Titre de l'invention: milieu réactionnel et méthode associée pour la détection, d’un micro-organisme cible.

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne le domaine du contrôle microbiologique au sens large, tel que le contrôle microbiologique d’un échantillon d’origine industrielle ou clinique. Plus particulièrement, la présente invention a trait à un milieu réactionnel et à la méthode associée pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’un microorganisme cible.

TECHNIQUE ANTERIEURE

[0001] Le contrôle microbiologique d’échantillons d’origines diverses requiert la mise en œuvre de techniques qui permettent la détection - par exemple aux fins d’identification et/ou de dénombrement et/ou de caractérisations biochimiques - de micro-organismes et dont le rendu en termes de résultats doit être le plus rapide possible.

[0002] Dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. L'approche est similaire pour la santé animale dans le domaine vétérinaire.

Dans le domaine agro-alimentaire, la problématique est identique. Elle distingue cependant :

- les micro-organismes pathogènes tels que les bactéries productrices de shiga-toxines (STEC), Salmonella, Listeria, Cronobacter, Bacillus, Staphylococcus dont la recherche s'applique aux matières premières, produits intermédiaires, produits finis commercialisés,

- les micro-organismes non pathogènes, utilisés comme indicateurs-qualité du processus de production, des matières premières aux produits finis, tout au long de la chaîne,

- les bactéries d'intérêt technologique telles que les ferments,

- les micro-organismes marqueurs de contamination.

La détection rapide et précise des contaminations présumées (au sein des lots alimentaires) permet de les contrôler et d'engager ainsi à bref délai des actions correctives.

[0003] Techniquement, une des principales difficultés est de pouvoir isoler la bactérie recherchée pour pouvoir l’identifier. Généralement, l’analyse microbiologique se fait en deux temps. La première est une phase de détection qui peut faire appel à de nombreuses technologies telles que les milieux de culture, les immuno-essais, la biologie moléculaire. Elle peut être suivie, notamment dans le domaine agro-alimentaire, d’une phase de confirmation afin de confirmer la présence du pathogène recherché et répondre aux normes en vigueur dans ce domaine. L’étape de confirmation impose donc des étapes supplémentaires et ici encore, nécessite une étape d’isolement de la bactérie recherchée.

[0004] Ainsi, dans le cas des E. coli productrices de shiga-toxines (STEC), le diagnostic repose sur l’utilisation de géloses sélectives et chromogéniques comme le SMAC (Sorbitol MacConkey Agar), le RMAC (Rhamnose MacConkey Agar) ou le Rainbow Agar 0157, afin de sélectionner la pousse de certaines bactéries et de colorer les souches d’intérêt. Mais finalement aucune de ces géloses n’est suffisamment spécifique aux STEC, sans une mise en culture permettant d’isoler et de confirmer l’identité de la souche à l’aide de tests de biologie moléculaire de type PCR. En effet, leur pathogénicité implique l’expression de plusieurs gènes de virulence, notamment stx1 et stx2 codant pour les deux types de shiga-toxines : STX1 et STX2. Ces deux toxines agissent en inhibant la synthèse protéique dans les cellules eucaryotes, ce qui in fine provoque l’apoptose. Afin d’identifier les STEC pathogènes avec précision, il est indispensable de réaliser une PCR pour les gènes stx1, stx2 ou eae (un autre facteur de virulence). Ces procédés sont donc longs, fastidieux et le germe portant les deux gènes (stx et eae) n’est pas systématiquement retrouvé en culture.

[0005] Il existe également des méthodes immunologiques. Un grand nombre de tests permettent la détection de E. coli O157:H7 dans les aliments et/ou dans les échantillons environnementaux. Ces systèmes comprennent des tests conventionnels ELISA en microplaques, des systèmes immunologiques en une étape et des systèmes complètement automatisés.

[0006] Les méthodes immunologiques en "une étape" sont très employées par les industriels du fait de leur rapidité d’exécution et de leur simplicité. Une grande partie de ces systèmes est basée sur le principe d’immuno-chromatographie. Le dispositif consiste en un support plastique contenant une membrane imprégnée de particules d’or ou de latex recouverte d’anticorps spécifiques d’E. coli O157:H7 (i.e. 0157 et éventuellement H7), un puits pour l’échantillon et une fenêtre de test et de contrôle. L’apparition d’une ligne colorée dans la fenêtre test indique un résultat positif signant la présence probable de E. coli 0157 dans l’aliment. On peut citer en exemple, le test « VIP EHEC » (BioControl, Montesson, France) qui permet, après un enrichissement de plusieurs heures de visualiser si un échantillon donné est contaminé ou non par E. coli 0157. Néanmoins, cette méthode ne permet pas de repérer la souche E. coli 0157 dans l’échantillon, ni de voir son caractère pathogène. [0007] Les systèmes ELISA/ELFA sont des méthodes immunologiques donnant un résultat en 2 heures en microplaque après une phase d’enrichissement (le plus souvent d’une durée de 24 heures). La société bioMérieux® a mis au point des kits ELISA (ELFA) automatisées reposant sur la technologie VIDAS®. Ces méthodes présentent l’inconvénient en cas de test positif de ne pas isoler directement la colonie suspecte. Il sera donc nécessaire de mettre en culture l’échantillon afin d’isoler la colonie positive et de confirmer par PCR que cette bactérie est bien celle ayant positivée le test.

[0008] Il existe également des méthodes ELISA pour la détection des STEC non-0157 reposant essentiellement sur la détection de la production des Shiga-toxines, éventuellement après une étape d'enrichissement. Certaines d'entre elles utilisent des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre la toxine STX, et la révélation avec des anticorps liés à la phosphatase alcaline. Parmi les kits ELISA disponibles, on peut citer le « Premier EHEC » ciblant les Shiga-toxines (Meridian Diagnostics Inc, USA). Des kits utilisant la technique de « reverse passive agglutination assay » (RPLA) adaptés à la détection des toxines STX ont également été conçus et commercialisés. Cette technique met en jeu des billes enduites d’anticorps qui interagissent avec les Shiga-toxines et produisent une couche diffuse à la base des puits dans lesquels se trouve le surnageant de culture. Ces méthodes nécessitent ensuite l’isolement de la colonie positive puis une étape de confirmation.

[0009] La méthode de séparation immuno-magnétique (IMS) a également été adaptée à la détection et l’isolement des souches appartenant aux 5 sérogroupes majeurs de STEC. Elle a lieu en milieu liquide et est réalisée à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'anticorps dirigés contre les antigènes 026, 0111 , 0103 et 0145. Toutefois, les souches isolées par cette méthode doivent être confirmées pour la présence du gène stx avant d’être considérées comme des souches de STEC.

[0010] Il existe donc un réel besoin de mettre au point une méthode fiable et rapide d’isolement et d’identification de bactéries cibles et notamment de bactéries pathogènes.

RESUME DE L’INVENTION

[0011] Un premier objet de l’invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir comprenant au moins un partenaire de liaison spécifique d’un composant d’un microorganisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme, couplé à au moins une nanoparticule pour former au moins un conjugué agglutinant. [0012] Le composant permettant de détecter le micro-organisme cible est un composant relargué par ledit micro-organisme dans le milieu réactionnel. Il peut s’agir d’un élément constitutif dudit micro-organisme cible tel qu’un lipopolysaccharide (LPS) ou un composant produit par le micro-organisme cible tel qu’une toxine.

[0013] De façon tout à fait avantageuse, le milieu permet ainsi de localiser sur le milieu de culture la colonie ciblée relarguant ledit composant. Ceci permet une meilleure détection du micro-organisme cible et un gain de temps très précieux dans le domaine du contrôle microbiologique, notamment au cours de l’étape de confirmation.

[0014] Préférentiellement, le conjugué comprend une nanoparticule colloidale ayant des propriétés optiques.

[0015] Avantageusement, le milieu selon l’invention comprend un inducteur de toxine. Ainsi, le milieu selon l’invention permet de façon tout à fait avantageuse de détecter les souches E. coli productrices de shiga-toxines (STEC).

[0016] Un autre objet de l’invention concerne une méthode de détection d’identification, de dénombrement et/ou d’isolement d’un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir, comprenant les étapes suivantes :

- Mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel selon l’invention

- Incuber

- Détecter la présence dudit micro-organisme cible.

[0017] De manière avantageuse, la détection se fait par l’apparition d’un halo autour du microorganisme cible sur le milieu réactionnel.

DESCRIPTION DES FIGURES

[0018] La figure 1 est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection de la souche E. coli 026, comprenant une protéine de phage couplée à une nanoparticule d’or.

[0019] La figure 2 est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection de la souche E. coli 0111 , comprenant un anticorps couplé à une nanoparticule d’or.

[0020] La Figure 3 est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection d’une bactérie cible productrice de la toxine STX1 comprenant un anticorps anti STX1 couplé à une nanoparticule d’or, en présence de la ciprofloxacine comme inducteur de toxine.

[0021] La Figure 4 est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection d’une bactérie cible productrice de la toxine STX1 comprenant un anticorps anti STX1 couplé à des nanoparticules d’argent, en présence de la mitomycine comme inducteur de toxine

[0022] La figure 5 est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection d’une bactérie cible productrice de la toxine STX1 et/ou STX2 comprenant un anticorps anti stx1 couplé à une nanoparticule d’argent, un anticorps anti STX2 couplé à une nanoparticule d’or, en présence de mitomycine

[0023] La Figure 6 est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection, d’une bactérie cible productrice de toxine STX1 et/ou STX2 comprenant un anticorps anti STX1 ou anti STX2 couplé à une même nanoparticule d’or, en présence de ciprofloxacine comme inducteur de toxine.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

[0024] Certains termes et expressions utilisés dans le cadre de l’invention sont détaillés ci- après.

[0025] Un premier objet de l’invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir comprenant au moins un partenaire de liaison spécifique d’un composant d’un micro-organisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme, couplé à au moins une nanoparticule pour former au moins un conjugué agglutinant.

[0026] Dit autrement, l’invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir comprenant au moins un conjugué agglutinant formé par au moins un partenaire de liaison spécifique d’un composant d’un microorganisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme, couplé à au moins une nanoparticuleD’une manière tout à fait surprenante, il a été constaté qu’il était possible de détecter un micro-organisme cible à l’aide d’un milieu réactionnel gélifié comprenant un conjugué agglutinant.

[0027] Par « milieu réactionnel », on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l’expression d’un métabolisme, à la survie et/ou la croissance des microorganismes. Ce milieu réactionnel peut soit être un milieu de culture microbiologique, soit être un milieu de révélation microbiologique. Dans ce dernier cas, la culture des microorganismes peut être effectuée préalablement dans un autre milieu. Le milieu réactionnel peut également être mis en contact avec un milieu de culture gélosé. Il peut être placé sous ou sur le milieu de culture qui permet la croissance des micro-organismes cibles. Le milieu réactionnel peut être ajouté après l’incubation du milieu de culture. Préalablement à son utilisation, le milieu réactionnel peut être déshydraté. Le milieu réactionnel peut être sous forme de pad.

[0028] Selon la présente invention, le milieu réactionnel est gélifié. Il se présente sous forme solide ou semi-solide. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel utilisé en microbiologie pour la culture des micro-organismes, mais il est possible d'utiliser d'autres agents gélifiants comme par exemple, la gélatine, l'agarose ainsi que d’autres gélifiants naturels ou artificiels. Ainsi, contre toute attente, le conjugué est capable de former un réseau avec la composant cible dans un milieu gélifié. Et de manière surprenante ce réseau est visuellement détectable par la formation d’un halo sans qu’il ne soit nécessaire de diminuer la dureté d’un milieu réactionnel semi-solide classique. Ainsi il n’est pas nécessaire de modifier les propriétés physico-chimiques du milieu réactionnel, telles que la dureté, pour permettre d’une part la diffusion des composants ciblés et d’autre part la réaction avec les conjugués.

[0029] Un certain nombre de préparations sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l’agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Mueller Hinton ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media. Ces milieux peuvent servir de base au milieu réactionnel selon l’invention. Le milieu réactionnel peut en outre comprendre d'éventuels additifs comme par exemple des acides aminés, des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, un ou plusieurs agents sélectifs, des inducteurs, des inducteurs de toxines, des tampons etc. Par « agent sélectif », on entend tout composé susceptible d’empêcher ou de ralentir la croissance d’un micro-organisme dit « non-cible », à savoir autre que le ou les micro-organisme(s) cible(s). Le terme « inducteur » se réfère à un composé capable d’induire l’expression d’un composé, telle une enzyme, une toxine, qui normalement resterait inexprimé.

[0030] Ledit milieu réactionnel peut également comprendre un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d’Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l’oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant. Lorsque le milieu réactionnel selon l’invention comprend en outre un substrat enzymatique spécifique d’une activité enzymatique d’au moins un micro-organisme cible, on utilise de préférence un substrat chromogène et/ou fluorogène. Par «substrat chromogène et/ou fluorogène », on entend un substrat permettant la détection d’une activité enzymatique ou métabolique des micro-organismes cibles/recherchés grâce à un signal détectable. Le milieu réactionnel selon l’invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant le métabolisme des micro-organismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un fluorophore. On citera, comme exemple de chromophore, le bromocresol pourpre, le bleu de bromothymol, le rouge neutre, le bleu d’aniline, le bleu de bromocresol.

[0031] L’homme du métier peut également utiliser une boîte de Pétri divisée en segment, telle qu’une bi-boîte, ou une tri-boîte, permettant de comparer aisément plusieurs milieux, comprenant différents substrats ou différents mélanges sélectifs, sur lesquels un même échantillon biologique aura été déposé.

Selon la présente invention, le milieu réactionnel comprend un partenaire de liaison spécifique d’un composant d’un micro-organisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme, couplé à une nanoparticule. Le partenaire de liaison spécifique est choisi parmi les anticorps, tous types de fragments Fab, les protéines recombinantes, les phages, les protéines de phage, les oligonucléotides, les aptamères, les affimères ou tout autre ligand ou anti-ligand bien connu de l’homme du métier. Selon la présente invention, le milieu réactionnel comprend un partenaire de liaison spécifique qui n’est pas lié audit composant du micro-organisme cible ou du composant issu dudit micro-organisme. Ce n’est que lors de l’utilisation dudit milieu, c’est-à-dire lors de l’ensemencement de l’échantillon sur le milieu réactionnel, que le partenaire de liaison spécifique peut se lier au composant d’un micro-organisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme.

[0032] Préférentiellement l’anticorps est un anticorps monoclonal ou un fragment d’anticorps monoclonal.

[0033] Selon la présente invention, le partenaire de liaison est spécifique d’un composant d’un micro-organisme cible. Le composant du micro-organisme cible est un composant relargué par ledit micro-organisme. Le composant peut ainsi être un élément issu de la surface de la bactérie tel qu’une protéine, un Lipopolysaccharide (LPS), un flagelle. Il peut également s’agir d’un élément interne à la bactérie tel que l’ARN, une protéine intracellulaire qui pourra être détecté lors de la mort d’une partie de la colonie bactérienne au cours de la croissance de celle-ci. Dans un mode de réalisation particulier, le partenaire de liaison est spécifique de l’ARN du micro-organisme cible. Dans ce mode de réalisation, le partenaire de liaison est composé d’au moins deux amorces différentes s’hybridant de façon complémentaire à l’ARN ciblé.

[0034] Dans un autre mode de réalisation particulier, le partenaire de liaison est spécifique d’un composant issu dudit micro-organisme. Ce composant peut être une molécule d’intérêt produite par le micro-organisme cible telle qu’une protéine, un antibiotique, une molécule de résistance à des agents antimicrobiens, des enzymes type protéases, des lipases ou glucoidases.

[0035] Selon la présente invention le partenaire de liaison est couplé à une nanoparticule. Ce complexe final est appelé conjugué. Dans un même milieu réactionnel, il est possible d’avoir des conjugués ayant des partenaires de liaison de nature différente couplés à des nanoparticules elles même de nature différente.

[0036] Le terme « nanoparticule » désigne les particules de l’ordre de grandeur du nanomètre. Les nanoparticules peuvent être choisies parmi l’or, le fer, l’argent, le cuivre, le carbone, le latex, le silicium, l’aluminium. Préférentiellement, les nanoparticules sont des nanoparticules colloidales choisies pour leur propriété optique à savoir leur capacité à se distinguer lorsqu’ un réseau se forme. De façon encore plus préférentielle, la nanoparticule est choisie parmi l’or, l’argent, le cuivre. Ainsi, lorsque les nanoparticules sont en or, elles changent de couleur, passant par exemple du rouge au gris lorsqu’elles forment un réseau. Lorsqu’elles ne sont pas agrégées, La longueur d’onde de la lumière absorbée est dans le rouge autour de 530nm. Lorsqu’elles sont agrégées, la longueur d’onde absorbée change du rouge au bleu/gris autour de 600 à 700nm. Dans un mode de réalisation particulier, il est possible d’utiliser ensemble plusieurs nanoparticules de couleurs différentes. Les réseaux ainsi formés permettent la distinction de plusieurs composants du micro-organisme cible.

[0037] Préférentiellement, les nanoparticules ont une taille comprise entre 10 et 200nm. Préférentiellement les nanoparticules ont une taille comprise entre 20 et 90nm, permettant une meilleure mobilité des conjugués dans le milieu réactionnel.

[0038] Avantageusement les nanoparticules permettent de diminuer la quantité nécessaire de partenaires de liaison pour la formation d’une agglutination. Ainsi, la concentration nécessaire en partenaires de liaison pour la réalisation d’un milieu réactionnel selon l’invention nécessite 100 à 1000 fois moins de partenaires de liaison qu’un milieu sans nanoparticule.

[0039] Préférentiellement, la quantité nécessaire en partenaires de liaison correspond à la quantité nécessaire pour recouvrir au minimum la moitié de la surface de la nanoparticule, et encore plus préférentiellement pour recouvrir entre le tiers et la moitié de la surface de la nanoparticule. Cette proportion permet au conjugué agglutinant de former un réseau dans le milieu réactionnel gélifié.

[0040] Avantageusement, les nanoparticules peuvent permettre de visualiser une agglutination autour d’une colonie bactérienne dont la taille ne permet pas encore d’être visible à l’œil nu. La détection peut ainsi être plus précoce. Avantageusement, les nanoparticules peuvent permettre de visualiser une agglutination autour d’une colonie bactérienne dont l'aspect translucide ne permet pas la détection par un automate de lecture. La détection peut ainsi être facilité.

[0041] Le couplage de la nanoparticule au partenaire de liaison peut se faire soit par une fixation directe soit par une fixation indirecte. Par fixation directe, on entend la fixation par adsorption, soit par liaison covalente. Par fixation indirecte, on entend une fixation par l’interaction de ligands/anti-ligands comme par exemple la biotine/strepatividine ou d’autres couples bien connus de l’homme du métier. En fonction du type de liaison choisie, l’homme du métier adaptera les conditions physico-chimiques du milieu réactionnel et notamment son pH.

[0042] Selon la présente invention, le conjugué est agglutinant c’est-à-dire qu’il provoque la formation d’un réseau d’agglutination en présence d’un composant d’un microorganisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme. Le composant étant multiépitope, plusieurs conjugués vont se fixer à ce composant et former une agglutination. Par agglutination, on entend le résultat d’une interaction entre au moins un composant d’un micro-organisme cible ou au moins un composant issu dudit microorganisme avec des partenaires de liaison couplés à une nanoparticule. Les réactions d’agglutination comprennent des réactions immunologiques, telles des réactions antigène-anticorps ou plus généralement des interactions spécifiques entre deux molécules. Par cette interaction, composants et conjugués s’agrègent, adhèrent entre eux et forment un réseau dans le milieu réactionnel. En pratique, plusieurs paramètres influencent la capacité du conjugué à être agglutinant dans un milieu gélifié comme principalement :

- la porosité du milieu gélifié

- la taille des nanoparticules

- la quantité de partenaires de liaison

- la quantité de nanoparticules

Il conviendra donc d’adapter ces paramètres afin de permettre une agglutination satisfaisante permettant sa détection. Avantageusement, le réseau formé par ladite réaction spécifique est alors détecté soit visuellement, soit de façon automatique grâce à un système optique. La colonie du micro-organisme cible est ainsi repérée. De préférence, le réseau forme un halo dans le milieu réactionnel gélifié détectable soit visuellement soit grâce à un système optique. Le réseau ou le halo circonscrit ainsi la colonie qui peut alors être avantageusement différenciée et/ou identifiée au sein d’une population.

[0043] Par « au moins un micro-organisme cible», on entend, au sens de la présente invention, au moins un micro-organisme que l’on souhaite détecter et/ou identifier et/ou dénombrer. Préférentiellement, le micro-organisme est choisi parmi Escherichia coli , Escherichia coli productrice de shiga toxine, Shigella, Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Pseudomonas, Bacillus cereus group, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus MSSA, Staphylococcus aureus MRSA, Streptococcus agalactiae. De préférence, le microorganisme est choisi parmi les souches E. coli, et préférentiellement parmi les souches E. coli productrices de shiga-toxines (STEC). Les E. coli entérohémorragiques (EHEC) sont des souches représentant un sous-groupe des Escherichia coli productrices de Shiga toxines STX (STEC), qui ont acquis le gène eae et provoquent un syndrome hémolytique et urémique. La possession de ces deux facteurs de virulence en simultané rend ce pathovar très virulent pour l’Homme. Il s’agit notamment des sérogroupes 026, 045, 080, 0103, 0111 , 0121, 0145 et 0157.

[0044] Dans un mode de réalisation particulier, le milieu réactionnel comprend un inducteur provoquant ou augmentant l’expression d’une molécule d’intérêt produite par le microorganisme cible. Cette molécule d’intérêt peut être une protéine, un antibiotique, une molécule de résistance à des agents antimicrobiens, une enzyme type protéase, une lipase ou une glucidase. Ainsi la présente invention permet la caractérisation ou la sélection de souches microbiennes par rapport à leur capacité à produire ces molécules d’intérêt. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention peut concerner le domaine de la bioproduction, et plus particulièrement la production de protéines recombinantes à partir d’un micro-organisme génétiquement modifié, pour laquelle il est nécessaire d’identifier les clones producteurs. La présente invention permet ainsi de bien voir que la protéine recombinante est produite. En présence d’un halo, Il est également possible d’estimer la quantité produite. Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention permet la détection de bactéries pathogènes résistantes.

[0045] Dans un mode de réalisation particulier, le milieu réactionnel comprend un inducteur de toxine. L’inducteur de toxine provoque un stress chez la bactérie qui va déclencher le cycle lytique des prophages dans la bactérie et donc stimuler la production de toxines qui seront libérées. A titre illustratif, on peut citer les toxines sécrétées par Staphylococcus aureus ou les shigatoxines sécrétées par les souches STEC. Il existe deux grands types de shigatoxines : STX1 et STX2 qui elles-mêmes présentent de nombreux variants. A ce jour, STX1 a 4 sous types STX1a, STX1c, STX1d, STX1e, et STX2 en a 12: STX2a, STX2b, STX2c, STX2d, STX2e, STX2f, STX2g, STX2h, STX2i, STX2j, STX2K, STX2I. De manière avantageuse, l’inducteur de toxine est choisi parmi les antibiotiques ou un stress physico-chimique. On citera, en tant qu’antibiotique, trimethoprime, sulfamethoxazole, norfloxacine, azithromycine, gemtamicine, polymyxine B, chloramphénicol, streptomycine, chlortetracycline, oxytetracyline, tylosine, mitomycine C, carbodox, oliquindox, rifampincine, imipenème, ciprofloxacine, cotrimoxazole, peniciline G, linlomycine. Dans un mode de réalisation préféré, le milieu selon l’invention comprend de la ciprofloxacine à une concentration comprise entre 0,005 et 0,030 mg/l. Dans un autre mode de réalisation préféré le milieu selon l’invention comprend de la mitomycine C à une concentration comprise entre 0.10 et 0.5 mg/l.

[0046] L’inducteur de toxine peut également être un stress physico-chimique réalisé, par exemple, par l’ajout de sel ou d’EDTA ou par une modification du pH ou encore par un stress UV. Le stress peut également être, par exemple, induit par l’ajout de noradrénaline. Ledit micro-organisme cible est susceptible d’être présent dans un échantillon. Par « échantillon », on entend une petite partie ou petite quantité isolée d'une entité pour l'analyse. L'échantillon peut être d'origine industrielle, soit, selon une liste non exhaustive, un prélèvement d'air, un prélèvement d'eau, un prélèvement effectué sur une surface, une pièce ou un produit manufacturé, un produit d'origine alimentaire. Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer de façon non exhaustive un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages...), de viande, de poisson, d'œufs, de fruits, de légumes, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc.). Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment des farines animales ou végétales. L'échantillon peut être d'origine biologique, soit animale ou humaine. Il peut alors correspondre à un prélèvement de fluide biologique (selles, urine, sang total, sérum, plasma, liquide céphalo-rachidien, sécrétion organique...), un prélèvement externe (peau, nez, gorge, ...) ou tissulaire ou des cellules isolées. Le prélèvement peut être utilisé tel quel ou, préalablement à l'analyse, subir une préparation de type enrichissement, extraction, concentration, purification, selon des méthodes connues de l'homme du métier. Le milieu réactionnel selon l’invention peut être d’autant plus intéressant lorsque l’échantillon est un échantillon polymicrobien ou chargé en flore annexe, comme par exemple les échantillons alimentaires tels que le fromage au lait cru ou les selles dans les échantillons cliniques.

[0047] Un autre objet de la présente invention concerne un kit de diagnostic permettant la préparation d’un milieu réactionnel selon l’invention comprenant

- un conjugué agglutinant tel que décrit dans la présente invention

- un milieu gélifiant.

[0048] Avantageusement, le milieu réactionnel peut être fabriqué extemporanément à l’aide d’un kit selon l’invention. Cela permet l’utilisation unitaire d’un milieu réactionnel, et d’augmenter la stabilité de celui-ci.

[0049] Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne le procédé d’obtention d’un milieu réactionnel selon l’invention comprenant les étapes de mise en contact d’un conjugué agglutinant avec un milieu gélifiant pour former le milieu réactionnel selon l’invention. La préparation du conjugué s’effectue par le couplage du partenaire de liaison avec la nanoparticule. Ces méthodes de couplage sont bien connues de l’homme du métier (Nicholas G. Weich ét al, 2017). Le conjugué est ensuite ajouté au milieu gélifié mis en surfusion. L’ensemble est ensuite homogénéisé et coulé dans la boîte de Pétri.

[0050] Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de culture microbiologique in vitro, dans laquelle des micro-organismes susceptibles d’être présents dans un échantillon sont ensemencés dans ou sur un milieu de culture selon l’invention. Le milieu de culture ensemencé est incubé dans des conditions appropriées connues de l’homme de l’art. L’ensemencement est réalisé selon des techniques classiques de microbiologie. Il peut également être effectué dans la masse autrement dit par inclusion.

[0051] Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de détection, d’identification, de dénombrement et/ou d’isolement d’au moins un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir comprenant les étapes suivantes :

- -mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel selon l’invention - Incuber

- détecter la présence dudit micro-organisme cible.

[0052] Par « détection », on entend la détection à l’œil nu ou à l’aide d’un appareil optique de l’existence d’une croissance des micro-organismes cibles de préférence des bactéries cibles. Lorsque le milieu réactionnel à partir duquel l’on souhaite détecter les microorganismes cibles comprend un substrat chromogène ou fluorogène, la détection peut être effectuée à l’aide d’un appareil optique pour les substrats fluorogènes, ou à l’œil nu ou à l’aide d’un appareil optique pour les substrats chromogènes.

[0053] Par « identification », on entend la détermination du genre et/ou de l’espèce et/ou un groupe au(x)quel(s) et/ou à laquelle appartient un micro-organisme cible.

[0054] Par « dénombrement d’au moins un micro-organisme cible », on entend le fait de comptabiliser/quantifier le nombre de micro-organismes cibles, par exemple le nombre de colonies bactériennes lorsque le micro-organisme cible est une bactérie.

[0055] Par « isolement » on entend le fait d’obtenir des colonies différentes espacées les unes des autres.

[0056] Le contrôle microbiologique correspond à l’analyse d’un échantillon dans le but de détecter des micro-organismes susceptibles d’être présents au sein dudit échantillon. Ainsi, d’une manière tout à fait surprenante, il a été constaté qu’un milieu selon l’invention permettait de détecter une bactérie cible et de l’isoler. Avantageusement, le milieu selon l’invention, peut permettre ainsi de repérer et sélectionner un micro-organisme cible parmi une population mixte présente sur un milieu réactionnel non sélectif ou insuffisamment sélectif. Préférentiellement, la méthode selon l’invention permet une détection par l’apparition d’un halo autour dudit micro-organisme cible sur le milieu réactionnel selon l’invention. Autrement dit, la détection se fait par l’observation de l’apparition d’un halo autour du microorganisme cible sur le milieu réactionnel.

[0057] Sans que cela ne soit limitatif, il s’avère que le milieu selon l’invention est particulièrement adapté à la détection des E. coli. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’une souche d’ E. coli, comprenant une protéine de phage spécifique du LPS de ladite souche couplée à une nanoparticule pour former un conjugué.

[0058] Dans ce mode de réalisation particulier, la quantité en protéine de phage spécifique du LPS permet de recouvrir au minimum le tiers de la surface de la nanoparticule.

[0059] Préférentiellement, dans ce mode de réalisation particulier, la nanoparticule est en or, de taille comprise entre 20 et 90 nm et à une concentration comprise entre 10 ¹⁰ et 10 ¹² nanoparticules/ml de milieu réactionnel. [0060] Dans ce mode de réalisation, le milieu réactionnel est formé à partir d’un milieu de culture connu pour la culture des souches d’E. coli tel que les milieux TBX ou chromID® Coli de la demanderesse, dans lesquels ont été ajoutés les conjugués agglutinants.

[0061] Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’une souche d’E. coli, comprenant un anticorps monoclonal spécifique de ladite souche couplé à une nanoparticule pour former un conjugué.

[0062] Préférentiellement, dans ce mode de réalisation particulier, la quantité en anticorps monoclonal permet de recouvrir au minimum la moitié de la surface de la nanoparticule, et encore plus préférentiellement pour recouvrir entre le tiers et la moitié de la surface de la nanoparticule.

[0063] Préférentiellement, dans ce mode de réalisation particulier, la nanoparticule est en or, de taille comprise entre 20 et 90 nm et à une concentration comprise entre 10 ¹⁰ et 10 ¹² nanoparticules/ml de milieu réactionnel.

[0064] Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’une souche d’E. coli productrice de shigatoxine comprenant au moins un inducteur de toxine, au moins un anticorps spécifique de Stx1 et/ou de Stx2, ledit au moins un anticorps étant couplé à une nanoparticule pour former un conjugué agglutinant. Autrement dit, la présente invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’une souche d’E. coli productrice de shigatoxine comprenant au moins un inducteur de toxine, au moins un conjugué agglutinant formé par au moins un anticorps spécifique de Stx1 et/ou de Stx2 couplé à une nanoparticule.

[0065] Ce mode de réalisation permet avantageusement de repérer une souche d’E. coli productrice de shiga-toxine par la formation d’un halo autour de ladite souche. En effet les conjugués formés d’anticorps couplés aux nanoparticules, se sont agglutinés autour de ladite colonie. Il est ainsi aisé de visualiser la colonie cible.

[0066] Dans ce mode de réalisation, ledit au moins un anticorps a une quantité permettant de recouvrir au minimum la moitié de la surface de la nanoparticule et préférentiellement au minimum le tiers de la surface de la nanoparticule. Dans ces modes de réalisations particuliers, le milieu comprend de la ciprofloxacine, à une concentration comprise entre 0.005 et 0.030 mg/l. Dans une variante de ces modes de réalisations particuliers, le milieu comprend de la mitomycine C, à une concentration comprise entre 0.10 mg/l à 0.50 mg/l.

[0067] Préférentiellement, dans ces variantes la nanoparticule est une nanoparticule d’or de taille comprise entre 20 et 90nm et à une concentration comprise entre 10 ¹⁰ et 10 ¹² nanoparticules/ml de milieu réactionnel. [0068] Lorsque le milieu selon l’invention comprend des partenaires de liaisons de plusieurs toxines, cette invention est particulièrement avantageuse pour discriminer dans un même échantillon les bactéries productrices de shiga toxine STX1 ou STX2 des bactéries productrices des deux types de shiga toxine STX1 et STX2. [0069] Cette invention est particulièrement intéressante pour faciliter la détection des STEC dans un échantillon polymicrobien. En effet, sans la présente invention qui permet de localiser la colonie d’intérêt, la méthode de référence ISO 16136 précise qu’il est nécessaire de tester jusqu’à 50 colonies par méthode moléculaire pour confirmer la présence d’un STEC. Au regard du nombre important de colonies sur la boite et la faible représentation du micro-organisme cible, la personne prélevant les colonies à des fins de confirmation, peut ne jamais prélever le micro-organisme cible. Ainsi la présente invention permet un gain de temps dans l’exécution du contrôle microbiologique. Elle est particulièrement avantageuse pour des échantillons chargés en flore annexe, où la quantité importante de colonies sur les boîtes de Pétri peut entraîner un risque de faux négatifs.

Exemples

[0070] Exemple 1 : Détection de E. coli 026 avec un milieu selon l’invention comprenant une protéine de phage couplée à une nanoparticule d’or

[0071] Préparation des nanoparticules d’or

[0072] Les nanoparticules de 40 nm sont fabriquées par la réduction du chlorure d’or par du citrate de sodium (méthode décrite par Turkevich and Frens en 1951). Ainsi, les nanoparticules d’or de 20 nm sont fabriquées à l’aide d’une solution de chlorure d’or diluée dans de l’eau distillée, additionnée de citrate trisodique puis portée à ébullition. La présence d’un pic d’absorbance à 517-519 nm permet de s’assurer de la bonne taille des particules. De ces particules de 20 nm sont synthétisées les particules de 40 nm. Pour cela les particules de 20 nm sont diluées en eau distillée puis portées à ébullition avec ajout de citrate trisodique et de chlorure d’or. Le pic d’absorbance est alors observé à 524- 526 nm à froid, témoin de l’augmentation de la taille des particules.

[0073] Préparation du conjugué :

[0074] Le phage évalué dans cet essai est le Phage Eco 026 BP1 , dirigé contre le LPS des Escherichia coli 026. Ce phage est issu de la collection de la Demanderesse.

L’ adsorption de la protéine de phage sur les nanoparticules est réalisée en prenant en compte la valeur de son point isoélectrique et selon les méthodes connues de l’homme du métier (Nicholas G. Welch et al) : Le phage ci-dessus est couplé de la manière suivante

- Dilution de 270 pg de protéines de phage dans 3 ml de Tris HCL (0.025M) pH 6

- Ajout de 30 ml d’or à une densité optique de 1 soit 7.7x10 ¹⁰ nanoparticules/ml ajustés préalablement au pH de 6 avec une solution K2CO3 à 0.1 M

- Agitation pendant 20 minutes

- Passivation en ajoutant 3 ml de BSA 10%

- Centrifugation à 8600 g pendant 30 min

- Retrait du surnageant et dosage du concentra obtenu au spectrophotomètre.

[0075] Préparation du milieu réactionnel selon l’invention :

Le conjugué produit est ajouté dans de la gélose en surfusion (chrom ID coli-ref 42017 bioMerieux) à 50°C afin d’obtenir une concentration en nanoparticules d’une densité optique de 3 à l’aide d’un spectrophotomètre. 18 ml de milieu par boite sont ensuite coulés. Les boites sont ensuite séchées. [0076] Ensemencement :

Dans cet exemple, une souche d’E. coli 026 et une souche d’ E. coli 0111 (collection de la demanderesse) sont inoculées et incubées 72H à 37°C.

[0077] Résultats

On observe visuellement un halo gris autour de la colonie possédant le LPS 026 (Figure 1). Ce virage au gris provient d’un réseau formé entre les LPS libérés par les colonies et les conjugués présents dans la gélose.

[0078] Exemple 2 : Détection d’E. coli 0111 avec un milieu selon l’invention comprenant un anticorps couplé à une nanoparticule d’or

[0079] Préparation des nanoparticules d’or

Les particules d’or de 40nm sont fabriquées comme indiqué à l’exemple 1.

[0080] Préparation du conjugué

[0081] L’anticorps monoclonal 2H5E9 IgG anti-Eco// 0111 est issu de la collection de la Demanderesse.

[0082] L’adsorption de l’anticorps sur les nanoparticules se fait de la manière suivante :

- Dilution de 90 pg d’anticorps dans 3 ml de Tris HCL (0.025M) pH 6.5

- Ajout de 30 ml d’or à une DO 1 ajustés préalablement au pH de 8 avec une solution K2CO3 0.1 M

- Agitation pendant 20 minutes

- Passivation en ajoutant 3 ml de BSA 10%

- Centrifugation à 8600 g pendant 30 min

- Retrait du surnageant et dosage du concentra obtenu au spectrophotomètre

[0083] Préparation du milieu réactionnel selon l’invention

[0084] Le conjugué produit est ajouté dans de la gélose en surfusion (chrom ID coli-ref 42017 bioMerieux) à 50°C afin d’obtenir une concentration en nanoparticules d’une densité optique de 3 à l’aide d’un spectrophotomètre. 18 ml de milieu par boite sont ensuite coulés. Les boites sont ensuite séchées.

[0085] Ensemencement

[0086] Dans cet exemple, une souche d’ E. coli 026 et une souche d’ E. coli 0111 issues de la collection de la Demanderesse, sont inoculées et incubées 72H à 37°C.

[0087] Résultat [0088] On n’observe pas d’halo gris autour de la colonie 026 alors qu’il est bien visible autour de la colonie 0111 (figure 2), permettant l’identification de cette dernière.

[0089] Exemple 3 : Détection d’une E. coli productrice d’une toxine STX1 avec un milieu selon l’invention comprenant un anticorps anti Stx1 couplé à une nanoparticule d’or et de la ciprofloxacine comme inducteur de toxine

[0090] Préparation des nanoparticules d’or

Les nanoparticules de 40 nm sont fabriquées tel que décrit à l’exemple 1.

[0091] Préparation du conjugué

L’anticorps évalué dans cet essai est l’anticorps IgG (ref ATCC 13C4 hybridome CRL- 1794) dirigé contre la toxine STX1.

L’adsorption de l’anticorps sur les nanoparticules se fait de la manière suivante :

- Dilution de 90 pg d’anticorps dans 3 ml de Tris HCL (0.025M) pH 8

- Ajout de 30 ml d’or à une DO 1 ajustés préalablement au pH de 8 avec une solution K2CO3 0.1M

- Agitation pendant 20 minutes

- Passivation en ajoutant 3 ml de BSA 10%

- Centrifugation à 8600 g pendant 30 min

- Retrait du surnageant et dosage du concentra obtenu au spectrophotomètre

Préparation du milieu selon l’invention

Supplémentation de la Gélose :

- Le conjugué produit est ajouté dans de la gélose en surfusion (chrom ID coli ref 42017 bioMerieux) à 50°C contenant l’inducteur de toxine, ici la ciprofloxacine à 10 ng/mL, afin d’obtenir une concentration en nanoparticules d’une DO 3. 18 ml de milieu par boite sont ensuite coulés. Les boites sont ensuite séchées.

[0092] Ensemencement

4 souches de collection interne de la Demanderesse dont trois possèdent le gène stx1 sont inoculées et incubées 24H à 37°C.

Conclusion :

On observe un halo gris autour des colonies productrices de toxine STX1 (figure 3). La toxine STX1 est détectée. Ce virage au gris provient d’un réseau formé entre les toxines libérées par les colonies et les conjugués présents dans la gélose. [0093] Exemple 4 : Détection d’une E. coli productrice de toxine STX1 dans un milieu selon l’invention comprenant un anticorps anti Stx1 couplé à des nanoparticules d’argent et de la mitomycine comme inducteur de toxine

[0094] Préparation des nanoparticules d’argent

[0095] Les nanoparticules d’argent de 40 nm ont été achetées auprès d’un fournisseur (Alfa aesar ; ref J67090.AE).

[0096] Préparation du conjugué

L’ adsorption de l’anticorps (ref ATCC 13C4 hybridome CRL-1794) sur les nanoparticules se fait telle que décrit à l’exemple 3.

[0097] Préparation du milieu selon l’invention

[0098] Le conjugué produit est ajouté dans de la gélose en surfusion TBX (ref AEB622817 bioMerieux) à 50°C contenant en plus un inducteur de toxine, ici la mitomycine C à 250 ng/mL, afin d’obtenir une concentration en nanoparticules d’une DO 3. Le milieu est ensuite coulé dans les boites puis séché.

[0099] Ensemencement

Deux souches de collection interne de la Demanderesse dont une possède le gène stx1 sont inoculées et incubées 24H à 37°C

[0100] Résultats

On observe un halo gris autour de la souche produisant la toxine STX1 (figure 4, colonie de droite). Ce virage au gris provient d’un réseau formé entre la toxine libérée par les colonies et les conjugués présents dans la gélose.

[0101] Exemple 5: Détection d’une E. coli productrice de toxines Stx1 et/ou Stx2 dans un milieu selon l’invention comprenant un anticorps anti Stx1 couplé à une nanoparticule d’argent, un anticorps anti Stx2 couplé à une nanoparticule d’or, en présence de mitomycine C

[0102] Préparation des nanoparticules d’argent ou d’or

[0103] Les nanoparticules d’argent de 40 nm ont été achetées après d’un fournisseur (Alfa aesar ; ref : J67090.AE).

[0104] Les nanoparticules sont fabriquées selon l’exemple 1.

[0105] Préparation du conjugué [0106] Les nanoparticules d’or de 40nm sont couplées à l’anticorps 9E4H11 anti stx2, collection de la demanderesse, selon la méthode décrite dans l’exemple 1 avec un pH de 9.

[0107] L’adsorption de l’anticorps 13C4 anti stx1 sur les nanoparticules d’argent se fait selon l’exemple 4 :

[0108] Préparation du milieu selon l’invention :

[0109] Les conjugués sont ajoutés dans la gélose TBX en surfusion (ref AEB622817 bioMerieux) à 50°C contenant l’inducteur de toxine, ici la mitomycine C à 250 ng/mL, afin d’obtenir une concentration pour chaque sorte de nanoparticules d’une DO 3. Le milieu est ensuite coulé dans les boites puis séché.

[0110] Ensemencement :

[0111] Deux souches provenant de la collection de la Demanderesse, l’une possédant le gène stx1 et l’autre le gène stx2 sont inoculées et incubées 24H à 37°C.

[0112] Résultats

[0113] Le milieu réactionnel avec les conjugués a une couleur rouge clair. On observe la présence d’un halo autour de chacune des 2 souches (figure 5). Ce qu’on remarque c’est que la couleur de l’ halo varie en fonction de la toxine produite. En effet dans le cas d’une production de toxine STX2 on a la formation d’un réseau entre la toxine et les nanoparticules d’or, entrainant un virage des nanoparticules d’or du rouge au gris et provoquant un halo jaune du fait de la présence des nanoparticules d’argent qui n’ont pas agrégées (colonie à gauche sur la figure 5). Dans le cas d’une production de toxine STX1 on a la formation d’un réseau entre la toxine et les nanoparticules d’argent, entrainant un virage des nanoparticules d’argent du jaune au gris et provoquant un halo rouge plus intense (rouge clair + gris) du fait de la présence des nanoparticules d’or qui n’ont pas agrégées (colonie à droite sur la figure 5).

[0114] Exemple 6 : Détection d’une E. coli cible productrice de toxine Stx1 et/ou Stx2 dans un milieu selon l’invention comprenant un anticorps anti Stx1 ou anti Stx 2 couplé à une même nanoparticule d’or en présence de ciprofloxacine comme inducteur de toxine

[0115] Préparation des nanoparticules

[0116] Les nanoparticules de 40 nm selon l’exemple 1

[0117] Préparation des conjugués [0118] Les anticorps évaluer dans cet essai sont l’anticorps 13C4 dirigé contre la toxine STX1 et l’anticorps 9E4H11 dirigé contre la toxine STX2 .

[0119] Ce mélange est adsorbé sur les nanoparticules selon les exemples précédent à un pH de 8

[0120] Préparation du milieu selon l’invention :

[0121] Le conjugué produit est ajouté dans de la gélose TBX en surfusion (ref AEB622817 bioMerieux) à 50°C contenant l’inducteur de toxine, ici la ciprofloxacine à 10 ng/mL, afin d’obtenir une concentration en nanoparticules d’une DO 3. 18 ml de milieu par boite sont ensuite coulés. Les boites sont ensuite séchées.

[0122] Ensemencement

[0123] 5 souches possédant ou non les gènes stx1 et/ou stx2 sont inoculées et incubées 24H à 37°C.

[0124] Conclusion : On observe un halo gris autour des colonies productrices des toxines STX1 et/ou STX2 (figure 6). Ce virage au gris provient d’un réseau formé entre les toxines libérées par les colonies et les conjugués présents dans la gélose.

Exemple 6 : Détection d’une souche d’E. coli productrice de la toxine STX1 par ensemencement dans la masse

[0125] Préparation des nanoparticules

[0126] Les nanoparticules de 40 nm sont fabriquées selon l’exemple 1.

[0127] Préparation des conjugués

[0128] L’anticorps utiliser dans cette étude est le 13C4 dirigé contre la toxine STX1 de Escherichia coli. L’adsorption est réalisée telle qu’indiqué aux exemples précédents

[0129] Préparation du milieu selon l’invention

[0130] Ajouter les conjuguées produit dans de la gélose en surfusion (TBX) à 50°C contenant l’inducteur de toxine ici la mitomycine C à 250 ng/mL afin d’obtenir une concentration en nanoparticules d’une DO 3.

[0131] Ensemencement

[0132] Dans cet exemple, deux souches, l’une produisant la toxine STX1 (024), l’autre ne la produisant pas (025), sont ensemencées dans la masse et incubées 24H à 37°C.

[0133] Conclusion : Dans le cas de la colonie 024, un halo gris est bien présent. Ce virage de couleur provient d’un réseau formé entre les toxines STX1 libérées par les colonies et les conjugués présents dans la gélose.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[0134] Nicholas G. Welch et al; “Orientation and characterization of immobilized antibodies for improved immunoassays (Review)”; Biointerphases 12, 02D301 (2017); https://doi.Org/10.1116/1.4978435 ; [0135] Turkevich et al, « A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold », 1951