sinalização celular, é inferior em células tratadas com scFv (Figura 65). A quantificação dos focos de tirosina fosforilada ratifica esse resultado (Figura 66), propondo, portanto, que o tratamento com scFv pode interferir na ativação celular, reduzindo a ativação de algumas vias de sinalização celular através do bloqueio de VLA-4.

[00320] Os resultados relativos a distribuição de actina e tirosina fosforilada sugerem que o bloqueio de VLA-4 promovido pelo tratamento com scFv causa alterações na ativação celular. Novos estudos e experimentos são necessários para investigar quais vias e respostas celulares são potencialmente afetadas.

[00321] Os resultados de RMSD, tanto no docking como na Dinâmica Molecular, mostraram que as três séries de mutações que originaram o scFv X foram eficazes, pois afetaram o equilíbrio do sistema do scFv e as integrinas α5β1 e α4β7, enquanto para a integrina α4β1 o sistema manteve-se estável. A análise de RMSF confirma, com o resultado de RMSD, que a interação entre o scFv X e a integrina α4β1 é mais estável em comparação as outras integrinas, pois houve uma menor flutuação. A constatação que o raio de giro se manteve constante para o scFv X e a integrina α4β1 durante toda a simulação certifica que o complexo formado pelas três cadeias peptídicas (alfa 4, beta 1 e scFv) se manteve estável, sem afastamento de nenhuma das cadeias, ratificando os resultados de RMSF e RMSD.

[00322] Os resultados da análise de ligações Hidrogênio sugerem que a segunda série de mutações foi capaz de aumentar o número de ligações Hidrogênio para α4β1 e diminuir para α5β1 e α4β7. Entretanto, a terceira série de mutações diminuiu esse valor para α4β1 e aumentou para α5β1. Comparando esses dados aos resultados de Haddock score, Cluster size, RMSD, RMSF e raio de giro, conclui-se que as ligações hidrogénios não são o tipo de interação chave para a ligação do scFv X à integrina α4β1. Já os resultados de pontes salinas indicam que as mutações feitas não foram favoráveis para a realização de novas pontes salinas, mas foram úteis para diminuir o número de pontes entre o scFv B e X com as integrinas que não são de interesse, α5β1 e α4β7. Portanto, essas pontes contribuem para a melhorar a especificidade entre os scFvs X e B com a integrina α4β1 em comparação com as outras duas integrinas.

[00323] Os valores de energias demonstrados confirmam o valor de Cluster size observado no docking para α4β7. Ou seja, o fato dos scFv nativo e B possuírem um alto valor de Cluster size é visto na DM pela baixa energia que esse sistema apresentou, o que o toma mais favorável. Esses resultados, novamente, ratificaram a necessidade da terceira série de mutações que originou o scFv X, o qual apresentou valores de energia bem mais favoráveis para a α4β1 em comparação aos outros scFvs. Apesar desse valor ainda ser um pouco superior ao valor para α4β7, as energias das interações não-ligadas junto a outros fatores, como as pontes salinas por exemplo, contribuem para que a interação do scFv X com a integrina α4β1 se sobressaia em comparação com as outras.

[00324] As energias eletrostáticas, vistas na análise do Potencial de Coulomb, apresentaram-se como uma componente chave da interação scFv X-integrina α4β1. Portanto, as mutações realizadas favoreceram esse tipo de interação. Além disso, as mutações realizadas levaram a contribuição das ligações de Van de Waals na energia total do sistema scFv - α4β1, como pode ser observado nos resultados da análise do Potencial de Lennard- Jones.

[00325] Após a interpretação dos resultados da DM e do docking, observa-se que os parâmetros de RMSD, RMSF, Raio de giro, Pontes salinas, Energia total, Pontencial de Coulomb e Potencial de Lennard-Jones analisados em conjunto são coerentes com o resultado dos dockings para o scFv X. Portanto, após as três séries de mutações houve um aumento da especificidade do scFv para a integrina α4β1.

[00326] Até 2012 existiam oito medicamentos aprovados e utilizados para o tratamento de esclerose múltipla e sete potenciais fármacos em desenvolvimento (GOLDENBERG, 2012). Os oitos tipos de fármacos atualmente utilizados são: Interferons beta, Acetato de glatiramer, Mitoxantrona, Fingolimod e o Natalizumab. Todos esses medicamentos possuem vantagens e desvantagens associadas a seu uso. Portanto, é válido comparar o scFv X, potencial fármaco para o tratamento de esclerose múltipla, com as ferramentas terapêuticas existentes.

[00327] Os interferons beta são citocinas naturalmente produzidas pelo sistema imune. Diversos mecanismos para a sua ação terapêutica foram propostos, como a inibição da ativação e proliferação de células T (DHIB- JALBUT; MARKS, 2009). Apesar da eficácia dessas moléculas na redução dos danos inflamatórios, sua aplicação envolve o risco de desenvolvimento de leucopenia, depressão e doença da tireóide (GOLDENBERG, 2012). O scFv X, em teoria, atuaria bloqueando a interação da VLA-4 com as proteínas VCAM-1, portanto, apenas impedindo a migração dos linfócitos T para o local da inflamção causadora da esclerose múltipla.

[00328] O acetato de glatiramer é um tipo de polímero inicialmente sintetizado para simular modelos de esclerose múltipla (ACETATO... 2016). Apesar do seu mecanismo exato de ação ser desconhecido, sabe-se que ele atua de forma diferente dos interferons beta. Entretanto, esse medicamento é recomendado para o tratamento inicial da doença e para pacientes que não toleram interferons beta (KP et al., 1988). O scFv X, em teoria, poderia ser utilizado em quadros mais avançados da doença, por bloquear diretamente a ação dos linfócitos T sobre a bainha de mielina.

[00329] A mixantrona é um imunossupressor, que age sobre células B, T e macrófagos (GOLDENBERG, 2012). Apesar de poder ser utilizada até mesmo em quadros mais avançados da doença, a supressão de células do sistema imune toma o organismo frágil e exposto a patógenos. A supressão de células B, por exemplo, interfere na produção de anticorpos, importantes moléculas de defesa. O alvo do scFv X é encontrado apenas em Linfócitos T e monócitos que, exceto em casos de infecção, é encontrado em baixa quantidade circulando no sangue. Portanto, a sua aplicação não afetaria o sistema imune como a mixantrona afeta.

[00330] O fingolimod é um imunomodulador que foi o primeiro medicamento oralmente administrado para esclerose múltipla e (GOLDENBERG, 2012). Apesar de sua eficácia, sua utilização aumenta o risco de infecções e edema macular. Não há como comparar diretamente o scFv X com o fingolimod, pois como ainda não há testes in vitro e in vivo, não se sabe os efeitos colaterais que esse potencial fármaco pode causar. Entretanto, é valido mencionar que scFvs em geral tem imunogenicidade reduzida e pouco tempo de retenção no corpo (AHMAD et al., 2012).

[00331] Como já mencionado, o Natalizumab é um anticorpo monoclonal que interage com integrinas α4β1e α4β7, cuja aplicação é associada ao risco de PML. Sabe-se que há populações de linfócitos que possuem integrinas do tipo α4β1e α4β7. Estudos indicam que o bloqueio das integrinas α4β1, mas não das integrinas α4β7, impede a infiltração de leucócitos no SNC (HAANSTRA et al., 2013). Portanto, a aplicação do scFv X impediria a passagem de linfócitos que possuem VLA-4 para o SNC, mas permitiria que algumas células T continuassem pudessem continuar a migrar normalmente. Ou seja, a presença uma população de linfócitos T circulantes poderia evitar a recrudescência de PML. Portanto, o scFv X seria capaz de impedir os danos à bainha de mielina causados pela migração errônea dos linfócitos T para o tecido saudável, mas permitiria que houvesse células circulantes hábeis para realizar a defesa do organismo, evitando a PML.

[00332] Outras duas etapas do desenvolvimento de anticorpos foram abordadas: produção e avaliação funcional in vitro. Nas etapas de produção, foram avaliados, principalmente, aspectos relativos aos procedimentos de produção e recuperação do scFv. Nas etapas de avaliação, avaliamos a interação do scFv com VLA-4, e seu efeito sobre a transmigração, adesão e migração em fluxo de linfócitos T (de linhagem e primários) sobre ligantes de VLA-4, além de observar parcialmente seu efeito sobre a ativação celular.

[00333] Durante as etapas de produção, observamos que o scFv foi expresso de forma insolúvel nas condições iniciais testadas. De fato, a expressão de proteínas recombinantes em E.coli possui como uma de suas principais limitações a produção de corpos de inclusão. Uma das possíveis estratégias para incrementar a solubilidade dessas proteínas é a alteração de fatores ambientais, tal como a redução da temperatura de expressão. Estudos relacionados à expressão da forma solúvel de scFvs, no caso, um scFv anti- TNFa, demonstraram que a expressão em temperaturas em tomo de 10°C foi benéfica para a produção de proteínas recombinantes solúveis (Sina et al, 2015). No caso do scFv anti- VLA-4 proposto nesse trabalho, a redução da temperatura de expressão teve um impacto negativo na sua produção pelas células de E.coli, devido à redução ou inibição da expressão da molécula, de forma que efeitos de solubilização parcial são irrelevantes devido à baixa quantidade de proteína produzida.

[00334] A adição de aditivos - tais como sais, aminoácidos, açúcares, detergentes e outras substâncias - durante a lise celular consiste em outra forma para melhorar a solubilidade de proteínas recombinantes (Leibly et al, 2012). A utilização de diferentes aditivos (glicerol, MgC12, NaCl e L- arginina) não apresentou efeitos notórios na solubilidade do scFv produzido. Entretanto, a adição de L-arginina e NaCl nas soluções tampões das etapas de purificação foi essencial para reduzir a formação de precipitados e, portanto, melhorar a estabilidade do scFv em solução. O uso de L-arginina está relacionado à redução de interações entre as moléculas de scFv, evitando que as mesmas formem agregados e venham a precipitar em solução. Além disso, o uso desse aminoácido auxilia no enovelamento da proteína durante as etapas de renaturação e na estabilização da molécula durante o armazenamento. Já adição de NaCl incrementa a solubilização da proteína devido ao efeito salting-in (Xu et al, 2015).

[00335] Apesar disso (detalhado no parágrafo acima), o acréscimo de agentes caotrópicos, como a ureia, foi necessária para promover a solubilização das moléculas de scFv presentes nas estruturas de corpos de inclusão, Substâncias tais como ureia e guanidina interagem com as proteínas e promovem uma linearização das mesmas, através da formação de uma camada no entorno das proteínas. A adição desses agentes causa, além da solubilização, a desnaturação reversível da proteína (Salvi et al, 2005). O uso de agentes caotrópicos como a ureia, entretanto, leva a uma perda de massa decorrente da adição de processos para a recuperação da proteína recombinante funcional.

[00336] A seleção da cepa de E.coli SHuffle® para a obtenção do scFv decorreu das características dessas bactérias que são favoráveis para a expressão de proteínas que possuem pontes dissulfeto. Essas bactérias possuem um ambiente citoplasmático oxidativo, em comparação com as outras cepas de E.coli, devido à deleção de duas redutases e à expressão constitutiva de uma dissulfeto isomerase. O citoplasma oxidativo evita que a expressão do scFv seja necessariamente redirecionada para o periplasma da célula e é favorável à formação de pontes dis sulfeto, e, portanto, à funcionalidade da proteína (Lobstein et al, 2012). De fato, os experimentos de avaliação funcional do scFv apresentaram bons indicativos, sugerindo a presença das suas duas pontes dissulfeto, que são essenciais para a manutenção da sua estrutura terciária e interação com a integrina VLA-4.

[00337] Outros fatores avaliados foram os rendimentos dos processos de produção do scFv, antes e depois do aumento de produção, cujos valores foram de, respectivamente 24,6 e 10 mg/L, até a etapa de renaturação. Estudos relacionados a expressão de scFv em E.coli apresentam valores de rendimento variáveis, tais como 2 mg/L (Xiong et al, 2009) e 35 mg/L (Dominici et al, 2014). Um trabalho realizado por Zarschler (Zarschler et al, 2013) e colaboradores demonstrou a produção de dois scFvs, clonados em plasmídeo pET28b, expressos em E.coli SHuffle®, em diferentes meios: LB, TB e Enpresso® em Erlenmeyer. Os autores observaram que as DOs da biomassa ao final do processo de expressão variaram de 8,3 a 10,7 para o meio TB, e 13,1 a 19,8 para o meio Enpresso. As DOs obtidas para a expressão do scFv anti-VLA-4, em nosso trabalho, foram de 8, para expressão em TB feita em Erlenmeyer, 14,3 para TB em biorreator e 19,1 para meio Enpresso®. Dessa forma, observa-se que os dados relativos a crescimento bacteriano dos processos de expressão do scFv anti-VLA-4 são coerentes com resultados observados na literatura. Entretanto, ao comparar os dados de rendimento, observa-se que os valores obtidos pelo trabalho mencionado são superiores a 100 mg/L (Zarschler et al, 2013), ou seja, cerca de cinco a dez vezes maiores que os valores de rendimento obtidos para o scFv anti-VLA-4. Sugere-se que um dos fatores que possa influenciar nessa diferença de valores seja a solubilidade da proteína e as etapas de purificação, pois os scFvs avaliados por Zarschler e colaboradores (Zarschler et al, 2013) encontram-se na fração proteica solúvel e não necessitam da adição de ureia para solubilização. [00338] O processo enzimático que conduz a liberação gradual de glicose para o meio de cultivo é uma das principais características para o meio Enpresso® B e seu alto desempenho. A utilização desse meio comercial, que em teoria mimetiza um processo de alimentação, fornece altos rendimentos relativos a produção de biomassa e de proteína recombinante (Ukkonen et al, 2017). A realização de um processo em batelada alimentada linear de glicose em meio TB para a produção do scFv anti-VLA-4, como tentativa de simular o processo enzimático do meio Enpresso, não apresentou alterações positivas ou negativas na geração de biomassa ou proteína recombinante. Sugere-se, a partir desse dado preliminar, que apenas a alimentação contínua e gradual de glicose no meio, para o sistema descrito neste trabalho, não é suficiente para induzir um aumento na produção de biomassa e scFv. Outros componentes do meio comercial podem influenciar no seu desempenho de geração de biomassa e proteína recombinante. Entretanto, podemos considerar que a forma de condução da batelada alimentada realizada neste trabalho pode não ter sido feita de forma ideal, pois não houve otimização e estudo aprofundado desse processo e, portanto, outras formas de condução podem resultar em uma melhor produtividade.

[00339] Após a realização do processo de aumento de produção, obtivemos 6 mg de proteínas ao final (após liofilização e reconstituição das amostras), enquanto o processo anterior forneceu apenas 1,72 mg de proteínas em sua última etapa (renaturação). Portanto, o uso de metodologias de maior capacidade volumétrica - tais como o biorreator de 2 L, o homogeneizador e o HPLC - permitiu um aumento na produção de proteínas. Devido à alta quantidade de proteínas que é necessária para realização dos ensaios funcionais, o uso dessas metodologias foi satisfatório para atender tais demandas. Além disso, o aumento de produção permitiu que os lotes de scFv elaborados fossem feitos de forma mais reprodutível e automatizada, que são também características importantes para a realização dos ensaios funcionais. [00340] Os ensaios funcionais de ELISA e transmigração em câmaras de Transwell forneceram uma avaliação inicial dos perfis de interação do scFv anti-VLA-4, com a integrina VLA-4. Nesses experimentos, Natalizumabe ou Fab de Natalizumabe forma utilizados como controle. Em ambos os experimentos, o desempenho do Natalizumabe ou Fab foi superior ao scFv. Esse resultado é esperado, pois a molécula de Fab e Natalizumabe (IgG) apresentam afinidades pela integrina VLA-4 na superfície celular - medida pelo Kd, constante de dissociação - de 6,4 nM e 0,28 nM, respectivamente (Yu et al, 2013). Já a molécula de scFv, apresenta um Kd estimado in silico de 0,55 nM para VLA-4. Observa-se que a afinidade por VLA-4 estimada, baseada no Kd teórico, para o scFv é aproximadamente duas vezes menor que para o Fab. Essa diferença de valores decorre da etapa de desenvolvimento racional do scFv, pois a construção de uma molécula com maior especificidade para integrina α4β1, e não necessariamente afinidade, foi priorizada (Chaves, 2016).

[00341] O experimento de ELISA demonstrou um sinal relativo ao reconhecimento de VLA-4 recombinante pelo Fab de Natalizumabe quase dez vezes superior ao reconhecimento pelo scFv. A divergência observada pode ser justificada por três fatores principais: diferença de afinidade, tipo de epítopo determinante - linear ou estrutural - e limitações da técnica relativas à aplicação do anticorpo conjugado com peroxidase para a revelação, que não foi ideal para a revelação do scFv. A diferença de afinidade foi discutida no parágrafo anterior. O tipo de epítopo determinante refere-se a região de reconhecimento de ambas as moléculas. O Natalizumabe e o Fab interagem com VLA-4 através da ligação a aminoácidos das folhas-β e regiões em loop presentes na estrutura de β-propeller da subunidade a4 (Yu et al, 2013), enquanto o scFv reconhece regiões presentes entre a interface das duas subunidades, interagindo simultaneamente com α4 e β 1 . Isso sugere que a interação do scFv com a integrina é associada ao epítopo do tipo determinante estrutural de maneira evidenciada em comparação com Natalizumabe ou Fab. Portanto, a realização de ensaios de interação entre scFv e VLA-4 é mais suscetível a variáveis que alteram a dinâmica estrutural da integrina, afetando o reconhecimento, devido ao tipo de determinante dessa interação.

[00342] Ao comparar com o Natalizumabe, a afinidade do scFv por VLA-4 é, teoricamente, dez vezes superior. Entretanto, o Natalizumabe é um anticorpo tipo IgG completa, ou seja, é capaz de interagir com duas moléculas de a4 simultaneamente, possuindo, portanto, maior avidez. Essa diferença de avidez condiz com os resultados observados na transmigração sobre VCAM- 1, em que o Natalizumabe apresenta uma maior capacidade de bloquear a transmigração celular (de células Jukart) que o scFv. Além disso, por ser um anticorpo comercial e utilizado para fins terapêuticos, esse anticorpo possui uma estabilidade maior em comparação ao scFv, influenciando em sua performance e na reprodutibilidade dos dados.

[00343] No contexto inflamatório, o bloqueio da interação entre VLA- 4 e VCAM-1 é crítico para reduzir a passagem dos leucócitos para o tecido alvo, dada a participação dessa molécula nesse processo (Hyduk & Cybulsky, 2007). Neste trabalho, observamos que o scFv foi capaz de reduzir a transmigração de células Jurkat sobre VCAM-1, sendo esse um dos primeiros indicativos para o potencial dessa molécula. Já os dados referentes a transmigração sobre FN, outro ligante da integrina, apresentou uma grande variabilidade - condizente também com os resultados de migração em fluxo de linfócitos T de memória sobre FN.

[00344] A molécula FN possui diferentes sítios de interação para diferentes integrinas, podendo apresentar mais de um sítio para a mesma integrina, além de motivos de interação compartilhados (Pankov & Yamada, 2002). A FN possui diferentes isoformas de acordo com a sua localização- ECM ou plasma sanguíneo -, fator que interfere também no reconhecimento da FN por integrinas e na sua funcionalidade. Nos experimentos de transmigração, redução da adesão e migração a FN do plasma sanguíneo foi utilizada para fornecer uma ideia geral do desempenho do scFv e do Natalizumabe ou Fab do Natalizumabe, visto que essa molécula é também um importante ligante de VLA-4. No caso do scFv, verificamos uma redução da adesão de linfócitos T de memória e da transmigração de células Jurkat sobre FN. Para a confirmação do efeito do scFv sobre a interação celular com a FN, experimentos utilizando outras isoformas de FN, extraídas de ECM, também devem ser realizados, visto que as diferenças estruturais e funcionais dessa molécula (To & Midwood, 2011) podem fornecer respostas distintas e auxiliar na interpretação dos resultados relativos ao bloqueio da interação entre VLA-4 e FN, em adição aos testes com FN plasmática.

[00345] A redução da adesão de linfócitos T de memória a VCAM-1, sob fluxo, é, em conjunto aos resultados de transmigração, um indicativo inicial do potencial do uso do scFv como biofármaco anti-inflamatório em doenças crônicas. A molécula VCAM-1 é diretamente associada a patologias de caráter inflamatório crônico, além de outras doenças tais como o câncer (Kong et al, 2018). Portanto, o bloqueio da interação entre VLA-4 e VCAM-1 é uma estratégia terapêutica, já adotada, como é o caso do Natalizumabe (Kummer & Ginsberg, 2006). O bloqueio dessa interação, sugerido pelos experimentos de redução da frequência de adesão em fluxo, fornece um indicativo adicional que o scFv anti- VLA-4 possui potencial para vir a ser avaliado futuramente em fases pré-clínicas e clínicas como biofármaco.

[00346] Dados em processo de publicação, obtidos por pesquisadores do Laboratório de Adesão e Inflamação (INSERM 1067, Marseille, França), demonstraram que Natalizumabe e Fab de Natalizumabe são capazes de reduzir a frequência de adesão de linfócitos T de memória sobre VCAM-1 em até dez vezes em comparação com o controle, enquanto o scFv reduz esse valor cerca de duas a três vezes. A capacidade inibitória do scFv inferior à do Natalizumabe e seu Fab deve ser avaliada e pode ser benéfica quanto ao quesito segurança, relacionada à LPM (Leucoencef alopatia Progressiva Multifocal).

[00347] Diferentes fatores causadores de imunodeficiência estão associados ao surgimento de LPM, de forma que o tratamento com natalizumabe poderia ser um dos fatores causadores dessa doença. Em geral, observa-se que pacientes acometidos possuem uma deficiência de linfócitos T CD4+ e CD8+ (Pavlovic et al, 2018), potencializando a sua vulnerabilidade à doença. Ambos os tipos celulares são necessários para a contenção na doença (Gheuens et al, 2011), entretanto, as células T CD4+, principalmente Thl, são especialmente importantes por coordenarem as respostas de T CD8+ (Jelcic et al, 2016).

[00348] A aplicação do Natalizumabe em pacientes com EM afeta a atividade de linfócitos T CD4+ e CD8+, interferindo na resposta imune celular e causando susceptibilidade à LPM em pacientes que possuem o vírus JC (Gheuens et al, 2011). Dessa forma, surge a hipótese que o menor potencial de inibição de VLA-4, em comparação com o Natalizumabe, pode apresentar uma vantagem. Tal hipótese supõe que o bloqueio reduzido de VLA-4 presente nos linfócitos permitiria que algumas células com integrinas não bloqueadas pudessem atuar normalmente, fornecendo determinado efeito protetor na contenção de LPM.

[00349] A passagem de linfócitos do vaso sanguíneo para o tecido alvo tem como uma das principais interações, a ligação de VLA-4 com VCAM-1. Por outro lado, a interação de VLA-4 com FN é relacionada à permanência das células no tecido inflamado, e em algumas doenças como a artrite reumatoide (Laffon et al, 2019). Apesar da frequência de adesão dos linfócitos T, sob fluxo, em superfícies com FN ser reduzida em comparação com VCAM-1, é possível observar uma diminuição desses valores de adesão após a aplicação do scFv. Essa diminuição é positiva para a aplicação do scFv como biofármaco para o tratamento de câncer, especialmente na prevenção da metástase, uma vez que a FN é uma das moléculas mediadoras na formação do nicho pré-metastático em órgãos como pulmão, fígado, rins e outros (Schlesinger & Bendas, 2015). Quanto ao desempenho do Fab nos experimentos em fluxo sobre FN, conclui-se que a interação de tal fragmento de anticorpo exclusivamente com a subunidade a4 não apresentou efeitos significativos de redução da frequência de adesão. Em hipótese, supõe-se que esse efeito seja relacionado ao tipo de reconhecimento da subunidade a4 por parte do Fab, pois é visto que interação entre FN e VLA-4 é mediada também pela subunidade β1 (Sánchez- Aparicio et al, 1994).

[00350] A interação de VLA-4 com seus ligantes é considerada fundamental para os processos relacionados a motilidade celular - tais como migração, adesão e espalhamento ou mudança de forma (Wu et al, 1995). O tratamento de linfócitos T de memória com scFv não apresentou alterações do perfil geral de migração e motilidade celular, sobre FN e VCAM-1 em fluxo. A ausência de uma variação significante na velocidade, trajetória, permanência sobre as superfícies e imobilização é apresentada como um aspecto favorável para a aplicação da molécula de scFv anti-VLA-4, pois a motilidade celular é necessária para a ocorrência de determinados processos imunológicos, tais como o tráfego de linfócitos para os linfonodos, onde ocorre a apresentação de antígenos (Wei et al, 2003), além de ser importante durante a embriogênese e processos de cicatrização (Franz et al, 2002). O scFv, portanto, afeta a transmigração celular mas não a motilidade e migração celular dependente de VLA-4, sendo este mais um indicativo que tal fragmento de anticorpo tenha um potencial anti-inflamatório, pois, em teoria, essa molécula é capaz de bloquear a passagem dos linfócitos T para o tecido alvo pelo bloqueio da interação com VCAM-1, mas não influencia nos aspectos de motilidade dessas células.

[00351] Estudos realizados por Mittelbrunn e colaboradores demonstram a presença da integrina VLA-4 na periferia da sinapse imunológica, durante o processo de apresentação de antígeno e ativação celular, além da mudança do perfil de produção de citocinas de acordo com o bloqueio da integrina em diferentes epítopos (Mittelbrunn et al, 2004). Tais estudos demonstram que VLA-4 está relacionada ao processo de ativação celular, durante a formação da sinapse imune, e que o seu bloqueio causa diferentes respostas celulares de acordo com a região de reconhecimento da integrina, induzindo a ativação ou repressão de diferentes vias de sinalização. De fato, o tratamento de linfócitos T CD8+ com scFv anti-VLA-4, em condições que simulam e induzem a formação da sinapse imune, afeta a ativação celular e a distribuição de actina. Apesar da alteração aparente da actina, os resultados anteriores, relativos a migração celular, demonstraram que o scFv não afeta a motilidade dos linfócitos T sobre VCAM-1 e FN. Sugere-se que a formação dos focos de actina, em conjunto com a diminuição da formação de pontos de actina fosforilada, estão relacionados a vias de sinalização alteradas devido ao bloqueio de VLA-4 pelo scFv, levando a uma resposta celular diferenciada. Novos estudos serão necessários para identificar quais vias são afetadas, como o scFv e o bloqueio de VLA-4 influenciam na resposta celular e como esses perfis de resposta são contextualizados no tratamento de uma doença inflamatória crônica.

[00352] Apesar das diferentes estratégias que podem ser adotadas para o desenvolvimento de fármacos e biofármacos, tal processo é demorado e requer bastante cuidado. O anticorpo Natalizumabe, por exemplo, foi desenvolvido por Ted Yednock, que apresentou seu trabalho relativo a um anticorpo anti-a4 em 1992, e foi submetido a avaliações clínicas entre 1999 e 2003 (Schwab et al, 2015). Em 2004, foi aprovado para a utilização no tratamento de EM e, em 2008, para o tratamento de doença de Crohn moderada a severa, ou seja, cerca de quinze anos foram necessários para a elaboração completa desse medicamento. Os efeitos do Natalizumabe relativos a inibição da transmigração de linfócitos, alcançados durante os processos de desenvolvimento desse anticorpo, servem como parâmetros para o desenvolvimento de inibidores de VLA-4. Entretanto, deve-se observar fatores relativos a segurança e especificidade desse inibidor.

[00353] Estudos demonstram que o bloqueio da integrina VLA-4, e não LPAM-1, é suficiente para reduzir a infiltração de leucócitos no SNC e amenizar o quadro de encefalomielite experimental autoimune (Csizmadia et al, 2013). A proposta do scFv anti- VLA-4 é ser específico para esta integrina, o que evitaria a inibição desnecessária da transmigração de leucócitos mediada por LPAM-1. Entretanto, experimentos in vitro, para confirmar a especificidade, e in vivo, para avaliar o seu potencial bloqueador na redução do escore clínico da doença, ainda são necessários para o avanço dessa molécula como biofármaco.

[00354] Como conclusões obtidas a partir do trabalho realizado obteve- se que:

1. A metodologia in silico empregada para promover as mutações foi eficaz, de forma que os scFv engenheirados efetivamente mostraram uma maior capacidade de interagir com integrinas α4β1.

[00355] 2. As interações determinantes que favoreceram a interação do scFv X com integrinas α4β1 foram pontes salinas, interações eletrostáticas e de Van der Waals.

[00356] 3. A modelagem comparativa de anticorpos é uma alternativa viável para a obtenção da estrutura tridimensional dessas moléculas, pois é possível utilizar templates de alta identidade.

[00357] 4. E recomendável realizar simulações de Dinâmica e docking

Molecular durante a fase de design de um fármaco, pois estas técnicas fornecem informações importantes sobre o comportamento e forma de interação de moléculas alvo.

[00358] Através do emprego de metodologias convencionais para obtenção de proteínas recombinantes, geramos um fragmento de anticorpo do tipo scFv voltado para o reconhecimento de VLA-4. Os resultados funcionais mostram que o scFv interage com VLA-4 e é capaz de inibir a adesão e transmigração de linfócitos T sobre ligantes dessa integrina, sem afetar a motilidade celular. Além disso, o bloqueio de VLA-4 com o scFv parece intereferir na ativação celular, devido a observação de mudanças dos padrões de focos de tirosina fosforilada e distribuição de actina.

[00359] O presente trabalho fornece uma nova ferramenta para o bloqueio de VLA-4 visando aplicações no tratamento de doenças inflamatórias crônicas através da redução da transmigração leucocitária para os sítios de inflamação.

REFERÊNCIAS

[00360] ABBAS, Abul K. Imunologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015.

[00361] ACETATO de Glatiramer (Copaxone ®). Disponível em: <https://esclerosemultipla.wordpress.com/2006/05/09/aceta to-de-glatiramer- copaxone-®/>. Acesso em: 05 out. 2016.

[00362] AHMAD, Zuhaida Asra et al. ScFv Antibody: Principles and Clinical Application. Clinical And Developmental Immunology, [s.l.], v. 2012, p.1-15, 2012. Hindawi Publishing Corporation.

[00363] ALTSCHUL, Stephen F. et al. Basic local alignment search tool. Journal Of Molecular Biology, [s.l.], v. 215, n. 3, p.403-410, out. 1990. Elsevier BV.

[00364] ANDRICOPULO, Adriano D. Métodos em Química Medicinal. Disponível em: <http://www.gradadm.ifsc.usp.br/dados/20132/ FFI0763-1/Modulo 11 2.pdf>. Acesso em: 30 set. 2016.

[00365] BERMAN, Helen M. et al. The protein data bank. Nucleic Acids Research, Piscataway, v. 28, n. 1, p.235-242, jan. 2000.

[00366] Bloomgren G, Richman S, Hotermans C, Subramanyam M, Goelz S, Natarajan A, et al. Risk of Natalizumab-Associated Progressive Multifocal Leukoencephalopathy. N Engl J Med [Internet]. 2012 May 17 [cited 2018 Dec 30] ;366(20): 1870-80. Available from: http://www.neim.org/doi/abs/10.1056/NEJMoal 107829

[00367] BLUNDELL, T. L. et al. Knowledge-based prediction of protein structures and the design of novel molecules. Nature, [s.l.], v. 326, n. 6111, p.347-352, 26 mar. 1987. Nature Publishing Group.

[00368] Chaves B. ENGENHARIA DE ANTICORPOS IN SILICO: CONSTRUÇÃO DE UM SCFV ANTAGÔNICO A INTEGRINAS α4β1 COMO ALTERNATIVA PARA O TRATAMENTO DE ESCLEROSE MÚLTIPLA. Universidade Federal do Ceará; 2016.

[00369] Chuluyan HE, Issekutz AC. VLA-4 integrin can mediate CD 11/CD 18 -independent transendothelial migration of human monocytes. J Clin Invest [Internet]. 1993 Dec 1 [cited 2018 Dec 24];92(6):2768-77. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7902847

[00370] Csizmadia V, Hofman SO, Fedyk ER, Haanstra KG, Blezer ELA, Lopes Estevao DM, et al. Antagonizing the 4 1 Integrin, but Not 4 7, Inhibits Leukocytic Infiltration of the Central Nervous System in Rhesus Monkey Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J Immunol. 2013;190(5):1961-73.

[00371] DHIB-JALBUT, S.; MARKS, S.. Interferon- mechanisms of action in multiple sclerosis. Neurology, [s.l.], v. 74, n. 11, p.17-24, 28 dez. 2009. Ovid Technologies (Wolters Kluwer Health).

[00372] DINÂMICA Molecular. Disponível em: <http://www.maxwell.vrac.puc-rio.br/21310/21310 5.PDF>. Acesso em: 29 set. 2016.

[00373] DOMINGUEZ, Cyril; BOELENS, Rolf; BONVIN, Alexandre M. J. J. HADDOCK: A Protein-Protein Docking Approach Based on Biochemical or Biophysical Information. J. Am. Chem. Soc., [s.l.], v. 125, n. 7, p.1731-1737, fev. 2003. American Chemical Society (ACS). [00374] Dominici S, Fiori V, Watson R, Weber E. Blocking monocyte transmigration in in vitro system by an anti- CD99 human antibody in single chain fragment variable (scFv) format. Efficient large scale purification of biological active scFv from inclusion bodies in E. coli expression system. J Immunol Methods. 2014;408:35-45.

[00375] Duplàa C, Couffinhal T, Dufourcq P, Lianas B, Moreau C, Bonnet J. The integrin very late antigen-4 is expressed in human smooth muscle cell. Involvement of alpha 4 and vascular cell adhesion molecule- 1 during smooth muscle cell differentiation. Circ Res [Internet]. 1997 Feb [cited 2018 Dec 26] ;80(2): 159-69. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9012738

[00376] Ecoiffier T, Annan J El, Rashid S, Schaumberg D, Dana R. Modulation of Integrin α4β1 (VLA-4) in Dry Eye Disease. Arch Ophthalmol [Internet]. 2008 Dec 8 [cited 2018 Dec 27];126(12): 1695. Available from: http://archopht.jamanetwork.com/article.aspx?doi=10.1001/arc hopht.126.12.1 695

[00377] EMSLEY, P. et al. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Cryst, [s.l.], v. 66, n. 4, p.486-501, 24 mar. 2010. International Union of Crystallography (lUCr).

[00378] Franz CM, Jones GE, Ridley AJ. Cell Migration in Development and Disease. Dev Cell [Internet]. 2002 Feb 1 [cited 2019 Mar 7];2(2): 153-8. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/ article/pii/S 153458070200120X

[00379] Gheuens S, Bord E, Kesari S, Simpson DM, Gandhi RT, Clifford DB, et al. Role of CD4+ and CD8+ T-Cell Responses against JC Virus in the Outcome of Patients with Progressive Multifocal Leukoencephalopathy (PML) and PML with Immune Reconstitution Inflammatory Syndrome. J Virol [Internet]. 2011 Jul 15 [cited 2019 Mar 7];85(14):7256-63. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21543472

[00380] Gismondi A, Morrone S, Humphries MJ, Piccoli M, Frati L, Santoni A. Human natural killer cells express VLA-4 and VLA-5, which mediate their adhesion to fibronectin. J Immunol [Internet]. 1991 Jan 1 [cited 2018 Dec 24];146(l):384-92. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/1701798

[00381] GOLDENBERG, Marvin M.. Multiple Sclerosis. Pharmacy And Therapeutics. Westfield, p. 175-184. mar. 2012.

[00382] GROM ACS Groningen Machine for Chemical

Simulations: User manual. User manual. Disponível em:

<ftp://ftp.gromacs.Org/pub/manual/manual-5.0.7.pdf> . Acesso em: 4 ago. 2016.

[00383] Grove RA, Shackelford S, Sopper S, Pirruccello S, Horrigan J, Havrdova E, et al. Leukocyte counts in cerebrospinal fluid and blood following firategrast treatment in subjects with relapsing forms of multiple sclerosis. Eur J Neurol [Internet]. 2013 Jul 1 [cited 2018 Dec 29] ;20(7): 1032— 42. Available from: http://doi.wiley.eom/10.l 111/ene.12097

[00384] HAANSTRA, K. G. et al. Antagonizing the α4β1 Integrin, but Not α4β7, Inhibits Leukocytic Infiltration of the Central Nervous System in Rhesus Monkey Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Journal Of Immunology, [s.l.], v. 190, n. 5, p.1961-1973, 30 jan. 2013. The American Association of Immunologists.

[00385] HAYRYAN, Shura et al. A new analytical method for computing solvent-accessible surface area of macromolecules and its gradients. Journal Of Computational Chemistry, [s.l.], v. 26, n. 4, p.334-343, 10 jan. 2005. Wiley-Blackwell.

[00386] HINTZE, Bradley J. et al. Molprobity's ultimate rotamer- library distributions for model validation. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, [s.l.], v. 84, n. 9, p.l 177-1189, 23 jun. 2016. Wiley- Blackwell.

[00387] Hyduk SJ, Cybulsky ML VCAM-1 and its functions in development and inflammatory diseases. In: Adhesion Molecules: Function and Inhibition [Internet]. Basel: Birkhãuser Basel; 2007 [cited 2019 Mar 7]. p. 141-74. Available from: http://www.springerlink.com/index/10.1007/978-3- 7643-7975-9 6

[00388] HYNES, Richard O. Integrins. Cell, [s.l.], v. 110, n. 6, p.673- 687, set. 2002. Elsevier BV.

[00389] Hyun Y-M, Chung H-L, McGrath JL, Waugh RE, Kim M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates T cell migration on VCAM-1. J Immunol [Internet]. 2009 Jul 1 [cited 2018 Dec 26];183(l):359-69. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19542447

[00390] Jelcic I, Jelcic I, Kempf C, Largey F, Planas R, Schippling S, et al. Mechanisms of immune escape in central nervous system infection with neurotropic JC virus variant. Ann Neurol [Internet]. 2016 Mar 1 [cited 2019 Mar 7];79(3):404-18. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/ana.24574

[00391] JUG, Gregor; ANDERLUH, Marko; TOMAEIc, Tihomir. Comparative evaluation of several docking tools for docking small molecule ligands to DC-SIGN. Journal Of Molecular Modeling, [s.l.], v. 21, n. 6, p.l- 12, jun. 2015. Springer Science + Business Media.

[00392] KHAN, Faez Iqbal et al. Current updates on computer aided protein modeling and designing. International Journal of Biological Macromolecules, [s.l.], v. 85, p.48-62, abr. 2016. Elsevier BV.

[00393] KITCHEN, Douglas B. et al. Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications. Nature Reviews Drug Discovery, [s.l.], v. 3, n. 11, p.935-949, nov. 2004. Nature Publishing Group.

[00394] KOEHL, Patrice; LEVITT, Michael. A brighter future for protein structure prediction. Nature Structural Biology, [s.l.], v. 6, n. 2, p.108- 111, 1 fev. 1999. Springer Nature.

[00395] Kong D-H, Kim YK, Kim MR, Jang JH, Lee S. Emerging Roles of Vascular Cell Adhesion Molecule- 1 (VCAM-1) in Immunological Disorders and Cancer. Int J Mol Sci [Internet]. 2018 Apr 2 [cited 2019 Feb 10];19(4). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29614819 [00396] KORTEMME, Tanja. Computational Alanine Scanning of Protein-Protein Interfaces. San Francisco: Science's Stke, 2004.

[00397] KP, Johnson et al. Extended use of glatiramer acetate (Copaxone) is well tolerated and maintains its clinical effect on multiple sclerosis relapse rate and degree of disability. Copolymer 1 Multiple Sclerosis Study Group. Neurology, [s.i], p. 701-708. mar. 1988.

[00398] KRISSINEL, Evgeny; HENRICK, Kim. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal Of Molecular Biology, [s.l.], v. 372, n. 3, p.774-797, set. 2007. Elsevier BV.

[00399] Kummer C, Ginsberg MH. New approaches to blockade of a4-integrins, proven therapeutic targets in chronic inflammation. Biochem Pharmacol [Internet]. 2006 Nov 30 [cited 2018 Dec 22];72(11): 1460-8. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/ article/abs/pii/S0006295206003613?via%3Dihub

[00400] Laff6n A, Garcia- Vicufla R, Humbria A, Postigo AA, Corbi AL, De Landizuri M 0, et al. Upregulated Expression and Function of VLA-4 Fibronectin Receptors on Human Activated T Cells in Rheumatoid Arthritis [Internet]. [cited 2019 Feb 10]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC295383/pdf/jcin vest00061- 0192.pdf

[00401] Leibly DJ, Nguyen TN, Kao LT, Hewitt SN, Barrett LK, van Voorhis WC. Stabilizing Additives Added during Cell Lysis Aid in the Solubilization of Recombinant Proteins. PLoS One. 2012;7(12). [00402] LOBB, R R; HEMLER, M e. The pathophysiologic role of alpha 4 integrins in vivo. Journal Of Clinical Investigation, [s.l.], v. 94, n. 5, p.1722-1728, 1 nov. 1994. American Society for Clinical Investigation.

[00403] Lobstein J, Emrich CA, Jeans C, Faulkner M, Riggs P, Berkmen M. SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm. Microb Cell Fact [Internet]. 2012 Dec 8 [cited 2019 Jan 7]; 11(1):753. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/22569138

[00404] LU, Yuan et al. SiRNA delivered by EGFR-specific scFv sensitizes EGFR-TKI-resistant human lung cancer cells.Biomaterials, [s.l.], v. 76, p.196-207, jan. 2016. Elsevier BV.

[00405] LÜTHY, Roland; BOWIE, James U.; EISENBERG, David. Assessment of protein models with three-dimensional profiles. Nature, [s.l.], v. 356, n. 6364, p.83-85, 5 mar. 1992. Springer Nature.

[00406] MCCONKEY, Brendan J.; SOBOLEV, Vladimir; EDELMAN, Marvin. The performance of current methods in ligand-protein docking. Current Science. Rehovot, p. 845-856. 10 out. 2002

[00407] McDonald KA, Horwitz AF, Knudsen KA. Adhesion molecules and skeletal myogenesis. Semin Dev Biol [Internet]. 1995 Apr 1 [cited 2018 Dec 26];6(2): 105-16.

[00408] MENG, Xuan-yu et al. Molecular Docking A Powerful Approach for Structure-Based Drug Discovery. Current Computer Aided-drug Design, [s.l.], v. 7, n. 2, p.146-157, 1 jun. 2011. Bentham Science Publishers Ltd..

[00409] Miller DH, Weber T, Grove R, Wardell C, Horrigan J, Graff O, et al. Firategrast for relapsing remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet Neurol [Internet]. 2012 Feb 1 [cited 2018 Dec 29]; 11(2): 131-9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/22226929 [00410] Mittelbrunn M, Molina A, Escribese MM, Yanez-Mo M, Escudero E, Ursa A, et al. VLA-4 integrin concentrates at the peripheral supramolecular activation complex of the immune synapse and drives T helper 1 responses. Proc Natl Acad Sci [Internet]. 2004 Jul 27 [cited 2019 Feb 10];101(30): 11058-63. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/15263094

[00411] MONTANARI, Maria Luiza C. et al. Sistemas transportadores de drogas. Química Nova, [s.l.], v. 21, n. 4, p.470-476, jul. 1998. FapUNIFESP (SciELO).

[00412] MORICOLI, Diego et al. Blocking monocyte transmigration in in vitro system by a human antibody scFv anti-CD99. Efficient large scale purification from periplasmic inclusion bodies in E. coli expression system. Journal Of Immunological Methods, [s.l.], v. 408, p.35-45, jun. 2014. Elsevier BV.

[00413] MULTIPLE SCLEROSIS INTERNATIONAL FEDERATION. What is MS? Disponível em: <https://www.msif.org/about- ms/what-is-ms/>. Acesso em: 28 out. 2015.

[00414] MURPHY, Kenneth; TRAVERS, Paul; WALPORT, Mark. Imunobiologia de Janeway. 7. ed. São Paulo: Artmed, 2010.

[00415] NAMBA, A. M.; SILVA, V. B. da; DA SILVA, C. H. T. P. Dinâmica molecular: teoria e aplicações em planejamento de fármacos. Eclética Química, [s.l.], v. 33, n. 4, p.13-23, dez. 2008. FapUNIFESP (SciELO).

[00416] Nieto M, Gómez M, Sánchez-Mateos P, Fernández E, Marazuela M, Sacedón R, et al. Expression of functionally active alpha 4 beta 1 integrin by thymic epithelial cells. Clin Exp Immunol [Internet]. 1996 Oct [cited 2018 Dec 26];106(l): 170— 8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/8870716

[00417] Olson DL, Burkly LC, Leone DR, Dolinski BM, Lobb RR. Anti-a4 integrin monoclonal antibody inhibits multiple myeloma growth in a murine model [Internet]. 2005 [cited 2018 Dec 30]. Available from: http://mct.aacrjournals.org/content/molcanther/4/1/91.full.p df

[00418] Pankov R, Yamada KM. Fibronectin at a glance. J Cell Sci [Internet]. 2002 Oct 15 [cited 2018 Dec 27];115(Pt 20):3861-3. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12244123

[00419] Pavlovic D, Patel MA, Patera AC, Peterson I. T cell deficiencies as a common risk factor for drug associated progressive multifocal leukoencephalopathy. Immunobiology [Internet]. 2018 Jun 1 [cited 2019 Mar 7];223(6-7):508-17. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S017129851 8300020 [00420] PINEIRO, Ángel. Introduction to Molecular Dynamics Simulations for Biological Systems. 2009. Disponível em: <http://smmb.usc.es/docs/mdproteins.pdf>. Acesso em: 01 mar. 2016.

[00421] Polman CH, O’Connor PW, Havrdova E, Hutchinson M, Kappos L, Miller DH, et al. A Randomized, Placebo-Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. N Engl J Med [Internet]. 2006 Mar 2 [cited 2018 Dec 30];354(9):899-910. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16510744

[00422] RATNIKOV, B. I.; PARTRIDGE, A. W.; GINSBERG, M. H. Integrin activation by talin. J Thromb Haemost, [s.l.], v. 3, n. 8, p.1783-1790, ago. 2005. Wiley-Blackwell.

[00423] REBOUÇAS, Alison de Sousa. Prospecção tecnológica, modelagem e Dinâmica Molecular do receptor CD20, alvo molecular do anticorpo monoclonal Rituximab. 2015. 44 f. TCC (Graduação) - Curso de Biotecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015.

[00424] Rosemblatt M, Vuillet-Gaugler MH, Leroy C, Coulombel L. Coexpression of two fibronectin receptors, VLA-4 and VLA-5, by immature human erythroblastic precursor cells. J Clin Invest [Internet]. 1991 Jan [cited 2018 Dec 27];87(1):6- 11. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1824634

[00425] Ryan DH, Nuccie BL, Abboud CN, Winslow JM. Vascular cell adhesion molecule- 1 and the integrin VLA-4 mediate adhesion of human B cell precursors to cultured bone marrow adherent cells. J Clin Invest [Internet]. 1991 Sep 1 [cited 2018 Dec 24];88(3):995-1004. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/1715889

[00426] SAKURAI, Ken et al. Investigation of the teratogenic potential of VLA-4 antagonist derivatives in rats. Reproductive Toxicology, [s.l.], v. 49, p.162- 170, nov. 2014.

[00427] Salvi G, De Los Rios P, Vendruscolo M. Effective interactions between chaotropic agents and proteins. Proteins Struct Funct Genet. 2005;61(3):492-9.

[00428] Sánchez-Aparicio P, Dominguez- Jiménez C, Garcia-Pardo A. Activation of the alpha 4 beta 1 integrin through the beta 1 subunit induces recognition of the RGDS sequence in fibronectin. J Cell Biol [Internet]. 1994 Jul [cited 2019 Feb 10] ; 126(1):271— 9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7517944

[00429] SÁNCHEZ, Roberto; 1ALI, Andrej. Advances in comparative protein-structure modelling. Current Opinion In Structural Biology, [s.l.], v. 7, n. 2, p.206-214, abr. 1997. Elsevier BV.

[00430] Sato T, Tachibana K, Nojima Y, D’Avirro N, Morimoto C. Role of the VLA-4 molecule in T cell costimulation. Identification of the tyrosine phosphorylation pattern induced by the ligation of VLA-4. J Immunol [Internet]. 1995 Sep 15 [cited 2018 Dec 24];155(6):2938-47. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7673711

[00431] Schleimer RP, Sterbinsky SA, Kaiser J, Bickel CA, Klunk DA, Tomioka K, et al. IL-4 induces adherence of human eosinophils and basophils but not neutrophils to endothelium. Association with expression of VCAM-1. J Immunol [Internet]. 1992 Feb 15 [cited 2018 Dec 26]; 148(4): 1086-92. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 1371130

[00432] Schlessinger J. Cell Signaling by Receptor Review Tyrosine Kinases receptor) are monomers in the cell membrane. Ligand binding induces dimerization of these receptors re-sulting in autophosphorylation of their cytoplasmic do [Internet]. Vol. 103, Cell. 2000 [cited 2019 Mar 7].

Available from: https://ac.els-cdn.com/S0092867400001148/l-s2.0- 0a85f6565840&acdnat= 1551963267 c4c439f597c6036e73a0el 2c611 e413a [00433] SCHLESINGER, Martin et al. The role of VLA-4 binding for experimental melanoma metastasis and its inhibition by heparin. Thrombosis Research, [s.l.], v. 133, n. 5, p.855-862, maio 2014. Elsevier BV.

[00434] Schlesinger M, Bendas G. Contribution of very late antigen-4 (VLA-4) integrin to cancer progression and metastasis. Cancer Metastasis Rev [Internet]. 2015 Dec 7 [cited 2018 Dec 28];34(4):575-91. Available from:

[00435] SCHRAUBER, Hannelore; EISENHABER, Frank; ARGOS, Patrick. Rotamers: To be or not to be?. Journal Of Molecular Biology, [s.l.], v. 230, n. 2, p.592-612, mar. 1993. Elsevier BV.

[00436] Schwab N, Schneider-Hohendorf T, Wiendl H. Therapeutic uses of anti- 4-integrin (anti- VLA-4) antibodies in multiple sclerosis. Int Immunol [Internet]. 2015 Jan 1 [cited 2018 Dec 29];27(l):47-53. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25326459

[00437] SHEN, Zhihong et al. Single-Chain Fragment Variable Antibody Piezoimmunosensors. Analytical Chemistry, [s.l.], v. 77, n. 3, p.797-805, fev. 2005. American Chemical Society (ACS).

[00438] Sina M, Farajzadeh D, Dastmalchi S. Effects of environmental factors on soluble expression of a humanized anti-TNF-a scFv antibody in Escherichia coli. Adv Pharm Bull [Internet]. 2015;5(4):455-61. Available from: http://dx.doi.org/10.15171/apb.2015.062

[00439] Singh J, Adams S, Carter MB, Cuervo H, Lee W-C, Lobb RR, et al. Rational design of potent and selective VLA-4 inhibitors and their utility in the treatment of asthma. Curr Top Med Chem [Internet]. 2004 [cited 2018 Dec 30] ;4(14): 1497-507. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15544540

[00440] SPAIN, Elaine et al. Detection of prostate specific antigen based on electrocatalytic platinum nanoparticles conjugated to a recombinant scFv antibody. Biosensors And Bioelectronics, [s.l.], v. 77, p.759-766, mar. 2016. Elsevier BV.

[00441] SRICHAI, Manakan Betsy; ZENT, Roy. Integrin Structure and Function. In: ZENT, Roy. Cell-Extracellular Matrix Interactions in Cancer. Nashville: Springer, 2010. p. 19-41.

[00442] Sugiura T, Kageyama S, Andou A, Miyazawa T, Ejima C, Nakayama A, et al. Oral treatment with a novel small molecule alpha 4 integrin antagonist, AJM300, prevents the development of experimental colitis in mice. J Crohns Colitis [Internet]. 2013 Dec 1 [cited 2018 Dec 29];7(l l):e533-42. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23623333

[00443] Takada Y, Ye X, Simon S. The integrins. Genome Biol [Internet]. 2007 [cited 2018 Dec 17];8(5):215. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17543136

[00444] TASHIRO, Ken-ichiro et al. An IKLLI-containing peptide derived from the laminin al chain mediating heparin-binding, cell adhesion, neurite outgrowth and proliferation, represents a binding site for integrin a3bl and heparan sulphate proteoglycan. Biochemical Journal. Great Britain, p. 119-126. maio 1999.

[00445] THOMPSON, Julie D; HIGGINS, Desmond G; GIBSON, Toby J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, Cambridge, v. 22, n. 22, p.4673-4680, nov. 1994.

[00446] To WS, Midwood KS. Plasma and cellular fibronectin: distinct and independent functions during tissue repair. Fibrogenesis Tissue Repair [Internet]. 2011 Sep 16 [cited 2019 Mar 7];4:21. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/21923916

[00447] Ukkonen K, Neubauer A, Pereira VJ, Vasala A. High Yield of Recombinant Protein in Shaken E. coli Cultures with Enzymatic Glucose Release Medium EnPresso B. In: Burgess-Brown NA, editor. Heterologous Gene Expression in E.colv. Methods and Protocols [Internet]. New York, NY: Springer New York; 2017. p. 127-37. Available from: https://doi.or /10.1007/978-l-4939-6887-9 8

[00448] UNGER, Ron et al. A 3D building blocks approach to analyzing and predicting structure of proteins. Proteins: Structure, Function, and Genetics, [s.l.], v. 5, n. 4, p.355-373, 1989. Wiley-Blackwell.

[00449] VAN DIJK, M. Information-driven protein-DNA docking using HADDOCK: it is a matter of flexibility. Nucleic Acids Research, [s.l.], v. 34, n. 11, p.3317-3325, 28 jun. 2006. Oxford University Press (OUP).

[00450] VERLI, Hugo. Bioinformática da Biologia à Flexibilidade Molecular. Porto Alegre: Hugo Verli., 2014.

[00451] Wei SH, Parker I, Miller MJ, Cahalan MD. A stochastic view of lymphocyte motility and trafficking within the lymph node. Immunol Rev [Internet]. 2003 Oct [cited 2019 Feb 10];195: 136-59. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/12969316

[00452] White J, Krishnamoorthy S, Gupta D, Lancelot M, Moore N, Samaik S, et al. VLA-4 blockade by natalizumab inhibits sickle reticulocyte and leucocyte adhesion during simulated blood flow. Br J Haematol [Internet]. 2016 Sep [cited 2018 Dec 30];174(6):970-82. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27291690

[00453] Wu C, Fields AJ, Kapteijn BA, McDonald JA. The role of alpha 4 beta 1 integrin in cell motility and fibronectin matrix assembly. J Cell Sci [Internet]. 1995 Feb [cited 2019 Feb 10];108 ( Pt 2):821-9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. ov/pubmed/7539441

[00454] Yoshimura N, Watanabe M, Motoya S, Tominaga K, Matsuoka K, Iwakiri R, et al. Safety and Efficacy of AJM300, an Oral Antagonist of a4 Integrin, in Induction Therapy for Patients With Active Ulcerative Colitis. Gastroenterology [Internet]. 2015 Dec [cited 2018 Dec 29]; 149(7): 1775-1783.e2. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26327130

[00455] Yu Y, Schürpf T, Springer TA. How natalizumab binds and antagonizes a4 integrins. J Biol Chem [Internet]. 2013 Nov 8 [cited 2018 Dec 26];288(45):32314-25. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24047894

[00456] Xiong H, Li S, Yang Z, Burgess RR, Dynan WS. E. coli expression of a soluble, active single-chain antibody variable fragment containing a nuclear localization signal. Protein Expr Purif [Internet]. 2009;66(2): 172-80. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/ i.pep.2009.03.002

[00457] XIONG, J.-p.. Crystal Structure of the Extracellular Segment of Integrin alpha Vbeta 3. Science, [s.l.], v. 294, n. 5541, p.339-345, 6 set. 2001. American Association for the Advancement of Science (AAAS).

[00458] Xu HN, Liu Y, Zhang L. Salting-out and salting-in: Competitive effects of salt on the aggregation behavior of soy protein particles and their emulsifying properties. Soft Matter. 2015 ; 11(29):5926-32.

[00459] Zarschler K, Witecy S, Kapplusch F, Foerster C, Stephan H. High-yield production of functional soluble single-domain antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact [Internet]. 2013 Oct 27 [cited 2019 Jan 8];12:97. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24161153