Proteína recombinante del receptor de la ferri-piscibactina y su aplicación para la producción de una composición inmunogénica frente a la pasteurelosis

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro de ia bioiogía y de ia biología molecular, y se refiere a la elaboración de composiciones inmunogénicas que comprenden la proteína del receptor de la ferri-piscibactina (FrpA) de Photobacterium damseiae subsp. piscicida para el desarrollo de una vacuna frente a la pasteurelosis que afecta a especies de peces de interés comercial de la industria acuícoia.

ESTADO DE LA TÉCNICA Photobacterium damse!ae subsp. piscicida (PhDP) es una bacteria gram-negatíva conocida previamente como Pasteureíia piscicida. PhDP es el agente causal de ia pasteurelosis, fotobacteriosis o pseudotuberculosís, una enfermedad devastadora en ia acuicultura marina que provoca elevadas mortalidades, posee un amplio rango de hospedadores, afectando a más de 20 especies de peces de interés acuícoia, y tiene una amplia distribución global (Romalde, 2002., Int. Microbio!. 5 (1): 3-9; Thyssen et ai., 1998. Int. J. Syst. Bacterio!. 48: 1 145-1 151 ; Toranzo et al., 2005. Aquacuiture. 246 (1-4): 37-61 ; Barnes et al. 2005., Dev. Biol. (Basel)A2V. 75-84).

PhDP es un patógeno facultativo intraceiuiar capaz de promover su internalización en las células del hospedador (Acosta et al. 2009., J. Fish Dis. 32(6): 535-541). El hecho de que PhDP sea un parásito intraceiuiar capaz de resistir a la fagocitosis hace que sea un patógeno difícil de detectar por el sistema inmune del hospedador a ia vez que dificulta los tratamientos químíoterápicos (Do Vale et ai., 2005. Mol. Microbio!. 58(4): 1025-1038).

La pasteurelosis puede cursar de forma aguda, provocando grandes mortalidades, o de modo crónico asintomático. Las infecciones asintomátícas afectan tanto a peces cultivados como a animales salvajes, siendo las poblaciones naturales de peces y moluscos el reservorio natural del patógeno (Serraca et al., 201 1. Can. J. Microbio!. 57(5): 437-40). Los peces enfermos suelen perder peso, presentar un oscurecimiento de la piel, necrosis en las branquias y en las visceras suelen apreciarse granulomas blancos. Los brotes de pasteureiosis se producen en ios meses de primavera y verano y se asocian a condiciones de estrés de ios peces y a la baja calidad del agua: temperatura alta (> 18°C) y baja salinidad (Magariños eí ai., 1996, Annu. Rev, Fish Dis. 6(0): 41-64). La enfermedad aparece mayoritariamente durante el estado larvario, provocando mortalidades de hasta el 90%, pero también afecta a peces juveniles en ios que ocasiona pérdidas del 50%. Tras ios brotes agudos, los animales asintomáticos se convierten en portadores y pueden desarrollar la enfermedad cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables para el patógeno. Además, se ha detectado la presencia de PhDP en fluidos ováricos y huevos provenientes de reproductores sanos, lo que indica una probable transmisión vertical (Romaide eí al., 1999. J. Microbiol. Methods. 38 (1-2): 147-154) Todo ello hace que ios brotes de pasteureiosis sean un problema recurrente en las plantas de acuicultura debido a su difícil erradicación y control.

Iniciaimente, ios brotes de pasteureiosis aparecieron mayoritariamente en Japón; sin embargo, en la década de 1990 empezaron a detectarse ios primeros brotes en Europa, Aunque las cepas de PhDP muestran características bioquímicas y serológicas muy homogéneas, se sabe que pueden agruparse en dos lineas clónales: una formada por los aislados de origen japonés y la otra formada por los aislados de origen europeo y americano (Magariños et al., 2000. Epidemiol. Infecí. 125 (1): 213- 219). Las bacterias patógenas tienen una serie de herramientas, denominadas factores de virulencia, que les permiten colonizar y persistir dentro de un hospedador. Los principales factores de virulencia descritos en PhDP son la presencia de una cápsula de polisacáridos y actividades enzimáticas como proteasas, fosfoiipasas, iipasas y hemoiisinas (Thyssen et al., 2000. Int. J. Sysí. Evo!. Microbiol. 50 (3): 1013- 1019; Magariños et ai, 1996. Microb. Paíhog. 21 (4): 289-297). De todos los factores de virulencia descritos en esta bacteria los más importantes son la producción de la toxina apoptótica AIP56, que le permite resistir la fagocitosis, y la producción y utilización de piscibactina, un potente sideróforo que le permite captar hierro del hospedador (Souto et ai, 2012. Eur. J. Org. Chem. 29: 5693-5700; Osorio et ai, 2006. Microbiology. 152 (1 1): 3327-3341). De hecho, se ha demostrado que al inactivar ios genes de biosíntesis de la piscibactina se produce una disminución significativa de la virulencia (Osorio eí al., 2006. Microbiology. 152 (1 1): 3327-3341). El sistema de la piscibactina está codificado en el plásmido pPHDP70 cuya presencia es una característica común a todos los aislados europeos y además se sabe que constituye un factor de virulencia clave (Osorio et al., 2015. App!. Environ. Microbio!. Jun19, 19. pii: AEM.01580-15). El grupo de genes que forman el sistema de la piscibactina incluye el gen denominado frpA que codifica al receptor de membrana externa FrpA. De acuerdo a la función de los homólogos FrpA participaría en la internalización del complejo hierro-piscibacfina. Sin embargo, todavía no se ha descrito la función concreta del gen frpA, ni de la proteína que codifica. Por otro lado, es interesante mencionar que el plásmido pPHDP70, y por tanto todos ios genes del sistema de sideróforos piscibactina incluido frpA, tienen la capacidad de transmitirse a otras bacterias potencialmente patógenas presentes en una misma planta de acuiculfura (Osorio et al., 2015. App!. Environ. Microbio!. Jun19, 19. pii: AEM.01580-15).

La primera estrategia utilizada para combatir la enfermedad se basó en el uso de antibióticos, pero la aparición de cepas resistentes y muitiresistentes provocó que esta estrategia fuese rápidamente ineficiente. Además, la persistencia de estas sustancias en el pez y el impacto que provocan al medioambiente hace que su utilización sea cada vez más restrictiva. En las últimas décadas los esfuerzos para controlar ¡a enfermedad se han centrado en el desarrollo de vacunas efectivas. Son numerosas las vacunas desarrolladas frente a PhDP y entre ellas podemos encontrar de diversos tipos y formulaciones. Sin embargo, ios niveles de protección en el pez no suelen ser satisfactorios. Las vacunas convencionales, llamadas bacterinas, están compuestas por cultivos de la bacteria inactivados por calor, formo! u otros métodos. Además este tipo de vacunas pueden ser enriquecidas con antígenos solubles como iipopolisacáridos (LPS), proteínas de membrana externa (OMP), componentes de la cápsula (CPS) o productos extracelulares (ECPs). De las numerosas vacunas disponibles la ICTH!OVAC-PD (vacuna DI21) comercializada por Hipra (España), es la que ha mostrado mayores grados de protección (protección en lubina > 60%) (Magariños et al., 1994. Bu!!. Eur. Assoc. Fish Paihol. 14 (4): 120-122). Se trata de una bacterina enriquecida con ECPs que se viene utilizando desde mediados de los años noventa.

El desarrollo de las técnicas de biología molecular ha permitido utilizar nuevas estrategias para la formulación de vacunas. En ios últimos años se han publicado trabajos en los que se opta por la utilización como antígeno de proteínas recombinantes purificadas a partir de cultivos de E. coü que, formuladas junto a otros componentes como sustancias adyuvantes o nano y microsistemas de vectorización, están obteniendo resultados prometedores, postulándose como candidatos potenciales para desarrollar nuevas vacunas para distintas especies de peces (Andreoni et al., 2013. Vaccine. 31 (5): 820-826; Ho L-P et al., 2011. Fish Sheiifish Immunol. 30 (1): 412-419; Ho L-P et ai, 2014. J. Fish Dis. 37 (1): 51-56; Zhao et ai 2014. Vaccine 32: 327-337).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La estrategia basada en el uso de antibióticos a gran escala para el tratamiento de ¡a pasteurelosis ha dado lugar a la aparición de cepas resistentes y muí ti resistentes que han hecho que su uso sea ineficiente. Además, la persistencia de los quimioterápicos en el pez y el impacto que provocan al medioambiente hace que su utilización sea cada vez más restrictiva. El desarrollo de la biología molecular ha permitido, en ios últimos años, la formulación de vacunas basadas en el uso de proteínas recombinantes en el papel de antígeno. En la presente invención se describe por primera vez el uso de la proteína recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) obtenida a partir de la secuencia nativa de la proteína FrpA (SEQ ID NO: 2) de PhDP para el control de la pasteurelosis en peces.

Dado que las proteínas más ¡nmunogénicas son las que forman parte de su superficie celular (Scarselii eí ai, 2005. Trends Biotechnoi. 23(2): 84-91), creemos que la utilización del receptor de membrana externa FrpA, necesario para la internalización de piscibactina, actuará como un antígeno eficaz capaz de activar el sistema inmune específico del pez. Para ello, en la presente invención se ha clonado el gen frpA (SEQ ID NO: 1) de PhDP en E. coli permitiendo la producción y purificación de la proteína recombinante FrpA (rFrpA) (SEQ ID NO: 4). La presente invención muestra además la formulación de un preparado inmunogénico a base de rFrpA (SEQ ID NO: 3 o 4) y un adyuvante oleoso como el de Freund para obtener una vacuna frente a la pasteurelosis. La optimización de un protocolo de vacunación y ios experimentos de infección experimental en lenguado (Solea senegalensis y Solea solea) indican que la inmunización con la proteína recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) induce la producción de anticuerpos específicos frente al receptor de la piscibactina, FrpA, confiriendo además una protección satisfactoria frente a PhDP. Así, un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína de PhDP, la FrpA, caracterizada por la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, o a la proteína recombinante rFrpA caracterizada por que comprende la SEQ ID NO: 4, o a poiipéptidos con, ai menos, un 80% de porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 2, así como a fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA, que mantienen las propiedades antigénicas de FrpA. En un aspecto particular de la invención, ésta se caracteriza por que la proteína recombinante comprende la SEQ ID NO: 4, y además se caracteriza por que dicha proteína recombinante al menos mantiene las propiedades antigénicas de la proteína FrpA (SEQ ID NO: 2). Cualquiera de estas proteínas o poiipéptidos puede incluirse en una composición inmunogénica que permite la producción de una vacuna frente a PhDP.

El uso de la vacuna así elaborada logra tasas de protección en peces iguales o superiores al 80% frente a peces no vacunados.

En esta memoria descriptiva se entiende como propiedades antigénicas la capacidad de una sustancia de ser reconocida por el sistema inmune de un organismo como un elemento extraño y generar una respuesta inmune específica que desemboca en la producción de anticuerpos contra dicha sustancia.

En esta memoria descriptiva se entiende por porcentaje de identidad de la secuencia aminoacídica el porcentaje de coincidencias de los mismos aminoácidos entre las dos secuencias alineadas, a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias. Además, los poiipéptidos con, al menos, un 80% de identidad con SEQ I D NO: 2 así como, los fragmentos inmunogénicos a los que se refiere la presente memoria son aquellos que mantienen las características antigénicas de la proteína FrpA.

En esta memoria descriptiva se entiende como fragmento inmunogénico un péptido capaz de activar el sistema inmune específico del pez generando anticuerpos frente a pasteurelosis.

La invención también se refiere ai gen que codifica la proteína FrpA de PhDP, caracterizado por la secuencia nucleofídica SEQ ID NO: 1 y a secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, ai menos, el 70% o aquellas que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas.

En esta memoria descriptiva se entiende por porcentaje de identidad de la secuencia nudeotídica el porcentaje de coincidencias de los mismos nudeotidos entre dos secuencias alineadas, a lo largo de toda la longitud de ambas secuencias.

Otro aspecto de la invención se refiere a la secuencia nudeotídica del gen frpA que comprende la SEQ ID NO: 1 , o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia SEQ ID NO: 1 , o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA (SEQ ID NO: 2} que mantienen las propiedades antigénicas, clonadas en un vector recombinante que, asimismo, es susceptible de incluirse en células o microorganismos hospedadores en los que se expresan las secuencias nucleotídicas descritas.

En un aspecto particular, la secuencia nudeotídica descrita en la presente invención es una secuencia nudeotídica recombinante, caracterizada por que comprende una secuencia de nudeotidos de SEQ ID NO: 3 que codifica una proteína recombinante rFrpA que preferentemente comprende la SEQ ID NO: 4 y que mantiene las propiedades antigénicas de la proteína FrpA que comprende la SEQ ID NO: 2.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector recombinante caracterizado por que comprende la secuencia nudeotídica recombinante descrita en la presente invención, preferentemente, donde dicha secuencia nudeotídica recombinante comprende la SEQ ID NO: 3.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula o microorganismo que comprende el vector recombinante descrito anteriormente. Otro aspecto de la invención se refiere a un organismo transgénico no humano que contiene, insertado en su genoma, una secuencia nudeotídica SEQ ID NO: 1 , secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70%, secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas o vectores que comprenden cualquiera de las anteriores secuencias. En una realización preferida, el organismo transgénico no humano comprende, insertado en su genoma, una secuencia nucleotídica recombinante que comprende la SEQ ID NO: 3, una secuencia aminoacídica recombinante que comprende la SEQ I D NO: 4, o un vector recombinante descrito anteriormente, que comprende la secuencia nucleotídica recombinante que comprende la SEQ I D NO: 3.

La invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende ai menos uno de los elementos seleccionados de entre cualquiera de los siguientes: la proteína FrpA (SEQ I D NO: 2), la proteína recombinante rFrpA (SEQ I D NO: 4), poüpépfidos con, al menos, un 80% de identidad con la proteína FrpA o fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antígénicas; la molécula nucleotídica del gen de FrpA (SEQ I D NO: 1 ), secuencias nucleotídicas recombinantes de! gen de FrpA (SEQ I D NO: 3), secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antígénicas; vectores recombinantes que comprenden cualquiera de estas secuencias nucleotídicas, o células, microorganismos u organismos transgénicos no humanos portadores de vectores que incluyen la molécula nucleotídica del gen de FrpA, secuencias con, ai menos, un 70% de identidad con dicha secuencia nucleotídica o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antígénicas.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición inmunogénica para la elaboración de un medicamento, preferentemente una vacuna. Alternativamente, la invención se refiere a la composición inmunogénica para su uso como medicamento, preferentemente una vacuna. Esta composición inmunogénica se puede utilizar en la elaboración de una vacuna o preparación farmacéutica con actividad inmunizadora para su administración a peces con el fin de conferirles protección frente a la pasteurelosis, enfermedad causada por la infección por PhDP, Alternativamente, se refiere a la composición inmunogénica para su uso en el tratamiento y/o prevención frente a la pasteurelosis, preferentemente en peces. Además, la composición inmunogénica comprende al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente un adyuvante, que se puede seleccionar de entre cualquiera de ios siguientes: aceite mineral, adyuvante de Freund completo (FCA), adyuvante de Freund incompleto (FIA), alginatos, beta-gíucanos, CpG, fiagelina, fosfito de aluminio y potasio, hidroxido de aluminio, interleuquinas, levamisoi, liposomas, microesferas biodegradables, ontanide ISA, Mycobacterium bovis, Mycobacterium butyricum, Mycobacterium chenoíae, nanopartículas PLGA, paredes celulares de micobacteria, polisacáridos bacterianos (LPS), quimiocinas, quitosano, saponinas, sorbitan sesquioleato, vitamina C, vitamina E, o cualquier combinación de los mismos; y donde el adyuvante preferido es el adyuvante de Freund, para mejorar la respuesta inmune, y puede comprender también un micro o nanosistema como sistema de vectorización.

En esta memoria descriptiva se entiende como microsistema de vectorización a un sistema constituido por partículas que presentan unas dimensiones microescalares y que puede ser utilizado para modificar y/o controlar la distribución de la composición inmunogénica a nivel tisular, celular o subceiular.

En esta memoria descriptiva se entiende como nanosistema de vectorización a un sistema constituido por partículas que presentan unas dimensiones nanoescaiares y que puede ser utilizado para modificar y/o controlar la distribución de la composición inmunogénica a nivel tisular, celular o subceiular.

En una realización preferida, la composición inmunogénica de la invención, particularmente la vacuna de la invención, va dirigida preferentemente al tratamiento de la pasteurelosis en peces. En otra realización más preferida aún, los peces se seleccionan de la lista que consiste en: Dicenírarchus labrax, Epinepheíus akaara, Macropodus opercularis, Morone americanas, Morone saxatilis, Mullus spp., Pagrus pagrus, Pictibiennius yatabei, Rachycentron canadum, Serióla quinqueradiata, Solea senegaiensi, Soiea solea y Sparus auraía. En otra realización más preferida aún, los peces son Soiea senegaiensis y Solea solea.

La vacuna elaborada con la composición inmunogénica que incluye la proteína recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) y adyuvante de Freund alcanza valores de protección satisfactorios, igualando la protección alcanzada por la vacuna comercializada por la casa comercial Hipra, a lo que suma además otros beneficios como el hecho de evitar problemas asociados a la bioseguridad ya que, no es necesario el cultivo a gran escala del patógeno del que proviene la proteína y el uso de una proteína recombinante que no supone ningún riesgo para la salud animal ni para el medio ambiente. La invención también se refiere a un procedimiento para ia producción de proteína recombinante (rFrpA) que comprende la SEQ ID NO: 4, o poiipéptidos con, ai menos, un 80% de porcentaje de identidad con SEQ ¡D NO: 2 o fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que comprende la SEQ ID NO: 2, que mantienen las propiedades antigénicas de la proteína, que comprende el cultivo de una célula o microorganismo hospedador recombinante según se describe en el presente documento, transfectado o transformado con la secuencia nucleotídica del gen rfrpA recombinante (SEQ ID NO: 3), o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos que mantienen las propiedades antigénicas de ia proteína clonadas en un vector, cultivado en condiciones que promueven la expresión para la posterior recuperación del poiipéptido.

En esta memoria descriptiva se entiende como condiciones que promueven ia expresión de un gen como aquellas condiciones de medio de cultivo, temperatura, pH y tiempo de incubación necesarias para que se pueda obtener ia correcta expresión de dicho gen obteniéndose ia proteína madura correctamente plegada.

La invención también se refiere a un procedimiento para la repiicación del gen que codifica ia proteína FrpA de PhDP, caracterizado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1 , secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, ai menos, el 80%, preferiblemente la secuencia nucleotídica recombinante que comprende la SEQ ID NO: 3, o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas de ia proteína FrpA que comprende el cultivo de una célula o microorganismo hospedador transfectado o transformado con un vector recombinante según se describe en el presente documento, que a su vez comprende el gen que codifica la proteína FrpA de PhDP, caracterizado por ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1 , secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, ai menos, el 80%, preferiblemente la secuencia nucleotídica recombinante que comprende la SEQ ID NO: 3, o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas de la proteína FrpA cultivado en condiciones que promueven la repiicación para la posterior recuperación del gen. Se entiende como condiciones que promueven la replicacion aquellas condiciones de temperatura, pH, medio de cultivo y tiempo necesarias para que se pueda obtener ¡a replicacion del vector utilizado para donar la proteína recombinante. Por otro lado, la invención también se refiere al procedimiento para elaborar una composición inmunogénica o preparación farmacéutica con actividad inmunizadora en peces que comprende la formulación de, al menos, uno de ios siguientes productos: la proteína FrpA, caracterizada por que comprende la SEQ ID NO: 2, la proteína recombinante rFrpA caracterizada por que comprende la SEQ ID NO: 4, polipéptidos con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 2, o fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas; el gen que codifica la proteína FrpA de PhDP, caracterizado por que comprende la SEQ ID NO: 1 , secuencias con un porcentaje de identidad con la SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70%, preferiblemente la secuencia nucleotídica recombinante que comprende la SEQ ID NO: 3 que codifica para la proteína recombinante que comprende la SEQ ID NO: 4, o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas; un vector recombinante que incluye una de estas secuencias nucleotídicas; una célula o microorganismo transfectado o transformado con un vector recombinante como el descrito aquí; un organismo transgénico no humano según se describe en el presente documento, que comprende insertado en su genoma una secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1 , secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70%, secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas o vectores que comprenden cualquiera de las anteriores secuencias; un adyuvante; un microsistema o nanosistema de vectorización.

La composición inmunogénica de la invención permite la obtención de un grado de protección elevado en peces, evitando el cultivo y manipulación del patógeno y evitando los problemas asociados a la utilización de vacunas poco caracterizadas procedentes de extractos brutos de la bacteria que puedan contener otros componentes no deseados como endotoxinas, exotoxinas, enzimas hidrolíticos, etc. Así, dado que cada patógeno tiene una vía de entrada, modo de colonización y persistencia en el hospedador diferente, hace que las estrategias utilizadas para combatir una enfermedad específica no sean acertadas o extrapoiabies de unas enfermedades a otras enfermedades. En este sentido, PhDP es de los patógenos más particulares descritos hasta ahora en acuicultura, siendo además un desconocido en cuanto a muchos de ¡os aspectos de su biología. A este respecto, tal y como se ha comentado anteriormente, la pasteurelosis puede cursar como fase aguda, provocando grandes mortalidades o en fase asintomática. Tras las fases agudas se cree que ¡os peces supervivientes se convierten en portadores y que estos transmiten la enfermedad aunque no se sabe cómo. Particularmente, se hipotetiza que PhDP vlve siempre asociado al hospedador pues nunca se ha aislado este patógeno de muestras de agua o sedimentos. Una vez dentro del pez, este patógeno se internaliza en ¡os macrófagos en cuyo interior persiste perfectamente viable. Este especial modo de vida hace que se oculte al sistema inmune y que ¡os peces portadores desencadenen nuevos brotes de pasteurelosis cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables a la bacteria. Todas estas particularidades del patógeno analizado en la presente invención hace que resultados experimentales obtenidos con otros patógenos no sean extrapolable a este microorganismo, por lo que hace necesario buscar candidatos idóneos para e¡ desarrollo de nuevos medicamentos, particularmente vacunas, útiles en diferentes especies de peces, para el tratamiento de la patología producida por dicho microorganismo que presenta una biología tan particular. Para resolver estos inconvenientes, en ¡a presente invención se describe ¡a proteína recombinante rFrpA (SEQ I D NO: 4) y su uso como medicamento, específicamente como vacuna, y más particularmente, para su uso en el tratamiento y/o prevención de la pasteurelosis. Adicíonalmente, otra de las ventajas mostradas en la presente invención por el uso de ¡a proteína rFrpA (SEQ ID NO: 4) como vacuna para el tratamiento y/o prevención de ¡a pasteurelosis es que, tal y como se ha comentado antes, dado que el sistema de sideróforos que comprende entre otros el gen frpA muestra una alta tasa de dispersión entre cepas pofencialmente patógenas presentes en una misma planta de acuicultura, el hecho de utilizar la proteína recombinante rFrpA como vacuna limitaría la dispersión del sistema de ¡a piscibactina entre ¡a microbiota disminuyendo la probabilidad de aparición de patógenos emergentes.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para su uso en la inducción de una respuesta inmune en peces que comprende la composición inmunogénica según se describe en el presente documento, y opcíonalmente instrucciones relacionadas con su administración. Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo obtenible tras la inmunización de un animal con la composición inmunogénica descrita en el presente documento. Enuna realización preferida, el anticuerpo de la invención se caracteriza por que el animal empleado para su obtención, vía inmunización, es preferentemente un pez.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Gei agarosa 1 %. A. Amplificación del gen frpA a partir de DNA genómico de Photobacterium damselae subsp. piscicida DI21. 1) marcador de peso molecular. 2) amplificación sin DNA genómico. 3) amplificación con DNA genómico. B. Amplificación del gen frpA tras ser clonado en pBAD. 1) marcador de peso molecular. 2) amplificación sin DNA plasmídico. 3) amplificación con el vector original derivado de pBAD (Guzman et al., 1995. J. Bacterio!. 177 (14): 4121-4130) (Nótese que este vector contenía la secuencia codificadora de otra proteína en el lugar a ocupar por FrpA; Viia Sanjurjo et al, sin publicar). 4) amplificación de pBAD-10His-FrpA. C. Amplificación del gen frpA que contiene pelB y 10 His tras ser clonado en pBAD 1) Amplificación sin DNA plasmídico. 2) Amplificación de pBAD~10His-FrpA.

Figura 2, Análisis de la expresión de rFrpA, M corresponde al marcador de peso molecular. Las fracciones celulares insoiubies (pellet) obtenidas después de la lisis por sonicado y posterior centrifugación fueron separadas en un gel de poiiacrilamida 8%- SDS. 1) Proteínas presentes sin inducción. 2) proteínas después de la inducción con arabinosa 0,2%. La flecha indica la proteína recombinante.

Figura 3. Las fracciones obtenidas en el proceso de purificación de rFrpA usando una resina de afinidad de níquel fueron analizadas en un gel de poiiacrilamida 10%-SDS. M corresponde ai marcador de peso molecular. 1) Fracción membranas totales de las células después de la solubilización con sarkosyl 1.5%. 2) Fracción membranas extemas de las células después de la solubilización con elugent 5%. 3) Fracción no retenida en la columna de afinidad de níquel. 4-6) Fracciones de lavado de la columna con tampón Tris-HCI 10 m pH 8.0, NaCI 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 30 mM. 9- 12) Fracciones de elución de la proteína con tampón Tris-HCI 10 mM pH 8.0, NaCI 0.05 M, elugent 0.25% y imidazol 500 mM. 13) FrpA concentrada obtenida después de combinar las fracciones de la columna.

Figura 4, A Digestión de rFrpA con tripsina. La reacción se llevó a cabo con 4 pg/mL de tripsina durante 15 min a temperatura ambiente. Los fragmentos obtenidos fueron analizados en un gel de poiiacrilamida 10%-SDS. M corresponde al marcador de peso molecular. 1) Fragmentos de rFrpA nativa 2) Fragmentos de rFrpA desnaturalizada por calentamiento a 100°C durante 10 min en presencia de SDS. B. Espectro de dicroismo circular de rFrpA.

Figura 5. Protocolo experimental de vacunación e infección experimental realizado para determinar el nivel de protección. También se muestran ios días en los que se obtuvieron muestras de suero para cuantificar la producción de anticuerpos.

Figura 6. Nivel de anticuerpos en sangre frente a PhDP presente en el suero de ios grupos de peces inmunizados con 100 μΙ de: PBS, PBS con adyuvante de Freund (en proporción 1 : 1), bacterina o vacuna rFrpA.

Figura 7. Supervivencia acumulada en los cuatro grupos de peces inmunizados con vacuna rFrpA, bacterina, PBS y Freund o PBS. Los resultados se muestran como el porcentaje de supervivencia acumulada en cada grupo de peces.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se ilustra adecuadamente mediante ios siguientes ejemplos, ios cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.

Ejemplo 1. Expresión de la proteína recombinante de FrpA (rFrpA de SEQ ID NO: 4) en E. cois

En este ejemplo se ilustra la metodología utilizada para la producción de la proteína recombinante rFrpA en E. coíí BL1 CodonPlus. Para ello se construyó un plásmido recombinante al clonar el gen frpA, que codifica para la proteína FrpA, en el plásmido pBAD (Guzman et al., 1995. J. Bacterio!. 177 (14): 4121-4130). La utilización del pBAD como vector de clonación permite que la expresión de frpA se active al añadir arabinosa al medio de cultivo. La construcción se realizó mediante "overíap extensión PCR doning" (Bryksin et a!., 2010, 48: 463-485). El gen frpA (SEQ ID NO: 1) se amplificó mediante PCR a partir del ADN de PhDP usando poiimerasa Phusion (Thermo Scientifíc) y los cebadores mencionados en la tabla No. 1. Para asegurar la correcta localización de rFrpA en la membrana externa de E. coli, se sustituyó el péptido señal nativo de FrpA, correspondiente a ios primeros 26 aminoácidos del extremo N-terminal, por PelB de Erwinia carotovora, dando lugar a la secuencia nucleotídica y aminoacídica recombinantes caracterizadas por las SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Adicionaimente se incluyó una secuencia que codifica la síntesis de 10 histidinas útil durante la purificación de rFrpA mediante resina de afinidad de niquei (de aquí en adelante nos referiremos a! constructo como: pelB- 10His-FrpA). La construcción fue transformada en E. coli BL21 CodonPius.

Tabla 1 . Cebadores usados para la amplificación del gen frpA y para su inserción en el plásmido pBAD.

Tras clonar la construcción pelB-10His-FrpA que comprende la SEQ ID NO: 3 en E. coli, se optimizaron las condiciones de expresión de rFrpA, para ello se probaron diferentes condiciones de cultivo variando la concentración de arabinosa, temperatura y el tiempo de incubación. Finalmente, las mayores cantidades de la proteína recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) se obtuvieron con cultivos de E. coli BL21 CodonPius incubados a 28°C durante 38 h suplementando el medio de cultivo con un 0.2% de arabinosa.

Para comprobar la correcta expresión de la proteína recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) se prepararon dos cultivos de E, coli BL21 CodonPius con el plásmido pelB-10His- frpA, uno de los cultivos se dejó crecer sin inducir y el otro cultivo se indujo con arabinosa 0.2% durante 3 h. A continuación, se centrifugaron ios cultivos y las células se resuspendieron en tampón Tris-HCi 20 mM, NaCI 0.5 M, KCi 0.1 M y se Usaron por sonicación, obteniéndose dos fracciones, el sobrenadante y el pellet, este último se resuspendió en lampón Tris-HC! 50 mM, Urea 6 M. Estas fracciones se cargaron en geies de poliacriiamida al 8%. En ia figura 2 se puede observar como a! adicionar e! inductor, aparece una banda alrededor de 75 KDa. Dicha banda fue analizada empleando la técnica de huella peptídica y fragmentación (MS y MS/MS) mediante ALDi-TOF/TOF, Los péptidos obtenidos permitieron comprobar la presencia de rFrpA.

Ejemplo 2. Purificación de la proteína rFrpA y estudio de su estructura terciaria Para la preparación de la vacuna se optó por trabajar con la proteína purificada a partir de las membranas externas de E. coü que expresasen la proteína rFrpA (SEQ ID NO: 4). En el ejemplo anterior hemos visto que rFrpA (SEQ ID NO: 4) puede ser sobreexpresada correctamente en E. co!i BL21 CodonPlus. En este ejemplo se ilustra ia producción y purificación de rFrpA (SEQ ID NO: 4) a media escala utilizando para ello cromatografía de afinidad, y se demuestra que rFrpA (SEQ ID NO: 4) conserva ia estructura tridimensional nativa de la proteína FrpA de PhDP.

De una placa de E. coü BL21 CodonPlus que porta ia construcción pelB-10His-FrpA se inició un cultivo bacteriano de 100 mL de LB suplementado con 200 g/mL de ampiciiina y 50 pg/mL de cloranfenicol que se incubó durante una noche a 28°C en agitación a 180 rpm. A la mañana siguiente se usaron 80 mL de preinócuio para iniciar un cultivo de 6 L del mismo medio. Este cultivo se incubó a 28°C con agitación durante aproximadamente 90 min, momento en el que se indujo ia expresión de rFrpA (SEQ ID NO: 4) ai añadir al medio de cultivo 0.2% de arabinosa. El cultivo se dejó crecer a 28°C con agitación durante 38 h. Posteriormente, se obtuvo el peiiet celular mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 min. Siguiendo esta metodología se obtuvo un pellet de 24.7 g que se conservó a -80° C hasta su procesamiento.

El peiiet obtenido de la inducción con arabinosa se resuspendió en tampón Tris-HCi 10 mM pH 8.0, NaCi 50 mM, conteniendo lisozima (Alfa Aesar), DNasa RQ1 RNase-Free (PROMEGA) e inhibidor de proteasas (SIGMA ALDRICH). Las células bacterianas se Usaron por sonicación y el iisado se centrifugó a 4500 rpm durante 0 min a 4°C para retirar los restos celulares. El sobrenadante se centrifugó a 33000 g durante 1 h a 4°C, para obtener las membranas totales. Posteriormente, las membranas totales se resuspendieron en agua y se adicionó sarkosyl (lauroil-sarcosinato sódico, SIGMA ALDRICH) al 3%. Estas membranas se solubilizaron durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Una vez disueltas ¡as membranas internas se obtuvieron las membranas extemas por centrifugación a 30000 g durante 1 h a 4°C.

Las membranas externas obtenidas por centrifugación como se mencionó previamente, se resuspendieron en elugent 5% (CALBIOCHE ) y se dejaron una noche a 4°C con agitación. Para retirar ¡as impurezas no solubles se centrifugó a 33.000 g durante 1 h a 4°C. La fracción soluble de ¡as membranas se combinó con tampón de equiiibrio (Tris-Hcl 10 mM pH 8.0, NaCI 0.05 M, elugent 0.25% y imidazol 10 mM). La purificación de rFrpA se hizo usando columnas de afinidad de níquel de 1 mL (Thermo Scientific™ HisPur™ Ni-NTA). La separación en la columna se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante, utilizando como tampón de lavado Tris- HCI 10 mM pH 8.0, NaCI 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 30 mM, y como tampón de elución Tris-HCI 10 mM pH 8.0, NaCI 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 500 mM. Las fracciones obtenidas se analizaron por SDS-PAGE y las fracciones que contenían ¡a proteína fueron combinadas, concentradas y cambiadas a tampón PBS con elugent 0.25% usando células con agitación Arnicon.

Por otra parte, para que rFrpA (SEQ ID NO: 4) genere una respuesta inmune efectiva frente a PhDP es indispensable el correcto plegamiento de rFrpA (SEQ I D NO: 4) en ¡a membrana externa de E. cois. Para estudiar ¡a estructura tridimensional de rFrpA (SEQ ID NO: 4) se realizaron dos pruebas: digestión con tripsina y análisis de dicroísmo circular. Reacción con tripsina: 10 L de disolución de proteina (2.55 mg/mL) se trataron con 4 g mL de tripsina (Sigma Aldrich) durante 15 min a temperatura ambiente. Los resultados de la digestión se visualizaron en un gel de poliacrilamida al 10%, una muestra de rFrpA (SEQ I D NO: 4) obtenida de las membranas externas y una fracción de la muestra anterior sometida a desnaturalización con SDS 0.1 % a 100°C. A diferencia de ¡a rFrpA (SEQ I D NO: 4) desnaturalizada, para ¡a que se observan una gran cantidad de bandas debido a ¡a presencia de sitios de corte expuestos durante la desnaturalización, ¡os productos de digestión de la rFrpA nativa (SEQ ID NO: 4) presentan menos bandas, debido a ¡a protección de gran parte de estos sitios en ¡a proteína intacta. (Figura 4A).

Para terminar de comprobar que rFrpA (SEQ I D NO: 4) estaba en su forma nativa se hizo el espectro de dicroísmo circular. El espectro obtenido para rFrpA (SEQ I D NO: 4) coincide con los espectros de proteínas de la familia de receptores de sideróforos que han sido estudiados previamente. El espectro de rFrpA (SEQ ID NO: 4) presenta un mínimo en 219 nm que confirma ¡a presencia de láminas β en su estructura secundaria (Figura 4B) (Microbes and infection 2006, 8: 2145-2153). Ejemplo 3. Experimento de inmunización con rFrpA (SEQ ID NO: 4) y producción de anticuerpos frente a PhDP

En este ejemplo se ilustra el experimento llevado a cabo para comprobar la capacidad inmunogénica de rFrpA (SEQ ID NO: 4) en peces cultivados. Para ello se realizó una experiencia de inmunización de lenguados a los que se les monitorizó la producción de anticuerpos frente a PhDP.

El protocolo de inmunización utilizado se ilustra en la Figura 5. Se utilizaron un total de 250 lenguados de 10 g de peso que fueron distribuidos al azar en 5 grupos de 50 peces. Un grupo de 50 peces actuó como testigo del experimento, ios restantes 4 grupos fueron sometidos a diferentes tratamientos al ser inmunizados con 100 μΐ_ de: (1) una solución inmunogénica que contenía la proteína rFrpA (SEQ ID NO: 4). A cada pez se le suministró 30 g de rFrpA (SEQ ID NO: 4) resuspendida en una solución de PBS con 0.25% de elugent y adyuvante de Freund en una proporción 1 : 1 (2) una bacterina (vacuna tradicional) obtenida al inactivar un cultivo de PhDP con un 0.1 % de formol, este cultivo inactivado se ajustó con PBS a una D0 ₆ oo = 1 , (3) adyuvante de Freund. A este grupo de peces se les suministró una solución de PBS y adyuvante de Freund en una proporción 1 : 1 y por último, (4) el grupo control sin vacunar tratado con solución salina. El método elegido para suministrar ios tratamientos fueron dos inmunizaciones por inyección intraperitoneai que se suministraron los días 0 y 30 siguiendo el protocolo expuesto en la Figura 5.

Para cuanfificar la respuesta inmune generada en el pez, ios días 0, 30 y 60 se obtuvieron muestras de suero. Con ios sueros se realizó un ínmunoenzímoensayo ELISA tipo sándwich, o de captura de anfígeno, utilizando como antígeno células inactivadas de PhDP y como anticuerpo una ig anti-Gurami capaz de reconocer específicamente los anticuerpos del lenguado. En la Figura 6 se muestran los niveles de anticuerpos frente a PhDP presentes en los sueros de los peces de cada tratamiento. Los resultados se expresan como un porcentaje siendo el 100% el nivel de anticuerpos de ios peces inmunizados con bacterina el día 60 ya que este fue el valor máximo. En los peces control, tratados con PBS, la presencia de anticuerpos frente a PhDP es testimonial y apenas alcanza el 5%, En el grupo de peces inmunizados con adyuvante de Freund se observa una producción significativa de anticuerpos. El adyuvante de Freund consiste en una suspensión oleosa de Mycobacterium tuberculosis por lo que creemos que se está produciendo un reconocimiento cruzado entre los anticuerpos frente a Mycobacterium y PhDP. En los peces inmunizados con bacterina se observa una producción de anticuerpos intensa y rápida, como se muestra en la Figura 6 la producción ya es máxima desde la primera inmunización. En el grupo de peces inmunizados con rFrpA (SEQ ID NO: 4) vemos que la producción de anticuerpos es gradual, de apenas el 7%, tras la primera inmunización, que sin embargo aumenta al 20% tras la segunda inmunización. Aunque ios niveles de anticuerpos son estadísticamente superiores en el grupo de peces inoculados con bacterina, la presencia de anticuerpos frente a PhDP en el suero de ios lenguados inmunizados con rFrpA (SEQ ID NO: 4) demuestra que rFrpA (SEQ ID NO: 4) es una profeína inmunogénica capaz de inducir una respuesta inmune específica en el lenguado. Tal y como se refleja en la bibliografía, cuando se realizan inmunizaciones con vacunas recombinantes, es necesario realizar una segunda inmunización o dosis de refuerzo, esta necesidad se refleja en el grupo de peces tratados con rFrpA (SEQ ID NO: 4), en el que sólo se detecta una producción significativa de anticuerpos tras la segunda inmunización.

Ejemplo 4. Determinación de la protección conferida frente a PhDP por ia rFrpA (SEQ ID NO: 4}

Para determinar el nivel de protección conferida por la vacuna recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) frente a PhDP se realizó una infección experimental inoculando a ios lenguados una dosis de PhDP capaz de producir un 100% mortalidad en un plazo de 7 a 10 días. En este experimento también se comparó el nivel de protección de ia vacuna rFrpA (SEQ ID NO: 4) con el conferido por una bacterina clásica utilizada en ia industria acuícoia. Tras haber suministrado ios diferentes tratamientos por medio de dos inmunizaciones, el día 60, se les inoculó a ios lenguados 100 μί_ de una suspensión de PBS con 10 ⁷ células mL ^"1 de PhDP. A partir de este momento se registró ia mortalidad acumulada en cada grupo de peces (tratamiento). Tras la infección se retiraron peces muertos entre los días 64 y 71 , momento a partir del cual se estabilizaron las curvas de supervivencia. La Figura 7 muestra la dinámica de supervivencia registrada entre ios días 61 y 75, Como se puede ver en la Figura 7, existen diferencias significativas entre los grupos de animales vacunados (rFrpA y Bacterina) y ¡os grupos control (PBS + Freund y PBS) (p < 0.001). En ios peces inoculados con PBS, o grupo control, se observa una rápida mortalidad que alcanza el día 88 al 100% de los peces. En el grupo de peces tratados con adyuvante se observa una reducción significativa de la mortalidad respecto al grupo control, consiguiendo contener la mortalidad en un 55%. Los grupos donde se observa un mayor nivel de supervivencia, y por tanto de protección frente a la pasteurelosis, son los grupos tratados con la vacuna recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) y con la bacterina. El índice de supervivencia se situó en el 74% y 80% respectivamente. Las diferencias no son significativas por lo que se puede considerar que la protección conseguida con la vacuna recombinante es equivalente a la conseguida con la bacterina, pero con las ventajas comentadas anteriormente que aporta el uso de una proteína purificada. En este sentido, las vacunas con bacterinas presentan múltiples desventajas, entre ellas, comprenden formol que es tóxico y mata a las células bacterianas, pero es incapaz de inactivar las toxinas secretadas al medio por éstas, pudiendo morir ios peces por el efecto de dichas toxinas contenidas en la vacuna.

Los resultados mostrados en la Figura 7 ponen de manifiesto que la proteína recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) es capaz de igualar la protección conferida por la bacterina (no hay diferencias significativas entre el grupo tratado con bacterina y el tratado con rFrpA). El hecho de que se produzca una mayor superviviencia, aunque no sea significativa, para el caso del grupo tratado con la bacterina, es que ésta se obtuvo de una cepa que no produce toxinas y se utilizó esa misma cepa para el experimento de infección de tal manera que el resultado de protección obtenido es el techo superior. A su vez, se infectó a ios peces con la misma cepa que se utilizó para vacunar, exclusivamente para llevar a cabo los ensayos aquí mostrados, siendo conscientes de que dicha situación no es real. De hecho es conocido que la vacuna actual en las plantas de cultivo tiene una protección muy baja frente a pasteurolisis debido a la gran heterogeneidad en cuanto a las cepas de PhDP existentes.

Por otro lado, el uso de las bacterinas como vacunas no es recomendable ni muy efectivo, ya que al ser preparados heterogéneos complejos es muy difícil obtener vacunas combinadas frente a más de un patógeno. La mayoría de ios aislados de PhDP secretan una gran cantidad de toxinas extracelulares ( agariños et a/,, 1992. Gen. Microbio!. 138: 2491-8), esto hace que sólo se puedan obtener bacterinas para su uso como vacunas, de un tipo de aislado muy concreto, particularmente, de aquellas bacterias que no secretan toxinas, con lo que la protección de la vacuna sólo es efectiva frente a este tipo de aislado. En cambio con el uso de la proteína recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) descrita en la presente invención se consigue una protección frente a cualquier tipo de aislado.

Los resultados obtenidos en el experimento de inmunización indican que la inmunización de ios lenguados de 10 g de peso con 30 g de proteína recombinante rFrpA (SEQ ID NQ: 4) es suficiente para conferir un nivel de protección satisfactorio, lo que hace que la utilización de la proteína de membrana externa rFrpA (SEQ ID NO: 4) se postule como una opción prometedora a la hora de combatir la pasteurelosis.

Ejemplo 5. Formulación de la vacuna recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) y protocolo de inmunización.

En este ejemplo se realiza una descripción detallada de la composición de la solución inmunogénica a base de la proteína recombinante FrpA (rFrpA) de SEQ ID NO: 4. La vacuna recombinante rFrpA (SEQ ID NO: 4) consiste en una solución de 800 g/mi de rFrpA (SEQ ID NO: 4) en tampón fosfato salino (PBS; pH 7.4) con un 0,25 % de elugent que se mezcla en una proporción 1 : 1 con adyuvante de Freund. Para la correcta inmunización de los peces la vacuna recombinante debe ser suministrada por medio de dos inmunizaciones. La inmunización consistirá en la inyección intraperitoneal de un volumen de 100 μΙ de la solución inmunogénica, por tanto cada pez será inmunizado con 30 μο de rFrpA (SEQ ID NO: 4). En la primera inmunización el adyuvante utilizado será el completo de Freund (SIG A-ALDRICH), mientras que en la segunda inmunización (dosis de refuerzo) se utilizará el adyuvante incompleto de Freund (SIGMA-ALDRICH). Las dos inmunizaciones deben estar espaciadas por un periodo de 30 días. Dado que la respuesta protectora en el pez es dependiente de la edad y la especie, podría ser conveniente ajusfar la cantidad de proteína recombinante inyectada a las circunstancias específicas de cada vacunación. La presente invención no pretende limitar la cantidad de proteina suministrada, y aunque en los ejemplos 3 y 4 se ha acreditado que la inmunización de lenguados de 10 g de peso con 30 μg de proteína recombinante es suficiente para generar un grado de protección satisfactorio, la composición inmunogénica podría contener hasta 300 \¿g de proteína recombinante sin provocar efectos nocivos en los animales.