Campo de Ia técnica La presente invención está relacionada con Ia rama de Ia inmunología y las vacunas virales, particularmente con el Virus de viruela aviar recombinante para combinaciones proteicas basadas en antígenos del virus de Ia hepatitis C (VHC) y composiciones farmacéuticas capaces de inducir una respuesta inmune celular contra el VHC.

Estado de Ia técnica anterior El VHC es identificado por primera vez en el año 1989, mediante el empleo de técnicas de biología molecular, como el principal agente causal de las hepatitis No-A, No-B postransfusionales (Choo Q-L., Kuo G., et al. (1989) Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244:359- 62; EP0318216 Chiron Corp). Actualmente existen en el mundo más de 170 millones de personas infectadas por este agente viral. El 85 % de las infecciones por el VHC son persistentes, causando frecuentemente cirrosis y carcinoma hepatocelular (Caselmann W. H., AIt M. (1996) Hepatitis C virus infection as a major risk factor for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 24:61-66). Se ha estimado que el 25 % de los portadores crónicos que viven al menos 20 años después de Ia infección por el VHC, desarrollan cirrosis y que de ellos, entre 1 y 4 % desarrolla carcinoma hepatocelular anualmente (Prince A.M., Shata MT. (2001) Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection. Clin. Liver. Dis. 5:1091-103). En Ia rama terapéutica, el tratamiento que ha rendido los mejores resultados consiste en Ia administración combinada de interferón alfa (IFN-α) pegilado y Ia ribavirina en regímenes intensivos. Sin embargo, este tratamiento es agresivo, costoso y efectivo en menos del 50 % de los casos (Prince A.M., Shata M.T. (2001) Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection. Clin. Liver. Dis. 5:1091-103). Se han evaluado como alternativas vacunales disímiles variantes de subunidades proteicas, partículas similares a virus, péptidos sintéticos, vectores vivos recombinantes y plasmidios para Ia inmunización con ADN, basadas en diferentes antígenos del VHC (US6635257, US6387662, US6235888, US6685944, US2003021805, Lechmann M., Liang TJ. (2000) Vaccine development for hepatitis C. Semin. Liver. Dis. 20:211-26). Algunas de estas variantes han demostrado su capacidad para inducir una respuesta inmune específica contra epitopos del VHC, aunque esta respuesta no parece ser aún suficiente. Hasta el momento no se han establecido completamente los parámetros inmunológicos que correlacionan con Ia protección a Ia infección por el VHC. Sin embargo, varios estudios sugieren que una respuesta temprana, vigorosa y multiespecífica de células T citotóxicas, caracterizadas por un patrón de citocinas característico de linfocitos T auxiliadores de tipo I1 favorece Ia resolución de Ia enfermedad y Ia inmunidad contra el virus. Por el contrario, una respuesta de células T tardía se relaciona con el establecimiento de Ia inmunopatología crónica del hígado (Cerny A., Chisari F.V. (1999) Pathogenesis of chronic hepatitis C: immunological features of hepatic injury and viral persistente. Hepatology. 30:595-601; Cooper S., et al. (1999) Analysis of a successful immune response against hepatitis C virus. Immunity 10:439-49; Lechner F., et al. (2000) Why do cytotoxic T lymphocytes fail to elimínate hepatitis C virus? Lessons from studies using major histocompatibility complex class I peptide tetramers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. ScL 355:1085-92; Takaki A., et al. (2000). Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades after recovery from a single-source outbreak of hepatitis C. Nat. Med. 6:578-82). Los vectores vivos recombinantes son candidatos atractivos para generar una respuesta inmune celular contra el VHC. La inmunización con adenovirus recombinantes para Ia cápsida y Ia E1 en ratones indujo una respuesta de tipo T citotóxica específica contra estos antígenos (Bruña-Romero O., et al. (1997) Induction of cytotoxic T-cell response against hepatitis C virus structural antigens using a defective recombinant adenovirus. Hepatology 25:470-7). Aunque estos resultados han sido alentadores, los problemas recientes con el uso de adenovirus recombinantes en terapia génica han creado incógnitas sobre su uso en humanos. El empleo de virus recombinantes de tipo vaccinia y virus de viruela de canarios, conteniendo diferentes genes del VHC ha inducido respuestas de tipo T citotóxicas en ratones, de acuerdo al antígeno evaluado, cuando se han combinado con candidatos basados en vacunas de ADN (Pancholi P., et al. (2000) DNA prime- canarypox boost with polycistronic hepatitis C virus (HCV) genes generates potent immune responses to HCV structural and nonstructural proteins. J. Infecí Dis. 182:18-27; Pancholi P., et al. (2003) DNA immunization with hepatitis C virus (HCV) polycistronic genes or immunization by HCV DNA priming-recombinant canarypox virus boosting induces immune responses and protection from recombinant HCV- vaccinia virus infection in HLA-A2.1-transgenic mice. J. Virol. 77:382-90). De hecho, no se ha evidenciado hasta el momento que Ia administración única de virus de viruela de canario recombinantes para antígenos de Ia región estructural del VHC induzca una respuesta celular in vivo efectiva por ejemplo en el modelo de reto con virus vaccinia recombinante. A este grupo de virus pertenece también el virus de viruela aviar (WA), cuyo empleo para Ia inducción de respuesta inmune no se ha reportado previamente para antígenos del VHC. El virus de viruela aviar no se replica en células de mamíferos, pero puede infectar y expresar eficientemente las proteínas codificadas por su genoma en el citoplasma. Debido a estas características, los riesgos regulatorios relacionados con el empleo en humanos es muy inferior al de otras variantes virales. Actualmente no existe ninguna vacuna disponible en el mercado y Ia mayoría de los estudios se concentran aún en Ia fase pre-clínica. Por tanto, Ia urgente necesidad de desarrollar un agente preventivo y/o terapéutico efectivo contra Ia infección por el VHC es un problema por solucionar.

Explicación de Ia invención Esta invención venciendo las limitaciones y el arte previo, resuelve el problema antes mencionado al proporcionar un virus de viruela aviar recombinante el cual contiene fragmentos de ADN derivados del virus de Ia hepatitis C en una región no esencial del genoma del WA, capaz de inducir una respuesta celular específica contra el VHC dependiendo de las regiones aminoacídicas provenientes de los antígenos del VHC contenidas en Ia proteína expresada por el WA. De acuerdo a Ia presente invención el virus FPCoEI expresa una proteína que comprende los aa 79-338 (SEQ ID No: 1) que incluye parte de Ia proteína de Ia cápsida y Ia E1 y el virus FPBS comprende una proteína quimérica (SEQ ID No: 2) que incluye epitopos específicos para linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ correspondientes a diferentes antígenos del VHC. En estos virus, Ia secuencia codificante para los antígenos del VHC procede del ADNc proveniente de un aislamiento cubano del VHC (Morales J, et al. WO 98/25960). Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para inducir respuesta inmune celular específica contra el VHC en sujetos vacunados. Dicha composición comprende una cantidad inmunizante efectiva del virus de viruela aviar recombinante y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los virus de viruela aviar que componen Ia invención tienen Ia capacidad de penetrar las células humanas y expresar los antígenos del VHC en el citoplasma de las mismas. La expresión en células humanas está dirigida por Ia unidad transcripcional, compuesta por un promotor inmediato/temprano sintético para WA. Estos virus contienen también el gen de Ia xantin guanosin fosforribosil transferasa bajo el control del promotor 7.5K de vaccinia. Estos virus no tienen capacidad para replicarse en humanos. Esta composición puede ser administrada por vía intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. El método de administración puede ser mediante jeringuillas, pistola de genes, spray u otros dispositivos de administración. Cada individuo recibe una dosis que oscila desde 2.5 x 107 a 1 x 108 UFP/dosis en un volumen determinado. En esta invención se describen también los procedimientos para Ia inmunización de los WA en esquemas alternos con plasmidios para Ia inmunización con ADN. Los WA también pueden ser administrados en esquemas alternos con proteínas u otros virus recombinantes para antígenos del VHC, o en esquemas paralelos con citocinas y otros compuestos inmunomoduladores. Estas combinaciones permiten Ia aparición de nuevas especificidades epitópicas o Ia potenciación de alguna rama de Ia respuesta inmune en particular. Las composiciones farmacéuticas compuestas por virus de viruela aviar recombinantes para antígenos del VHC pueden tener las siguientes ventajas: - Es posible obtener una respuesta celular específica vigorosa. - Se requiere un reducido número de dosis para lograr el efecto deseado. - Es posible el empleo de estas formulaciones como núcleo para vacunas combinadas. - No se requiere adyuvación. - Pueden ser empleadas en combinación con agentes antivirales. Dependiendo de las circunstancias, a determinar en cada caso, Ia composición farmacéutica de Ia presente invención puede administrarse para inducir inmunidad contra el VHC antes de, simultáneamente o después de otra terapia o vacuna, igualmente para inducir inmunidad preventiva contra Ia infección por el VHC y para inducir inmunidad contra el VHC en pacientes con hepatitis C crónica, cirrosis y cáncer de hígado. Breve descripción de los dibujos Figura 1: Representación esquemática de Ia región correspondiente a los antígenos del VHC en los virus de viruela aviar recombinantes. Figura 2: Esquema de inmunización con los diferentes virus de viruela aviar. Respuesta de anticuerpos (A). Respuesta de linfocitos secretores de interferón gamma (B). Respuesta frente al reto con virus vaccinia (C) Figura 3: Esquema de inmunización con FPCoEI y FPBS por diferentes vías de inoculación. Respuesta frente al reto con virus vaccinia recombinante para los antígenos de Ia región estructural del VHC. Figura: 4: Esquema de inmunización con FPCoEI y FPBS con diferentes cantidades. Respuesta frente al reto con virus vaccinia recombinante para los antígenos de Ia región estructural del VHC. Figura: 5: Esquema de inmunización basado en combinaciones de FPCoEI y una formulación de una vacuna de ADN. Respuesta de anticuerpos contra Core, E1 y E2 (A). Respuesta frente al reto con virus vaccinia recombinante para los antígenos de Ia región estructural del VHC (B).

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN Como se entiende en esta invención, los términos Virus de Hepatitis C o VHC describen al virus de una manera genérica, por Io que los términos no son limitantes a una secuencia viral particular del VHC o aislamiento. A si mismo por secuencia codificante se entiende una molécula de ácido nucleico Ia cual es traducida a un polipéptido, usualmente vía ARNm, cuando es colocada bajo control de una secuencia regulatoria apropiada. En este caso una secuencia codificante puede incluir, pero no es limitante para ADNc y secuencias nucleotidicas recombinantes. La presente invención será descrita más completamente mediante los ejemplos siguientes, los cuales son ilustrativos y no limitan el alcance de Ia invención.

Ejemplo 1: Evaluación de los virus FPCoEIc, FPCoEI, y el FPBS Con el objetivo de evaluar Ia capacidad de virus de viruela aviar recombinantes para antígenos del VHC de inducir una respuesta inmune celular específica se obtuvieron los virus FPCoEIc, FPCoEI y FPBS. La Figura 1 muestra una representación esquemática de la secuencia correspondiente a los antígenos del VHC. Los virus fueron obtenidos de Ia siguiente forma. Fibroblastos de pollo fueron infectados con WA y posteriormente fueron transfectados con los plasmidios pFPCoElc, pFPCoEl o pFPBS utilizando lipofectamina (Invitrogen, USA). Estos plasmidios son derivados del plasmidio pFP67xgpt (Vázquez-Blomquist D., González S., Duarte CA. (2002) Effect of promoters on cellular immune response induced by recombinant fowlpox virus expressing multi-epitope polypeptides from HIV-1. Biotechnol. Appl. Biochem. 36:171-9) que contienen Ia secuencia codificante para las regiones que comprenden los aa 1-338, aa 79-338 (SEQ ID No: 1), o Ia secuencia codificante para una proteína quimérica basada en epitopos específicos para linfocitos T (SEQ ID No: 2) (plasmidios pFPCoElc, pFPCoEl y pFPBS, respectivamente). A continuación se realizaron varios ciclos de purificación viral en medio selectivo con xantina, hipoxantina y ácido micofenolico. Después se amplificó el producto viral de una placa de infección y se confirmó Ia presencia del inserto correspondiente al VHC mediante reacción en cadena de Ia polimerasa. Se analizó Ia inmunogenicidad de los virus FPCoEIc, FPCoEI y FPBS en ratones BALB/c hembras de 8 semanas, después de administrar 2 dosis de 2.5x107 UFP por vía intraperitoneal con un intervalo de 3 semanas entre ellas. Los grupos de inmunización estuvieron compuestos por 10 animales. La Figura 2A muestra que solo Ia inmunización con el FPCoEI fue capaz de inducir niveles detectables de anticuerpos contra Core y El Sin embargo, Ia Figura 2B muestra Ia inducción de una respuesta positiva de linfocitos secretores de IFN-gamma en los animales inmunizados con el FPCoEI y el FPBS, estadísticamente superior (Prueba T de Student, p<0.05) a Ia detectada en los animales inmunizados con el virus negativo (FP9). La inmunización con el FPCoEIc no indujo una respuesta positiva de linfocitos secretores de IFN-gamma. Adicionalmente, como se muestra en Ia Figura 2C, los animales de los grupos inmunizados con los virus FPCoEI y FPBS fueron capaces de reducir de manera significativa (Prueba T de Student, p<0.05) Ia carga viral en ovarios después del reto con 106 UFP de un virus vaccinia recombinante (vvRE) para los antígenos de Ia región estructural del VHC (aa 1-650 de Ia poliproteína viral) con relación a Ia observada después del reto con el virus vaccinia no recombinante para antígenos del VHC (WR). Igualmente Ia carga viral del vvRE en los animales inmunizados con el FPCoEI y el FPBS fue estadísticamente inferior a Ia detectada en los animales inmunizados con el virus de viruela aviar negativo FP9 (Prueba T de Student, p<0.05). La inmunización con el FPCoEIc no redujo de forma significativa Ia carga viral en ovarios. El reto con virus vaccinia se realizó por vía intraperitoneal, 2 semanas después de Ia última inmunización con los virus de viruela aviar. La extracción de los ovarios se realizó 5 días después de inoculado el vvRE. El ensayo de reto con virus vaccinia recombinante ha sido ampliamente evaluado para evidenciar Ia capacidad de un candidato vacunal de inducir una respuesta celular fuerte in vivo. Particularmente, Ia reducción del título viral en ovarios se relaciona fundamentalmente con Ia inducción de una fuerte respuesta de linfocitos T CD8+.

Ejemplo 2: Vías de administración de VVA (intraperitoneal, subcutánea e intramuscular) Con el objetivo de evaluar Ia influencia de Ia vía de inoculación sobre Ia respuesta inmune generada por los virus de viruela aviar recombinantes, se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas. Los grupos de inmunización estuvieron compuestos por 10 animales. Los virus (2.5x107 UFP) fueron administrados por vía intraperitoneal, intramuscular o subcutánea en 2 ocasiones con intervalo de 3 semanas entre ellas. La Figura 3 evidencia que no existió diferencias significativas entre las vías de inmunización en cuanto a Ia capacidad de los virus de viruela aviar recombinantes FPCoEI y FPBS para reducir Ia carga viral del virus vaccinia recombinante vvRE en ovarios. Estos 2 recombinantes indujeron una respuesta positiva de reducción de Ia carga viral con relación al virus de viruela aviar control negativo FP9 (Prueba T de Student, p<0.05). El reto viral se realizó mediante Ia inoculación intraperitoneal de 106 UFP del vvRE, 2 semanas después de Ia última dosis con los virus de viruela aviar. La extracción de los ovarios se realizó 5 días después de inoculado el vvRE.

Ejemplo 3: Comparación de las dosis (0.9x107, 2.5x107, 5x107, 1x108) Fueron inmunizados por vía intramuscular, ratones BALB/c hembras en las semanas 0 y 3 con diferentes cantidades de los virus recombinantes. Los grupos de inmunización estuvieron compuestos por 10 animales. Como se aprecia en Ia Figura 4, los animales inmunizados con 0.9x107 UFP no tuvieron diferencias significativas entre Ia carga viral detectada en ovarios del vvRE después del reto con 106 UFP de este virus vaccinia, 2 semanas después de Ia última inmunización con los virus de viruela aviar. En cambio, Ia administración de 2.5x107, 5x107, 1x108, de FPCoEI y FPBS redujo de manera significativa el título de vvRE en ovarios con relación al detectado en animales inmunizados con cantidades similares del virus de viruela aviar control negativo FP9 (Prueba T de Student, p<0.05). En todos los casos, Ia extracción de los ovarios se realizó 5 días después de inoculado el vvRE.

Ejemplo 4: Esquemas alternos con ADN y VVA Con el objetivo de evaluar Ia respuesta inmune inducida en esquemas que combinasen un candidato vacunal de ADN con un virus de viruela aviar recombinante para antígenos del VHC se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas. Los grupos de inmunización estuvieron compuestos por 10 animales. Un grupo (Co- plDKE2) fue inmunizado por vía intramuscular en Ia semana 0, 3, 7 y 12 con una mezcla de 100 μg de un plasmidio que expresa los primeros 650 aa de Ia poliproteína del VHC, plDKE2 (Dueñas-Carrera S., et al. (2004). Immunization with a DNA vaccine encoding the hepatitis-C-virus structural antigens elicits a specific immune response against the capsid and envelope proteins in rabbits and Macaca ¡rus (crab- eating macaque monkeys). Biotechnol Appl Biochem. 39:249-55) y 10 μg de Ia proteína recombinante de Ia cápsida del VHC, Co.120 (Alvarez-Obregon J. C, et al. (2001). A truncated HCV core protein elicits a potent immune response with a strong participation of cellular immunity components in mice. Vaccine 19:3940-46). Un grupo de animales (pAEC-K6) fue inmunizado en condiciones similares con el plasmidio control negativo pAEC-K6 (Herrera A.M., et al. (2000). A family of compact plasmid vectors for DNA immunization in humans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-51). Otro grupo fue inmunizado con 2.5x107 UFP del FPCoEI por vía intramuscular en las semanas 0 y 3. También se inmunizaron animales con el virus de viruela aviar control negativo FP9 en las mismas condiciones. Adicionalmente, un grupo (Co-plDKE2/FPCoE1) fue inmunizado por vía intramuscular en las semanas 0 y 3 con Ia mezcla Co-plDKE2 y en las semanas 9 y 12 con el FPCoEl Otro grupo (Co-plDKE2/FP9) fue inmunizado de forma similar, pero las dosis de Ia semana 6 y 9 fueron administradas con el FP9. En Ia Figura 5 A se aprecia que los mayores niveles de anticuerpos se indujeron en el grupo Co-plDKE2 (Prueba T de Student, p<0.05). Además, Ia administración alterna de Co-plDKE2 y FPCoEI indujo niveles de anticuerpos superiores a los detectados en el grupo inmunizado con el FPCoEI solo (Prueba T de Student, p<0.05). En Ia Figura 5 B se puede apreciar que tanto los grupos inmunizados con FPCoEI, Co-plDKE2, como los inmunizados con Co- plDKE2 en las 2 primeras dosis y FPCoEI en las otras 2, redujeron de forma significativa (Prueba T de Student, p<0.05) Ia carga viral del vvRE después del reto con relación a los animales inmunizados con los controles negativos. El valor promedio más bajo de carga viral fue detectado en los animales inmunizados con Co- plDKE2 en las 2 primeras dosis y FPCoEI en las otras 2. El reto viral se realizó mediante Ia inoculación intraperitoneal de 106 UFP del vvRE, 2 semanas después de Ia última dosis con los virus de viruela aviar. La extracción de los ovarios se realizó 5 días después de inoculado el vvRE. LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

<120> VECTORES VIVOS RECOMBINANTES Y SU USO EN COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS CONTRA EL VIRUS DE LA HEPATITIS C

<130> Sec VHC

<140> <141>

<150> CU 2004-0174 <151> 2004-08-11

<160> 2

<170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 831 <212> ADN <213> Fragmento de ADN del VHC del nucleótido 237 al 1014

<400> 1 atgaggcctc ccgggtaccc ttggcccctc tatggtaacg agggcatggg atgggcagga 60 tggctcctgt caccccgtgg ctctcggcct agttggggcc ccactgaccc ccggcgtagg 120 tcgcgtaatt tgggtaaggt catcgatacc ctcacatgcg gcttcgccga cctcatgggg 180 tacattccgc tcgtcggcgc ccccctaggg ggcgctgcca gggccctggc gcatggcgtc 240 cgggttctgg aggacggcgt gaattatgca acagggaatc tgcccggttg ctctttctct 300 ctcttccttt tggctttgct gtcctgtttg accatcccag tttccgccta tgaagtgcgc 360 aacgcgtccg gggtgtacca tgtcacgaac gactgctcca actcaagcat tgtgtatgag 420 gcagacgaca tgatcatgca cacccccgga tgcgtgccct gcgttcggga ggacaacacc 480 tcccgctgct gggtagcgct cacccccaca ctcgcggcca ggaatgccag cgtccccacc 540 acgacaatac gacgccacgt cgatttgctc gttggggcgg ctgctctctg ctccgctatg 600 tacgtggggg atctctgcgg atctgttttc ctcgtttccc agctgttcac cttctcgcct 660 cgccggcatg agacagcaca ggactgcaac tgctcaatct atcccggcca cgtatcaggt 720 caccgcatgg cctgggatat gatgatgaac tggtcacctt caacagccct agtggtatcg 780 cagttactcc ggatccgtcg acctgcagca tgccatggca taagtgacta g 831

<210> 2 <211> 602 <212> DNA <213> Secuencia Artificial que incluye epitopos del VHC

<400> 2 atgggatcca cccacgtgac cggcggcagc caggcccgca ccacccacag cttcacctcc 60 ctgctgcgcc agggcgccaa gcagaacgtg cagctgatcg gcaaggtgat cgacaccctg 120 accagcggct tcgccgacct gatgggctac atcccactgg tgggcgcccc actgggcggc 180 gccgcccgcg ccaagaaggg ccacgtgagc ggccaccgca tggcctggga catgatgatg 240 aactgggcca gcaagaaggc cgccagccgc gccgccggct tgcaggacag caccatgctg 300 gtgagcgaag gccgcagctg ggcccagcct ggctacccat ggccactgta tggcaacgag 360 ggcatgggca agaagggctc cagcttcagc ctgttcctgt tggccctcct gagcagcttg 420 accatcaaga agatgagcta ctcctggacc ggcgccctgg tgaccccaag cgccgccgag 480 aagaagctgt tgttcaacat cctgggcggc tgggtgaaga agagcatggt gggcaactgg 540 gccaaggtga agaagtacac cggcgacttc gacagcgtga tcgactccag gccttaactg 600 ca 602