Область техники

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и ветеринарии, а именно к рекомбинантному белку GBD-ActRIIB, включающему фрагмент рецептора ActRIIB (активиновый рецептор II типа В) и глюкансвязывающий домен (GBD), способу получения белка GBD-ActRIIB на альфа-глюкане, инъекционному препарату на основе белка GBD-ActRIIB, а также способу использования указанного инъекционного препарата для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.

Уровень техники

Активиновые рецепторы (ActR) - гликопротеины с молекулярной массой ~55 кДа, представляющие собой трансмембранные белки, состоящие из лиганд-связывающего внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического серин/треонинкиназного домена. Рецепторы активина подразделяются на типы I и II, каждый из которых представлен двумя изоформами - А и В.

Рецепторы ActRUA и ActRIIB были идентифицированы как рецепторы П типа для активинов [1, 2]. Кроме активинов, ActRUA и ActRIIB могут взаимодействовать с несколькими белками суперсемейства TGF-P, включая ВМР7, Nodal, GDF8 и GDF11 [3-6].

GDF8 (growth differentiation factor 8), также известный как миостатин, - это секретируемый фактор роста, который подавляет рост и дифференцировку мышечной ткани. Миостатин экспрессируется в мышцах и затем выделяется в кровь, оказывая свое действие на мышцы за счет связывания с рецепторами ActRII (activin type II receptor) [7].

GDF8 представляет собой негативный регулятор массы скелетных мышц. Нокаут гена GDF8 у трансгенных мышей характеризуется выраженной гипертрофией и гиперплазией скелетных мышц [8]. Аналогичное увеличение массы скелетных мышц обнаружено при наличии природных мутаций GDF8 у крупного рогатого скота [9-12]. Пьемонская и бельгийская голубая породы коров несут мутацию гена GDF8, которая вызывает выраженное увеличение мышечной массы [13]. Путем манипулирования с активностью GDF8 можно вызвать значительные физиологические изменения в организме. Исследования на животных показали, что блокирование миостатина приводит к значительному увеличению сухой мышечной массы с практически полным отсутствием жировой прослойки [14]. В настоящее время ведется разработка целого ряда блокаторов действия миостатина.

Патент US6096506A заявляет антитело, которое специфически связывается с миостатином.

Патент US6468535B1 заявляет способ увеличения мышечной массы животного путем введения моноклонального антитела против миостатина и блокирования его активности.

Кроме этого, известен патент RU2613420C1, заявляющий о получении слитого белка с последовательностью миостатина, способного в составе иммуногенной композиции индуцировать синтез специфических аутоантител к миостатину, блокировать его действие и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани.

Разработан препарат ACVR2B на основе растворимой формы рецептора ActRIIB. Белок ACVR2B имеет участок, способный связываться со свободным миостатином, блокируя его способность активировать рецепторы ActRIIB на поверхности миобластов. Варианты полипептидов ActRIIB, обладающие значительно сниженным сродством к активину (например, активину А и/или активину В) по сравнению с другими лигандами ActRIIB, такими как GDF11 и/или миостатин, называются ловушками GDF. Данный препарат был создан Se-Jin Lee (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore). Препарат-ловушка c ACVR2B доказал высокую эффективность на лабораторных мышах. Был зафиксирован мышечный прирост после четырех недель применения препарата. Максимальные показатели мышечного прироста были достигнуты при двух инъекциях в неделю, в дозировке 50 мкг на килограмм массы тела. Мышечная масса этих мышей увеличилась на 61 % по сравнению с исходной [15]. Модулированию роста тканей с помощью растворимых форм ActRIIB посвящены патенты US8252900B2 и US8343933B2. В патенте US8710016B2 предлагается использовать лиганд ActRUB для терапии мышечной дистрофии. Как заявлено в патенте US7842663B2, ловушки GDF могут применяться для повышения мышечной массы и снижения жировой массы. В заявке на патент US2016/0031993A1 указано, что моноклональные антитела к ActRIIB могут использоваться для роста мышечной ткани и лечения мышечных расстройств, таких как мышечные потери. Однако все предложенные технологии блокирования биологической активности миостатина имеют целый ряд ограничений при использовании, поскольку требуют систематического применения дорогостоящих моноклональных антител к миостатину, растворимых форм лигандов-ловушек на основе рецептора ActRIIB или моноклональных антител к рецепторам ActRUA и ActRIIB на протяжении многих месяцев. Таким образом, крайне актуальна разработка новых технических решений для снижения концентрации миостатина в крови животных и уменьшения связывания с рецепторами ActRIIB на поверхности миобластов. Одной из альтернативных технологий, реализованных в настоящем изобретении, является блокирование рецептора ActRIIB и миостатина с помощью аутоантител.

Раскрытие изобретения

Задачей, на решение которой направлено изобретение является разработка нового эффективного способа увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в частности в разработке инъекционного препарата, содержащего иммунологически активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, и способа его использования.

Достигаемый технический результат заключается в увеличении мышечной массы и повышении мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в легкой очистке белка, где концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB. Кроме того, технический результат заключается в получении универсального средства для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, то есть разработанное средство может быть использовано для всех сельскохозяйственных животных и птиц. Также белок по изобретению имеет повышенную устойчивость к протеазам в сравнении с нативной конформации антигена ActRIIB и демонстрирует высокую стабильность при хранении. Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов. Значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что у иммунизированных животных и птиц может проходить от нескольких недель до нескольких месяцев между бустерными иммунизациями, что позволяет иммунной системе блокировать путем индукции синтеза специфических аутоантител эндогенный рецептор ActRIIB, препятствуя его связыванию с миостатином и/или снижая его активность в организме в течение длительного времени, ингибировать сигнал клеткам мышечной ткани, останавливающим их рост.

Механизм действия основан на индукции синтеза специфических аутоантител к эндогенному рецептору ActRIIB, блокировании активности эндогенного миостатина в сыворотке крови и индукции комплексных перестроек адаптивного генеза, выражающихся в структурных преобразованиях в организме и стимуляции роста мышечной ткани.

При реализации изобретения были решены следующие задачи:

1) создание рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с молекулярной массой 36 кДа, включающего фрагмент рецептора ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 1, спейсер с последовательностью SEQ ID NO 2 и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO 3, разработка эффективного способа получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 4 в клетках Escherichia coli BL21, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB;

2) создание инъекционного препарата, содержащего иммунологически активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа- глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте, разработка эффективного способа использования этого препарата в виде подкожных или внутримышечных инъекций, решающего задачу повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики и др.) и птицы за счет индукции синтеза специфических аутоантител к ActRIIB, блокировании его действия, снижения активности эндогенного миостатина в сыворотке крови и, как следствие, стимуляции роста мышечной ткани при условии несистематического применения препарата.

Следует отметить, что аминокислотная последовательность ActRIIB высокогомологична (>90%) у всех сельскохозяйственных животных и птиц. Вследствие этого разработанный препарат представляет собой универсальное средство для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.

Решение первой поставленной задачи обеспечивается получением рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с молекулярной массой 36 кДа, включающего фрагмент белка ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 1, глицин-сериновый спей сер с последовательностью SEQ ID NO 2 и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans c последовательностью SEQ ID NO 3.

Способ получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на альфа-глюкане включает следующие стадии:

1) выращивание клеток штамма Е. colt BL21, экспрессирующих ген, кодирующий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 4;

2) связывание рекомбинантного белка GBD-ActRIIB в составе клеточных экстрактов штамма A. coli BL21 с глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;

3) последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.

Рекомбинантный белок GBD-ActRIIB включает в себя белковую последовательность глюкансвязывающего домена (GBD), определяющего способность данного белка связываться с глюкансодержащим сорбентом, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на альфа-глюкане. Иммобилизация на альфа- глюкане обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке альфа- глюкансвязывающего домена из Streptococcus mutans, который обладает высоким сродством к альфа-глюканам (пуллулан, гликоген, декстран, крахмал) и обеспечивает необратимое связывание с носителем в широком диапазоне значений pH 6, 0-9,0 и концентраций соли 0- 3 М NaCl.

Поскольку в клетках Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с альфа-глюканом, то синтезируемый в клетках Е. coli рекомбинантный белок GBD-ActRIIB является единственным белком клеток штамма-продуцента, прочно связывающимся с альфа- глюканом. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата рекомбинантного белка, иммобилизованного на альфа-глюкансодержащем сорбенте.

Решение второй поставленной задачи обеспечивается созданием инъекционного препарата для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы. Полученный препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, охарактеризованный выше, суспендированный в среде из альфа- глюкансодержащего сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе. Метод повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы включает двукратное с интервалом в 20 суток проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, в дозе 5-100 мкг указанного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.

Таким образом, получен активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, обладающий способностью самопроизвольно связываться с глюкансодержащим сорбентом, формируя высокоиммуногенную композицию в форме полиантигена, индуцировать синтез специфических аутоантител к ActRIIB при введении в составе инъекционного препарата сельскохозяйственным животным и птице и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани и повышать мясную продуктивность.

Осуществление изобретения

Первым этапом работы стал дизайн рекомбинантного белка GBD-ActRIIB. Была спланирована нуклеотидная последовательность химерного гена (SEQ ID NO 4), кодирующая фрагмент рецептора ActRIIB (SEQ ID NO 1), спей cep (SEQ ID NO 2) и альфа- глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans (SEQ ID NO 3). Для эффективной экспрессии в Е. coli последовательность химерного гена оптимизировали по кодонному составу и вторичной структуре мРНК.

В составе слитого рекомбинантного белка представлен фрагмент рецептора ActRIIB, соответствующий внеклеточному лигандсвязывающему домену. В аминокислотной последовательности фрагмента ActRIIB может содержаться одно или более изменений относительно природного полипептида ActRIIB, но не в лигандсвязывающих последовательностях. Помимо целевого антигена, в состав слитого рекомбинантного белка может входить один или более дополнительных доменов, придающих желаемое свойство, такое как простая и эффективная очистка, например, последовательность полигистидина, слитого с глутатион-8-трансферазой или, предпочтительно, последовательность глюкансвязывающего домена (GBD) по изобретению, который придает целевому белку высокое сродство к альфа-глюканам (пуллулан, гликоген, декстран, крахмал) и обеспечивает необратимое связывание с носителем, позволяя осуществлять эффективную иммобилизацию рекомбинантного белка на глюкансодержащем сорбенте и получение высокоочищенного препарата целевого белка GBD-ActRIIB, не содержащего примесей других бактериальных белков, ДНК штамма-продуцента, липополисахаридов и эндотоксинов. Полисахарид-связывающий домен может быть присоединен к антигену ActRIIB через оптимально сконфигурированный спейсер переменной длины. Спейсер необходим для обеспечения представления антигена ActRIIB на поверхности белковой молекулы, а также оптимальной презентации иммунной системе животного. Представленный в данном изобретении вариант спейсера с последовательностью SEQ ID NO 2 обеспечивает эффективное формирование нативной конформации антигена ActRIIB, повышенную устойчивость к протеазам, оптимальное воздействие на иммунную систему и в экспериментах по иммунизации сельскохозяйственных животных и птиц с целью увеличения мышечной массы продемонстрировал неожиданное улучшение по сравнению с конструкциями, не имеющими спейсерной последовательности и/или других последовательностей, отличных от представленной в настоящем изобретении.

Целевой ген, кодирующий слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 4 синтезировали химико-ферментативным методом с последующим клонированием. В результате получили плазмиду pGBD-ActRIIB, кодирующую белок GBD-ActRIIB. Для экспрессии рекомбинантного белка предпочтительно использование клеток Е. coli BL21 и их производных, обеспечивающих высокий уровень синтеза целевого слитого белка, а также плазмидных векторов экспрессии типа рЕТ.

Далее получали штамм-продуцент рекомбинантного белка GBD-ActRIIB. Для этого клетки Е. coli BL21 трансформировали полученной плазмидой pGBD-ActRIIB. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-Р-О-тиогалактопираноз� �да (ИПТГ) и выращивали в течение 3 ч при 37 °C. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli BL21 [pGBD- ActRIIB], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы, молекулярная масса которой соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GBD- ActRIIB - 36 кДа. Уровень синтеза целевого белка в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Показано, что рекомбинантный белок GBD-ActRIIB синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец включения.

Для получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB клеточную культуру штамма Е. coli BL21 [pGBD-ActRIIB] выращивали в 1 л среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37 °C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 B течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000 g нерастворимый белок GBD-ActRIIB оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8 М мочевине, центрифугировали 30 мин при 12000 g и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на сорбенте супернатант разводили фосфатным буфером в 4 раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана, инкубировали при 25 °C в течение 2 ч. Центрифугировали при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза.

Иммобилизованный на альфа-глюкане слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB представлял собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты белкового препарата составляла не менее 90 %. Консервацию проводили добавлением бензилового спирта до концентрации 0,1 %.

Слитый белок может быть очищен в соответствии с известными технологиями очистки белка, включая, например, лизис бактериальных клеток ферментом лизоцимом, разрушение ДНК на установках типа French-press, ультразвуком или ДНКазой, последующее дифференциальное центрифугирование телец включения, растворение телец включения в гуанидинхлориде или мочевине, процедуры рефолдинга, колоночную хроматографию на аффинных и ионобменных колонках и т.п.

Полученный слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении. Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов. Следует отметить, что полисахарид-связывающий домен можно заменить другими полипептидами, например, фрагмент антигена ActRIIB можно комбинировать с KLH (keyhole limpet hemocyanin, гемоцианин лимфы улитки), столбнячным токсоидом, CRM197 (разновидность дифтерийного токсина) или другими белковыми носителями.

Таким образом, по разработанной простой и эффективной технологии был получен слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB для последующего создания на его основе инъекционного препарата для введения сельскохозяйственным животным и птице с целью увеличения мышечной массы. Концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, как правило, она составляет 4-6 мг/мл. Следующим этапом исследования стала разработка инъекционного препарата на основе белка GBD-ActRIIB для введения сельскохозяйственным животным и птице. Инъекционный препарат представляет собой варианты иммуногенной композиции на основе слитого рекомбинантного белка GBD-ActRIIB (в качестве антигена), суспендированного в среде из альфа-глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте. Препарат стерилизуется с помощью ультрафильтрации. Альтернативно, иммуногенные композиции в данном изобретении могут быть приготовлены с использованием индивидуально простерилизованных компонентов перед окончательным составлением композиции.

Инъекционный препарат, представляющий собой иммуногенную композицию по настоящему изобретению, включает слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB (1-10 мг/мл), декстран-500 (1-10 мг/мл), ВЕАЕ-декстран-500 (0, 2-2,0 мг/мл).

Варианты иммуногенной композиции содержат в своем составе оптимизированные адъюванты (пример № 2), которые обеспечивают индукцию гуморального иммунного ответа, стабильны, безопасны и эффективны при использовании для сельскохозяйственных животных и птицы. В их составе отсутствуют продукты животного происхождения и канцерогенные соединения. Иммуногенные композиции в данном изобретении могут быть приготовлены в виде стерильной масляной эмульсии с Montanide™ (примеры № 3 и 4) или взвеси с гидроокисью алюминия (пример № 5). Варианты иммуногенных композиций в данном изобретении могут дополнительно включать диспергирующие или смачивающие агенты, суспендирующие агенты или другие подобные материалы.

Во всех вариантах исполнения иммуногенная композиция должна быть стерильной, стабильной в условиях производства и хранения. Предотвращение роста числа микроорганизмов может быть достигнуто путем добавления различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, бензилового спирта, парабенов, хлорбутанола, сорбиновой кислоты, тиомерсала и т.п.

Типичные варианты реализации изобретения направлены на сельскохозяйственных животных и птиц, которым вводят инъекционный препарат на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB по данному изобретению с целью ограничения или предотвращения воздействия эндогенного миостатина на мышечную ткань, что приводит к дополнительному росту мускулатуры. Иммуногенный инъекционный препарат с рекомбинантным белком GBD-ActRIIB и адъювантами оптимизирован для использования у позвоночных, в частности, для лечения заболеваний, вызывающих деградацию мускулатуры. Поскольку рецептор ActRIIB высококонсервативен у позвоночных, варианты реализации настоящего изобретения пригодны для индукции иммунного ответа у всех целевых позвоночных, иммунизированных с использованием способов и композиций, описанных в данном изобретении.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инъекционный препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в растворе альфа- глюкана (50 % по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50 % по массе) или гидроокиси алюминия (равный объем). Разработан способ использования инъекционного препарата по изобретению путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата двукратно с интервалом 20 суток в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.

За счет связывания рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с высокополимерными растворимыми полисахаридами формируются молекулярные комплексы большого размера (20-40 нм), обеспечивающие иммуногенность препарата и устойчивость к деградации протеазами. Таким образом, антиген ActRIIB по настоящему изобретению присутствует в тканях у сельскохозяйственных животных и птицы более продолжительное время, оказывая более длительное воздействие на иммунную систему. Настоящее изобретение также обеспечивает максимизированный иммунный ответ за счет оптимизированных адъювантов.

Значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что у иммунизированных животных и птиц может проходить от нескольких недель до нескольких месяцев между бустерными иммунизациями, что позволяет иммунной системе блокировать путем индукции синтеза специфических аутоантител эндогенный рецептор ActRIIB, препятствуя его связыванию с миостатином и/или снижая его активность в организме в течение длительного времени, ингибировать сигнал клеткам мышечной ткани, останавливающим их рост. Как следствие, изобретение обеспечивает способ увеличения мышечной массы, повышения мышечной силы и повышение плотности костей у сельскохозяйственных животных и птицы. Заболевания или расстройства, в терапии или профилактике которых могут использоваться иммуногенные композиции по изобретению, включают, не ограничиваясь ими, дряхлость, кахексию, возрастную саркопению, мышечное истощение, миопатию, мышечную дистрофию, остеопороз, ожирение, сердечную недостаточность или заболевания сердца. Таким образом, заявленное изобретение, а именно новый инъекционный препарат на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB и способ его использования, обладает научной новизной, не имеет полных аналогов и обладает конкурентным преимуществом для достижения технического результата, заключающегося в увеличении мышечной массы и повышении мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в легкой очистке белка, где концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB, в получении универсального средства для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, повышенную устойчивость к протеазам в сравнении с нативной конформации антигена ActRIIB, рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов.

Реализацию изобретения рассмотрим на характерных примерах, которые приведены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения каким-либо способом рамок данного изобретения.

Пример 1. Получение рекомбинантного белка GBD-ActRIIB

Была спланирована нуклеотидная последовательность химерного гена (SEQ ID NO 4), кодирующая фрагмент рецептора ActRIIB (SEQ ID NO 1), спей cep (SEQ ID NO 2) и альфа- глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans (SEQ ID NO 3). Далее ген (SEQ ID NO 4) синтезировали химико-ферментативным методом с последующим клонированием.

На основе плазмидного вектора экспрессии типа рЕТ получили плазмиду pGBD- ActRIIB, кодирующую белок GBD-ActRIIB, путем клонирования гена (SEQ ID NO 4) в указанную материнскую плазмиду.

Для экспрессии рекомбинантного белка использовали клетки Е. colt BL21, что обеспечило высокий уровень синтеза целевого слитого белка.

Для этого клетки Е. colt BL21 трансформировали полученной плазмидой pGBD- ActRIIB. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-Р-О-тиогалактопираноз� �да (ПИГГ) и выращивали в течение 3 ч при 37 °C. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. colt BL21 [pGBD- ActRIIB], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы, молекулярная масса которой соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GBD-ActRIIB - 36 кДа. Уровень синтеза целевого белка в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Показано, что рекомбинантный белок GBD-ActRIIB синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец включения.

Для получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB клеточную культуру штамма Е. coli BL21 [pGBD-ActRIIB] выращивали в 1 л среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37 °C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 B течение 15 мин.

Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000 g нерастворимый белок GBD-ActRIIB оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8 М мочевине, центрифугировали 30 мин при 12000 g и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на сорбенте супернатант разводили фосфатным буфером в 4 раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана, инкубировали при 25 °C в течение 2 ч. Центрифугировали при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза.

Иммобилизованный на альфа-глюкане слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB представлял собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты белкового препарата составляла не менее 90 %. Консервацию проводили добавлением бензилового спирта до концентрации 0, 1 %.

Слитый белок может быть очищен в соответствии с известными технологиями очистки белка, включая, например, лизис бактериальных клеток ферментом лизоцимом, разрушение ДНК на установках типа French-press, ультразвуком или ДНКазой, последующее дифференциальное центрифугирование телец включения, растворение телец включения в гуанидинхлориде или мочевине, процедуры рефолдинга, колоночную хроматографию на аффинных и ионобменных колонках и т.п.

Полученный слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении. Концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, как правило, она составляет 4-6 мг/мл.

Пример 2. Получение иммуногенной композиции с рекомбинантным белком GBD- ActRIIB

Стандартными методами при стандартных условиях проводили соединение полученного очищенного слитого белка GBD-ActRIIB с водно-масляной суспензии Montanide или гидроокиси алюминия.

В конкретных вариантах осуществления изобретения препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в растворе альфа-глюкана (50 % по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50 % по массе) или гидроокиси алюминия (равный объем), и используется путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата двукратно с интервалом 20 суток в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.

Эффективность применения инъекционного препарата на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы иллюстрируется следующими примерами.

Пример 3. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела поросят

В условиях промышленного свиноводческого комплекса поросятам породы ландрас в возрасте 100-120 суток с массой тела 50-55 кг подкожно вводили препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа-глюкана (50 % по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50 % по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 5-100 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животного. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных.

Результаты исследования представлены в таблице 1. Как видно из полученных данных, двукратное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, привело к увеличению массы тела поросят через 60 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка на 4,8 % по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг - на 13,7 %; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг - на 11,8 %. Таблица 1 - Изменение массы тела поросят, иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB В таблице 2 представлены результаты определения методом иммуноферментного анализа уровня аутоантител к миостатину в сыворотках крови поросят после иммунизации препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB.

Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов.

Таблица 2 - Уровень аутоантител к ActRIIB в образцах сывороток крови поросят, иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB

Из данных таблиц 1 и 2 следует, что оптимальной дозой препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, для индукции аутоантител у животных является доза, равная 50 мг/кг массы тела животного. Пример 4. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела быков холмогорской породы

В условиях откормочного комплекса бычкам холмогорской породы в возрасте 10 месяцев подкожно вводили препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа-глюкана (50 % по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50 % по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 50 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Изменение массы тела бычков калмыцкой породы, иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB

Как видно из представленных в таблице 3 данных, двукратное (с интервалом 20 суток) введение бычкам калмыцкой породы препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD- ActRIIB, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 10,8 % по сравнению с контрольной группой животных.

Пример 5. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела индеек

Препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, внутримышечно вводили индейкам (самцам) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) в возрасте 30 суток. Препарат применяли в дозах 5 и 50 мкг/кг рекомбинантного белка GBD-ActRIIB, суспендированного в среде из альфа-глюкана (50 % по массе), суспензии гидроокиси алюминия (50 % по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 5-50 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела птицы. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Результаты исследования представлены в таблице 4. Таблица 4 - Изменение массы тела индеек породы белая широкогрудая, иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB

Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 20 суток) введение индейке (самцы) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, привело к увеличению массы тела животных через 70 суток после второй инъекции препарата при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка на 12,1 %, а в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 13,6 % относительно контрольной группы птиц.

Приведенные примеры осуществления изобретения не являются исчерпывающими.

Возможные иные примеры осуществления, соответствующие объему патентных притязаний.

Список использованных источников

1 Mathews L.S., Vale W.W. // Cell. - 1991. - V. 65. - P. 973-982.

2 Attisano L., Wrana J.L., Cheifetz S., Massague J. // Cell. - 1992. - V. 68. - P. 97-108.

3 Yamashita H., ten Dijke P., Huylebroeck D. et al. // J. Cell Biol. - 1995. - V. 130. - P. 217- 226.

4 Lee S.J., McPherron A.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2001. - V. 98. - P. 9306-9311.

5 Yeo C., Whitman M. // Mol. Cell. - 2001. - V. 7. - P. 949-957.

6 Oh S.P., Yeo C.-Y., Lee Y. et al. // Genes Dev. - 2002. - V. 16. - P. 2749-2754.

7 Carnac G, Ricaud S., Vernus B., Bonnieu A. // Mini Rev. Med. Chem. 2006. V. 6. P. 765- 770.

8 McPherron A.C., Lawler A.M., Lee S. J. // Nature. - 1997. - V. 387. - P. 83-90.

9 Ashmore C.R., Parker W., Stokes H., Doerr L. // Growth. - 1974. - V. 38. - P. 501-507. 10 Swatland H. J., Kieffer N.M // J. Amm. Sci. - 1994. - V. 38. - P. 752-757.

11 McPherron A C., Lee S.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - V. 94. - P. 12457-12461.

12 Kambadur R., Sharma M., Smith T.P., Bass J.J. // Genome Res. - 1997. - V. 7. - P. 910- 915. 13 Grobet L., Martin L.J., Poncelet D. et al. // Nat. Genet. - 1997. - V. 17. - P. 71-74.

14 Kota J., Handy C.R., Haidet A.M. et al. Follistatin Gene Delivery Enhances Muscle Growth and Strength in Nonhuman Primates // Sci. Transl. Med. - 2009. - V. 1. - P. 6ral5.

15 Lee S.J., Reed L.A., Davies M.V. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - V. 102. - P. 18117-18122.

Перечень последовательностей:

SEQ ID NO 1 Последовательность аминокислот ActRIIB

SEQ ID NO 2 Последовательность аминокислот глицин-серинового спейсера

SEQ ID NO 3 Последовательность аминокислот альфа-глюкансвязывающего домена (GBD) из Streptococcus mutans

SEQ ID NO 4 Последовательность нуклеотидов гена, кодирующего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, и последовательность аминокислот рекомбинантного белка GBD- ActRIIB