CON UN INMUNOMODULADOR

Campo Técnico

La presente invención se relaciona con el campo técnico de productos farmacéuticos veterinarios, y en particular divulga una vacuna recombinante contra el circovirus porcino, la cual se obtiene por medio de un vector de expresión en levaduras.

Antecedentes de la invención

El mercado de la carne de cerdo ha tenido un crecimiento sostenido en los últimos años, llegando a ser la más consumida a nivel mundial. Los datos de la FAO (Perspectivas alimentarias - Resúmenes de mercado, mayo del año 2015) muestran que en el año 2014 se produjeron 314,7 millones de toneladas de carne a nivel mundial, siendo la carne de cerdo la más consumida. A nivel sudamericano, Chile se ha mantenido en los últimos 10 años como el sexto mayor productor de cerdos en el mundo y el segundo mayor productor de cerdos de Sudamérica (ProChile. (2013). PMP Estudio de mercado: carne de cerdo en Argentina, Oficina comercial de Chile en Buenos Aires y Mendoza, Argentina-ProChile, 19 pp.). A pesar que el mercado porcino va en aumento, existen diversos factores que limitan la producción de cerdos, siendo el factor más importante las enfermedades. Las medidas actuales de bioseguridad han sido exitosas en el control de enfermedades bacterianas, no así en el control de enfermedades virales. El mayor problema en el manejo de la salud de los cerdos es la posibilidad de diseminación de infecciones virales en las granjas, de los cuales se destaca el circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), siendo uno de los patógenos más devastadores en cerdos en los últimos 20 años (Davies, P. R. (2012). One world, one health: the threat of emerging swine diseases. A North American perspective. Transboundary and emerging diseases, 59(s1 ), 18-26).

El circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) es el agente etiológico del Síndrome multisistémico de desmedro post-destete o PMWS (por sus siglas en inglés de Postweaning multisystemic wasting syndrome). Este síndrome afecta a cerdos de 2 a 3,5 meses de edad, aunque también ha sido descrita en animales de 1 a 6 meses de i edad, inclusive en lechones de pocos días de edad. Las tasas de morbilidad y letalidad son cercanas al 4-30% y 70-80%, respectivamente. Los síntomas incluyen pérdida de peso, desmedro, disnea, aumento del tamaño de los nodulos linfoides, diarrea, palidez e ictericia (Segalés, J., & Domingo, M. (2002). Postweaning mulstisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. A review. Veterinary Quarterly, 24(3), 109-124).

El circovirus porcino de tipo 2 se clasifica en el grupo II de los virus, familia circoviridae, género circovirus. El PCV2 es un virus de ADN de simple hebra (ADNss), circular, de un largo de 1 ,7 Kbp, no tiene envoltura y mide 12-23 nm de diámetro (Alian G.M. y cois. (1998). Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe. J Vet Diagn Invest 10: 3-10). El virus PCV2 contiene 1 1 marcos abiertos de lectura u ORF (de las siglas en inglés Open fíeading Framé) con el potencial para codificar 5 proteínas mayores de 5 kDa. Los dos ORFs principales son el ORF1 , que codifica una proteína de 35,7 kDa involucrada en la replicación viral (proteína Rep), y el ORF2 de 750bp de longitud que codifica para la principal proteína estructural de la cápside (proteína Cap) de 27,8 kDa, la cual posee propiedades inmunogénicas (Cheung A.K., (2012). Porcine circovirus: transcription and DNA replication. Virus Res. 164: 46-53.).

El virus PCV2 infecta preferentemente células del sistema inmunitario, modulando negativamente el patrón de citoquinas reguladoras de la respuesta inmune, lo que produce una inmunodepresión severa (Darwich L. y cois. (2004) Pathogenesis of postweaning multisystemic wasting síndrome caused by Porcine circovirus 2: an immune riddle. Arch Virol 149 (5): 857-74). Se ha determinado que ciertas regiones CpG del genoma viral del PCV2 (en su mayoría regiones del ORF1 ), inhiben la secreción de lnterferón-α (INF-a) en células derivadas de la medula ósea (Kekarainen, T., Montoya, M., Mateu, E., Segalés, J., (2008) Porcine circovirus type 2-induced interleukin-10 modulates recall antigen responses. J.Gen Virol 89 (3): 760-765), lo que contribuye a generar un estado de inmunodepresión, condicionando que otros patógenos puedan infectar a los cerdos que han sido contagiados con PCV2, los que terminan por debilitar a los planteles porcinos, llevándolos a la muerte o al sacrificio (Alian G.M., Ellis J.A., (2000) Porcine circoviruses: a review. J Vet Diagn Invest 12:3-14).

La tendencia mundial para combatir la infección del PCV2 y el ciclo clínico de PMWS es la vacunación completa de los planteles porcinos, además de prevenir lesiones y enfermedades paralelas (Chae C, (2012). Commercial porcine circovirus type 2 vaccines: Efficacy and clinical application. The Veterinary Journal (194): 151 ). El estado de la técnica es vasto en cuanto a la divulgación de vacunas destinadas a la prevención y control del circovirus. Así, la solicitud de patente US2010150959 describe métodos y composiciones para el tratamiento de cerdos contra PCV2. En particular, divulga un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia que codifica un ORF2 de PCV2 modificado, operativamente unido a un promotor, en donde la secuencia de ORF2 se modificó eliminando la señal de localización nuclear, de forma tal de permitir que la proteína derivada del ORF2 truncado sea secretada en una célula infectada.

La solicitud US2013302370 divulga un vector de expresión de la proteína del ORF2 de PCV2, preferentemente en baculovirus, la cual se recupera del sobrenadante de las células infectadas y se inactiva con etilenimina. Como una divulgación general describe que se pueden utilizar agentes inmunomoduladores tales como interleuquinas, interferones, u otras citoquinas para obtener composiciones inmunogénicas.

Las vacunas comercializadas actualmente en Chile se basan en subunidades recombinantes del circovirus PCV2 obtenidas en células de insecto (CircoFLEX®, Circumvent®, Porcilis®, FosteraPCV®), o bien corresponden a virus inactivos (Cicromune®, Circovac®). En general las vacunas comerciales anti-PCV2 se basan en inmunógenos que sólo generan anticuerpos neutralizantes que controlan el curso clínico de enfermedad, pero que no han logrado controlar la infección subclínica, manteniendo la infección viral en la población porcina y la amenaza de reemergencia de la enfermedad clínica (Opriessnig T. y cois. (2010). Comparison of the effectiveness of passive (dam) versus active (piglet) immunization against porcine circovirus type 2 (PCV2) and impact of passively derived PCV2 vaccine-induced immunity on vaccination. Veterínary Microbiology 142: 177-183). Como se mencionó anteriormente, una de las técnicas más usadas para producir componentes de vacunas es mediante sistemas de expresión en baculovirus y multiplicación en células de insecto. Otros sistemas biológicos ampliamente conocidos en el estado de la técnica para la expresión de proteínas heterólogas son las levaduras. Un ejemplo de tales levaduras empleadas para este fin es Pichia pastorís, la cual se ha utilizado ampliamente para la expresión de proteínas heterólogas bajo el control del promotor de la enzima alcohol oxidasa PAOX1 (Ahmad, M. y cois. (2014). Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Applied microbiology and biotechnology, 98(12), 5301 -5317). Este análisis global del estado de la técnica indica que, a pesar de que se han descrito diversas formulaciones de vacunas anti-PCV2, éstas al ser aplicadas en cerdas inducen inmunidad pasiva que podría proteger a las crías, sin embargo, cuando estas vacunas se basan en virus atenuados o en subunidades virales, la inmunidad pasiva transmitida en la leche materna afecta la eficacia de la vacunación. Lamentablemente, la erradicación o eliminación total de PCV2 es prácticamente imposible, pero podría ser factible mediante programas de vacunación masivos con vacunas más eficientes que las actuales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 A: detalle de la secuencia aminoacídica de la proteína variante quimérica de Cap de PCV2 de la presente invención (denominada Quimeral , identificada mediante SEQ.ID.2).

Figura 1 B: muestra la estructura tridimensional de Quimeral .

Figura 2: esquema de recombinación homologa del vector de co-expresión de la presente invención con el genoma de levadura. PAOX1 : secuencia promotora del gen de la enzima alcohol oxidasa 1 (AOX1 ) y extremos 5 ^' y 3 ^' del gen; T: secuencia terminadora; P: secuencia promotora; SS: secuencia señal de secreción; pIFN-a: secuencia codificante del interferón alfa porcino.

Figura 3A: alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas de las proteínas Quimeral y las proteínas de la cápside de PCV2 aislado de Rancagua, Chile (año 2007) y la proteína Cap consenso (PDB 3R0R), la cual posee los residuos más conservados de Cap en el mundo.

Figura 3B: es una superposición de las estructuras tridimensionales de la proteína Cap. En gris claro se destaca la estructura modelada para Quimeral , superpuesta a la estructura cristalina de la proteína Cap de PCV2 en gris oscuro (PDB 3R0R).

Figura 4: subclonamiento de la secuencia codificante de Quimeral en el plásmido de expresión pKmin-VectDual. (A) Se observa en la electroforesis en gel de agarosa la digestión del plásmido pUC57-Quimera1 para extraer el gen de la Quimeral de 720 bp, Carril 1 : Patrón de peso molecular, Carril 2: Plásmido pUC57-Quimera1 digerido con la enzima Mscl. (B) Se observa el gel virtual de la digestión del plásmido pUC57-Quimera1 con la enzima Mscl. (C) Se observa en la electroforesis en gel de agarosa la purificación de la secuencia de Quimeral de aproximadamente 700 bp y del vector pKmin-VectDual de aproximadamente 7,1 Kbp linealizado con la enzima Mscl, Carril 1 : Patrón de peso molecular, Carril 2: Vector pKmin-VectDual linealizado y purificado, Carril 3: secuencia de la Quimeral purificada. (D) Se representa el gel virtual de la digestión del plasmido pKmin-VectDual-Qm1 con la enzima Mscl. (E) Se observa la representación del clonamiento del gen Quimeral en el vector pKmin-VectDual. (F) Se observa la representación esquemática del vector pKmin-Dual-Qm1 . Se detallan en segmentos acotados en diagramas de flechas o rectángulos: el gen Quimeral , el gen que codifica interferón alfa porcino (INFaPOR), el gen y promotor HIS3 del gen que codifica la enzima imidazol glicerol fosfato deshidratasa, además se representan los respectivos promotores del gen AOX1 . Notl y Mscl: Sitios de restricción para las endonucleasas respectivas.

Figura 5: análisis de la expresión de proteínas recombinantes en sobrenadante de lisado celular y en sobrenadante de cultivo celular de levaduras. (A) Muestras de sobrenadante de lisado celular de levaduras transformadas. PPM: Patrón de peso molecular de proteínas; C-: Control negativo, muestra de levadura Pichia pastoris MP36 sin transformar; Cap: Muestra de clon Cap; Q1 : Muestra de clon Quimeral . (B) Muestras de sobrenadante del cultivo de levaduras transformadas. PPM: Patrón de peso molecular de proteínas; C-: Control negativo, muestra de levadura MP36 sin transformar; Cap: Muestra de clon Cap; Q1 : Muestra de clon Quimeral .

Figura 6: representa la metodología de cultivo de Pichia pastoris y la expresión de proteínas recombinantes.

Figura 7-: muestra un ensayo de proliferación en linfocitos porcinos. C-: Control negativo sin INF-α porcino, Se (MP36): Sobrenadante de cultivo de levaduras sin transformar; 1 μg μL, 10 μg μL, 25 μg μL, 50 μg μL: Concentraciones de INF-α porcino en 100 μΙ_ de medio de cultivo. Los datos representan la media de experimentos independientes realizados con 12 replicados y analizados estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional y post-test de Dunnet ( ^*** p< 0,001 , ^** p< 0,01 , ^* p< 0,05).

Figura 7B: cuantificación relativa de la expresión génica de OAS2, el cual es un indicador de actividad antiviral en linfocitos porcinos cultivados en presencia del IFN-a porcino producido en levaduras. Se (MP36): Sobrenadante de cultivo de levaduras no transformadas. Los datos representan la media de experimentos independientes realizados por cuadruplicado normalizados por el control negativo de células sin tratamiento (C-), los datos se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional ( ^*** p< 0,001 , ^** p< 0,01 , ^* p< 0,05).

Figura 8: esquema de inmunización de cerdos con las formulaciones preparadas.

Figura 9: cuantificación por PCR en tiempo real de la carga viral de PCV2 (número de copias de ADN/mL) en muestras de sangre de grupos de cerdos inmunizados con las diferentes formulaciones vacunales utilizadas. Quimeral : Grupo inmunizado con formulación de antígeno Quimeral , Quimeral + pINFalfa: Grupo inmunizado con formulación de antígeno Quimeral combinado con interferon alfa porcino, C- (levaduras MP36): Grupo control negativo vacunado con una formulación de sobrenadante de lisis celular de levaduras no transformadas, Placebo: Grupo control negativo vacunado con tampón fosfato. Los datos representan la media de experimentos independientes realizados por cada grupo y se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional y post-test de Dunnet. Se gráfico la significancia de los grupos ( ^*** p< 0,001 ) Quimeral , Quimeral + INFalfa.

Figura 10: cuantificación por PCR en tiempo real de la carga viral de PCV2 (número de copias de ADN/mL) en muestras de sangre de cerdos en un ensayo de protección horizontal.

DIVULGACION DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica sintética que codifica una variante de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 que comprende una secuencia que codifica un fragmento de la proteína de la cápside de una cepa del circovirus porcino de tipo 2; y una secuencia que codifica un fragmento de la proteína de la cápside del virus del mosaico del tabaco. La secuencia polinucleotídica en forma preferente adicionalmente comprende al menos un epítopo antigénico de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2. En una realización preferida, dicha secuencia comprende la secuencia SEQ.ID.NO.1 o cualquier variante derivada de la misma.

Un segundo objeto de invención corresponde a una proteína recombinante de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 que comprende un fragmento de la proteína de la cápside de una cepa del circovirus porcino de tipo 2; y un fragmento de la proteína de la cápside del virus del mosaico del tabaco. En forma preferente, la proteína recombinante comprende la secuencia SEQ. ID.NO.2 o cualquier variante derivada de la misma.

Un tercer objeto de invención incluye un vector para la expresión de genes de interés en la levadura Pichia pastoris, que comprende: a) un cásete de expresión que codifica un gen de interés de expresión intracelular; b) un cásete de expresión que codifica un gen de interés de expresión extracelular; y c) una secuencia codificante de un marcador de selección posicionado entre el cásete de expresión que codifica el gen de interés de expresión intracelular y el cásete de expresión que codifica el gen de interés de expresión extracelular. En una modalidad preferida, ambos casetes de expresión comprenden el mismo promotor. En una modalidad más preferida, dicho promotor es el promotor PAOX1 de Pichia pastoris. En una modalidad aún más preferida, el cásete de expresión que codifica un gen de interés de expresión extracelular incluye adicionalmente una secuencia señal de secreción y preferentemente es el péptido señal Suc4 de Saccharomyces cerevisiae.

En otra realización preferida, el gen de interés de expresión intracelular es un gen que codifica una variante de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2, en donde dicho gen comprende la secuencia polinucleotídica sintética que codifica una variante de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2, que comprende una secuencia que codifica un fragmento de la proteína de la cápside de una cepa del circovirus porcino de tipo 2; y una secuencia que codifica un fragmento de la proteína de la cápside del virus del mosaico del tabaco. Preferentemente, la variante de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 comprende la secuencia SEQ. ID.N0.1 o cualquier variante derivada de la misma. En otra modalidad de la invención, el gen de interés de expresión extracelular es el gen que codifica para un interferón, preferentemente interferón alfa porcino.

En otra modalidad, el marcador de selección es un marcador auxotrófico, preferentemente es el gen HIS3.

Otro objeto de la presente invención es un cásete de expresión que codifica una variante de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 que comprende: a) una secuencia polinucleotídica sintética que codifica una variante de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 que comprende una secuencia que codifica un fragmento de la proteína de la cápside de una cepa del circovirus porcino de tipo 2; y una secuencia que codifica un fragmento de la proteína de la cápside del virus del mosaico del tabaco, b) una secuencia promotora de la transcripción río arriba de la secuencia definida en a), y c) un terminador de la transcripción río abajo de la secuencia definida en a).

Un objeto de invención adicional de la presente invención es una célula de levadura transformada que comprende un polinucleótido recombinante seleccionado del grupo que consiste del vector de expresión y el cásete de expresión previamente descritos. Preferentemente, la levadura es Pichia pastorís.

Otro objeto de invención se refiere a una vacuna contra el circovirus porcino de tipo 2 que comprende: a) una variante de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 que comprende un fragmento de la proteína de la cápside de una cepa del circovirus porcino de tipo 2 y un fragmento de la proteína de la cápside del virus del mosaico del tabaco; y b) opcionalmente un interferón.

En la vacuna descrita, el interferón preferentemente es interferón alfa porcino. Otro objeto de la presente invención es un método para la producción de una vacuna contra circovirus porcino de tipo 2 en levaduras que comprende: a) proporcionar un vector de expresión según se describió anteriormente, en donde el gen de interés de interés de expresión intracelular codifica una proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2; y el gen de interés de expresión extracelular es el gen que codifica interferón porcino; b) transformar una levadura con el vector; c) aislar la variante de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 desde el medio intracelular de la levadura transformada, y d) aislar el interferón porcino desde el medio extracelular del cultivo de la levadura transformada.

Preferentemente, en el método descrito el gen de interés de expresión intracelular que codifica una proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 posee la secuencia nucleotídica sintética mencionada anteriormente en el primer objeto de invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona con una composición vacunal y métodos para preparar una nueva vacuna contra la infección y las patologías asociadas al circovirus porcino de tipo 2 (PCV2). La vacuna incluye un nuevo antígeno quimérico recombinante derivado de la proteína de la cápside (Cap) de PCV2 y una citoquina recombinante potenciadora de la respuesta inmune en los cerdos. Específicamente, la presente invención provee una secuencia sintética de ADN que codifica una variante quimérica de la proteína de la cápside (Cap) del virus PCV2, la cual se expresa en levaduras transformadas genéticamente y permite su ensamblaje formando partículas similares a virus (VLPs, del inglés virus-like partióles). La invención proporciona un método para obtener una composición vacunal para la prevención o el tratamiento de enfermedades asociadas a PCV2 en cerdos, que comprende la producción del antígeno y la citoquina inmunomoduladora mediante la tecnología de expresión de proteínas heterólogas en levaduras; obteniéndose ambos componentes de la composición vacunal a partir de un único cultivo de las levaduras transformadas genéticamente.

La inmunización de cerdos con esta vacuna genera una protección efectiva contra PCV2 en los animales. Su administración puede realizarse en cerdos con diferentes estadios de infección previa con el agente patogénico, o bien en cerdos sanos. En ambos casos se desarrolla un estado de protección inmunológica en los animales vacunados que bloquea tanto el desmedro derivado del desarrollo de una patología asociada al circovirus porcino de tipo 2, como la propia infección viral latente. La protección inducida por la vacuna en los cerdos reduce la presencia del PCV2 en circulación a niveles indetectables por técnicas de determinación de carga viral, basadas en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.

La presente invención genera potenciales beneficios directos a la sanidad, el manejo y la crianza de cerdos a nivel mundial. La vacuna se puede administrar de forma masiva en los criaderos de cerdos, en una o dos dosis, en forma independiente de la edad del animal o de su nivel de infección previa con el virus PCV2. El diseño de las secuencias de aminoácidos incluidas en el antígeno quimérico contra PCV2 y su distribución específica en una estructura terciaria básica, así como su co-administración con la citoquina inmunopotenciadora interferón alfa porcino (plFN-α), son la base de la inducción de esta respuesta protectora observada en los animales vacunados.

La presente invención se relaciona con una secuencia de ADN sintética (SEQ.ID.1 ) que codifica una proteína o antígeno quimérico derivado de la proteína Cap del circovirus porcino de tipo 2, denominada Quimeral. El diseño de esta proteína se realizó tomando en cuenta las siguientes consideraciones: a) que la proteína sea representativa de cepas virales chilenas y extranjeras, b) que se conserven las secuencias aminoacídicas de los dominios epitópicos antigénicos importantes, y c) que se mantenga la estructura secundaria y tridimensional de la proteína nativa Cap. Para cumplir con lo anterior, el diseño de la proteína quimérica, cuya secuencia aminoacídica corresponde a SEQ.ID.2, incluyó fragmentos de tres fuentes diferentes: 1 ) el extremo amino terminal de un aislado chileno de PCV2 obtenido de la ciudad de Rancagua, Chile (GenBank EU519224.1 ), el que comparte una identidad fenotípica con aislados de PCV2 de China, Brasil, Holanda y Francia, 2) los epítopos de regiones antigénicas expuestas más importantes de PCV2 (Shang S.B. y cois. (2009). Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus, and antigenic phenotype of porcine circovirus Type 2. Mol Immunol. 46(3):327-34), y c) regiones de la estructura secundaria de la proteína de la cápside del virus del mosaico del tabaco, homologa estructural de Cap de PCV2.

En una modalidad preferida, la Figura 1 ^a muestra la secuencia aminoacídica SEQ.ID.2 de la proteína quimérica de Cap de PCV2 según se indica: (residuos 1 -41 ): extremo N-terminal de aislado chileno de PCV2; (residuos 42-59, 88-1 12, 137-170 y 213-224): secuencias de la proteína de la cápside del virus del mosaico del tabaco (TMV) con el código Protein Data Bank (PDB) 1 C8N; (residuos: 60-87, 1 12-137, 168- 212 y 225-231 ): secuencias de los dominios epitópicos más relevantes de la proteína de la cápside de PCV2 con el código PDB 3R0R, la que reúne los residuos más conservados de la proteína Cap alrededor del mundo; (residuos 1 12, 137 y 168-170): secuencias comunes entre PDB 1 C8N y 3R0R; y (residuos 232-237): cola de histidina 6xHis. La Figura 1 B muestra la estructura tridimensional de Quimeral , en donde se observa que los dominios más importantes de Cap de PCV2 (en color gris oscuro) quedan en regiones expuestas de la proteína. La presente invención también abarca un vector recombinante de expresión de proteínas heterólogas en levaduras, y particularmente proporciona un vehículo para expresar dos genes de interés en forma simultánea y equivalente, en donde uno de los productos de la transcripción y traducción se destina al compartimento intracelular de la levadura, mientras que el otro es secretado al medio extracelular, facilitando la purificación de las proteínas así obtenidas para producir la vacuna o composición farmacéutica. La invención también se relaciona con levaduras recombinantes que contienen la secuencia divulgada en la presente invención, así como el vector de expresión que la incluye. En una modalidad preferida, la levadura se selecciona del grupo que consiste en: Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp. y Schizosaccharomyces pombe. En una modalidad aún más preferida, la levadura es Pichia pastoris.

La secuencia sintética de ADN que codifica una proteína quimérica de la proteína de la cápside de PCV2 o fragmentos de la misma pueden clonarse en un vector de expresión en levaduras que contiene un promotor de expresión adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción adecuados, que se transfieren a las levaduras para obtener la proteína Cap quimérica, la cual forma partículas icosaédricas similares al virus (VLPs). Las técnicas de biología molecular para llevar a cabo dichas manipulaciones son ampliamente conocidas en el estado de la técnica y por cualquier experto en la materia. A modo de referencia, el siguiente documento Weidner, M. y cois. (2010). Expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (36), e1862-e1862 indica un protocolo estándar de obtención de proteínas recombinantes en Pichia pastoris. La invención también se relaciona con un método para expresar la proteína quimérica de Cap de PCV2 en una célula de levadura, el cual comprende los pasos de introducir un vector que incluye la secuencia sintética de ADN SEQ.ID.1 en una levadura; y cultivar dicha levadura para que produzca la proteína recombinante.

La secuencia sintética de ADN SEQ.ID.1 de la presente invención, o una variante de la misma puede ensamblarse en una construcción genética o cásete de expresión diseñado para proporcionar una expresión eficiente en las levaduras transformadas con dicho constructo. La construcción preferentemente contiene la secuencia SEQ.ID.1 , junto con secuencias reguladoras de la transcripción tales como un promotor río arriba de la secuencia de interés y un terminador río abajo de la secuencia de interés. En una modalidad preferida, el promotor es la secuencia promotora del gen de la enzima alcohol oxidasa 1 PAOX1 (GenBank FN392322.1 ), el cual es inducible por metanol. Sin embargo, cualquier experto en la materia podría utilizar otros promotores ampliamente conocidos en el estado de la técnica, ya sea inducibles o constitutivos. A modo de ejemplo, dentro de la primera categoría se encuentran: DAS, FLD1 , ICL1 , PH089, THI1 1 , ADH1 , EN01 , GUT1 , entre otros. Dentro de los promotores constitutivos susceptibles de utilizarse se encuentran: GAP, TEF1 , PGK1 , GCW14, G1 y G6. Un terminador de la transcripción preferido es el terminador GAP (GenBank CP005276.2), aunque se pueden utilizar otros terminadores conocidos. La combinación del promotor PAOX1 y el terminador GAP es particularmente preferida. La vacuna de la presente invención, además de incluir como antígeno a la proteína Cap quimérica previamente descrita, incluye una citoquina inmunopotenciadora. Dicha citoquina es preferentemente el interferón alfa porcino (plFN-α), cuya secuencia nucleotídica SEQ.ID.3, o una variante de la misma, se clona en el vector recombinante de expresión de proteínas heterólogas en levaduras de la presente invención, y la expresión de dicha proteína de secuencia aminoacídica SEQ.ID.4 se dirige al medio extracelular mediante la adición de una secuencia señal de secreción. En una modalidad preferida, dicha señal de secreción es Suc2, la cual deriva de la enzima sacarasa de Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otra señal de secreción conocida en el estado de la técnica, tales como α-MF, PH01 , SUC2, PHA-E, KILM1 , pGKL, CLY, K28, Scw, Dse, Exg, entre otras.

Un objeto novedoso de la presente invención lo constituye el vector de expresión de proteínas heterólogas en levaduras utilizado que comprende dos construcciones genéticas, unidades transcripcionales o casetes de expresión, que permiten la coexpresión de dos genes de interés, mencionado aquí como vector dual, en donde el producto de uno de ellos se obtiene intracelularmente, mientras que el producto de la expresión del otro gen se dirige al medio extracelular. Lo anterior, además, es un aspecto ventajoso de la invención ya que permite facilitar el proceso de purificación de dichas proteínas, pues mediante la transformación de las levaduras con un solo vector se logra obtener una proteína de interés en el interior de las células, mientras que la otra proteína se obtiene en el sobrenadante del cultivo, lo cual se logra a través de la inclusión de una señal de secreción en el cásete de expresión. Adicionalmente, el vector de la presente invención incluye un marcador de selección, cuya posición en el vector es particularmente esencial, ya que debe ubicarse entre los dos casetes de expresión para que se logre la integración deseada al genoma de la levadura. La posición especialmente seleccionada de un marcador de selección entre dos constructos o casetes para la expresión de dos proteínas de interés permite seleccionar exclusivamente a las levaduras que recombinaron e integraron al genoma ambos constructos de interés. El marcador de selección puede ser cualquiera de los conocidos en el estado de la técnica, tales como marcadores de auxotrofía (histidina, adenina, lisina, arginina, entre otros) o bien marcadores en base a genes de resistencia a antibióticos, tales como: zeocina, nourseotricina, entre otros ampliamente conocidos por cualquier experto en la materia. En una modalidad preferida, el marcador de selección es por auxotrofía, particularmente histidina 3 (His 3), el cual posee río arriba la secuencia promotora HIS3 y río abajo la secuencia terminadora GAP.

En una modalidad preferida del vector de co-expresión de dos proteínas de interés o vector dual de la presente invención, las secuencias promotoras de ambos casetes de expresión son las mismas, lo cual permite obtener una expresión equivalente y simultánea de las proteínas de interés. La selección de la posición del marcador de selección no es trivial, ya que sólo cuando éste se encuentra entre ambos casetes de expresión es posible seleccionar aquellas levaduras transformadas que incorporan e integran efectivamente ambas construcciones genéticas en el genoma por recombinación homologa, indicado con líneas cruzadas continuas en la Figura 2; y descartar aquellas células que recombinaron con el promotor que se encuentra río abajo del marcador de selección, indicado con líneas cruzadas segmentadas.

La vacuna o composición vacunal de la presente invención comprende un antígeno quimérico de la proteína Cap de PCV2 y el interferon alfa porcino, los cuales en una modalidad preferida se encuentran en una proporción de 70% de proteínas derivadas del extracto antígeno quimérico (VLPs) y un 30% de proteínas derivadas del extracto de interferon alfa porcino. Las cantidades del antígeno quimérico presente en la composición vacunal se encuentran en un rango entre 100 y 150 μg mientras que el interferon alfa porcino entre 40 a 65 μg.

La vía de administración puede ser inyección intramuscular, subcutánea, intradérmica, impresión a través de la piel, y otros tales como administración intraperitoneal, intravenosa, oral o incluso mediante inhalación. Se puede administrar en al menos una dosis, y opcionalmente se pueden proporcionar al animal vacunaciones de refuerzo. El rango de edad de los cerdos a vacunar puede variar entre 15 y 30 días de vida, preferentemente previo al destete. Opcionalmente, la vacuna puede utilizarse en conjunto con cualquier adyuvante oleoso u otro que sea potencialmente inmunogénico en cerdos, como por ejemplo Montanide ISA 15 ^a VG, Adyuvac 70, Montanide 888, Adyuvante de Freund; o bien en conjunto con un vehículo farmacéutico. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína quimérica construida a partir de un fragmento de la proteína Cap de PCV2 y un fragmento de la proteína Cap del virus del mosaico del tabaco. Dicha composición incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable, el cual comprende cualquier materia prima utilizada en la manufactura de la composición, excluyendo a los principios activos (la proteína quimérica y el interferón porcino).

Habiendo descrito las modalidades preferidas de la invención con referencia a las figuras que acompañan la descripción, se entenderá que la invención no se limita a dichas modalidades preferidas, y que cualquier experto en la materia podría realizar modificaciones, manteniendo la esencia de la invención. A continuación se presentan ejemplos de realización de la invención, los cuales se han incluido con el objetivo de ilustrar la invención, sus modalidades preferidas y ejemplos comparativos, pero en ningún caso deben considerarse para restringir el alcance de la solicitud de patente, el cual sólo está delimitado por el contenido de las reivindicaciones que aquí se adjuntan.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

EJEMPLO 1. Diseño de una proteína variante quimérica de Cap de PCV2.

Se diseñó una proteína quimérica derivada de la proteína Cap del circovirus porcino de tipo 2, la cual se denominó Quimeral . La secuencia nucleotídica codificante de dicha proteína corresponde a SEQ.ID. 1 , mientras que la secuencia aminoacídica corresponde a SEQ.ID.2, según se muestra en la Tabla 1 y Figura 1 . Como se mencionó anteriormente, el diseño de la proteína quimérica incluyó fragmentos de tres fuentes diferentes: 1 ) el extremo amino terminal de un aislado chileno de PCV2 obtenido de la ciudad de Rancagua, Chile (EU519224.1 ), el que comparte una identidad fenotípica con aislados de PCV2 de China, Brasil, Holanda y Francia, 2) los epítopos de regiones antigénicas expuestas más importantes de PCV2 (Shang S.B. y cois. (2009). Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus, and antigenic phenotype of porcine circovirus Type 2. Mol Immunol. 46(3):327-34), y c) regiones de estructura secundaria la proteína de la cápside del virus del mosaico del tabaco (TMV), homologa estructural de Cap de PCV2 (3R0R_A). Con este diseño se logra obtener una proteína quimérica variante Cap que posee los epítopos antigénicos más importantes del virus, representa diversas cepas de aislados de diferentes lugares tales como Chile, China, Brasil, Holanda y Francia, y al utilizar como base la proteína de la cápside del virus del mosaico de la planta del tabaco (TMV) se logra crear una estructura tridimensional que simplifica la expresión de esta variante en levaduras, preferentemente Pichia pastorís. Con lo anterior es posible exponer los dominios antigénicos de PCV2 de interés en la proteína de la cápside de TMV, de forma similar a un hapten o/proteína transportadora.

Tabla 1 . Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de la variante quimérica de Cap- PCV2 (Quimeral ).

El antígeno Quimeral adopta virtualmente una conformación espacial similar a la que presenta la proteína Cap de PCV2, y podría mantener los epítopos inmunogénicos del virus porcino según un análisis de superposición mostrado en la Figura 3 ^a . La proteína Quimeral posee un 66% de identidad con la proteína Cap de PCV2, de esta forma es estructuralmente similar a Cap del circovirus porcino, pero presenta un porcentaje de identidad de secuencia menor. En un alineamiento realizado en el programa Clustal omega mostrado en la Figura 3 ^a se observa la diferencia en la secuencia primaria de Quimeral en comparación con el aislado del virus PCV2 de Rancagua, Chile, y con la secuencia aminoacídica de la estructura de la cápside viral del PCV2 (PDB 3R0R). Se aprecia la similitud en el extremo amino-terminal entre la Quimeral y el aislado nacional, y se destaca la diferencia en ese mismo extremo con la secuencia de la estructura PDB 3R0R. En la Figura 3B se muestra un alineamiento de las estructuras de Quimeral y Cap consenso de PCV2 (PDB 3R03).

EJEMPLO 2. Diseño del vector de co-expresión de proteínas heterólogas en levaduras.

El diseño de un vector de co-expresión de proteínas heterólogas en la levadura Pichia pastoris es fundamental para garantizar el ensamblaje en VLPs de las proteínas recombinantes derivadas de Cap de PCV2 y disminuir los costos en la producción y manejo de las levaduras genéticamente transformadas. Por esto se trabajó en función de obtener un mismo clon que expresara en el citoplasma celular la proteína quimérica derivada de Cap y que dirigiera la secreción de INF-α al medio de cultivo. El virus PCV2 se libera desde una célula infectada por 2 vías diferentes: por gemación de grupos virales, o por lisis de células apoptóticas y/o muertas (Rodríguez- Cariño, C, Duffy, C, Sánchez-Chardi, A., McNeilly, F., Alian, G. M., & Segalés, J. (201 1 ). Porcine circovirus type 2 morphogenesis in a clone derived from the I35 lymphoblastoid cell line. Journal of comparative pathology, 144(2), 91 -102). El PCV2 se ensambla en el núcleo de la célula porcina hospedera y sus proteínas, incluyendo la proteína antigénica Cap, no pasan a la ruta se secreción, sino que poseen señales de localización nuclear (Khayat R. y cois. (201 1 ) The 2.3-Angstrom Structure of Porcine Circovirus 2. Journal of Virology 85 (15): 7856-7862). Por tanto, desde el enfoque biotecnológico, resulta adecuado expresar este antígeno intracelularmente para simular las condiciones nativas de ensamblaje de la proteína y mantener así la secuencia de epítopos conformacionales antigénicos. En el caso del INF-α, esta es una proteína secretable que sí se sintetiza de forma nativa, pasando por la maquinaria secretora de las células porcinas, retículo endoplasmático y aparato de Golgi (Dinarello C.A., (2007). Historical insights into cytokines. Eur. J. Immunol. 37 (1 ): 34-45), por tanto, se dirigió la secreción del interferón porcino en la levadura para simular las condiciones de expresión y obtener la proteína recombinante en el medio de cultivo. Para ello se incluyó la señal de secreción de la enzima sacarasa (Suc4) del organismo Saccharomyces cerevisiae de un tamaño de 338 pb. Tecnológicamente, el diseño se enfocó además a permitir la separación y purificación de los dos componentes de una futura formulación vacunal, antígeno y citoquina, de forma simple mediante la separación celular del medio de cultivo después de la inducción de la expresión con metanol. Esto permitió reducir el número de clones necesarios que cultivar, simplificando la producción al evitar la necesidad de contar con un clon adicional que exprese sólo INF-α en el medio de cultivo, y el incremento en el costo asociado durante la producción comercial de los futuros componentes de la vacuna. Si se considera que la generación de clones es sólo un paso para la luego escalar el proceso a un rango de cultivo preparativo o productivo, el proceso se simplifica en cuanto a la producción de INF-α en el mismo clon de levadura que expresa el antígeno.

De esta manera se diseñó un vector dual para co-expresar en forma simultánea dos proteínas de interés en levaduras, particularmente en Pichia pastoris. Este vector contiene dos unidades transcripcionales independientes: una construcción genética o cásete de expresión para el gen de la proteína variante de Cap de PCV2 Quimeral (Figura 1 ) y otro para el INF-α porcino. El vector se diseñó conteniendo los genes de interés bajo la acción de promotores idénticos correspondientes al promotor de la enzima alcohol oxidasa 1 (PAOX1 ), lo que garantiza una expresión similar de ambos genes y le permite integrarse en el genoma de la levadura por recombinación homologa. El marcador de selección utilizado fue el gen para selección por auxotrofía histidina 3 (His3), el cual fue puesto entre los casetes de expresión mencionados, lo que permite seleccionar a las levaduras que integraron ambos constructos en su genoma (líneas continuas en forma de X, Figura 2) y descartar aquellas que recombinen sólo uno de los casetes (líneas segmentadas en forma de X, Figura 2). El diseño de este vector fue pensado para expresar la proteína variante de Cap del PCV2 (Quimeral ) en el citoplasma de las levaduras, respetando la naturaleza del virus PCV2 como patógeno intracelular, evitando que se realicen modificaciones post-traduccionales a la proteína pues ésta no transita por la ruta secretoria del Aparato de Golgi. Paralelamente, la expresión del interferón alfa porcino fue direccionada hacia el medio de cultivo, ya que naturalmente es una proteína cuyo destino es ser secretada. Para esto al gen de la citoquina se le agregó la señal de secreción de la enzima sucrosa invertasa (Suc2) del organismo Saccharomyces cerevisiae. El vector de co-expresión y la secuencia codificante de Quimeral fueron sintetizados, esta última en el vector comercial pUC57.

Para obtener el vector de co-expresión con la secuencia inserta de Quimeral (SEQ.ID.1 ) y plFN-α (SEQ.ID.3, Tabla 2) se realizaron procedimientos de biología molecular estándares para amplificar los plásmidos y clonar las secuencias de interés, los cuales son ampliamente conocidos por cualquier experto en la materia. Los procedimientos generales requeridos para el manejo y evaluación del ADN se realizaron de acuerdo a lo descrito en el Manual de Protocolos "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Sambrook y col. 2012). Las digestiones de ADN con las enzimas de restricción se realizaron de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes (Promega, EE.UU.). Las electroforesis de ADN se efectuaron en geles de agarosa al 0,8 y 1 % peso/volumen en tampón TAE a 5 V/cm (Figura 4--D). Los plásmidos se amplificaron en bacterias E. coli DH5a, las cuales fueron transformadas por electroporación. La purificación del ADN plasmidial de E. coli se realizó a través del método de lisis alcalina (Birnboim H.C., Doly J., (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids fíes. 7(6): 1513-1523). El vector de co-expresión o dual se denominó pKmin-Dual-Qm1 , cuyo tamaño fueron 7.849 pb y posee sitios de restricción Not\, Nae\, Msc\ y EcoRI, según se muestra en la Figura 4E y 4F.

Tabla 2. Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de interferón alfa porcino.

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGD

Secuencia de FDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRCDLPQTHSLA aminoácidos HTRALRLLAQMRRISPFSCLDHRRDFGFPQEALGGNQVQKAQAMAL

VHEMLQQTFQLFSTEGSAAAWDESLLHQFCTGLDQQLRDLEACVM

SEQ.ID. 4

QEAGLEGTPLLEEDSILAVRKYFHRLTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEV

MRAFSSSTNLQDRLRKKE

EJEMPLO 3. Transformación de levaduras con el vector de co-expresión con Quimeral e interferón alfa porcino y obtención de las proteínas recombinantes.

Se transformaron levaduras P. pastoris de la cepa MP36, la cual es auxótrofa para histidina, con el vector pKmin-Dual-Qm1 (Figura 4F) linealizado con la endonucleasa Not\, el cual contiene los casetes de expresión y el marcador de selección entre los constructos que codifican para la variante quimérica de Cap de PCV2 (Quimeral , SEQ.ID.1 ) y el interferón alfa porcino (SEQ.ID.3). Como control se realizó una transformación de levaduras con el mismo vector y ambos casetes pero con la proteína Cap obtenida del aislado de PCV2 obtenido en Rancagua en el año 2007 (código genbank EU519224.1 ). Para seleccionar los clones que integraron el material genético satisfactoriamente, es decir, ambos casetes de expresión más el marcador de selección, se utilizó la expresión de His3, creciendo las levaduras en ausencia de histidina e inhibiendo la expresión basal de la enzima imidazol glicerol fosfato deshidratasa con 3- aminotriazol (3-AT). Los clones que presentaron el mayor número de copias de los vectores integrados en su genoma, crecieron en concentraciones crecientes del inhibidor del gen de la histidina deshidratasa. Siguiendo este principio, se escogieron los clones de mayor crecimiento en placas de selección, teniendo aproximadamente 20 clones de P. pastoris transformados con el plásmido pKmin-Dual-Qm1 . La correcta integración de los constructos de interés se realizó mediante análisis de Southern Blot.

Expresión de proteínas recombinantes por las levaduras transformadas.

Las levaduras se sembraron en medio de cultivo YPG (Bartnicki-García y Nickerson, 1962) y se dejaron crecer durante 24 h con agitación orbital (240 rpm) a 28°C, en pre- cultivos de 10 mL. Posteriormente se agregaron 10 mL de pre-cultivos a volúmenes analíticos o preparativos de 100 y 500 mL de medio YPG respectivamente, se dejó crecer en cultivo discontinuo durante 24 h con agitación orbital (240 rpm) a 28°C, hasta el agotamiento del glicerol. Posteriormente se inició la fase de inducción de la expresión génica, adicionando 1 % de metanol al medio de cultivo para activar el promotor PAOX1 (Cos, O., Ramón, R., Montesinos, J. L, & Valero, F. (2006). A simple model-based control for Pichia pastoris allows a more efficient heterologous protein production bioprocess. Biotechnology and bioengineering, 95(1 ), 145-154). Durante 72 h se mantuvieron los niveles de metanol y las mismas condiciones de crecimiento como se resume en la Figura 6. Posteriormente se separó el medio de cultivo del precipitado celular, centrifugando a 2370 g por 10 min.

Ruptura celular de levaduras.

El precipitado celular se separó en tubos de centrífuga de 50 ml_, conteniendo 3 g de biomasa cada uno, y se homogenizó en 30 ml_ de solución tampón fosfato Tween 0,7% y sacarosa al 35%. Las levaduras resuspendidas se lisaron por presión en prensa francesa (Emulsiflex-C5, Canadá), con ocho ciclos de pulsos de presión de 20.000 psi e incubación en hielo durante 2 minutos. El lisado celular se centrifugó a 2.370 g por 30 minutos, se recuperó el sobrenadante de la ruptura y se eliminó el precipitado.

Precipitación de proteínas del medio de cultivo.

Después de obtener el medio de cultivo libre de células por centrifugación, se precipitó 1 mL de medio de cultivo agregando 0,1 volúmenes de deoxicolato de sodio 15 mg/mL y la mezcla se agitó e incubó a 25°C durante 10 minutos. Luego se adicionó 0,1 volúmenes de TCA 72%, se centrifugó a 9.600 g durante 15 minutos, se eliminó el sobrenadante, se adicionó 1 volumen de acetona fría, se centrifugó a 9.600 g durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó al aire durante 30 segundos. Finalmente, el precipitado resultante se resuspendió en 50 μΐ de agua desionizada estéril (Brown, R. E., Jarvis, K. L., & Hyland, K. J. (1989). Protein measurement using bicinchoninic acid: elimination of interfering substances. Analytical biochemistry, 180(1 ), 136-139).

Después de confirmar la integración del vector o plásmido pKmin-Dual-Qm1 en el genoma de las levaduras, se analizó la expresión de las proteínas recombinantes luego de la inducción con metanol. La detección de la proteína recombinante Quimeral se hizo luego de realizar una ruptura celular de las levaduras y una detección con un anticuerpo policlonal anti-proteína Cap (VMRD PAB-PCV2) y Western Blot (Figura 5). En este experimento se detectó una señal con migración electroforética menor a 30 kDa, correspondiente a la proteína Cap y Q1 de 27 kDa (ver Figura 5 ^a ). Cabe destacar que no se visualizan diferencias notorias en la cantidad de proteína total cargada de las muestras, lo cual se puede apreciar en la tinción con azul de coomasie del gel SDS- PAGE (Azul de coomasie en Figura 5 ^a ).

Además, en el ensayo de Western Blot con el anticuerpo monoclonal de ratón anti- interferón alfa porcino 27105-1 (PBL) se detectó señal de INF-α porcino en las muestras obtenidas de sobrenadante de medio de cultivo de las levaduras transformadas, observándose una banda inmunoreactiva de aproximadamente 20 kDa, correspondiente al tamaño esperado del INF-α recombinante (Figura 5B). Con lo anterior se confirma que con el vector de la presente invención es posible co-expresar dos proteínas recombinantes en levaduras, las que se obtienen posteriormente desde el medio intracelular y extracelular, respectivamente.

EJEMPLO 4. Efecto estimulante de IFN-α en linfocitos de cerdo y propiedades antivirales.

Efecto estimulante de IFN-a en la proliferación de linfocitos de cerdos.

Se analizó la capacidad del extracto producido por las levaduras transformadas en el sobrenadante del cultivo (extracelularmente), al cual se denominó [IFN-α porcino], para estimular la proliferación de células mononucleares de sangre periférica de cerdos. Se cultivaron 400.000 células mononucleares en una placa de 12 pocilios. Luego las células se incubaron con [INF-α porcino] en concentraciones de: 0, 10, 50 μg/mL, en 500 μΙ_ de medio de cultivo DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina-gentamicina al 1 % y L-glutamina 2 mM. Se utilizó como control 500 de medio de cultivo. Las células se mantuvieron a 37°C en un ambiente humidificado con C0 ₂ al 5% por 24 horas. Para cuantificar la viabilidad y proliferación de las células se utilizó el método de medición de actividad mitocondrial de células vivas mediante el ensayo colorimétrico de MTT (reducción metabólica del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT)). La medición de actividad se realizó en el equipo SPECTROstar Nano (BMG Labtech, Alemania). Como se observa en la Figura 7-, las células proliferaron a una mayor tasa frente a una mayor concentración de interferón. Efecto antiviral de IFN-α porcino

Se analizó la capacidad del [INF-α porcino] secretado por las levaduras transformadas para estimular la expresión génica del mediador antiviral OAS2 en células mononucleares de sangre periférica de cerdos sanos. Se extrajo ARNm de las células de cerdo estimuladas con interferon alfa y se realizó una cuantificacion relativa de la expresión del gen 2 ^' 5 ^' oligoadenilato sintetasa 2 (OAS2), cuyo producto activa a enzimas ARNasas que inhiben la replicación viral, usando el Kit de PCR en tiempo real de un paso Brilliant II Ultra-Fast SYBR® Green QPCR Master Mix 1 -step (Agilent Technologies, EEUU). Las reacciones de PCR se realizaron en el equipo AriaMx y analizadas con el software AriaMxl .O (Agilent Technologies, EEUU) con el método del ₂ -ΔΔΟΤ _u t¡|¡ _Z ando como normalizador el gen de la β-actina porcina.

En la Figura 7B se muestra la cuantificacion relativa de la expresión génica del mediador antiviral OAS2 en linfocitos porcinos tratados con 10 y 50 μg/mL del extracto de [INF-α porcino] secretado por las levaduras transformadas. Lo anterior demuestra que el interferon alfa porcino estimula a células mononucleares de sangre periférica de cerdos, las que contienen linfocitos. La estimulación de las células con esta citoquina inmunopotenciadora favorece la actividad antiviral.

EJEMPLO 5. Obtención de una formulación vacunal contra el virus PCV2 que incluye una variante quimérica de Cap de PCV2 e interferon alfa porcino.

Para la evaluación de la efectividad del antígeno Quimeral combinado con el interferon porcino se prepararon formulaciones de 2 mL de volumen total. La emulsión se constituyó con 20% de adyuvante Montanide ISA 35 VG, se mantuvo una concentración de 600 g/mL para la proteína Quimeral correspondiente al 70% del volumen total de la emulsión, y se agregaron 300 de [INF-α porcino] secretado por las levaduras transformadas, correspondiente al 10% del volumen total de la emulsión. Para preparar la solución acuosa, se mezcló por vortex a 4°C por 30 minutos.

Las vacunas de interés que se formularon fueron: antígeno Quimeral solo y la combinación del antígeno Quimeral con IFN-α porcino. Las vacunas usadas como control negativo se constituyeron con el sobrenadante de ruptura celular de levaduras no transformadas {Pichia pastoris MP36) y tampón fosfato como placebo respectivamente, según se indica en el ejemplo siguiente. EJEMPLO 6. Ensayo in vivo en cerdos con diferentes formulaciones vacunales.

Se prepararon diferentes formulaciones vacunales según la Tabla 3. Para evaluar la efectividad de las mismas se utilizaron 22 cerdos clínicamente sanos, de tres semanas de edad, distribuidos al azar para generar dos grupos experimentales, además de dos grupos control. Se evaluó la capacidad inmunoprotectora contra el PCV2 de las formulaciones vacunales basadas en el extracto de lisis celular que contiene el antígeno Quimeral , combinado con el extracto de sobrenadante de cultivo celular que contiene la citoquina INF-α porcino.

Tabla 3. Distribución de grupos y número de animales para cada tipo de formulación.

No. Grupo Emulsión No. Animales

1 Quimeral 6

2 Quimeral + INF-a 6

3 MP36 5 ^*

4 (Placebo) Tampón fosfato 5 ^*

*Controles negativos

Los cerdos se inmunizaron según el esquema indicado en la Figura 8. El desafío se realizó inoculando 10 mL de circovirus porcino tipo 2 (1 x 10 ⁴⁷ TCID50). Se utilizaron procedimientos estándares para la inyección de 2 mL de cada una de las formulaciones por ruta intramuscular sin afectar el bienestar y normal desarrollo de los animales tratados.

Se tomaron muestras de sangre de cada animal en todos los momentos posteriores a la primera vacunación como se observa en la Figura 8. Todas las muestras de sangre se tomaron en volúmenes de 5 mL, desde la vena yugular del animal. Posteriormente se evaluaron los parámetros de efectividad de las preparaciones vacunales por la medición de los niveles de carga viral (número de copias de ADN/mL) por medio de PCR en tiempo real para la detección de PCV2. Esta técnica es una herramienta valiosa que sirve para determinar el estatus sanitario de una granja, según Grau-Roma y cois. (2009). Infection, excretion and seroconversion dynamics of porcine circovirus type 2 (PCV2) in pigs from post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) affected farms in Spain and Denmark. Veterínary microbiology, 135(3), 272-282. De esta forma, la carga viral de PCV2 en sangre permite categorizar a los cerdos como infectados sub- clínicamente con PCV2 (<10 ⁶ copias ADN/mL), sospechosos (10 ⁶ -10 ⁷ copias ADN/mL) o positivos para PCVAD (enfermedades asociadas a PCV2) (>10 ⁷ copias ADN/mL) según Liu, Q. y cois. (2000). Quantitative, competitive PCR analysis of porcine circovirus DNA in serum from pigs wit postweaning multisystemic wasting syndrome. Journal of clínica! microbiology, 38(9), 3474-3477; y Olvera, A. y cois. (2004). Comparison of porcine circovirus type 2 load in serum quantified by a real time PCR in postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome naturally affected pigs. Journal of virological methods, 1 17(1 ), 75-80.

Se realizó la extracción de ADN del PCV2 partir del suero de los cerdos inmunizados, utilizando el kit comercial QlAamp DNA Mini kit (Qiagen, Alemania) según protocolo estandarizado por el fabricante. La curva estándar se realizó con 5 diluciones seriadas (1 :10) del control positivo, utilizadas en duplicado para cada punto de la curva. Las muestras se analizaron por duplicado como réplicas técnicas, al igual que el control negativo que incluyó agua en reemplazo del templado de ADN. Para la reacción de PCR se utilizó el kit SensiMixTM SYBR Hi-ROX (Bioline, U.K.) en un volumen final de 10 μί. Las reacciones se corrieron en el equipo Stratagene-Mx3000P™ PCR en Tiempo Real (Stratagene. EE.UU). Los partidores usados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Partidores para PCR en tiempo real para detección de PCV2.

Sentido Antisentido Tamaño de amplicón (pb) '-tggcccgcagtattctgatt-3 ^' 5 ^' -cag ctg gg acag cag ttg ag -3 ^' 73

En la Figura 9 se observa el gráfico de la cuantificación de las copias virales del PCV2 en distintas etapas del ensayo de inmunización en los 4 grupos de animales vacunados con las distintas formulaciones preparadas, donde a) corresponde a la vacunación; b) al refuerzo y c) al desafío. Se puede observar que al día 42 las composiciones de la proteína Quimera 1 y aquella combinada con interferón alfa porcino eliminan al virus de la circulación sanguínea de los cerdos en forma rápida (7 días). Al día 35, esta última combinación con el interferón mantiene un título viral inferior en los animales en comparación con la composición con la proteína Quimeral por sí sola. Los animales que fueron tratados con el sobrenadante de ruptura celular de levaduras no transformadas {Pichia pastoris MP36) y tampón fosfato como placebo presentaron una carga viral significativamente mayor que los animales tratados con las composiciones que comprenden Quimeral , como se indica a los días 42 y 64 en la Figura 9, los que se pueden categorizar como cerdos sospechosos o positivos para las enfermedades asociadas a PCV2. Como se vio anteriormente, el efecto inmunoestimulante de la proliferación de los linfocitos de los cerdos y el potencial de inducción de la expresión de genes cuyas proteínas son capaces de actuar en contra de virus, como es el caso de OAS2, haciendo que la combinación de ambos elementos en la formulación conforme un producto eficiente. EJEMPLO 7. Ensayo de protección horizontal en cerdos.

Para el ensayo de protección horizontal se utilizaron 20 cerdos clínicamente sanos, de tres semanas de edad, con los que se generaron tres grupos experimentales distribuidos al azar según la Tabla 5.

Tabla 5. Distribución de grupos y número de animales para cada tipo de formulación en ensayo de protección horizontal.

No. Grupo Emulsión No. Animales

Vacunado Quimeral + INF-a 6

Placebo MP36/tampón fosfato 8

Infeccioso - 6

Los animales fueron inoculados con las emulsiones vacunales o el placebo, y pasadas tres semanas se aplicó un refuerzo en las mismas condiciones. Los animales de estos dos grupos se mantuvieron en condiciones de aislamiento hasta el día 60 postvacunación. De forma paralela, los animales del grupo "infeccioso" fueron inoculados por vía intranasal con 1 x10 ^{4 7} TCID50 de circovirus porcino tipo 2. Posteriormente se hicieron cohabitar los animales de los tres grupos (vacunados, placebos e infecciosos) durante cuatro días. Pasado este período los animales infecciosos se sacrificaron y los cerdos de los grupos vacunado y placebo se mantuvieron en cohabitación durante cuatro semanas.

Se tomaron muestras de sangre de cada animal semanalmente durante el ensayo. Todas las muestras de sangre se tomaron en volúmenes de 5 mL, desde la vena yugular del animal. Posteriormente se evaluaron los parámetros de efectividad de las preparaciones vacunales por la medición de los niveles de carga viral por medio de PCR en tiempo real para detección de PCV2 según lo descrito en el ejemplo anterior. Se observó un incremento en la carga viral de los animales del grupo infeccioso entre el día de la inoculación (día -4) hasta el día final de la cohabitación (día 1 ) según la Figura 10. Además, se observaron diferencias significativas en la carga viral de los animales vacunados con respecto al grupo placebo desde el día siete posterior a la cohabitación con el grupo infeccioso y hasta el final del experimento en la cuarta semana posterior a la cohabitación. Resulta relevante que los cerdos del grupo placebo aumentaron su carga viral al final del ensayo hasta títulos de carga viral de PCV2 superiores a 1 x10 ⁸ , considerados como clínicamente enfermos a diferencia del grupo vacunado que disminuyó drásticamente su carga viral hasta el final del ensayo. Lo anterior indica que la vacuna que comprende la proteína Quimeral y el interferon alfa porcino es altamente eficaz en el control de la carga viral de PCV2 en cerdos.