Die Erfindung betrifft ein Bildgebungsverfahren mit den folgenden Verfahrensschritten:

Erzeugung von zumindest teilkohärenter elektromagnetischer Beleuchtungsstrahlung,

Beleuchten eines Objektes mit der Beleuchtungsstrahlung,

Bewegen des Objektes lateral relativ zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung in zwei oder mehrere Lateralpositionen,

Detektieren von mehreren Intensitätsmustern, wobei jeder der Lateralpositionen ein detektiertes Intensitätsmuster zugeordnet ist, wobei die Intensitätsmuster durch Streuung oder Beugung der Beleuchtungsstrahlung an dem Objekt in einer Detektionsebene durch Uerzeugt werden, und

Rekonstruieren eines Bildes des Objektes aus den detektierten Intensitätsmustern mittels eines Phasenrekonstruktionsalgorithmus.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Bildgebungssystem zur Durchführung des Verfahrens, mit einer Beleuchtungslichtquelle, eingerichtet zur Erzeugung von zumindest teilkohärenter elektromagnetischer Beleuchtungsstrahlung, einer Positionierungseinheit, eingerichtet zum Bewegen des Objektes und des Verlaufs der Beleuchtungsstrahlung relativ zueinander, einem Flächendetektor, eingerichtet zum Detektieren von Intensitätsmustern, die durch Streuung oder Beugung der Beleuchtungsstrahlung an dem Objekt in einer durch die Ebene des Flächendetektors vorgegebenen Detektionsebene erzeugt werden, einer Steuereinheit, eingerichtet zum Ansteuern der Positionierungseinheit und des Flächendetektors in der Weise, dass das Objekt sequenziell in zwei oder mehrere vorgegebene Lateralpositionen bewegt wird und zwei oder mehrere Intensitätsmuster detektiert werden, wobei jeder der Lateralpositionen ein detektiertes Intensitätsmuster zugeordnet ist, und einem Computer, der durch Software dazu eingerichtet ist, ein Bild des Objektes aus den detektierten Intensitätsmustern mittels eines Phasenrekonstruktionsalgorithmus zu rekonstruieren.

Die Ptychographie ist eine computergestützte Bildgebungsmethode, bei der Bilder durch die Verarbeitung zweier oder mehrerer Intensitätsmuster erzeugt werden, die durch Beugung oder Streuung von zumindest teilkohärentem Licht an einem Objekt durch Interferenz entstehen. Die Intensitätsmuster werden durch eine konstante Funktion (z.B. Fokusgeometrie der Beleuchtungsstrahlung oder Geometrie einer Aperturblende) erzeugt, die sich relativ zu dem Objekt lateral, d.h. in seitlicher Richtung, um einen bekannten Betrag translatorisch bewegt. Die Intensitätsmuster treten in einiger Entfernung von dem Objekt auf, so dass sich die gebeugten oder gestreuten Lichtwellen der Beleuchtungsstrahlung ausbreiten, überlagern und miteinander interferieren, um so die Intensitätsmuster zu erzeugen.

Die Ptychographie kann mit sichtbarem Licht, Röntgenstrahlung, extremem Ultraviolett (XUV) oder auch mit Elektronenstrahlung durchgeführt werden. Im Gegensatz zu konventionellen Linsenabbildungen wird die Ptychographie nicht von linsenbedingten Aberrationen oder Beugungseffekten beeinflusst, die durch eine begrenzte numerische Apertur verursacht werden. Die Erzeugung der Intensitätsmuster erfolgt in der Regel linsenlos. Dies ist besonders wichtig für die Abbildung von Wellenlängen im atomaren Bereich, wo es schwierig und teuer ist, qualitativ hochwertige Objektive mit hoher numerischer Apertur herzustellen.

Ein weiterer Vorteil der Ptychographie besteht darin, dass transparente Objekte abgebildet werden können. Dies liegt daran, dass die Methode auf die Phase der Beleuchtungsstrahlung, die das Objekt passiert hat, anspricht. Im Fall der biologischen Mikroskopie mit sichtbarem Licht bedeutet dies, dass Zellen nicht gefärbt oder markiert werden müssen, um einen Kontrast zu erzeugen. Obwohl die an dem Objekt gebeugte oder gestreute Beleuchtungsstrahlung in der Ptychographie als Intensitätsmuster detektiert wird, bedeutet die mathematische Einschränkung durch die Translationsinvarianz von Beleuchtung und Objekt in Kombination mit den bekannten lateralen Verschiebungen zwischen ihnen, dass die Phase des Wellenfeldes durch eine inverse Berechnung (Phasenrekonstruktionsalgorithmus) per Computer rekonstruiert werden kann. Damit können alle Informationen über das Wellenfeld der gebeugten oder gestreuten Beleuchtungsstrahlung (Amplitude und Phase) wiederhergestellt werden, und es können nahezu perfekte Bilder des Objekts gewonnen werden, und zwar mit einer räumlichen Auflösung, die deutlich kleiner ist als die Größe des beleuchteten Bereichs auf dem Objekt. Die Anforderungen an die Beleuchtungsoptik sind vergleichsweise gering (siehe J. Rodenburg and A. Maiden, „Ptychography” in „Springer Handbook of Microscopy“, herausgegeben von P. W. Hawkes und J. C. H. Spence , Springer International Publishing, 2019, Seiten 819 bis 904).

In den vergangen Jahren haben lasergetriebene kohärente Strahlungsquellen im extremen Ultraviolett (XUV) eine enorme Performancesteigerung erfahren, womit hochaufgelöste Ptychographie im Labormaßstab möglich geworden ist. Neueste Implementierungen erreichen eine Auflösung bis in den sub-20 nm- Bereich und erlauben Bildgebung mit quantitativem Amplituden- und Phasenkontrast einschließlich räumlich aufgelöster Materialidentifikation anhand des gemessenen komplexen Brechungsindex.

Bislang wird die laterale, d.h. seitliche Bewegung des Objektes relativ zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung durch Positionierung des gesamten Aufbaus, welcher die Probe trägt (Probentisch, Probenhalter) mittels mechanischer Präzisionskomponenten, wie Piezoscannern oder Hexapoden (siehe J. Rodenburg et al., aaO, Seite 849) ausgeführt. Hierbei müssen im Verhältnis zu dem tatsächlich interessierenden Objekt (z.B. eine biologische Zelle, ein Mikropartikel etc.) relativ große Massen bewegt und abgestoppt bzw. stabilisiert werden, um die verschiedenen Lateralpositionen sequenziell anzufahren. Dies benötigt in nachteiliger Weise sehr viel Zeit. Die mit herkömmlichen ptychographischen Bildgebungssystemen erzielbare Scanrate ist entsprechend gering. Die Bewegung der Beleuchtungslichtquelle (und ggf. der zugehörigen Beleuchtungsoptik) selbst kann hier in vielen Fällen keine Abhilfe schaffen. Diese führt meist zu Abbildungsfehlern und damit zu unerwünschten Veränderungen (z.B. Phasengradienten) der Beleuchtung. Dadurch wird die Grundannahme der Ptychographie (unveränderliche Beleuchtung bis auf die laterale Bewegung) verletzt (siehe J. Rodenburg et al., aaO, Seite 849).

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Bildgebungsverfahren und ein entsprechendes System bereit zu stellen, bei denen die beschriebenen Nachteile vermieden werden. Insbesondere soll die Geschwindigkeit der Bildaufnahme erhöht werden.

Diese Aufgabe löst die Erfindung ausgehend von einem Bildgebungsverfahren der eingangs genannten Art dadurch, dass sich das Objekt in einem von der Beleuchtungsstrahlung durchstrahlten flüssigen Medium befindet und darin durch Dielektrophorese relativ zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung in die zwei oder mehreren Lateralpositionen bewegt wird.

Ausgehend von einem Bildgebungssystem der eingangs genannten Art löst die Erfindung die Aufgabe entsprechend dadurch, dass die Positionierungseinheit dazu eingerichtet ist, das in einem von der Beleuchtungsstrahlung durchstrahlten flüssigen Medium befindliche Objekt durch Dielektrophorese relativ zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung in die zwei oder mehreren Lateralpositionen, d.h. in seitlicher Richtung, zu bewegen.

Bei der Dielektrophorese wird ein inhomogenes elektrisches Feld zur Manipulation von Objekten, insbesondere kleinen Partikeln benutzt. Durch das inhomogene Feld wird in den Partikeln ein Dipolmoment induziert, das dann in Wechselwirkung mit dem erzeugten Feld tritt. Die Partikel erfahren dadurch eine Kraft und bewegen sich - je nach Feld und Dipolmoment - in Bereiche hoher oder niedriger Feldstärke, d.h. das Objekt bewegt sich auf ein Extremum des Feldes (Feldmaximum oder -minimum) zu und wird dort gehalten. Somit können Objekte gewissermaßen in einem „Feldkäfig“ eingefangen werden. Durch Variation der räumlichen Lage des Feldextremums, d.h. durch Variation der räumlichen Feldverteilung im Verlauf der Zeit, kann das Objekt gezielt in verschiedene Lateralpositionen bewegt werden. Gemäß der Erfindung wird also zur translatorischen Bewegung des Objektes lateral zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung nicht der Aufbau zur Probenhalterung, sondern das in dem flüssigen Medium (z.B. wässrige Elektrolytlösung, Öl) befindliche Objekt (d.h. biologische Zelle, Mikropartikel) als solches durch dielektrophoretische Kräfte seitlich bewegt. Dies erfolgt durch Variation der elektrischen Feldparameter. Da diese sehr schnell verändert werden können und bei der Bewegung des bloßen Objektes nur geringe Trägheitseffekte auftreten, sind die erforderlichen Änderungen der Lateralposition mit sehr kurzer Zeitfolge (z.B. wenige ms pro Lateralposition) möglich. Der gesamte übrige Aufbau, der bei dem Bildgebungsverfahren verwendet wird, bleibt ortsfest.

Bei einer möglichen Ausgestaltung ist das Objekt ein Partikel, dessen Durchmesser 1-1000 pm, vorzugsweise 1-200 pm beträgt. Z.B. kann es sich bei dem Objekt um eine biologische Zelle handeln. Derartig kleine Partikel lassen sich in einem flüssigen Medium sehr gut per Elektrophorese bewegen. Zweckmäßig kann sich das Objekt in einem Mikrokanal befinden, der von dem flüssigen Medium durchströmt wird. Die Breite des Mikrokanals kann bis zu 1000 pm, vorzugsweise bis zu 500 pm betragen, wobei die Höhe in Richtung der Beleuchtungsstrahlung an den Partikeldurchmesser angepasst ist. Das bedeutet, dass die Höhe möglichst nur um ein geringes Maß größer als der Partikeldurchmesser ist, so dass der Partikel zwar in dem Mikrokanal lateral beweglich ist, die Beweglichkeit in Richtung parallel zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung aber eingeschränkt ist, und zwar möglichst in der Weise, dass sie für den Bildgebungsvorgang keine Relevanz hat. Durch das in dem Mikrokanal strömende Medium wird der abzubildende Partikel zugeführt. Die erzeugte dielektrophoretische Kraft hält den Partikel entgegen der durch die Strömung wirkenden Kraft in Position.

Das Bewegen des Objektes kann vorteilhaft, wie oben erläutert, in einem dielektrischen Feldkäfig erfolgen, der durch eine Mehrzahl von auf oder in den Wandungen des Mikrokanals angeordneten Elektroden, die jeweils mit einer elektrischen Wechselspannung beaufschlagt werden, gebildet wird. Der dielektrische Feldkäfig kann z.B. durch acht mit einer elektrischen Wechselspannung beaufschlagte, voneinander beabstandete Elektroden gebildet werden, von denen vier auf oder in der Bodenwandung und die anderen vier auf oder in der Deckwandung des Mikrokanals angeordnet sind. Eine solche Elektrodenanordnung ist besonders praktikabel. Die Anordnung kann mit geringem Aufwand bereitgestellt werden. Durch sie resultiert eine elektrische Oktopolanordnung, mit der sich sehr einfach gezielt Feldextrema zum Positionieren des Partikels erzeugen lassen. Das Bewegen des Objektes relativ zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung in die zwei oder mehreren Lateralpositionen kann dabei durch Variation der an die Elektroden angelegten elektrischen Wechselspannungen hinsichtlich Spannungsamplitude und/oder Frequenz und/oder Phase mit einfachen technischen Mitteln erfolgen. Die erforderlichen Frequenzen der elektrischen Wechselspannung liegen je nach den dielektrischen Eigenschaften des Objektes und des Mediums beispielsweise im MHz-Bereich. Bei einer einfachen Ausgestaltung werden die Elektroden mit Wechselspannungen derselben Frequenz beaufschlagt, wobei sich die Wechselspannungen, die an die einzelnen Elektroden angelegt werden, hinsichtlich der Phase voneinander unterscheiden. Die relative Phase bleibt dabei zeitlich konstant, es wird lediglich die Amplitude zur Bewegung des Partikels in die verschiedenen Lateralpositioen variiert. Dabei kann vorteilhaft jeder Lateralposition ein Satz von Wechselspannungswerten (z.B. ein Satz von Spannungsamplitudenwerten bei ansonsten unveränderlicher Frequenz und unveränderlichen relativen Phasen) zugeordnet sein, mit denen die Elektroden beaufschlagt werden.

Bei einer praktischen Realisierung sollte die Bewegung des Objektes in der Weise erfolgen, dass in benachbarten Lateralpositionen mit der Beleuchtungsstrahlung beleuchtete Bereiche des Objektes räumlich überlappen. Die Überlappung ist vorteilhaft für die Konditionierung der Phasenrekonstruktion anhand der Intensitätsmuster.

Das erfindungsgemäße Bildgebungsverfahren eignet sich für Beleuchtungswellenlängen im Bereich zwischen 0,01 nm und 3 mm, vorzugsweise im Röntgenbereich, im XUV-Bereich, im VIS-Bereich, im IR-Bereich, im midlR- Bereich oder im THz-Bereich. Damit werden die relevanten praktischen Anwendungsfelder der Erfindung abgedeckt. Vorteilhaft kann die Detektion der Intensitätsmuster, wie bei der Ptychographie üblich, ohne abbildende Optik, d.h. linsenlos, erfolgen. Abbildungsfehler von optischen Komponenten spielen somit bei der Bildgebung keine Rolle.

Die detektierten Intensitätsmuster werden jeweils durch Interferenz der an dem Objekt gestreuten oder gebeugten Beleuchtungsstrahlung in der Detektionsebene erzeugt.

Bei einer möglichen Ausgestaltung kann eine zur Strahlformung ausgelegte Maske im Strahlverlauf zwischen Beleuchtungslichtquelle und Objekt vorgesehen sein, um den beleuchteten Bereich auf dem Objekt, d.h. die Beleuchtungsfunktion präzise vorzugeben.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Figur 1 : schematisch ein erfindungsgemäßes Bild- gebungssystem;

Figur 2: Illustration der Bewegung eines Partikels im Feldkäfig per Dielektrophorese.

Die Figur 1 zeigt schematisch ein Bildgebungssystem für die Ptychographie gemäß der Erfindung.

Das System umfasst einen Laser 1 als Beleuchtungslichtquelle, der einen Laserstrahl als Beleuchtungsstrahlung emittiert. Als Beleuchtungsoptik 2 ist eine Maske im Strahlverlauf zwischen Beleuchtungslichtquelle 1 und Objekt 3 vorgesehen, um den beleuchteten Bereich präzise vorzugeben.

Eine Positionierungseinheit 4 und ein Flächendetektor 5 (z.B. ein CCD-Element) dienen zur Gewinnung von Bilddaten mittels der Ptychographie. Bei einem Ptychographiescan werden mittels einer Steuereinheit 6 die Positioniereinheit 4 und der Flächendetektor 5 in der Weise angesteuert, dass das Objekt 3 sequenziell in mehrere vorgegebene Lateralpositionen (d.h. in seitlicher Richtung, quer zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung) translatorisch bewegt wird und entsprechend mehrere Beugungsbilder als digitale Intensitätsmuster mittels des Flächendetektors 5 detektiert werden, wobei jeder der Lateralpositionen ein detektiertes Intensitätsmuster zugeordnet ist. Die den einzelnen Intensitätsmustern zugeordneten Positionsdaten werden zu den Intensitätsmustern auf einem Computer 7 gespeichert und aus der Kombination der Positionsdaten und den Intensitätsmustern entsteht ein Ptychographie- Datensatz. Ein geeigneter numerischer Phasenrekonstruktionsalgorithmus (wie er als solcher im Stand der Technik bekannt ist) wird mittels des Computers 7 auf den Ptychographie-Datensatz angewendet, um ein Bild des Objektes 3 zu erzeugen, das mittels des Computer 7 schließlich ausgegeben und (z.B. per Monitor) dargestellt werden kann.

Gemäß der Erfindung ist die Positionierungseinheit 4 dazu eingerichtet ist, das in einem von der Beleuchtungsstrahlung durchstrahlten flüssigen Medium befindliche Objekt 3 durch Dielektrophorese relativ zum Verlauf der Beleuchtungsstrahlung in die zwei oder mehreren Lateralpositionen zu bewegen. Das partikuläre Objekt 3 (z.B. biologische Zelle, Mikropartikel) wird dabei als solches bewegt. Hierfür befindet sich das Objekt 3 in einem transparenten flüssigen Medium (z.B. wässrige Lösung, Öle, Alkohol etc.) in einem ebenfalls für die Beleuchtungsstrahlung transparenten Mikrokanal 8, der von dem flüssigen Medium durchströmt wird (angedeutet in Figur 1 durch Blockpfeile). Das Bewegen des Objektes 3 erfolgt in einem dielektrischen Feldkäfig, der durch eine Mehrzahl (hier acht) von auf den Boden- und Deckwandungen des Mikrokanals angeordneten Elektroden E1-E8, die jeweils mit einer elektrischen Wechselspannung beaufschlagt werden, gebildet wird. Der dielektrische Feldkäfig wird durch räumliche Feldextrema mittels der dargestellten Elektrodenanordnung erzeugt. Das durch das elektrische Feld polarisierte Objekt 3 wird auf diese Weise in einem Potentialtopf gefangen. Die acht Elektroden E1-E8 sind hierzu bei dem Ausführungsbeispiel rechtwinklig, kreuzförmig auf den Boden- und Deckwandungen angeordnet, wobei die freien Enden der Elektroden auf das von den Elektroden freibleibende Zentrum des Feldkäfigs zuweisen. In diesem freibleibenden Bereich wird der Feldkäfig von der Beleuchtungsstrahlung passiert. Ein derartiger Feldkäfig lässt sich nahezu beliebig miniaturisieren, entsprechend dem Durchmesser des abzubildenden Objektes 3. Elektrodenanordnungen mit typischen Abmessungen von wenigen 100 nm und darunter sind mittels Elektronenstrahl-Lithographie oder anderer aus dem Bereich der Halbleitertechnologie bekannter Strukturierungs- und Depositionsverfahren realisierbar. Die Manipulation von organischen Zellen erfordert einen Feldkäfig mit einem zwischen den Elektrodenspitzen freibleibenden Bereich mit Längenabmessungen von 10 bis 200 pm. Als günstig hat sich ein Verhältnis von Kammer- zu Objektdurchmesser von 2 bis 40 erwiesen. Für die Handhabung biologischer Zellen sind Temperaturen über 270 K und leitfähige Elektrolytlösungen als flüssiges Medium sinnvoll. Der dielektrische Feldkäfig schirmt in dem erzeugten Potentialtopf gefangene Objekte gegen das Eindringen weiterer Objekte ab.

Die acht auf der Boden- und Deckwandung des Mikrokanals 8 angeordneten Elektroden E1-E8 bilden bei dem Ausführungsbeispiel der Figur 1 einen Oktopol, in dem bei Beaufschlagung der einzelnen Elektroden E1-E8 mit um 180° phasenverschobenen Wechselfeldern ein elektrisches Feldextremum im Zentrum der Anordnung entsteht, in welches das Objekt 3 bei geeigneter Wechselfeldfrequenz (im MHz-Bereich) getrieben wird. Durch Variation der an den einzelnen Elektroden E1-E8 angelegten Spannungsamplituden verändert sich die Verteilung der lokalen elektrischen Feldstärke und damit die dielektrophoretische Kraft, die auf das Objekt 8 wirkt, wodurch es in unterschiedliche Bereiche des Feldkäfigs lateral verschoben wird. Dies illustriert die Figur 2, die ein Schema eines dielektrophoretischen Feldkäfigs mit den Elektroden E1-E8 zeigt und ein in der Feldfalle gefangenes Objekt 3 (nicht maßstabsgetreu). Die Pfeile verdeutlichen die Translation des Partikels, wenn ein oder mehrere Elektrodenpaare gegenüber den anderen durch Ansteuerung mit einer gegenüber U1 niedrigeren Spannungsamplitude U2 beufschlagt werden. Der Spitze-Spitze-Abstand einander diagonal gegenüberliegender Elektroden beträgt hier 40 pm, was z.B. die Manipulation von biologischen Zellen mit einem Durchmesser um 10 pm erlaubt.

Die maximale Positionsverschiebung, welche mit der beschriebenen Anordnung erzielt werden kann, ist gegeben durch das Verhältnis aus Größe des Feldkäfigs (welche durch den Abstand benachbarter Elektroden E1-E8 bestimmt ist) und den Objektdurchmesser. Dieses Verhältnis kann zweckmäßig so gewählt werden, dass der Bewegungsspielraum eines typischen Objektes 3 (z.B. biologische Zelle, Mikropartikel) den zweifachen Durchmesser des Feldkäfigs übersteigt. Dies ist für einen Ptychographiescan ausreichend. Die Genauigkeit der Positionierung liegt in der Praxis im Bereich < 50 nm, abhängig von der Präzision und Stabilität der Wechselspannungserzeugung hinsichtlich Frequenz, Phase und Amplitude. Die Genauigkeit hängt auch von möglichen hydrodynamischen und/oder thermischen Störungen in dem flüssigen Medium ab. Ggf. kann der Fluidstrom bei der Detektion des Intensitätsmusters jeweils gestoppt werden, um die Genauigkeit zu erhöhen.

Im Gegensatz zu den üblicherweise im Rahmen einer Ptychographie zur Positionierung bzw. Bewegung eines partikulären Objektes relativ zur Beleuchtungsstrahlung eingesetzten Techniken ermöglicht die Nutzung der Dielektrophorese sehr viel schnellere zeitliche Abfolgen von Lateralpositionen, wodurch Aufnahmen mit höherer Bildrate durchgeführt werden können. Die Geschwindigkeit der Bildaufnahme (Messzeit pro Fläche) kann um mehrere Größenordnungen gesteigert werden. Außerdem kann auf aufwändige und teure Präzisionsmechanik zur Positionierung verzichtet werden, was die Kosten des Aufbaus senkt. Insbesondere dann, wenn das Objekt, wie bei biologischen Zellen, in einer Flüssigkeit vorliegt/vorliegen muss, kann die Positionierung mittels Dielektrophorese wesentlich genauer sein als die mechanische Bewegung der gesamten Flüssigkeitszelle mit verzögerter und ggfs. unvollständiger sowie kaum reproduzierbarer Folgebewegung des Objektes im Fluid. Somit lässt sich durch die Erfindung gegenüber dem Stand der Technik auch die Qualität der erzeugten Bilder erhöhen.

- Patentansprüche -