Campo da Invenção

[0001] A presente invenção se refere a um método preditivo qualitativo, método e kit aplicados ao diagnóstico diferencial precoce das formas mais prevalentes de meningites bacterianas e virais, possibilitando detectar e distinguir as diversas formas de meningite. A invenção se refere, ainda, ao uso de proteínas biomarcadoras para a predição de meningite.

[0002] A presente invenção utiliza método preditivo qualitativo baseado na detecção combinada e análise sequencial da presença/ausência de pelo menos três entre quatro biomarcadores específicos. Os biomarcadores são representados por proteínas da resposta inflamatória do hospedeiro humano presentes no líquido cefalorraquidiano dos pacientes. A aplicação do método preditivo qualitativo permite diferenciar os pacientes que apresentam meningite vira! daqueles que apresentam meningite bacteriana, determinando ainda a etiologia da meningite bacteriana, se pneumococica ou meningococica. A presente invenção proporciona ainda um método de diagnóstico diferencial de meningites baseado na aplicação do método preditivo e proporciona também a possibilidade de incorporação do método da presente invenção em um kit diagnóstico que contenha ligantes às proteínas biomarcadoras, como anticorpos ou aptâmeros, adaptados a um método de avaliação laboratorial que pode incluir o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), cromatografia, turbidimetria, eletroforese capilar, entre outros.

Fundamentos da invenção

[0003] Muitos estados de doença são caracterizados por diferenças nos níveis de expressão de genes, na presença ou concentração de determinadas proteínas, e outros biomarcadores. Nesse contexto, surge a possibilidade de utilização de modelos (métodos) preditivos para o auxilio no diagnóstico de doenças.

[00041 Meningite é a inflamação das meninges em resposta a Infecções ou exposição a agentes químicos. De acordo com a etiologia, as meningites são classificadas como asséptica (MA), sem evidência de infecção bacteriana çausatíva, ou bacteriana (MB). Enquanto as MA, em sua maioria, são benignas e de curso autoiimitado, as MB estão associadas a aftas taxas de mortalidade e morbidade que permanecem inalteradas nas últimas décadas apesar dos avanços nas terapias antimicrobtanas e cuidados intensivos para manutenção dos sistemas vitais dos pacientes (Scheid W, Koede! U, Nathan 8, Pfíster H; Pathophysiology of bactéria! meningitis: mechanism(s) of neuronal injury. J Infect Dis 2002, 186 Suppl 2.S225-233),

[0005J Meningite bacteriana (MB) é uma das dez principais causas de mortes relacionadas a infecções em todo o mundo (Fauci A. Jnfectíous diseases: consideratíons for the 21 st ceníury. Ciín Infect Dis 2001 , 32(5); 675- 685), com incidência estimada de 2-5/100 mil casos por ano em países desenvolvidos, podendo atingir valores até dez vezes maiores em países em desenvolvimento (Murray J, Lopez A: Giobaí burden of disease and injuries series. Geneva; 1996.). A MB está associada a taxas de mortalidade de até 30%. Além disso, entre 30 e 50 % dos pacientes que sobrevivem à infecção desenvolvem sequelas neurológicas permanentes, incluindo surdez neurosensoríal, retardo mental, dificuldades de aprendizado, deficiências sensoriais e motoras e paralisia cerebral ( erkelbach S, Síttinger H, Schweizer I, Muller M: Cognitiva outcome after bacterial meningitis. Acta Neuroi Scand 2000, 102(2): 118-123).

[0006] Os agentes etiológicos mais comuns de M8 são Str ptococcuç pneumoniae (pneumococos), Neísseria meningitidis (meningococos), e Haemophiius infíuenzae tipo b (Hib). Desde a criação e inclusão da vacina anti- Hib no calendário básico de vacinação, no final da década de 90, os pneumococos tornaram-se o agente causador mais frequente de M8 não epidêmica adquirida na comunidade entre crianças maiores do que um ano de idade (Schuchat A, Robinson K, Wenger J, Harrison L, Farley M, Reingold A, Lefkowitz L, Perkins B. Bactéria! meningitis in the United States in 1995. Active Surveiiiance Team. N Engl J ed 1997, 337(14):970-976). Dentre as MB, a meningite pneumocócica é a que está associada às mais altas taxas de fatalidade e morbidade. A meningite meningocócica é, sobretudo, uma doença epidêmica e afeta principalmente crianças e adultos jovens.

[0007] Meningite asséptica (MA) é definida como inflamação do espaço subaracnóide, caracterizada por pleocitose de células mononucleares e com cultura estéril do líquor (liquido cefalorraquidiano ou fluido cerebrospinal). Embora a principal causa de MA sejam infecções virais, o diagnóstico diferencial de MA inclui também meningite tuberculosa ou fúngica, inflamação causada por infecção parameningeal, doenças vasculares do colágeno e inflamações das meninges causadas por drogas (Ravel R: Clinicai Laboratory Medicine: Clinicai Application of Laboratory Data: Elsevier Health Sciences; 1994). Meningites virais são comuns e frequentemente não relatadas. Os enterovírus não pliovírus (Çoxsaçkievirus e Eçhovirus) são responsáveis por 80 a 90% dos casos de meningites virais com etiologia definida (Atkinson P, Sharland M, Maguire H: Predominant enteroviral serotypes causing meningitis. Archives of Disease in Childhood 1998, 78:373-374).

[0008] As MB caracterizam-se por uma intensa inflamação granulocítica nos espaços subaracnóide e ventricular que se estende ao espaço perilinfático do ouvido interno e causa morte neuronal principalmente no córtex (CX) e no hipocampo (HC) cerebrais e no gânglio espiral coclear. Na meningite pneumocócica, observam-se áreas corticais com evidência morfológica de necrose neuronal aguda, sendo a apoptose a forma predominante de lesão neuronal no HC (Meli D, Christen S, Leib S, Tauber M: Current concepts in the pathogenesis of meningitis caused by Streptococcus pneumoniae. Curr Opin Infect Dis 2002, 15(3):253-257). A resposta inflamatória à infecção determina o resultado clínico da MB. A cascata de eventos inflamatórios que dirige a patogênese da MB é iniciada pela presença da bactéria no líquor. Componentes bacterianos estimulam a produção e liberação, pelas células endoteliais, astrócitos e microglia, de mediadores inflamatórios que podem lesar diretamente o tecido cerebral, interagir com outros moduladores da reação inflamatória, ou, ainda, induzir mecanismos secundários capazes de causar lesões cerebrais (Koedel U, Pfister H: Oxidative stress in bacterial meningitis. Brain Pathol 1999, 9{1):57-67). Outra característica marcante da MB é o aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica comprometendo a homeostase no microambiente neuronal.

[0009] A maior parte dos dados sobre a patofisiologia das MB foram obtidos com estudos empregando modelos experimentais de meningite pneumocócica. Pouco se sabe sobre a patofisiologia da meningite meningocócica. Se por um lado, é razoável fazerem-se algumas extrapolações a partir de resultados de estudos da doença pneumocócica, as diferenças nas taxas de mortalidade e morbidade entre as meningites pneumocócica e meningocócica permanecem inexplicadas.

[0010] O processo inflamatório observado em pacientes com MA por enterovírus é bem menos conhecido do que no caso das MB. Sabe-se que a resposta inflamatória é deflagrada pela penetração dos vírus no sistema nervoso central (SNC) principalmente por disseminação hematogênica a partir de sítios de infecção primária (Tunkel A, Wispelwey B, Scheld W: Pathogenesis and pathophysiology of meningitis. Infect Dis Clin North Am 1990, 4(4):555- 581). A presença dos vírus no SNC induz a produção/liberação de citocinas pró-inflamatórias que promovem a infiltração de leucócitos na área infectada (Sato M, Hosoya M, Honzumi K, Watanabe M, ninomiya N, Shigeta S, Suzuki H: Cytokine and cellular inflammatory response in enteroviral meningitis. Pediatrics 2003, 112(5): 1103-1107).

[0011] O manejo das MAs causadas por enterovírus se faz com terapias de suporte para controle dos sintomas já que não há nenhuma droga licenciada para uso clínico que seja eficaz contra esses patógenos. Diferentemente, o tratamento das MB se faz com antibióticos associados ou não a anti- inflamatórios. Atrasos na administração dos antibióticos e anti-inflamatórios podem ter consequências devastadoras para o paciente com MB (desenvolvimento de sequelas neurossensoriais e até a morte). Quando há qualquer suspeita de MB, inicia-se a antibioticoterapia empírica até obtenção dos resultados dos exames de cultura do líquor.

[0012] Assim, o diagnóstico diferencial rápido de MA e MB poderia reduzir o tempo de hospitalização dos pacientes com MA, os custos do tratamento, a exposição dos pacientes ao risco de infecções nosocomiais e os efeitos indesejáveis do uso de antibióticos e anti-inflamàtórios. Portanto, o diagnóstico preciso e rápido das meningites é fundamental para a tomada de decisão pela abordagem terapêutica adequada e em tempo hábil para cada forma de meningite.

Diagnóstico das meningites

[0013] Atualmente, MA e MB são diagnosticadas com base em achados clínicos e laboratoriais, em que o exame do líquor é essencial para confirmar o diagnóstico de meningite baseado nos sinais clínicos. Os principais parâmetros citoquímicos do líquor atualmente utilizados no diagnóstico diferencial desses dois tipos de meningite são a contagem global e diferencial de leucócitos, e os níveis de proteínas totais e de glicose.

[0014] Estes parâmetros norteiam a decisão do médico para iniciar o tratamento empírico até que se tenha o diagnóstico definitivo com base no resultado da cultura bacteriana ou da pesquisa de antígenos dos patógenos. No entanto, a diferenciação entre MB e MA pode ser dificultada pela variabilidade dos parâmetros atualmente utilizados para o diagnóstico destas doenças (Negrini B, Kelleher K, Wald E. Cerebrospinal fluid findings in aseptic versus bacterial meningitis. Pediatrics 2000, 105(2):316-319). [0015] Atualmente, têm sido propostos modelos multiparamétricos baseados em combinações de parâmetros clínicos e taboraíoriats para definição de diagnóstico clínico da meningite (Nigrovic LE, Kuppermann N, al!ey R. Development and valtdatíon of a multivariable predictive model to distingui sh bactéria! from aseptic meningitis in chiidren in the post-Haemophílus influenzae era. Pedíatrics. 2002,110(4):712-9; Jaeger F, teroy J, Duchêne F, Baty V, Baii!et S, Estavoyer JM, et ai. Validation of a diagnosis model for differentiating bacteríat from virai meningitis in ínfants and chiidren under 3.5 years of age. Eur J Çlin Microbiol Infect Dis. 2000; 19(6):418-21). Nenhum critério clínico ou laboratoriaí considerado independentemente é capaz de diferenciar a meningite bacteriana da meningite virai com alta sensibilidade e boa especificidade. Assim, várias equipes propuseram sistemas de pontuação que consideram combinações de parâmetros clínicos e laboratoriais para definirem-se regras de decisão clínica. Porém, estes sistemas de pontuação são dificilmente transponível s entre diferentes hospitais e a distribuição da pontuação obtida aparece dispersa devido à variabilidade da apresentação clínica das meningites.

[0016] A identificação do agente etiológico da meningite é fundamental para auxiliar na escolha da terapia apropriada e para o rastreamento epidemiológico regional da doença. A cultura do líquor é considerada padrão- ouro para o diagnóstico diferencial das meningites. No entanto, o resultado da cultura do líquor é demorado, o que obriga o uso de terapia empírica com antibióticos de largo espectro e, em alguns casos, a administração de antibióticos aos pacientes cuja etiologia se revela virai ao diagnóstico confirmatório. Esfregaços de iíquor corados com a coloração de Gram e o teste de aglutinação em látex também são utilizados como metodologias auxiliares

[0017] Os métodos de detecção dos patógenos por biologia molecular, apesar da alta especificidade, têm sua sensibilidade afetada pela antibioticoterapia, podem produzir resultados falso-positivos devido a resquícios de ácidos nucleicos dos patógenos presentes no líquido cefalorraquidiano após a cura do paciente e dificilmente se aplicam a laboratórios hospitalares desprovidos de pessoal treinado e infraestrutura adequada. No Brasil, tais métodos têm sido usados apenas para o diagnóstico confirmatório e estudos epidemiológicos.

[0018] Devido à dificuldade de se distinguirem pacientes com MB daqueles com MA durante o atendimento de urgência, a maior parte dos autores recomenda a instauração de terapia antimicrobiana em todos os pacientes com meningite aguda desde que haja qualquer dúvida quanto à etiologia da doença até que se obtenham os resultados das culturas bacterianas do líquor ou da identificação de antígenos que confirmem a presença do patógeno (Tunkel A, Hartman B, Kaplan S, Kaufman B, Roos K, Scheld W, Whitley R: Practice guidelines for the management of bacterial meningitis. Clin Infect Dis 2004, 39:1267-1284). Se, por um lado, esta recomendação permite tratarem-se, em tempo hábil, a maioria dos casos de MB, ela tem por consequência a hospitalização e o uso empírico de antibióticos de maneira quase sistemática, mas inútil a posteriori, dos pacientes com MA (Swingler G, Delport S, Hussey G: An audit of the use of antibiotics in presumed virai meningitis in children. Pediatr Infect Dis J 1994, 13:1107-1110), o que aumenta o risco de infecções nosocomiais e efeitos indesejáveis associados ao uso de antibióticos, além de aumentar consideravelmente o custo do tratamento (Parasuraman T, Frenia K, Romero J: Enteroviral meningitis. Cost of illness and considerations for the economic evaluation of potential therapies. Pharmacoeconomics 2001 , 19(1):3-12). Além disso, a terapia adjuvante com anti-inflamatório (dexametasona), preconizada em alguns casos de MB pode agravar o quadro de pacientes com meningite virai.

[0019] O cenário apresentado deixa claro que o diagnóstico diferencial rápido e acurado das meningites é, atualmente, uma demanda técnica não atendida pelas abordagens tecnológicas disponíveis, motivada tanto pela necessidade de melhoria na eficácia do manejo dos pacientes, quanto pela possibilidade de redução de custos no tratamento.

[0020] A comunidade científica tem realizado pesquisas para identificação de novos biomarcadores para o diagnóstico das meningites, como, por exemplo, a avaliação do potencial de citocinas e quimiocinas como marcadores para o diagnóstico diferencial entre as meningites bacterianas e virais e de prognóstico da doença. Entretanto, frequentemente a avaliação destes biomarcadores no seu potencial diagnóstico difere entre os trabalhos, gerando resultados contraditórios. Na maioria dos estudos até hoje realizados, a concentração de algumas citocinas pró-inflamatórias está consideravelmente aumentada no líquor ou soro de pacientes com meningite bacteriana em comparação com a meningite virai. Entretanto, a avaliação como marcador diagnóstico de cada citocina difere entre os trabalhos. Por exemplo, Vázquez e colaboradores (Vázquez JA, Adducci MeC, Coll C, Godoy Monzon D, Iserson KV. Acute meningitis prognosis using cerebrospinal fluid interleukin-6 leveis. J Emerg Med. 2012;43(2):322-7.) demonstraram que a IL-6 é um bom marcador para diagnóstico e prognóstico da meningite bacteriana, sendo que concentrações desta interleucina acima de 35-40 pg/mL seriam capazes de diferenciar esta doença da meningite virai ou de indivíduos saudáveis com sensibilidade de 100% e especificidade de 95%. Todavia, outros autores consideraram que a IL-6 não deve ser utilizada como marcador diferencial das meningites, devido a sobreposições das faixas de concentrações desta interleucina nos grupos de pacientes com meningite bacteriana, virai ou sem meningite (Pinto Júnior VL, Rebelo MC, Gomes RN, Assis EF, Castro-Faria- Neto HC, Bóia MN. IL-6 and IL-8 in cerebrospinal fluid from patients with aseptic meningitis and bacterial meningitis: their potential role as a marker for differential diagnosis. Braz J Infect Dis. 2011;15(2):156-8., e Mukai AO, Krebs VL, Bertoli CJ, Okay TS. TNF-alpha and IL-6 in the diagnosis of bacterial and aseptic meningitis in children. Pediatr Neurol. 2006,34(1 ):25-9.). Por exemplo, alguns pacientes com meningite meningococica apresentaram concentrações de IL-6 menores que 20 pg/mL, enquanto alguns pacientes com meningite virai apresentaram concentrações de IL-6 superiores a 50 pg/mL (Mukai AO e colaboradores). Estes resultados contrariam o ponto de corte proposto por Vázquez e colaboradores para distinção dos casos com meningite bacteriana a partir da dosagem de IL-6.

[0021] O potencial diagnóstico de alguns dos biomarcadores que compõem o método preditivo qualitativo proposto pela presente invenção já foi apontado pelo estado da técnica. Foram relatadas altas concentrações da f ração C3 do complemento no líquor de pacientes com meningite bacteriana em comparação a pacientes com meningite virai e controles sem infecção no SNC (Stahel P, Nadal D, Pfister H, Paradisis p, Barnum S. Complement C3 and factor B cerebrospinal fluid concentrations in bacterial and aseptic meningitis. The Lancet 1997, 349: 1886-1887; GoonetiHeke U, Scarborough M, Ward S, Hussain S, Kadioglu A, Gordon S. Death is associated with complement C3 depletion in cerebrospinal fluid of patients with pneumococcal meningitis. mBio 2012, 3(2): e00272-11 ). Aiém disto, a patente US 5.778.895 provê um método para o diagnóstico diferencial de meningite bacteriana, baseado na medida dos níveis das frações C3 e B do complemento no líquido cefalorraquidiano de pacientes.

[0022] Diversos estudos demonstram também a existência de níveis aumentados da proteína C-reativa no líquor e soro de pacientes com meningite bacteriana em comparação com pacientes com meningite virai ou indivíduos controles (Nathan BR, Scheld WM. The potential roles of C-reactive protein and procalcitonin concentrations in the serum and cerebrospinal fluid in the diagnosis of bacterial meningitis. Curr Clin Top Infect Dis. 2002;22:155-65; Donald PR, Strachan AF, Schoeman JF, De Beer FC. Cerebrospinal fluid C- reactive protein in infective meningitis in childhood. J Lab Clin Med. 1985;106(4):424-7; BenGershôm E, Briggeman- ol GJ, de Zegher F. Cerebrospinal fluid C-reactive protein in meningitis: diagnostic value and pathophysiology. Eur J Pediatr. 1986;145(4):246-9; Pemde HK, Harish K, Thawrani YP, Shrivastava S, Belapurkar KM. C-reactive protein in childhood meningitides. Indian J Pediatr. 1996;63(1 ):73-7).

[0023] Além disto, a literatura científica revela que a concentração de Apolipoproteína A-l no líquido cérebro-espinhal de pacientes com meningite mostrou-se aumentada na fase aguda da doença, retornando a concentrações basais na fase convalescente, enquanto o nível da proteína em outras doenças neurológicas permaneceu inalterado em relação ao grupo de pacientes controles (Apo A-l and apo E concentrations in cerebrospinal fluids of patients with acute meningitis. Ann Clin Biochem. 1998 May; 35 (Pt 3):408-14).

[0024] Entretanto, como observado pelo estado da arte de conhecimento dos inventores, não há indicação do uso de marcadores proteicos para diferenciação entre as formas da doença. Portanto, o estado da arte é deficiente na falta de meios precisos e eficientes para o diagnóstico diferencial das meningites virai, pneumocócica e meningocócica.

[0025] A invenção, que será descrita mais adiante em detalhes, fornece uma solução completa e sistematizada para o diagnóstico das meningites e determinação de sua etiologia, em um único teste. Mais especificamente, a invenção aqui apresentada revela um método preditivo qualitativo baseado na detecção combinada e análise sequencial da presença/ausência de pelo menos três entre quatro biomarcadores específicos, sendo capaz de diferenciar os pacientes que apresentam meningite virai daqueles que apresentam meningite bacteriana, determinandò ainda a etiologia da meningite bacteriana, se pneumocócica ou meningocócica.

Sumário da invenção

[0026] A presente invenção e refere a um método preditivo qualitativo, método e kit aplicados ao diagnóstico diferencial precoce das formas mais prevalentes de meningites bacterianas e virais, possibilitando detectar e distinguir rapidamente as diversas formas de meningite, o que é um pré- requisito para a aplicação, em tempo hábil, da abordagem terapêutica adequada capaz de reduzir a mortalidade e morbidade associadas às formas malignas desta doença.

[0027] De uma forma geral, a metodologia da presente invenção emprega um método preditivo qualitativo baseado na detecção combinada e análise sequencial de biomarcadores específicos, representados por proteínas da resposta inflamatória do hospedeiro humano presentes no líquido cefalorraquidiano. A aplicação do método preditivo permite diferenciar os pacientes que apresentam meningite virai daqueles que apresentam meningite bacteriana, determinando ainda a etiologia da meningite bacteriana, se pneumocócica ou meningocócica.

[0028] O método preditivo qualitativo foi desenvolvido com base na realização de estudos de proteômica - por eletroforese bidimensional (2D- PAGE) e espectrometria de massas (MS) - do líquor de pacientes com meningite. A comparação dos perfis proteicos do líquor nos grupos "meningite virai", "meningite meningocócica", "meningite pneumocócica" e "controle" foi realizada por meio da análise das diferenças qualitativas entre estes perfis. Para cada etiologia de meningite e para o grupo de indivíduos controle foram formados os respectivos subconjuntos interseção, compostos por spots gerados na eletroforese bidimensional presentes em todas as amostras de um dado grupo, e conjuntos união, compostos pelos spots observados em pelo menos uma amostra de um dado grupo. A comparação dos subconjuntos interseção do grupo de pacientes com cada etiologia de meningite estudada com os conjuntos união dos grupos de pacientes com as outras etiologias de meningite ou de indivíduos controles resultou em spots distintivos que foram encontrados apenas no subconjunto interseção de cada etiologia de meningite. O trabalho comparativo foi possível através da composição de uma matriz de presença (1), ou ausência (0), de todas as proteínas identificadas por espectrometria de massas em cada grupo de meningite ou controle, Nesta matriz, as proteínas foram ciassificadas como ^* presentes ou ausentes para cada subconjunto interseção e conjunto união das etiologias de meningite ou controles. Esta matriz permitiu, em última instância, a seleção das proteínas distintivas que foram se!ecionados para composição do painel de biomarcadores do método preditivo qualitativo, a saber, apoiipoproteína A-l, fração C3 do complemento, proteína C-reativa e cininogênio.

[0029] O método preditivo qualitativo é baseado na detecção combinada e análise sequencia! da presença/ausência de pelo menos três dos quatro biomarcadores seiecionados, permitindo diferenciar os pacientes que apresentam meningite virai daqueles que apresentam meningite bacteriana, determinando ainda a etiologia da meningite bacteriana, se pneumocócica ou meningocócica,

{0030] O método preditivo qualitativo é constituído por três nós, sendo cada um dos nós relacionado ao teste para detecção de pelo menos um dos quatro biomarcadores proteicos específicos. O primeiro nó, representado peio teste da presença de Apoiipoproteína A-l, permite a distinção entre grupo de pacientes acometidos por meningite, de pacientes sem infecção no sistema nervoso centra! ou acometidos por meningite virai. O segundo nó do método preditivo qualitativo, representado pelo teste da presença de Proteína C~reativa e/ou de Fração C~3 do complemento, permite a distinção entre grupo de pacientes acometidos por meningite bacteriana, de pacientes acometidos por meningite virai O terceiro nó do método preditivo, representado pelo teste da presença de Cininogênio, permite a distinção entre grupo de pacientes acometidos por meningite meningocócica, de pacientes acometidos por meningite pneumocócica.

{00311 A presente invenção apresenta ainda um método para o diagnóstico diferencial de meningites, que compreende a detecção, através de imunoensaio, dos biomarcadores apoiipoproteína A-l; proteína C-reativa e/ou fração C-3 do complemento no líquor de pacientes com suspeita de meningite e a análise sequencial dos resultados, de acordo com o primeiro, segundo e terceiro nós do método preditivo qualitativo. Após a análise do terceiro nó, o laboratorista será capaz de emitir o diagnóstico de presença e etiologia da meningite, segundo as causas mais prevalentes: meningite virai, meningite meningocócica e meningite pneumocócica.

[0032] O método da presente invenção, baseado na detecção combinada e análise sequencial da presença/ausência de biomarcadores específicos, pode ainda ser incorporado em um kit diagnóstico de imunoensaio que contenha ligantes às proteínas biomarcadoras, como anticorpos ou aptâmeros, adaptados a um método de avaliação laboratorial que pode incluir o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), cromatografia, turbidimetria, eletroforese capilar, entre outros.

[0033] Os referidos ligantes às proteínas biomarcadoras poderão ser representados por anticorpos exibindo como características:

- anticorpos primários do tipo IgG ou Ig com afinidade específica contra epítopos de cada um dos quatro biomarcadores e produzido em coelhos, cabras, dentre outros animais; e

- anticorpos secundários do tipo IgG com afinidade específica contra epítopos das cadeias pesadas de IgG ou IgM de coelhos, cabras, ou outros animais, segundo a origem e o tipo do anticorpo primário utilizado.

[0034] Os anticorpos primários ou secundários são conjugados a enzima, ou biotina, ou fluoróforo. Para detecção do sinal quando se utilizam anticorpos ligados a enzima, usa-se substrato que muda de cor após ser modificado pela enzima; para anticorpos ligados à biotina, usa-se esptreptavidina conjugada a enzima e substrato para produção de cor; no caso de anticorpos ligados a fluoróforos, a detecção se faz pela luz emitida em resposta a excitação em comprimento de onda adequado.

[0035] Também pode-se usar anticorpos primários ou secundários acoplado a partículas d© ouro, ou de fátex para detecção visual do resultado.

[0036] Alternativamente, os referidos lígantes ás proteínas biomarcadoras poderão ser representados por apíâmeros, por exemplo, de oligonucleotídeos de DNA fita simples que, em condições de pH, salinidade e temperatura fisiológicos se enovelam assumindo conformações tridimensionais que apresentam sítios de ligação por complementariedade com regiões da estrutura terciária de cada um dos quatro biomarcadores, A detecção dos apíâmeros ligados aos biomarcadores pode ser feita com base na mudança de suas propriedades de migração à eietroforese capiiar, ou pode-se acoplar biotina ou ainda ffuorocromos aos apíâmeros para detecção como descrito acima para os anticorpos.

[0037J Como a presente invenção se baseia na identificação de proteínas da resposta imune do hospedeiro e não de proteínas do patógeno, ainda que haja erradicação do patógeno, a reação inflamatória do hospedeiro se mantém no curso da doença, aumentando a janela temporal para o diagnóstico diferencial da meningite através da detecção de biomarcadores da resposta imune, o que representa outra vantagem associada à tecnologia. Além disso, eventuais resquícios de ácidos nucléicos dos patôgenos presentes no líquido cefalonraquidíano após a cura do paciente que podem causar resultados falsos positivos nos métodos de biologia molecular não afeiam com os resultados da presente invenção.

|0038] O emprego do método prediíivo, método e kit aqui descritos podem contribuir decisivamente para o diagnóstico rápido da presença e etiologia da meningite no início do curso da doença em um paciente, permitindo a tomada de decisão consciente sobre a terapêutica adequada, evitando a internação e antibioticoterapia indiscriminadas, além da redução nos custos do tratamento.

Breve descrição das figuras

[0039] Figura 1 ; Diagrama de Venn para a distribuição de spots do subconjunto interseçâo de meningite pneumococica. A figura revela os dois spots únicos do subconjunto interseçâo do grupo de pacientes com meningite pneumococica após as análises comparativas entre o subconjunto interseçâo de meningite pneumococica e os conjuntos união com as outras etiologias de meningite e do grupo controle.

[0040] Figura 2: Diagrama de Venn para a distribuição de spots do subconjunto interseçâo de meningite meningocócica. A figura revela os cinco spots únicos do subconjunto interseçâo do grupo de pacientes com meningite meningocócica após as análises comparativas entre o subconjunto interseçâo de meningite meningocócica e os conjuntos união com as outras etiologias de meningite e do grupo controle.

[0041] Figura 3: Diagrama de Venn para a distribuição de spots do subconjunto interseçâo de meningite virai. A figura revela os quatro spots únicos do subconjunto interseçâo do grupo de pacientes com meningite virai após as análises comparativas entre o subconjunto interseçâo de meningite virai e os conjuntos união com as outras etiologias de meningite e do grupo controle.

[0042] Figura 4: Modelo preditivo qualitativo de biomarcadores proteicos da meningite. A figura retrata a estrutura do modelo preditivo qualitativo, identificando os biomarcadores empregados e seus três nós de análise, que representam a forma sequencial para leitura da detecção dos biomarcadores.

[0043] Figura 5: Previsão da localização celular das proteínas identificadas que compõem os conjuntos união e subconjuntos interseçâo da meningite. A) previsão de localização celular das proteínas que compõem os conjuntos união das meningites (n = 131); B) previsão de localização celular das proteínas que compõem os subconjuntos interseçâo das meningites (n = 37).

Descrição detalhada da invenção

[0044] A presente invenção se refere a um método preditivo qualitativo, método e kit aplicados ao diagnóstico diferencial precoce das formas mais prevalentes de meningites bacterianas e virais, possibilitando detectar e distinguir as diversas formas de meningite na fase inicia! da doença. De forma geral, a metodologia da invenção emprega um método preditivo baseado na detecção combinada e análise sequenciai de pelo menos três dentre quatro biomarcadores específicos, representados por proteínas da resposta inflamatória do hospedeiro humano presentes no líquido cefalorraquidiano. A aplicação do método preditivo permite diferenciar os pacientes que apresentam meningite vira! daqueles que apresentam meningite bacteriana, determinando ainda a etiologia da meningite bacteriana, se pneumocócica ou meningocócica.

[0045] Os quatro biomarcadores empregados no método preditivo qualitativo incluem: Apolipoproteína A-l, Proteína C-reativa, Fração C-3 do complemento e Cininogênio.

[0046] O método preditivo qualitativo é constituído por três nós, sendo cada um dos nós relacionado ao teste de pelo menos um dos quatro! biomarcadores proteicos específicos, O primeiro nó, representado pelo teste da presença de Apolipoproteína A~l, permite a distinção entre grupo de pacientes acometidos por meningite, de pacientes sem infecção no sistema nervoso central ou acometidos por meningite virai. O segundo nó do método preditivo qualitativo, representado pelo teste da presença de Proteína C-reativa e/ou de Fração C-3 do complemento, permite a distinção entre grupo de pacientes acometidos por meningite bacteriana, de pacientes acometidos por meningite viraí. O terceiro nó do método preditivo, representado peio teste da presença de Cininogênio, permite a distinção entre grupo de pacientes acometidos por meningite meningocócica, de pacientes acometidos por meningite pneumocócica.

[0047] Mais especificamente, a positividade em relação à proteína Apolipoproteína A-l indica a condição "meningite", enquanto o resultado negativo no primeiro nó do método preditivo qualitativo indica "ausência de infecção no sistema nervoso centra!" ou "meningite virai". Com relação ao segundo nó do método preditivo qualitativo, a positividade em relação às proteínas fração C-3 do complemento e/ou proteína C-reativa, combinada com o resultado positivo no primeiro nó, indica a condição "meningite bacteriana", enquanto a negatividade em relação à fração C-3 do complemento e/ou proteína C-reativa, combinada com o resultado positivo no primeiro nó, indica a presença de meningite virai. No que diz respeito ao terceiro nó do método preditivo qualitativo, a positividade da proteína cininogênio, combinada com a positividade no primeiro e segundo nós, indica a condição "meningite meningocócica", enquanto o resultado negativo na análise do terceiro nó, combinado com a positividade no primeiro e segundo nós, indica a condição "meningite pneumocócica".

[0048] Desta forma, a emissão do diagnóstico sobre a presença e etiologia da meningite deve se basear nos seguintes parâmetros:

(1) Meningite virai: resultado negativo no primeiro nó do método preditivo, combinado com resultado negativo no segundo nó do método preditivo; ou, resultado positivo no primeiro nó do método preditivo, combinado com resultado negativo no segundo nó do método preditivo.

(2) Meningite bacteriana, sem determinação da etiologia: resultado positivo no segundo nó do método preditivo, combinado com resultado positivo no primeiro nó do método preditivo.

(3) Meningite meningocócica: resultado positivo no terceiro nó do método preditivo, combinado com resultados positivos no primeiro e segundo nós do método preditivo.

(4) Meningite pneumocócica: resultado negativo no terceiro nó do método preditivo, combinado com resultado positivo no primeiro e segundo nós do método preditivo.

[0049] O método para o diagnóstico diferencial de meningites compreende as seguintes etapas: (a) Incubação do líquor de paciente com ligantes específicos para as proteínas apolipoproteína A-l; proteína C-reativa e/ou fração C-3 do complemento; cininogenio;

(b) Detecção combinada das proteínas apolipoproteína A-l; proteína C- reativa e/ou fração C-3 do complemento; cininogênio no líquor de paciente através de um imunoensaio;

(c) Determinação dos resultados empregando o método preditivo qualitativo, por meio da análise sequencial do primeiro, segundo e terceiro nós, em que:

(i) resultado negativo no primeiro nó do método preditivo, combinado com resultado negativo no segundo nó do método preditivo; ou, resultado positivo no primeiro nó do método preditivo, combinado com resultado negativo no segundo nó do método preditivo indica a condição "meningite virai";

(ii) resultado positivo no segundo nó do método preditivo, combinado com resultado positivo no primeiro nó do método preditivo indica a condição "meningite bacteriana";

(iii) resultado positivo no terceiro nó do método preditivo, combinado com resultados positivos no primeiro e segundo nós do método preditivo indica a condição "meningite meningocócica";

(iv) resultado negativo no terceiro nó do método preditivo, combinado com resultado positivo no primeiro e segundo nós do método preditivo indica a condição "meningite pneumocócica".

[0050] O método da presente invenção, baseado na detecção combinada e análise sequencial da presença/ausência de biomarcadores específicos, pode ser incorporado em um kit diagnóstico de imunoensaio que contenha ligantes às proteínas biomarcadoras, como anticorpos ou aptâmeros, adaptados a um método de avaliação laboratorial que pode incluir o ELISA (Enzyme Linked lmmunosorbent Assay), cromatografia, turbidimetria, eletroforese capilar, entre outros.

{0051] De modo que a matéria na qua! as características acima citadas, vantagens e objetivos da invenção, bem como outras que se tornarão ciaras, sejam atingidas e possam ser compreendidos em detalhe, descrições mais partscuíares da invenção estão ilustradas nos Exemplos a seguir. Porém, os Exemplos ilustram realizações prefendas da invenção e, portanto, não são para ser considerados como limitativos no seu escopo.

Exemplo 1

Casuística

[0052] Para a análise comparativa do proteoma de líquor utilizando géis bidimensionais foram selecionados 18 pacientes com meningite pneumocócica, meningite meningocócica ou meningite virai e seis indivíduos controles (Tabela 1 ), todos submetidos à punção liquóríca lombar. Imediatamente após a colheita do líquor, as amostras foram centrifugadas para separação de células e os sobrenadantes foram congelados a -20°C e, posteriormente, a -80°C até serem analisados.

Tabela 1: Caracterização da população estudada

DADOS SOCIO-

DADOS CLINICO-LABORATORIAIS DEMOGRÁFICOS

Onde: MP: Meningite pneu ocócica; MM: Meningite meningocócica; MV: Meningite virai; CTRL: Controle; H. IJPIl: Hospital Infantil João Pauto II; H.GT: Hospital Giselda Trigueiro; a: anos; m: meses; M: masculino; F: feminino; (+): positivo; (-): negativo; N/A: ignorado; Gram: bacterioscopia por Gram; Leucócitos {células/mm3); Proteínas e Glicose: mg/dL; dados de cultura, Gram e látex: no líquor.

[0053] Foram analisados adicionalmente os resultados de exames dos parâmetros citoquímicos do líquor, a saber: contagem total e diferencial de leucócitos, proteínas totais e glicose, do grupo de pacientes que compõem este estudo para comparação com dados pré-estabelecidos na literatura científica. Os resultados destes testes foram coletados a partir da revisão dos prontuários dos pacientes,

[0054] O diagnóstico confirmatório das meningites bacterianas se deu pela detecção dos patógenos no líquor, ou no sangue, por um ou mais dos seguintes testes, cultura, bacterioscopia por Gram, ou aglutinação em látex. O diagnóstico de meningite virai foi feito por exclusão das formas bacterianas de meningite quando havia quadro clínico de meningite com resultados de cultura, bacterioscopia por Gram e aglutinação de látex negativos, mas com contagem de leucócitos levemente aumentada (> 50 células), níveis de proteínas podendo estar levemente aumentados, ou normais (normal: 15 a 45mg/dL) e glicose normal ou levemente diminuída (normal: 60mg/dL). O grupo controle foi formado por indivíduos sem infecção no SNC, infecções sistémicas, doenças psiquiátricas ou neurodegenerativas atendidos por suspeita de meningite, mas cuja doença foi descartada pelo diagnóstico confirmatório e pelos valores de parâmetros citoquímicos normais.

[0055] A avaliação do parâmetro contagem total de leucócitos demonstrou diferenças significativas entre os pacientes com meningites bacterianas em comparação àqueles com meningite virai ou controles e entre estes dois últimos. Os valores de mediana da contagem de leucócitos no líquor encontrados para pacientes com meningite pneumocócica (MP) e meningite meningocócica (MM) (MP: 1.199 células/mm3 e MM: 4.680 células/mm3) foram significativamente superiores aos encontrados para pacientes com meningite virai (MV) e controles (CTRL) (MV: 44,5 células/mm3 e CTRL: 2 células/mm3). Entretanto, foram observadas sobreposições dos valores de leucócitos, por exemplo, entre os pacientes com meningite meningocócica e meningite virai, o que inviabiliza a discriminação entre estes pacientes.

[0056] A concentração de proteínas no líquor é considerada um dos indicadores mais sensíveis de patologias no SNC. Os resultados demonstraram diferenças significativas entre os pacientes com meningite bacteriana ( P: 260,5mg/dl_ e MM: 194,5mg/dL) em relação àqueles com meningite virai (MV: 31 ,5mg/dl_) ou controles (CTRL: 25mg/dL) (p < 0.01 ), mas não entre esses dois últimos, tendo em vista que ambos apresentaram valores de concentração de proteína dentro dos valores normais (18 a 58mg/dL). Apesar dos níveis de proteínas totais no líquor de indivíduos normais serem levemente distintos dos observados em pacientes com meningite virai, o valor de mediana destes últimos está incluído no intervalo considerado normal. Também foram observadas sobreposições dos valores de proteínas totais entre os pacientes com meningite pneumocócica e meningite meningocócica, o que inviabiliza a discriminação entre estes pacientes.

[0057] As análises realizadas para os parâmetros contagem diferencial de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e glicose total no líquor não revelaram diferença estatisticamente significativa entre os grupos investigados. Os valores de mediana encontrados para contagem diferencial de leucócitos PMN em pacientes com meningite bacteriana (MP: 91% e MM: 94%) foram superiores àqueles encontrados em pacientes com meningite virai (MV: 43%) e controles (CTRL: 54%), mas as diferenças não foram estatisticamente significativas (p > 0.05). Os valores de mediana para glicose no líquor encontrados para pacientes com meningite pneumocócica (22,5 mg/dL) foram inferiores aos encontrados para pacientes com meningite meningocócica (41 mg/dL). Todos os pacientes com meningite virai e controles apresentaram concentração de glicose dentro dos valores normais (> 40 mg/dL).

[0058] Portanto, nesta pequena casuística nenhum dos parâmetros citoquímicos clássicos, quando analisados isoladamente, mostrou-se suficientemente sensível e específico para o diagnóstico diferencial das meningites pneumocócica, meningocócica ou virai.

Exemplo 2

Processamento das amostras

[0059] O líquor contém pequenas moléculas, sais, peptídeos, proteínas e enzimas que desempenham papéis críticos em diversos processos fisiológicos. Para se aperfeiçoar a resolução da eletroforese bidimensional é necessária a remoção da maior parte do conteúdo salino do líquor a fim de eliminar possíveis interferentes.

[0060] Amostras de líquor em estado bruto de pacientes com meningite virai e controles apresentaram concentração proteica muito inferior às concentrações proteicas das amostras de líquor de pacientes com meningite bacteriana. É importante ressaltar que, do conteúdo proteico total do líquor, mais de 50% corresponde à albumina e 15% ou mais, às imunoglobulinas. Por conseguinte, a depleção das proteínas abundantes é essencial para a detecção de proteínas menos representativas no líquor. Para obtenção de quantidade de proteína suficiente para as etapas posteriores do método da presente invenção, o dobro do volume de líquor em estado bruto foi utilizado para amostras de pacientes com meningite virai e controles em comparação com pacientes com meningites bacterianas.

[0061] Seis amostras de cada etiologia (meningite pneumocócica, meningocócica, ou virai) e seis amostras de indivíduos controles foram concentradas entre 30 a 35 vezes para amostras bacterianas e entre 40 a 45 vezes para amostras virais e controles por precipitação com acetona. Albumina e imunoglobulinas foram depletadas utilizando colunas preparadas com uma mistura de anti-HSA Sepharose e proteína G Sepharose de alto desempenho. Em seguida, as proteínas foram novamente precipitadas com acetona para concentração e dessalinizacão. Nessa etapa, todas as amostras foram concentradas aproximadamente 20 vezes. Os precipitados foram ressuspendidos em tampão de reidratação (IEF) e as concentrações proteicas foram determinadas pelo método de Bradford em estado bruto e após depleção, utilizando padrão com albumina bovina sérica. Para verificar a qualidade das amostras em estado bruto e verificar a eficiência da depleção de albumina e IgG as amostras foram separadas por eletroforese unidimensional em géis desnaturantes de poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE) e corados com nitrato de prata.

Exemplo 3

Separação das proteínas por eletroforese bidimensional

[0062] Foram confeccionados doze géis bidimensionais contendo 0,5 pg de proteínas do líquor (representando amostras de seis indivíduos e suas duplicatas técnicas) para cada etiologia de meningite estudada e grupo controle, totalizando 48 géis. A quantidade fixa de 0,5 pg de proteína foi preparada para focalização isoelétrica utilizando fitas de IPG de 7 cm, pH 3- 10NL no equipamento PROTEAN IEF Celi (BioRad, PA, EUA) a 20°C, 50 mA gel nas condições descritas a seguir: reidratação passiva por 4 horas, 20°C; Passo 1 : 50 V, 12 horas; Passo 2: 500 V, 30 minutos; Passo 3: 1.000 V, 30 minutos; Passo 4: 4.000 V, 1 hora; e Passo 5: 4.000 V, 16.000 V-hr. Após a realização de etapas de equilíbrio (redução e alquilação das proteínas), as fitas foram submetidas ao processo de separação das proteínas pela segunda dimensão, realizado por PAGE em gel 12% de poliacrilamida, e os géis foram corados com nitrato de prata.

[0063] As imagens dos géis 2DE de amostras de pacientes que formam os grupos com meningite pneumocócica, meningocócica, virai e controles foram analisadas com o programa PDQuest 7.3.0 (Bio-Rad, PA, EUA). As imagens digitalizadas dos géis bidimensionais foram utilizadas para a análise qualitativa do proteoma do líquor, isto é, a comparação dos perfis proteicos de líquor de pacientes com meningite pneumocócica, meningite meningocócica e meningite virai entre st, além da comparação entre estes últimos e os perfis proteicos obtidos de líquor de indivíduos controles.

[0064] Para cada etiologia de meningite e para o grupo de indivíduos controles foram formados os respectivos subconjuntos interseçáo compostos por spots presentes em todos os 12 géis bidimensionais contendo as amostras de seis indivíduos de um dado grupo e conjuntos união compostos pelos spots observados em peto menos um dos 12 géis bidimensionais com as amostras dos seis indivíduos de um dado grupo, conforme mostrado na Tabela 2.

Tabela 2: Número de spots que compõem os subconjuntos interseçáo e conjuntos união do líquor de pacientes com meningite e controles

MP MM MV CTRL

União (U) 170 105 75 121

Interseçáo (Π) 23 33 27 17

Onde: MP: meningite pneumocócica; MM: meningite meningocócica; MV:

meningite virai; CTRL: controle.

[0065] A comparação dos subconjuntos interseçáo do grupo de pacientes com cada etiologia de meningite estudada com os conjuntos união dos grupos de pacientes com as outras etiologias de meningite ou de indivíduos controles resultou em spots distintivos que foram encontrados apenas no subconjunto interseçáo de cada etiologia de meningite (Tabela 3).

Tabela 3; Spots definidos na análise comparativa entre as diferentes etiologias de meningite e grupo controle

CONJUNTOS UNIÃO

spots)

SUBCONJUNTOS

Comum Distintivo Comum Distintivo Comum Distintivo Comum Distintivo

INTERSEÇÁO MP (23 spots) 20 3 _ _ 19 4 15 8

MM {33 spots) 12 21 24 9 19 14

MV {27 spots) 20 7 16 11 16 11

Onde; MP: meningite pneumocócica; MM: meningite meningocócica; MV: meningite virai; CTRL: controle.

[0066] Os resultados das análises comparativas entre os spots do subconjunto interseção de pacientes com meningite pneumocócica e os spots dos conjuntos união dos grupos controle e das outras etiologias de meningite resultaram em spots únicos do subconjunto interseção dos pacientes com meningite pneumocócica _í conforme apresentado na Figura 1. Foram encontrados apenas dois spots únicos do subconjunto interseção do grupo de pacientes com meningite pneumocócica após as análises comparativas entre o subconjunto interseção de meningite pneumocócica e os conjuntos união com as outras etiologias de meningite e do grupo controle.

[0067] Os resultados das análises comparativas entre os spots do subconjunto interseção de pacientes com meningite meningocócica e os spots dos conjuntos união dos grupos controle e das outras etiologias de meningite resultaram em spots únicos do subconjunto interseção dos pacientes com meningite meningocócica, conforme apresentado na Figura 2. Foram encontrados cinco spots únicos do subconjunto interseção do grupo de pacientes com meningite meningocócica após as análises comparativas entre o subconjunto interseção de meningite meningocócica e os conjuntos união com as outras etiologias de meningite e do grupo controle.

[0068] Os resultados das análises comparativas entre os spots do subconjunto interseção de pacientes com meningite virai e os spots dos conjuntos união dos grupos controle e das outras etiologias de meningite resultaram em spots únicos do subconjunto interseção dos pacientes com meningite virai, conforme apresentado na Figura 3. Foram encontrados guatro spots únicos do subconjunto interseção do grupo de pacientes com meningite virai após as análises comparativas entre o subconjunto interseção de meningite virat e os conjuntos união com as outras etiologias de meningite e do grupo controle.

[0069] Sendo assim, os spots únicos encontrados nos subconjuntos interseção de cada etiologia de meningite foram priorizados para identificação por espectrometria de massas para posterior composição do método preditívo qualitativo das meningites.

Exemplo 4

Identificação das proteínas diferencialmente expressas por espectrometria de massa

[0070] A análise comparativa das imagens dos géis bidimensionais com proteínas do iíquor de pacientes com meningite e controles possibilitou a seleção de spots proteicos que correspondem a potenciais biomarcadores para cada etiologia de meningite.

[0071] Géis bidimensionais foram confeccionados com pools de três amostras de pacientes com meningite pneumocócica, ou meningite meningocócica, ou meningite virai, respectivamente. Para cada etiologia de meningite, três géis bidimensionais de pools de amostras foram feitos contendo 10, 40 e 100 g de proteína a fim de aumentar a probabilidade de sucesso na identificação de proteínas distintas com eventuais superposições no mapa proteômico. Todas as proteínas identificadas em cada gel produzido foram consideradas na presente invenção. Nessa etapa, os géis foram corados com Coomassie coloidal compatível com espectrometria de massas.

[0072] Dos 695 spots proteicos submetidos à espectrometria de massas, 553 (80%) foram identificados e correspondem a 131 proteínas diferentes. Destas, 37 proteínas correspondem a spots que pertencem aos subconjuntos interseção das meningites pneumocócica, meningocócica ou virai. Além dos spots pertencentes aos subconjuntos interseção do grupo de pacientes com meningite e ausentes nos conjuntos união das outras etiologias da doença ou de indivíduos controles, buscou-se a identificação de todos os spots dos conjuntos união de cada etiologia de meningite.

[0073] A maioria dos spots únicos dos subconjuntos interseção de cada etiologia de meningite foi descartada como potencial biomarcador, após a identificação por espectrometria de massas, por se tratar de spots cuja proteína identificada foi também encontrada em outros spots dos géis bidimensionais. A mesma proteína pode estar presente em mais de um spot possivelmente devido à ocorrência de modificações pós-traducionais, tais como carbonilação, fosforilação e metilação e a proteólise in vivo, via proteassoma e lisossoma.

[0074] Foi construída uma matriz de presença (1) ou ausência (0) composta pela lista de todas as proteínas correspondentes aos spots pertencentes aos subconjuntos interseção identificadas por espectrometria de massas (Tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6). Nesta matriz, as proteínas foram classificadas como presentes ou ausentes para cada subconjunto interseção e conjunto união das etiologias de meningite ou controles. Portanto, esta matriz permitiu a seleção dos cinco spots que, juntamente com os dois spots únicos pertencentes ao subconjunto interseção de meningite meningocócica, correspondem às quatro proteínas utilizadas para construção do método preditivo qualitativo para diagnóstico das meningites.

Tabela 4: Matriz dos spots do subconjunto interseção do grupo de pacientes com meningite pneumocócica

Spots Revisado após identificação proteica

Spot Proteína Π MM ri V U MM U MV UCtrl A n MM ri V UMM UMV UCtrl

P-1 α-2-HS-glicoproteína 0 0 0 0 1 112910 0 0 1 1 1 p.2 α-1-antitripsina 0 0 0 0 1 6137432 1 1 1 1 1 p.3 a-1-antitripsina 0 0 1 1 1 6137432 1 1 1 1 p.4 α-1-arititripsina 0 0 1 1 1 6137432 1 1 1 1 p.5 α-1-antitripsína 0 0 6137432 1 1 ρ.β α-1 H Tro 1 0 1 1 1 223069 1 0 1 0 1 7 α-1-antitripsina 0 0 1 1 1 6137432 1 1 1 1 1 p.8 Hemopexina 0 0 1 1 1 386789 1 1 1 1 1 p.9 Hemopexina 0 0 1 1 1 386789 1 1 1 1 1 p.10 Hemopexina 0 0 1 1 1 386789 1 1 1 1 1 p.11 Albumina 0 0 1 1 1 28592 1 0 1 1 1 p.12 não identificado 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 p.13 Transferrina 0 0 1 1 1 115394517 1 1 1 1 — 1 p.14 Transferrina 0 0 1 1 1 115394517 1 1 1 1 1 p.15 Transferrina 0 0 1 1 1 115394517 1 1 1 1 p.16 Componente C3 1 0 1 1 179665 1 0 1 0 1

P-17 Haptoglobína 0 0 1 1 1 306882 1 0 1 1 1 p.18 Haptoglobina 0 0 1 1 1 306882 1 0 1 1 1 p.19 Haptoglobina 0 0 1 1 1 306882 1 0 1 1 p.20 C-reativa 1 0 1 0 1 1942435 1 0 1 0 1 p.21 Apolipoproteína Al 1 0 1 1 0 90108664 1 0 1 1 0 p.22 Transtiretina 1 0 1 0 1 17942890 1 1 1 1 1 p.23 Transtiretína 0 0 0 0 0 17942890 1 1 1

Onde: D: subconjunto interseção; U: conjunto união; MM: meningite meningocócica; MV: meningite virai; Ctrl: controle.

Tabela 5: Matriz dos spots do subconjunto interseção do grupo de pacientes com meningite meningocócica

Spots Revisado após identificação proteica

Spot Proteína nMP n MV UMP UMV UCtrl gí ΠΜΡ ηινιν UMP UMV UCtrl m.1 Ceruloplasmina 0 0 1 0 1 1620909 0 0 0 1 1 m.2 α-1-B-Glicoproteína 0 0 1 0 0 69990 0 0 1 1 m.3 α-1-B-Glicoproteína 0 0 1 1 1 69990 0 0 1 1 1 m.4 Receptor de célula T cadeia β 0 0 1 0 0 78101492 0 0 1 1 0 m.5 Hemopexina 0 0 1 0 1 386789 1 1 1 1 1 m.6 Hemopexina 0 0 1 1 1 386789 1 1 1 1 1 m.7 Hemopexina 0 0 0 1 1 386789 1 1 1 1 1 m.8 Hemopexina 0 0 1 1 1 386789 1 1 1 1 m.9 Receptor de célula T cadeia β 1 1 1 1 0 78101492 1 1 1 1 0 m.10 Transferrina 1 1 1 1 1 115394517 1 1 1 1 1 m.11 Transferrina 1 1 1 1 0 115394517 1 1 1 1 1 m.12 Transferrina 1 1 1 1 1 115394517 1 1 1 1 1 m.13 Transferrina 1 1 1 1 1 115394517 1 1 1 1 1 m.14 Transferrina 1 0 1 0 0 115394517 1 1 1 1 1 m.15 o>1 antiquimiotripsina 1 0 1 0 1 177933 1 0 1 0 1 m.16 α-1-antitripsina 1 1 1 1 0 6137432 1 1 1 1 1 m.17 Cininogênio 0 0 0 0 0 4504893

m.18 Proteína ligadora de vitamina D 1 1 1 1 0 181482 1 1

rn.19 Proteína ligadora de vitamina D 1 0 1 0 0 181482 1 1 1 1 1 m.20 α-1-antitripsina 0 0 0 0 0 6137432 1 1 1 1 1 m.21 α-1-antitripsina 1 1 1 1 0 6137432 1 1 1 1 m.22 α-1-Glicoproteína ácida 0 0 0 0 0 112877 1 1 1 1 1 m.23 α-1-Glicoproteína ácida 1 0 1 0 0 112877 1 1 1 1 m.24 Haptoglobina 0 0 0 1 0 306882 1 0 1 1 m.25 Componente C3 0 0 0 0 0 179665 1 0 1 0 1 m.26 Ζη-α-2-glícoproteína 0 0 1 1 1 38026 0 1 1 1 m.27 Haptoglobina 1 0 1 1 0 306882 1 0 1 1 1 m.28 Haptoglobina 1 0 1 1 1 306882 1 0 1 1 1 m.29 C-reativa 0 0 1 0 0 1942435 0 0 1 0 1

m.30 Apolipoproteína A-l 0 0 0 0 0 90108664 1 0 1 1 0 m.31 Apolipoproteína A-l 1 0 1 1 0 90108664 1 0 1 1 0 m.32 Transtiretina 0 1 0 1 0 17942890 1 1 1 1 1 m.33 Transtiretina 0 1 0 1 0 17942890 1 1 1 1 1

Onde: Π: subconjunto interseção; U: conjunto união; MP: meningite pneumocócica; MV: meningite virai; Ctrl: controle. Tabela 6: Matriz dos spots do conjunto interseção do grupo de pacientes com meningite virai

Spots Revisado após identificação protei

Spot Proteína n MP n iviv U MP U MV U Ctrl n P n MV U MP U MV U Ct v.1 não identificado 0 0 0 0 0 - 0 0 0 0 0 v.2 não identificado 0 0 0 1 0 - 0 0 0 1 0 v.3 não identificado 0 0 0 0 0 - 0 0 0 0 0 v.4 não identificado 0 0 1 1 1 - 0 0 1 1 1 v.5 produto não nomeado 0 0 1 1 1 22761380 0 0 1 1 1 v.6 Hemopexina 0 0 1 1 1 386789 1 1 1 1 1 v.7 não identificado 0 0 1 1 1 - 0 0 1 1 1 v.8 Hemopexina 0 0 1 1 386789 1 1 1 1 1 v.9 produto não nomeado 0 0 1 1 1 22761380 0 0 1 1 1 v.10 Transferrina 0 0 1 1 110590597 1 1 1 1 1 v.11 Transferrina 0 0 1 1 1 110590597 1 1 1 1 1 v.12 Transferrina 0 0 1 1 1 110590597 1 1 1 1 1 v.13 Transferrina 0 0 1 1 1 110590597 1 1 1 1 1 v.14 não identificado 0 0 1 1 1 - 0 0 1 1 1 v.15 Transferrina 0 0 1 1 1 110590597 1 1 1 1 1 v.16 Transferrina 0 0 1 0 1 110590597 1 1 1 1 1 v.17 a-1 -antitripsina 0 0 1 1 177831 1 1 1 1 1 v.18 não identificado 0 0 1 0 1 - 0 0 0 0 1 v.19 Proteína ligadora de vitamina D 0 0 1 0 1 181482 1 1 1 1 1

v.20 Proteína ligadora de vitamina D 0 0 1 0 1 181482 1 1 1 1 1 v.21 α-1-Glicoproteína ácida 0 0 0 0 1 112877 1 1 1 1 1 v.22 Transtiretina 0 0 1 0 1 17942890 1 1 1 1 1 v.23 Transtiretina 0 0 0 1 1 17942890 1 1 1 1 1 v.24 Prostaglandina D sintase 0 0 0 0 1 283806778 0 0 0 1 1 v.25 Prostaglandina D sintase 0 0 0 0 0 283806778 0 0 0 1 1 v.26 não identificado 0 0 0 1 0 - 0 0 0 1 0 v.27 Transtiretina 0 0 0 0 0 17942890 1 1 1 1 1

Onde: Π: subconjunto interseção; U: conjunto união; MP: meningite pneumocócica; MV: meningite virai; Ctrl: controle

Exemplo 5

Seleção de candidatos a biomarcadores para o diagnóstico diferencial das meningites

[0075] Com base na análise das matrizes (Exemplo 4) de presença versus ausência, as quatro proteínas selecionadas foram combinadas para compor um método preditivo qualitativo capaz de diferenciar as meningites pneumocócica e meningocócica entre si e da meningite virai ou controles (Tabela 7 e Figura A).

Tabela 7: Matriz de presença/ ausência das proteínas selecionadas para composição do método preditivo qualitativo

DESCRIÇÃO gi n MP n MM n MV U MP U MM U MV U Ctrl

Apoiipoproteína Al 90108664 1 1 0 1 1 1 0

C-reativa 1942435 1 1 0 1 1 0 1

Componente C3 179665 1 1 0 1 1 0 0

Cininogênio 4504893 0 1 0 0 1 0 0

Onde: Π: subconjunto interseção; U: conjunto união; MP: meningite pneumocócica; MM: meningite meningocócica; MV: meningite virai; CTRL: controle.

[0076] A ausência da proteína apoiipoproteína A-l está associada às condições de ausência de infecção no SNC (grupo controle) ou meningite virai. Os spots correspondentes a apoiipoproteína A-l ocorrem no conjunto união do grupo de meningite virai, mas não no conjunto união do grupo controle, de modo que a ausência desta proteína pode indicar qualquer uma destas duas condições, e sua presença implica nas condições de meningite bacteriana ou virai. O spot correspondente à proteína c-reativa foi identificado no conjunto união do grupo controle, mas não no conjunto união do grupo de meningite vira!. Ainda que, isoladamente, a presença da proteína c-reativa possa indicar à condição controle, esta pode ser excluída pela presença da proteína apolipoproteína A-l. Sendo assim, utilizou-se o componente C3 do sistema complemento ou a c-reativa, uma vez que a ausência destas proteínas define a condição de meningite virai. O componente C3 do sistema do complemento caracteriza a condição de meningite bacteriana sem definição do agente etiológico, sendo que seu spot correspondente foi identificado nos dois subconjuntos interseção dos grupos das meningites bacterianas e não no conjunto união do grupo com meningite virai. Para a definição do agente etiológico da meningite bacteriana propõe-se a proteína cininogênio. A presença da proteína cininogênio está associada à meningite meningocócica, enquanto sua ausência indica meningite pneumocócica (Figura 4). A proteína cininogênio foi encontrada somente no subconjunto interseção de meningite meningocócica e seu spot correspondente não pertence aos conjuntos união das demais etiologias de meningite nem do grupo controle. A partir destes resultados, foi elaborado o método preditivo descrito na Figura 4, no qual a presença ou ausência das proteínas descritas acima deve ser analisada sequencialmente.

Exemplo 6

Previsão da localização celular das proteínas identificadas

[0077] A localização celular das proteínas identificadas por espectrometria de massas foi prevista utilizando-se suas respectivas sequências de aminoácidos obtidas no banco de dados do NCBI, em formato fasta. Essas sequências foram submetidas à versão web do software SherLoc 2 (http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/SherLoc2).

[0078j Os resultados mostraram que a maioria das proteínas identificadas nos conjuntos união das meningites foram previstas como citoplasmáticas (46%), ou extracelulares (45%), podendo ser ainda nucleares (3%), de membranas plasmáticas (4%) ou mitocondriais (2%). Ademais, as proteínas identificadas que pertencem ao subconjunto interseção para as meningites foram previstas somente como extraceiulares (71%), ou citoplasmáticas (29%) (Figura 5).

0079] Uma das mais distintas características das células eucarióticas é a compartimentalização de proteínas. A localização de uma proteína muitas vezes é um passo essencial para determinar a sua função.

[0080] A ocorrência de proteínas nucleares e mitocondriais apenas nos conjuntos união das meningites sugere tratar-se de proteínas ocasionalmente liberadas para o meio extracelular em decorrência da morte de neurónios, glia, ou células do infiltrado inflamatório durante o curso das meningites.

[0081 ] O fato dos subconjuntos interseção conterem predominantemente proteínas extraceiulares (e algumas citoplasmáticas) reforça a ideia de que as proteínas avaliadas para seleção dos biomarcadores para as meningites participam dos processos fisiológicos da resposta do hospedeiro à infecção bacteriana.

[0082] Além disso, os pacientes incluídos neste estudo são de diferentes grupos etários (infantes, crianças e adultos) e suas amostras de líquor foram colhidas em diferentes momentos ao longo do curso da doença. Outro fator relevante da presente invenção é que as amostras destes pacientes são provenientes de dois hospitais de regiões distintas do país (sudeste e nordeste) e, possivelmente, representam diferentes backgrounds genéticos do hospedeiro. Desse modo, todas as etapas do delineamento experimental supracitadas contribuem para a confiabilidade dos resultados encontrados na presente invenção.

[0083] Com base nos Exemplos acima e resultados gerados a partir da análise comparativa do proteoma do líquor de pacientes com meningites pneumocócica, meningocócica, virai e controles foi possível identificar proteínas específicas da resposta do hospedeiro à infecção por esses patógenos _. Especificamente, dentre as proteínas identificadas, quatro dessas proteínas são objeto da presente invenção como biomarcadores para o diagnóstico diferencia! das meningites malignas e benignas. Combinadas em um método preditivo, essas proteínas biomarcadoras foram capazes de distinguir entre os pacientes com meningites pneumococica, meningococica e virai dos indivíduos sem infecção no sistema nervoso central. A sensibilidade, a especificidade e a acurácia foram de 100% envolvendo 24 pacientes (seis em cada grupo), testados em duplicata técnica.

[0084] Conforme Exemplos e discussões acima, as proteínas apolipoproteína A-l, proteína C-reativa, fração C3 do complemento e cininogênio foram as proteínas selecionadas como biomarcadores para o diagnóstico diferencial das meningites, pois foram capazes de distinguir entre os pacientes com meningites pneumococica, meningococica e virai dos indivíduos controles (indivíduos sem infecção, ou doença psiquiátrica ou neurodegenerativa no sistema nervoso central).

[0085] A partir de anticorpos ou aptâmeros capazes de reconhecer os biomarcadores identificados na presente invenção, são produzidos kits para diagnóstico diferencial das meningites na forma de testes de ELISA, aglutinação em látex, Western-blot, cromatografia lateral, eletroforese capilar, dentre outros.