Elle se rapporte également au procédé de dépistage ante-mortem d'ATNC mettant en oeuvre ledit réactif. Elle a enfin pour objet un procédé de dosage ante- mortem d'ATNC dans un échantillon biologique.

Les agents transmissibles non conventionnels (ATNC) encore appelés « prion », provoquent chez l'homme et l'animal des maladies appelées « encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST) ». Parmi celles- ci, on relève essentiellement la maladie de Creutzfeld-Jakob chez l'homme, la tremblante chez le mouton et la chèvre, et l'encéphalopathie spongiforme bovine chez les bovins (ESB).

Le dépistage de ces maladies, dont l'évolution est constamment fatale puisqu'aucun traitement efficace n'est encore proposé, ne peut tre effectué que par le biais d'échantillons biologiques, essentiellement de matière cérébrale, prélevée puis analysée en post-mortem. La biopsie cérébrale, possible chez l'homme pour le diagnostic ante-mortem, n'est plus faite aujourd'hui pour le risque de contamination que le geste fait courir aux acteurs.

Il n'est donc pas possible à l'heure actuelle de dépister un individu atteint d'une ESST pendant sa vie durant, sans risque de contamination.

Dès lors, le problème que se propose de résoudre l'invention est de proposer un réactif destiné au dépistage ante-mortem d'ATNC, qui ne présente aucun risque de contamination.

On connaît de par l'article HSICH et coll. publié dans le NEJM en date du 26 septembre 1996,335, volume 13, pages 924-930 « The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encéphalopathies », que l'on retrouve systématiquement dans un certain nombre de liquides biologiques, tels que le LCR, le sang (sérum, plasma, concentré leucocytaire), la

lymphe, l'urine ou encore le lait d'individus atteints d'une ESST, un marqueur protéique d'antigène, identifié sous la dénomination « protéine 14-3-3 ».

Pour résoudre le problème précédemment décrit, l'invention propose donc un réactif destiné au dépistage ante-mortem d'ATNC susceptible d'tre obtenu par un procédé selon lequel : - dans une première étape, on met en contact tout ou partie de la protéine 14-3-3 ou de l'anticorps anti-protéine 14-3-3 avec une solution aqueuse aldéhydique pour obtenir une dilution finale d'aldéhyde comprise entre 1 et 2 %, - dans une seconde étape, on fixe tout ou partie des protéines 14-3-3 ou des anticorps anti-protéine 14-3-3 contenus dans le produit issu de la première étape sur un support en présence d'une solution aqueuse aldéhydique.

En d'autres termes, l'invention consiste en un réactif constitué pour l'essentiel de supports sur lesquels sont fixés soit tout ou partie des anticorps anti- protéine 14-3-3 ou soit tout ou partie des protéines 14-3-3, disponibles aujourd'hui dans le commerce et synthétisés artificiellement. L'aldéhyde remplit une fonction différente dans chaque étape, respectivement : - dans la première étape, une fonction d'augmentation de l'efficacité du titrage et partant d'amélioration de la sensibilité du test sans altération du caractère antigénique des protéines ou des anticorps anti-protéines, - dans une seconde étape, une fonction de couplage des anticorps ou des protéines au support.

Pour ne pas altérer le caractère antigénique des protéines 14-3-3, ou des anticorps anti-protéines 14-3-3, le temps de contact entre les éléments précités et la solution aldéhydique dans la première étape est avantageusement inférieur à 1 heure, de préférence supérieur à 15 minutes.

L'aldéhyde utilisé en pratique est le glutaraldéhyde.

En pratique, les supports destinés à supporter soit les anticorps anti-protéines 14-3-3 soit les protéines 14-3-3, sont des globules rouges, notamment aviaires ou encore des membranes artificielles.

Selon une autre caractéristique du procédé, la concentration de l'aldéhyde dans la solution aqueuse utilisée dans la seconde étape est comprise entre 0,01 et 0,1 M.

Dans un mode de réalisation avantageux, on intercale entre la première et la seconde étape, une étape de lavage du produit obtenu à l'issue de la première étape.

L'invention concerne également le procédé de dépistage ante-mortem d'ATNC dans un échantillon biologique.

Ce procédé consiste à mettre en présence d'un échantillon biologique le réactif tel que décrit ci-avant, puis à détecter par agglutination et/ou inhibition d'agglutination, la présence ou l'absence de tout ou partie d'anticorps anti-protéine 14-3-3 ou de protéines 14-3-3 dans ledit échantillon.

Comme déjà dit, l'échantillon biologique est avantageusement choisi parmi les liquides biologiques choisis dans le groupe comprenant le LCR, le sang (sérum, plasma, concentré leucocytaire), la lymphe, l'urine, et le lait.

Dans le mode de réalisation selon lequel les supports ou membranes artificielles sont sensibilisés aux marqueurs, c'est-à-dire à la protéine 14-3-3, la présence d'une agglutination par des anticorps anti-protéine 14-3-3, après mise au contact avec le produit biologique, signe l'absence d'antigène dans le sang, c'est-à- dire l'absence d'infection. Au contraire, l'absence d'une agglutination signe la présence d'antigènes dans l'échantillon biologique, et donc celle de l'infection.

Dans le mode de réalisation selon lequel les supports sont sensibilisés avec un anticorps anti-protéine 14-3-3, l'agglutination directe desdits supports avec la protéine 14-3-3, signe la présence de l'antigène dans l'échantillon biologique, et donc celle de l'infection.

L'absence d'agglutination peut tre due au fait que le marqueur n'est pas en quantité suffisante dans l'échantillon. Dans ce cas, on ajoute un excès de protéines 14-3-3 dans l'échantillon biologique. L'absence d'agglutination signe alors la présence d'antigènes. Au contraire, la présence d'une agglutination témoigne de l'absence d'antigène.

L'invention concerne également un procédé de dosage ante-mortem d'ATNC dans un échantillon biologique, selon lequel on mélange ledit échantillon à étudier à différentes dilutions avec le réactif ci-avant décrit, on observe ensuite à quelle dilution il y a agglutination et/ou inhibition d'agglutination, puis on détermine la concentration de l'échantillon en protéines 14-3-3 ou en anticorps anti-protéine 14-3-3 en se référant à un étalon.

L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux de l'exemple de réalisation suivant.

Préparation de globules rouges aviaires sensibilisés par la protéine 14-3-3 On prépare une suspension de protéine 14-3-3 dans une solution tampon PBS contenant du glutaraldéhyde pour obtenir une dilution finale de 1,5 %. Le temps de contact entre la solution de glutaraldéhyde et les protéines est de 20 minutes.

Parallèlement, des globules rouges de dinde sont mis en suspension dans un tampon PBS de pH 7,4, à raison de 5 ml de globules rouges dans un volume de 100 ml de PBS.

On ajoute alors à cette suspension, une solution aqueuse de glutaraldéhyde de concentration égale à 0, 05 M et la solution de protéines obtenue dans la première étape.

On laisse agir les globules rouges, le glutaraldéhyde et la protéine pendant 10 minutes. On lave ensuite les globules rouges sensibilisés obtenus par centrifugation, puis remise en suspension dans une solution tamponnée PBS. On ajoute alors à la suspension une solution de lysine et on laisse réagir pendant 15 à 30 minutes.

Les globules rouges sensibilisés ainsi traités sont alors récupérés par centrifugation, puis lavés avant d'tre remis en suspension dans du PBS contenant 0,7/10 000 (poids/volume) d'azoture de sodium.

L'utilisation du réactif ainsi fabriqué, chez le mouton, dont la scrapie ou tremblante représente une forme d'encéphalite spongiforme, a permis de mettre en évidence dans le LCR, prélevé au moment du décès, une réaction positive dans 4 cas sur 5. Le test est resté négatif dans les deux cas où l'abattage a été effectué sur des animaux en bonne santé.

L'invention et les avantages qui en découlent ressortent bien de la description qui précède.

On note en particulier la possibilité de procéder à un diagnostic des maladies prioniques chez l'homme et chez l'animal en ante-mortem par le biais d'un test simple à mettre en oeuvre et fiable, et sans risque de contamination.