Insbesondere kommen unpolare Lösungsmittel zum Ausfällen von Fredericamycin A zum Einsatz. Die beschrieben Aufreinigungsmethode kommt ohne chromatographische Reinigungsschritte aus.

Fredericamycin A (NSC-305263) ist ein Antitumor-Antibiotikum, das durch Fermentation eines Stammes von Streptomyces griseus (ATCC 49344) gewonnen werden kann (Pandey et al., J. Antibiot. 34/11, 1981,1389-1401). In der Literatur sind mehrere Methoden zur Gewinnung von reinem Fredericamycin A beschrieben (Pandey et al. ; Byrne et al., Biochemistry 24,1985, 478-486 ; USP 4,584, 377), die jedoch alle mindestens einen säulenchromatographischen Reinigungsschritt auf Kieselgelbasis beinhalten. Bei einer säulenchromatographischen Trennung ist erfahrungsgemäß mit hohen Substanzverlusten (2 30 %) zu rechnen. Des Weiteren ist die Säulenchromatographie eine Trennmethode, die mit hohen Materialkosten (Lösungsmittel und Kieselgel) sowie einem großen Aufwand an Zeit und Personal verbunden ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufkonzentration von Fredericamycin A aus einem Stoffgemisch, enthaltend den Verfahrensschritt bei dem aus einer sauren Lösung, die Fredericamycin A enthält, durch Zugabe eines unpolaren Lösungsmittels in der Lösung enthaltenes Fredericamycin A ausgefällt wird.

Unter Aufkonzentration wird die Reduktion von Komponenten verstanden, die neben Fredericamycin A in einem festem Stoffgemisch oder der Suspension oder (Teil-) Lösung des Stoffgemischs, z. B. einem Rohextrakt oder einem Teil-aufgereinigtem Extrakt vorliegen. Bei den Komponenten werden Lösungsmittel nicht betrachtet. Bevorzugt werden bei der Aufkonzentration mehr wie 75%, bevorzugt mehr wie 80%, insbesondere 85% oder mehr der Initialmenge des Fredericamycin A über alle Konzentrationsschritte aufgereinigt.

Bei den einzelnen Schritten werden bevorzugt mehr wie 90%, besonders bevorzugt mehr wie 95%, insbesondere 97% oder mehr des Fredericamycin A aufgereinigt.

Der gew.-% ige Anteil der Komponenten neben Fredericamyin A wird über alle Konzentrationsschritte bevorzugt von über 70,80 oder sogar 85 Gew. % auf weniger wie 10 Gew. %, bevorzugt 5 Gew. %, insbesondere 3 oder weniger Gew. % gebracht. Eine weitere Aufreinigung durch Wiederholung der Verfahrensschritte ist selbstverständlich möglich.

Unter Stoffgemisch wird ein festes Stoffgemisch oder eine Suspension oder (Teil-) Lösung des Stoffgemischs verstanden. Im Stoffgemisch liegen neben Fredericamycin A noch andere Komponenten vor, meist Komponenten die aus der Reinigung von Naturextrakten oder chemischen Synthese vorliegen. Typische Stoffgemische sind Rohextrakt oder einem Teil-aufgereinigtem Extrakt.

Unter sauren Lösung wird eine Lösung verstanden mit einem pH-Wert von kleiner gleich 5, bevorzugt kleiner gleich 4. Die Lösung kann direkt aus dem Extraktionsverfahren stammen und muss gegebenenfalls im pH angepasst werden (z. B. durch Essigsäure, HCl oder TFA) oder es handelt sich um eine Lösung, die von einem festen Stoffgemisch erstellt worden ist. Lösungsmittel sind z. B. Chloroform, Methylenchlorid, Trichlormethan, Essigester, Ether u. a.. Unter Lösung wird auch eine Teillösung oder kolloidale Lösung verstanden, bevorzugt ist aber eine Lösung ohne mit dem Auge erkennbaren Feststoffen vorliegt.

Unter Zugabe wird eine ausreichende Menge verstanden, um den größten Teil an Fredericamycin A wieder auszufällen. Bevorzugt wird für das zugegebene Lösungsmittel das Minimum bestimmt zwischen nicht ausgefallenem Fredericamycin A im Verhältnis zu den ausgefallen Nebenkomponenten. In der Nähe dieses Minimums wird zugegeben.

Unter unpolarem Lösungsmittel werden Lösungsmittel verstanden, die das Ausfallen von Fredericamycin A aus einer sauren Lösung bedingen.

Bevorzugt sind Lösungsmittel, die im Polaritätsintervall von cyclischem, linearem oder verzweigtem Cs-cl2-Alkan oder C5-C12-Alken liegen oder noch unpolarer sind. Besonders bevorzugt sind cyclisches, lineares oder verzweigtes C5-C12-Alkan, C5-C12-Alken oder Gemische daraus, insbesondere cyclisches, lineares oder verzweigtes Hexan, insbesondere Cyclohexan.

Unter Fredericamycin A ausfällen wird verstanden, dass bevorzugt mehr wie 90%, besonders bevorzugt mehr wie 95%, insbesondere 97% oder mehr der eingesetzten Menge an Fredericamycin A als abtrennbarer Stoff vorliegen. Das Abtrennen erfolgt bevorzugt durch Zentrifugieren oder Filtration.

Bevorzugt sind die oben genannten Verfahren, die zusätzlich den Verfahrensschritt der Behandlung eines festen Stoffgemisches mit einem protischen Lösungsmittel enthalten. Dieser Verfahrensschritt wird bevorzugt nach dem vorherigen durchgeführt. Unter Behandlung wird die innige Kontaktierung des festen Stoffgemisches mit dem protischen Lösungsmittel verstanden. Dies kann z. B. durch Ultraschall verstärkt werden. Unter protischem Lösungsmittel wird bevorzugt ein C1-C4-Alkanol oder Mischungen daraus verstanden, oder polare Lösungsmittel der gleichen Polarität. Insbesondere bevorzugt ist Methanol. Das protische Lösungsmittel kann auch Wasser enthalten. Die Wiederholung des Schrittes einmal mit Wasserzusatz, einmal ohne Wasserzusatz ist bevorzugt.

Besonders bevorzugt ist die anschließende Wiederholung der Lösung in einem sauren Lösungsmittel mit anschließender Fällung durch Zugabe eines unpolaren Lösungsmittels.

Bevorzugt sind oben genannte Verfahren bei denen der Verfahrensschritt Ausfällen mit unpolarem Lösungsmittel als erstes, der Verfahrensschritt Behandeln mit protischem Lösungsmittel und optional Wasser als zweites vorliegt. Besonders bevorzugt ist die Wiederholung des vorherigen Schrittes diesmal optional ohne Wasser.

Insbesondere bevorzugt ist als abschließender Verfahrensschritt das Ausfällen mit unpolarem Lösungsmittel.

Beschreibung der Aufkonzentration von Fredericamycin A Die folgende Beschreibung der Aufkonzentration dient nur als Leitschnur und kann von einem Fachmann variiert werden.

Ein Rohextrakt des Mycels von Streptomyces griseus ATCC 49344 (Pandey et al. ) wird in wenig angesäuertem Lösungsmittel z. B.

Methylenchlorid, das 0.1 % Trifluoressigsäure (TFA) enthält, gelöst, anschließend mit einem Überschuss eines unpolaren Lösungsmittel, z. B. der 9-fachen Menge Cyclohexan versetzt. Dabei fällt der größte Teil des FM-A wieder aus (98 %) und kann abgetrennt, z. B. abzentrifugiert werden, während der Großteil der mittel-bis unpolaren Substanzen gelöst bleiben und mit dem Lösungsmittel entfernt werden.

Der Niederschlag wird nun in einem protischen Lösungsmittel, z. B.

Methanol digeriert, anschließend Wasser z. B. mit 50 Vol. % Wasser versetzt, wobei hauptsächlich die polaren und mittelpolaren Substanzen gelöst werden, während FM-A größtenteils ungelöst bleibt und abgetrennt, z. B. abzentrifugiert wird.

Im dritten Schritt wird mit polarem Lösungsmittel, z. B. reinem Methanol gewaschen, wobei mittelpolare Substanzen entfernt werden.

Im vierten Schritt wird z. B. erneut mit Methylenchlorid/Cyclohexan 1 : 9 (+ TFA) gewaschen wie in Schritt 1 beschrieben, wobei Reste lipophiler Substanzen entfernt werden.

Als Produkt erhält man reines Fredericamycin A (98 % nach NMR), Ausbeute-85% Beispiel für einen Reinigungsprozess Ein typischer Rohextrakt von 600 g des getrockneten Mycels von Streptomyces griseus ATCC 49344 enthält etwa 4 Gramm Fredericamycin A bei einem Gesamtgewicht von ca. 30 Gramm.

Die gesamte Masse wird im Ultraschallbad in 400 ml Methylenchlorid (CH2Cl2) gelöst unter Zusatz von 0.4 ml Trifluoressigsäure (TFA).

Dann werden 3.6 Liter Cyclohexan zugesetzt, wobei über 98 % des Fredericamycins ausfallen. Diese werden bei 5000 g 20 Minuten abzentrifugiert, der Überstand, der einen Großteil der mittel-bis unpolaren Substanzen enthält (-22 g), wird verworfen.

Der Niederschlag wird in 2 Liter Methanol im Ultraschallbad digeriert, dann mit 1 Liter Wasser versetzt. Hierbei fallen über 95 % des Fredericamycins aus und werden abzentrifugiert. Der Überstand enthält die mittel-bis polaren Substanzen (-2 g) und wird verworfen.

Der Niederschlag wird erneut in 2 Litern Methanol im Ultraschallbad digeriert, anschließend abzentrifugiert. Erneut fallen etwa 95 % des Fredericamycins aus, während Reste von polaren und mittelpolaren Substanzen gelöst bleiben (-2 g) und mit dem Überstand entfernt werden.

Als letztes wird Waschschritt Nummer 1 wiederholt, um Reste lipophiler Substanzen (-0. 2 g) zu entfernen. Der Verlust an Fredericamycin beträgt hier erneut etwa 2 %. Man erhält 3.4 g reines Fredericamycin A in Form eines dunkelroten bis schwarzen Pulvers, Reinheit-98 % (NMR), Ausbeute %.