[0001] 本发明涉及人参皂苷单体 Rh2的纯化方法的技术领域， 特别涉及对以 β -葡萄糖 苷酶催化 Rg3制备 Rh2的酶反应液进行纯化的方法。

背景技术

[0002] 人参皂苷是一种三萜类化合物， 主要存在于人参属药材中， 被视为是人参中起 药理活性的主成分， 具有治疗心脑血管系统疾病、 提高机体免疫力、 抗肿瘤、 抗疲劳、 抗菌、 延缓衰老等作用。 现今已明确知晓的人参皂苷单体约有 40余种 ， 如 Rbl、 Rb2、 Rb3、 Rc、 Rd、 Rgl、 Rg2、 Rg3、 Rhl、 Rh2及 Re等。

[0003] 据大量研究发现， 在众多人参皂苷单体中以人参皂苷 Rh2的功效最为显著， 几 乎代表了人参里的全部正面功效。 人参皂苷 Rh2是人参皂苷中抗癌活性最强的单 一成分， 其对恶性细胞有着显著的抑制效果， 可以有效地控制恶性细胞的生长 ， 甚至将恶性细胞转化为正常细胞。 随着临床试验结果陆续地被报导出来， 人 参皂苷 Rh2对于抗癌的疗效极为惊人的满意， 被视为当今最具潜力的天然抗癌物 质。

[0004] 人参中含有的人参皂苷 Rh2极为稀少， 在白参中并未发现含有 Rh2， 而在红参 中的含量仅为十万分之一， 且提取十分困难， 因而价格十分昂贵。 基于此， 目 前人参皂苷 Rh2的大规模生产一般为人工制备。 研究发现， 人参皂苷 Rg3的结构 仅比人参皂苷 Rh2多了一个糖基， 因此可通过水解 Rg3中多出的糖基获得 Rh2。 又因 Rg3的药理活性及生物利用度均低于 Rh2， 且 Rg3的天然含量比 Rh2高很多， 提取相对容易， 故而， 工业上会采用 β-葡萄糖苷酶催化水解 Rg3来制备 Rh2。 为 了获得较为纯净的人参皂苷 Rh2， 在反应完成后， 还需对此种制备方法的酶反应 液进行进一步纯化处理。 目前已知的纯化处理方法多为将酶反应液过滤 后经大 孔树脂分离或者过硅胶柱层析， 可是此种纯化方法操作繁琐、 耗吋耗力、 且成 本较高。

技术问题 [0005] 鉴于现有技术存在的上述不足， 本发明的目的在于提供一种人参皂苷 Rh2的新 的纯化方法， 用于对以 β-葡萄糖苷酶催化 Rg3制备 Rh2的酶反应液进行纯化， 旨 在解决现有的纯化方法存在的操作繁琐、 耗吋耗力、 且成本较高的技术问题。 问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 为实现上述目的， 本发明提供了一种人参皂苷 Rh2的纯化方法， 用于纯化以 β- 葡萄糖苷酶催化 Rg3制备 Rh2的酶反应液， 其特征在于： 用萃取体系对所述酶反 应液进行萃取， 静置分层后留取上层溶液， 并对所述上层溶液进行溶剂回收， 即得 Rh2产品； 所述萃取体系由硫酸铵、 乙醇和乙酸乙酯组成， 所述硫酸铵的用 量为 2-20g/100ml所述酶反应液， 所述乙醇和所述乙酸乙酯的总体积量为所述酶 反应液体积的 0.5-5倍， 并且所述乙醇和所述乙酸乙酯的体积比为 1:1-4。

[0007] 在本发明提供的上述人参皂苷 Rh2的纯化方法中， 由于硫酸铵不溶于乙醇和乙 酸乙酯， 故宜将萃取体系的各组分分别加入到酶反应液 中。 优选先按配比将硫 酸铵加入酶反应液中， 待溶解完全后再按配比分别加入乙醇和乙酸乙 酯， 摇匀 后静置分层。

[0008] 优选地， 所述硫酸铵的用量为 5-15g/100ml所述酶反应液。

[0009] 更优选地， 所述硫酸铵的用量为 8-15g/100ml所述酶反应液。

[0010] 更优选地， 所述硫酸铵的用量为 8g/100ml所述酶反应液。

[0011] 优选地， 所述乙醇和所述乙酸乙酯的总体积量为所述酶 反应液体积的 2-3倍。

[0012] 更优选地， 所述乙醇和所述乙酸乙酯的总体积量为所述酶 反应液体积的 2倍。

[0013] 优选地， 所述乙醇和所述乙酸乙酯的体积比为 1:2-4。

[0014] 更优选地， 所述乙醇和所述乙酸乙酯的体积比为 1:2-3。

[0015] 更优选地， 所述乙醇和所述乙酸乙酯的体积比为 1:2。

发明的有益效果

有益效果

[0016] 与现有技术相比， 本发明提供的人参皂苷 Rh2的纯化方法具有操作简单、 耗吋 较短且成本低廉的优点， 该方法只需使用少量的萃取剂经一次性萃取便 可获得 较高收率和纯度的人参皂苷单体 Rh2， 所获得的纯化产品极具市场竞争力。 本发明的实施方式

[0017] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细 说明， 以下实施例是对本发明的 解释， 本发明并不局限于以下实施例。

[0018] 纯化处理对象： 邦泰生物工程 （深圳） 有限公司采用生物酶催化法 （以人参皂 苷 Rg3为底物， 在 DMSO和磷酸钠缓冲液存在的条件下， 用 β-葡萄糖苷酶催化制 备 Rh2) 经充分反应后制备得到的酶反应液， 经高效液相色谱法测得： 以 Rg3计 ， 该次酶催化反应的转化率为 92.6%， 酶反应液中的 Rh2的纯度为 7.3%。

[0019] 对上述酶反应液的纯化过程如下：

[0020] 按配比向酶反应液中加入硫酸铵， 待溶解完全后再按配比加入乙醇和乙酸乙酯 ， 充分摇匀后静置分层， 下层为水相， 上层为有机相； 取上层的有机相置旋蒸 仪中旋蒸， 在 70°C条件下以 60rpm转速旋蒸至体积不再变化， 回收溶剂， 趁热过 滤， 再用 1%体积的纯水冲洗滤饼， 烘干后即得 Rh2产品。

[0021] 实施例 1

[0022] 乙醇和乙酸乙酯总用量优化对比

[0023] 按上述纯化流程对上述酶反应液进行纯化处理 ， 其中， 硫酸铵的加入量为 8g/l 00ml酶反应液， 乙醇和乙酸乙酯的体积比为 1:2， 乙醇和乙酸乙酯加入的总体积 量分别为酶反应液体积的 0.5倍 （0.5BV) 、 1倍 （1BV) 、 2倍 （2BV) 、 3倍 （3 BV) 和 5倍 （5BV) ， 测得纯化所得 Rh2产品的收率和纯度分别如表 1所示， 表中 萃取剂指代乙醇和乙酸乙酯的总体积量。

[0024] 表 1

[] [表 1]

[0025] 实施例 2

[0026] 乙醇和乙酸乙酯比例优化对比 [0027] 按上述纯化流程对上述酶反应液进行纯化处理 ， 其中， 硫酸铵的加入量为 8g/l 00ml酶反应液， 乙醇和乙酸乙酯加入的总体积量为酶反应液体 积的 2倍， 乙醇和 乙酸乙酯加入的体积比分别为 1:1、 1:2、 1:3和 1:4， 测得纯化所得 Rh2产品的收率 和纯度分别如表 2所示， 表中醇 /酯指代乙醇和乙酸乙酯的体积比。

[0028] 表 2

[] [表 2]

[0029] 实施例 3

[0030] 硫酸铵用量优化对比

[0031] 按上述纯化流程对上述酶反应液进行纯化处理 ， 其中， 乙醇和乙酸乙酯加入的 总体积量为酶反应液体积的 2倍， 乙醇和乙酸乙酯加入的体积比为 1:2， 硫酸铵的 加入量分别为 2g/100ml酶反应液 （记为 2%) 、 5g/100ml酶反应液 （记为 5%) 、 8 g/100ml酶反应液 （记为 8%) 、 15g/100ml酶反应液 （记为 15%) 、 20g/100ml酶 反应液 （记为 20%) ， 测得纯化所得 Rh2产品的收率和纯度分别如表 3所示。

[0032] 表 3

[] [表 3]

[0033] 实施例 4

[0034] 与单纯用乙酸乙酯萃取的对比

[0035] 方法 A: 按上述纯化流程对上述酶反应液进行纯化处理 ， 其中， 硫酸铵的加入 量为 8g/100ml酶反应液， 乙醇和乙酸乙酯加入的总体积量为酶反应液体 积的 2倍 ， 乙醇和乙酸乙酯加入的体积比为 1:2， 重复纯化处理三组酶反应液， 测得纯化 所得 Rh2产品的收率分别如表 4所示。

[0036] 方法 Β ·· 单纯用乙酸乙酯对上述酶反应液进行萃取， 重复萃取三次， 每次乙酸 乙酯加入的体积量为酶反应液体积的 2倍， 重复纯化处理三组酶反应液， 测得纯 化所得 Rh2产品的收率分别如表 4所示， 表中列出了三次萃取分别对应的收率。

[0037] 表 4

[] [表 4]

[0038]