COMPLEJO RECRISTALIZADO DE CLORHIDRATO DE ENROFLOXACINA DIHIDRATADO, Y METODO PARA OBTENER EL MISMO

CAMPO DE APLICACION

La presente invención está relacionada con los principios y técnicas desarrolladas en la Industria Farmacéutica Veterinaria para el desarrollo de nuevas composiciones farmacéuticas para fabricar medicamentos que contribuyan a la salud animal, y más específicamente, está relacionada con un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado útil el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas, así como con el método para obtener el mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El organismo animal contiene todos los componentes necesarios para mantener la vida. Es cálido, húmedo y rico en muchos nutrientes diferentes. En razón de ello, los tejidos animales son sumamente atractivos para los microorganismos que buscan invadirlos y explotar esos recursos en su beneficio.

En el mundo existe una amplia y muy diversa serie de microorganismos, incluyendo virus, protozoos y parásitos helmintos. En su intento por sobrevivir, muchos de estos microorganismos ven al organismo de los animales como una rica fuente de nutrientes y un lugar donde cobijarse. Es por ello que dichos microorganismos buscarán formas de invadir los tejidos animales, lo que, generalmente, el sistema inmune evita o por lo menos controla.

Si los microorganismos logran vencer las defensas, pueden producir enfermedad, y por lo tanto, se les denomina "patógenos". En este contexto, la infección es el proceso biológico complicado que surge durante la penetración del microorganismo infeccioso. En algunos casos, la infección del animal aparece como el resultado de la penetración de agentes patógenos del ambiente, tal como de animales infectados, corrales, agua y alimentos contaminados, entre otros; estando en este caso ante una infección exógena. Mientras que en otras ocasiones, los agentes patógenos se encuentran en el mismo organismo del animal sano (sobre la piel o mucosas, que tienen comunicación con el mundo exterior) como comensales, sin manifestar su poder patógeno, mientras el microorganismo posea defensas suficientemente fuertes.

En razón de lo anterior, desde hace muchos años se han desarrollado diversos antibióticos para el tratamiento de las infecciones bacterianas. Los antibióticos se obtienen de dos formas: i) de forma natural; en donde todos los antibióticos se hacían antes desde organismos vivos (bacteria, hongos), dicho en otras palabras, los organismos son los que fabricaban los antibióticos; y, ii) de forma artificial (química o sintética): se hacen cambiando las moléculas de las cadenas químicas que van junto al núcleo (anillo) de las penicilinas, en donde según las moléculas que se cambien se obtienen efectos diferentes sobre microorganismos diferentes.

Las quinolonas son antibióticos conocidos desde los año 60's y desde entonces se ha investigado y sintetizado gran número de quinolonas, pero siempre buscando aumentar el espectro de acción e incrementar su actividad y como reducir los efectos no deseados.

La sustitución con flúor en la posición 6 (dando origen así a las fluorquinolonas) fue el cambio que representó un salto cualitativo en el desarrollo de estos compuestos. Con ello se mejoró la unión a su enzima diana, la DNAgirasa bacteriana, y se aumentó la penetración celular hasta 70 veces con respecto a las quinolonas que no tienen flúor en esa posición. El flúor en la posición 6, un radical 4-etil-piperazinil-1-ilo en la posición 7 y un ciclopropilo en la posición 1 distinguen a las quinolonas de tercera generación. En particular la sustitución en la posición 7 les da la propiedad de lograr el doble de la concentración plasmática en comparación con otras quinolonas denominadas de segunda generación.

Las fluorquinolonas son un grupo de agentes antibacterianos sintéticos usados en medicina tanto humana como veterinaria para el tratamiento de una variedad de enfermedades infecciosas. Aunque se han sintetizado muchas de ellas, las más conocidas entre las desarrolladas y usadas en medicina veterinaria incluyen la amifloxacina, ciprofloxacina, danofloxacina, enrofloxacina, marbofioxacina, norfloxacina y sarafloxacina.

Sin embargo, el fármaco que revolucionó la terapéutica de enfermedades bacterianas en medicina veterinaria fue, y sigue siendo, la enrofloxacina [(1-3,- ciclo- propil-6-flúor-1 ,-dihidro-4oxo-7(4-etil-1-piperazinil)3-quionolona- ácido carboxílico)], desarrollada en los años 80's para su uso exclusivo en medicina veterinaria. Tanto en la década de los 80 ^' s como de los 90 ^' s se hace evidente el incremento en el uso de este agente antibacteriano. Las razones de ello son su elevada potencia antibacteriana, rápida destrucción bacteriana en cuestión de minutos y debido a que las concentraciones óptimas bactericidas in vitro son tan solo 2 veces el valor de la concentración mínima inhibitoria.

Entre las características más importantes de la enrofloxacina destaca que actúa de manera dependiente de la concentración, ejerciendo un rápido efecto bactericida contra Gram negativas aerobias y micoplasmas, incluyendo algunas que son resistentes a otros antibacterianos y a quinolonas y fluoroquinolonas de primera y segunda generación. Además, con esta sustitución se aumentó la eficacia contra patógenos Gram negativos y se amplió el espectro de actividad al actuar contra patógenos Gram positivos.

La enrofloxacina se caracteriza por una muy buena actividad antimicrobiana, incluso contra microorganismos poco susceptibles o resistentes a los antimicrobianos de uso corriente en animales. Tiene un excelente comportamiento farmacocinético, absorción casi completa y una distribución tisular que garantiza concentraciones inhibitorias mínimas frente a los microorganismos causantes de la mayoría de las enfermedades en los animales. Su índice terapéutico es alto, y puede administrarse sin mayores problemas en terapias combinadas con otros medicamentos.

La enrofloxacina es estable a cambios de temperatura e influencias hidrolíticas. Ligera sensibilidad a exposiciones prolongadas e intensas de luz, sin embargo no se afecta su actividad.

La enrofloxacina es un antibiótico muy lipofílico y la adición de un ácido carboxílico y una amina terciaria contribuye a las propiedades anfotéricas de la molécula, cuya fórmula es la siguiente:

Estructura molecular de la enrofloxacina

La apariencia física de la enrofloxacina es en forma de cristales de color ligeramente amarillos, con un punto de fusión de 219 a 221 °C. Es ligeramente soluble en agua (0.6 mg/ml), p/ , =5.74 y pK ₂ =8.70, ligeramente soluble en etanol y ácido clorhídrico 0.1 N, bastante soluble en hidróxido de sodio 1 N. La sustancia activa es estable a la temperatura y a la hidrólisis.

La enrofloxacina puede existir en cuatro formas posibles: como un catión (C), una especie no ionizada neutra (N), un zwitterión (Z) y un ión básico (A), dependiendo del pH del medio. A un pH bajo, tanto en el grupo 7-piperazinilo y el grupo 3-carboxilo están protonados.

Comportamiento del equilibrio ácido base de la enrofloxacina.

El perfil de pH-solubilidad de enrofloxacina presenta una zona de baja solubilidad en el entorno del punto isoeléctrico. La solubilidad máxima se alcanza a pH 5.02 (10.42 ± 0.96 mg/ml. La cantidad de enrofloxacino solubilizada se puede aumentar usando una solución amortiguadora de acetato más concentrada, en la cual, es posible solubilizar 100 mg/ml de enrofloxacina.

Los ingredientes farmacéuticos activos o fármacos, en sus formas puras, tienen un valor definido de solubilidad en un sistema biológico. Los fármacos disponibles en el mercado sufren de dificultades de formulación debido a su escasa solubilidad en agua, lo que a su vez resulta en baja biodisponibilidad..La mejora de los perfiles de solubilidad y disolución de estas moléculas de fármacos lipófilcos sin alterar la estructura molecular es un reto particular para el desarrollo exitoso de los productos farmacéuticos. La máxima solubilidad para la enrofloxacina se logra a un pH de 5.02 y el mayor porcentaje de transferencia de fase acuosa a fase orgánica se encuentra a un pH de 7. Esto significa que cuando el pH del medio está cercano a la neutralidad se favorece el ingreso de enrofloxacina a las bacterias en forma de zwitterion a través de canales de porinas hidrofilicas, mientras que al encontrarse en pH ^' s ácidos se encuentra en forma ionizada y no puede entrar a la bacteria por difusión ni por los canales de porinas.

Los métodos comúnmente usados para incrementar la solubilidad son: control de pH (comportamiento ácido-base), uso de co-solventes, modificación de la constante dieléctrica, uso de surfactantes (concentración micelar crítica), formación de complejos, formación de dispersiones sólidas y modificación química (mediante la formación de sales o la sustitución de grupos funcionales. Las estrategias en aumentar la solubilidad de la enrofloxacina se ha enfocado al uso de co-solventes, formación de complejos de inclusión con ciclodextrinas, y más recientemente la formación de co-cristales.

En la generación de los productos farmacéuticos modificados, el uso de la química supramolecular y el concepto de ingeniería de cristal han ganado un enorme interés en los últimos años. Esto es debido a la posibilidad de mejorar la solubilidad y biodisponibilidad de los productos a través de la formación de polimorfos^ sales y co- cristales. Para el polimorfismo, la existencia de una molécula en más de una forma cristalina, las diferentes disposiciones de empaquetamiento cristalino influyen en las propiedades físico-químicas, incluyendo la velocidad de disolución y solubilidad y por ende en la biodiponibilidad de la molécula.

Las estructuras cristalinas de enrofloxacina se han reportado en la literatura como complejos de metales y tres sales orgánicas, a saber: 2-hidroxietanoamino enrofloxacinato; enrofloxacina picrato; y, como monohidrato de citrato (Golovnev, Vasiliev et al. 2012).

No obstante lo anterior, hasta ahora no se ha estudiado la solubilidad de estos complejos metálicos. Estudios recientes sobre enrofloxacina y la formación de co- cristales utilizando evaporación lenta, co-cristalización y molienda asistida por solventes ha sido reportada. Se ha encontrado que el incremento de la solubilidad de enrofloxacina es dependiente del formador de co-cristal. La Solicitud de Patente Mexicana No. MX/a/2009/007598 se refiere a un nuevo hexahidrato de enrofloxacina (compuesto (I)), a procedimientos para su preparación, medicamentos que lo contienen, así como a su uso para combatir enfermedades.

Hasta ahora, el compuesto descrito en la Solicitud MX/a/2009/007598 se ha dado a conocer sólo por una modificación cristalina (hexahidrato de enrofloxacina) y tiene un punto de fusión de 224°C y un característico difractograma de rayos X, espectro IR, espectro de Raman, espectro FIR y espectro NIR y contiene 23.1% de agua de hidratación.

Además del documento anterior, en el estado de la técnica existen diversos documentos que hacen referencia a la enrofloxacina, tal es el caso de la Patente Mexicana No. 191 ,310 que se refiere a una composición en donde la fluoroquinolona es seleccionada del grupo que consiste en amifloxacina, benofloxacina, danofloxacina, difloxacina, enrofloxacina, ferofloxacina, fleroxacina, lomefloxacina, marbofloxacina, norfloxacina, ofloxacina, perfloxacina, ruflóxacina, sarafloxacina y temafloxacina.

La Patente Mexicana No. 200,399 describe nuevas soluciones para inyección e infusión de composición: a) enrofloxacina, 0.1 a 20% en peso, referido al peso total de la solución, en forma de sus sales con ácidos polihidroxicarboxílicos o aminoácidos o mezclas de ellos; b) ácidos polihidroxicarboxílicos o aminoácidos o mezclas de ellos, en exceso 0.1 a 5 molar, referido a enrofloxacin; c) dado el caso, 0.1 a 30% en peso, de coadyuvantes de formulación, referido al peso total de la solución; d) agua, hasta 100% en peso.

La Patente Mexicana No. 260,386 describe una composición farmacéutica caracterizada porque es una asociación fisicoquímicamente estable que contiene enrofloxacina en una concentración de alrededor de 3% a alrededor de 10% peso/volumen de la composición y piroxicam en una concentración de alrededor de 0.1% a alrededor de 2% peso/volumen de la composición en solución y portadores, vehículos o excipientes farmacéuticos aceptables, el método de fabricación de la asociación fisicoquímicamente estable y sus uso en el campo de medicina veterinaria. La Publicación Internacional No. WO2010123337 se refiere al campo de la medicina veterinaria, en particular, a los agentes antibacterianos derivados de fluoroquinolonas, y, en particular, a una serie de sales de enrofloxacina tales como ENR- Mg, ENR-Fe, ENR-Mn, ENR-Cu, Co-ENR , ENR-Ni, ENR-Ca, ENR-Zn, Cd y ENR-ENR- U02. En esta nueva forma química, la enrofloxacina logra mucho mayor biodisponibilidad que la enrofloxacina base o sal de ácido clorhídrico, así como un mayor tiempo de permanencia en los organismos de aves, cerdos, vacas, cabras, ovejas, perros, gatos y caballos. Dichas sales también pierden prácticamente todo el sabor amargo asociado con enrofloxacina básica o el clorhidrato. Por otra parte, el tiempo medio de retención en todo de la especie mencionada se incrementa, extendiendo así el tiempo en el que las concentraciones consideradas para ser terapéutico se puede conseguir.

La Patente Coreana No. KR20130062187 describe una composición antibacteriana compleja para asegurar una excelente actividad antibacteriana contra bacterias gram-positivas y bacterias gram-negativas, y para el tratamiento de diversas infecciones. La composición antibacteriana contiene de 10 a 35% en peso de enrofloxacina, 5 a 25% en peso de trimetoprima y 40 a 80% en peso de sulfametoxazol. La composición antibacteriana compleja contiene enrofloxacina, trimetoprim, sulfametoxazol y se mezcla en una relación en peso de 02:01 :05. Asimismo, se describe un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas en un sistema digestivo de los animales o un sistema respiratorio de animales que contiene la composición antibacteriana compleja como un ingrediente activo. El medicamento se fabrica en forma de polvo, gránulos, inyección o ungüento. La Patente China No. C 10321818 se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de enfermedades bacterianas y micoplasma de ganado y un uso de los mismos. La composición farmacéutica comprende del 5 al 15% en peso de enrofloxacina, un hidrato de enrofloxacina o un derivado de enrofloxacina (tal como enrofloxacina base) y 1 a 10% en peso de butafosfan. La composición farmacéutica que contiene enrofloxacina puede reducir la frecuencia de inyección, se pueden tratar o prevenir las enfermedades bacterianas y micoplasma de ganado, y puede mejorar el aumento de peso de los lechones después de haber sido inyectado en el lechón.

La Patente China No. CN102038643 describe un polvo soluble de enrofloxacina y un método de preparación y aplicación del mismo, y puede resolver el problema del pobre efecto de esterilización debido a la menor solubilidad en agua de enrofloxacina en el estado de la técnica. Un esquema técnico es que, el polvo soluble de enrofloxacina es una mezcla de enrofloxacina y un sólido inorgánico alcalino o alcalino orgánico de acuerdo con una relación en peso de (1-10): . La invención también describe un método de preparación y aplicación del polvo soluble de enrofloxacina. La invención resuelve el problema de la baja solubilidad de la enrofloxacina en agua, y supera la desventaja del pobre efecto curativo debido a la baja concentración de enrofloxacina causado por llevar el medicamento en agua.

Como puede verse de lo anterior, en el estado de la técnica existen diversos medicamentos que tienen a la enrofloxacina como principio activo, los cuales sólo se distinguen por precio económico, pero que no cumplen con los requisitos terapéuticos señalados. Esto hace que se tenga la percepción de que "hay resistencia" cuando en realidad es más común la NO-bioequivalencia, además de que su composición es muy variable en pH y características fisicoquímicas. Por otro lado, desafortunadamente, existen muchas facetas equívocas relacionadas con el uso de la enrofloxacina, ya que han proliferado en el mercado preparados de calidad dudosa, no bioequivalentes. Adicionalmente, existen prácticas de manejo de este fármaco que resultan en concentraciones plasmáticas bajas [Área Bajo la Curva (AUC, por sus siglas en inglés)] o con baja Concentración máxima (Cmax), tal como la administración de enrofloxacina en el agua de bebida a cerdos; dosificaciones en el agua de bebida en aves comerciales sin restringirla previamente; dosificación de la enrofloxacina en premezcla; uso de aguas duras como vehículo en pollo de engorda; preparados farmacéuticos que distan mucho de ser bioequivalentes en bovinos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a una nueva sal de enrofloxacina, en donde dicha nueva sal es un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado que comprende una mezcla de sales o complejos de enrofloxacina con iones metálicos, el procedimiento para su preparación y su uso en medicina veterinaria, y más específicamente, en composiciones farmacéuticas que lo contienen y que son útiles en el tratamiento de enfermedades de origen bacteriano. En donde dicha mezcla de sales de enrofloxacina comprende: clorhidrato de enrofloxacina dihidratada, enrofloxacina hexahidratada y clorhidrato de enrofloxacina.

El complejo recristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado siguiente fórmula (I):

Fórmula (I) El complejo recristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la fórmula (I) tiene un pico de máxima intensidad a un ángulo 2Θ de 25.67 en el XRPD, Asimismo, tiene bandas características a 2392 cm ^"1 y 1630 cm ^"1 en el espectro de infrarrojo y presenta un punto de fusión endotérmico con un máximo en 327.9°C y una fase de transición cristalina a 136°C.

El complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado se obtiene por medio del método que las etapas de:

a) Preparar 50ml de una solución que contiene desde 2% hasta 30% en peso de una sal de sulfato de magnesio;

b) Adicionar 10g de enrofloxacino anhidro y mantener la suspensión en agitación mecánica durante 10 minutos;

c) Acidificar bruscamente adicionando 30 mi de una mezcla 50:50 de agua y ácido ácido clorhídrico;

d) Mantener en agitación mecánica constante el producto de la reacción anterior durante 3 a 5 horas;

e) Filtrar con presión negativa a través de membrana con poro de 0.45 m para concentrar el producto;

f) Lavar la pasta obtenida en la etapa e) anterior primeramente con 50 mi de alcohol etílico y posteriormente con 50 mi de acetona, preferiblemente haciéndolo en dos ocasiones; y,

g) Secar la pasta al vacío para obtener el producto final que es un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado.

La recristalización ácida y formación de complejos con cloro, magnesio y sulfato producen un complejo de clorhidrato de enrofloxacina recristalizado de alta solubilidad, lo cual brinda por vía oral concentraciones séricas máximas (Cmax) y áreas bajo la curva de concentración (AUC) vs. tiempo mayores que las logradas con la enrofloxacina base. Asimismo, la recristalización ácida y formación de complejos con cloro, magnesio y sulfato producen un complejo de clorhidrato de enrofloxacina recristalizado de alta solubilidad, lo cual brinda por vía subcutánea concentraciones séricas máximas (Cmax) y áreas bajo la curva (AUC) de concentración vs. tiempo mayores que las logradas con la enrofloxacina base.

OBJETOS DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta los defectos de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención el proveer un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado, el cual es sumamente útil en el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas.

Un objeto más de la presente invención es proveer un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado que sea altamente soluble en agua.

Sigue siendo un objeto más de la presente invención proveer un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado que tenga una elevada biodisponibilidad en rumiantes, equinos, cerdos y aves.

Es todavía más un objeto de la presente invención proveer un método para la obtención del complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado.

Un objeto adicional de la presente invención es proveer una composición farmacéutica a base del complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina empelada en medicina veterinaria. Otro objeto más de la presente invención es proveer el uso de la composición farmacéutica a base del complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina para fabricar un medicamento útil para tratar y prevenir enfermedades infecciosas de tipo bacteriana.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, la invención misma, tanto por su organización, así como por su método de operación, conjuntamente con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la siguiente descripción detallada de una modalidad particularmente preferida de la presente invención, cuando se lea en relación con los dibujos que se acompañan, en los cuales: La figura 1 es una gráfica que muestra el difractogtama de difracción de rayos X de un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado, obtenido de conformidad con una modalidad particularmente preferida de la presente invención.

La figura 2 es una gráfica en donde se muestra el espectro de infrarrojo del complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la presente invención.

La figura 3 es un termograma de análisis de calorimetría diferencial de barrido del complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la presente invención. La figura 4 es una gráfica que muestra espectros de UV-Vis de enrofloxacina base (negro), del hidrato de enrofloxacina y el complejo recristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado.

La figura 5 muestra la curva de actividad concentración de ENR-O y de ENR-CC vía oral en pollos, dosificados a razón de 10 mg/kg.

La figura 6 muestra concentraciones tisulares de enrofloxacina en pollitos de 1 día, dosificados vía oral a razón de 10 mg/kg con la ENR-0 y ENR-CC. La figura 7 muestra concentraciones tisulares de enrofloxacina en pollitos de 1 día, dosificados vía oral a razón de 10 mg/kg con la ENR-0 y ENR-CC.

La figura 8 muestra concentraciones tisulares de enrofloxacina en pollitos de 1 día, dosificados vía oral a razón de 10 mg/kg con la ENR-0 y ENR-CC.

La figura 9 muestra concentraciones tisulares de enrofloxacina en pollitos de 1 día, dosificados vía oral a razón de 10 mg/kg con la ENR-0 y ENR-CC.

La figura 10 muestra concentraciones tisulares de enrofloxacina en pollitos de 1 día, dosificados vía oral a razón de 10 mg/kg con la ENR-0 y ENR-CC.

La figura 11 muestra la curva de actividad/concentración en perros dosificados a razón de 5 mg/kg vía PO y SC del producto ENR-CC y ENR-O. La figura 12 muestra la curva de actividad/concentración de enrofloxacina y sus metabolítos administradas en equinos a dosis de 5 mg/kg de ENR-CC y ENR-O. La figura 13 muestra la curva de actividad/concentración de enrofloxacina y sus metabolítos en bovinos F1 a razón de 7.5 mg/kg de ENR-CC y ENR-O.

La figura 14 muestra la curva de actividad/concentración de enrofloxacina y sus metabolítos en cerdos F1 a razón de 7.5 mg/kg para la vía IM y de 10 mg/kg para la vía PO, de ENR-CC y ENR-O.

La figura 15 muestra la curva de actividad/concentración de enrofloxacina y sus metabolítos en cabras F1 a razón de 7.5 mg/kg de ENR-CC y ENR-O.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCION

Sorprendentemente se ha encontrado una nueva sal de enrofloxacina, la cual se describe de conformidad con una modalidad particularmente preferida de la presente invención, en donde dicha nueva sal es un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado que comprende una mezcla de sales o complejos de enrofloxacina con iones metálicos, el procedimiento para su preparación y su uso en medicina veterinaria, y más específicamente, en composiciones farmacéuticas que lo contienen y que son útiles en el tratamiento de enfermedades de origen bacteriano. En donde dicha mezcla de sales de enrofloxacina comprende: clorhidrato de enrofloxacina dihidratada, enrofloxacina hexahidratada y clorhidrato de enrofloxacina.

El complejo reciristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado se obtiene a partir de enrofloxacina anhidra y de una sal metálica. La formación de enrofloxacina hexahidratada con rendimientos del 10 al 90 %, la formación de enrofloxacino clorhidrato con rendimientos del 10 al 90 %, la formación de complejos de enrofloxacino con formula general (C19H22FN ₃ O ₃ ) _x Mg S0 ₄ , en donde x = 1 , 2, 3 o 4 con rendimientos de 0 al 60 %.

El complejo recristalizado de clorhidrato de enrofioxacina dihidratado de la presente invención muestra mejores rendimientos y un mejor perfil farmacocinético que la enrofioxacina base y la enrofioxacina hexahidratada encontrados en el estado de la técnica.

El complejo recristalizado de clorhidrato de enrofioxacina dihidratado tiene la siguiente fórmula (I):

Fórmula (I)

El complejo recristalizado clorhidrato de enrofioxacina dihidratado de la fórmula (I), en comparación con la enrofioxacina hexahidratada, tiene claramente una estructura diferente y presenta un diferente difractograma de rayos X de polvos, espectro de infrarrojo, perfil térmico y diferente valor de solubilidad a 25°C.

El complejo recristalizado clorhidrato de enrofioxacina dihidratado de la fórmula (I) tiene un pico de máxima intensidad a un ángulo 2Θ de 25.67 en el XRPD, tal como se muestra en la figura 1 de los dibujos que se acompañan. La obtención de los difractigrmas se realizó de la siguiente manera: las muestras se analizaron en un Difractómetro BRUKER D8 ADVANCE; posteriormente se colocaron en el portamuestras de vidrio mediante el montaje de polvo en una cavidad. Se utilizó radiación Ka de Cu (λ = 1.5406 A°) y filtro de Ni; a 40 kV, 40 mA de 2 a 60 ° 2Θ, en 30 minutos.

El complejo recristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la fórmula (I) tiene bandas características a 2392 cm ^"1 y 1630 cm ^"1 en el espectro de infrarrojo, tal como se puede apreciar en la figura 2 de los dibujos que se acompañan.

Los espectros de infrarrojo de obtuvieron por medio de reflactancia por ATR en un equipo FTIR SPECTRUM 400 Marca Perkin Elmer. El complejo recristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la fórmula (I) presenta un punto de fusión endotérmico con un máximo en 327.9°C y una fase de transición cristalina a 136°C de acuerdo con la figura 3 de los dibujos que se acompañan, que es consistente con la estructura molecular de dicho compuesto clorhidrato de enrofloxacina dihidratado y la estructura elucidada por rayos X.

Los termogramas de DSC y TGA se obtuvieron aplicando calorimetría diferencial de barrido con un equipo Mettler Toledo, modelo DSC1 , con STAR software versión 11.0. Se calibra el equipo para ajuste de temperatura, flujo de calor y calibración total. Las muestras fueron pesadas en paneles de aluminio de 40 L con tapa. Se inicia el calentamiento de 25 a 350°C con una rampa de calentamiento de 10°C/min, en atmósfera de nitrógeno La elucidación de la estructura se realizó por difracción de rayos X en un equipo El complejo recristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la fórmula (I) contiene en mayor proporción la molécula identificada por cristalografía de rayos X de monocristal en la que se presenta la siguiente estructura cristalina:

Estructura de clorhidrato de enrofíoxacino dihidratado.

El complejo recristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la fórmula (I) presenta un incremento en la solubilidad de hasta 20 veces más en comparación con la enrfloxacina base. La determinación de la solubilidad se realizó a 25°C, en donde las muestras se midieron en un espectrofotómetro a una longitud de onda máxima de 277 nm. En la figura 4 de los dibujos que se acompañan se puede apreciar el incremento de la solubilidad del compuesto de fórmula (I).

En la Tabla I que se muestra a continuación, se puede apreciar que la solubilidad del compuesto de fórmula (I) es mejor que la solubilidad de la enrofloxacina base y la enrofloxacina hexahidratada. Tabla I

Por otro lado, en la presente invención se describe un método para la obtención del complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado, el cual comprende las etapas de:

a) preparar 50ml de una solución que contiene desde 2% hasta 30% en peso de una sal M _m X _n O _p , en donde M se selecciona del grupo que comprende un metal alcalino o alcalinotérreo, y el subíndice m = 0, 1 , 2, 3 o 4; X se selecciona del grupo que comprende Cl, Br, I, S, y N; subíndice n = 0, 1 , 2, 3, 4, 5, o 6; O es Oxígeno y el subíndice p = 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; preparándose la solución preferiblemente con una sal de sulfato de magnesio (MgS0 ₄ );

b) adicionar 10g de enrofloxacino anhidro y mantener la suspensión en agitación mecánica durante 10 minutos;

c) acidificar bruscamente adicionando 30 mi de una mezcla 50:50 de agua y un ácido de formula general H¡X _n O _p , en donde el subíndice i = 0, 1 , 2, 3 o 4; X se selecciona del grupo que comprende Cl, Br, I, S y N, y el subíndice n = 0, 1 , 2, 3, 4, 5, o 6; O es Oxígeno, y el subíndice p = 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; adicionándose preferiblemente ácido clorhídrico;

d) mantener en agitación mecánica constante el producto de la reacción anterior por un espacio de tiempo que va de 3 a 5 horas;

e) filtrar con presión negativa a través de membrana con poro de 0.45 μιη para concentrar el producto; f) lavar la pasta obtenida en la etapa e) anterior primeramente con 50 mi de alcohol etílico y posteriormente con 50 mi de acetona, preferiblemente haciéndolo en dos ocasiones; y,

g) secar la pasta al vacío para obtener el producto final que es un complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado.

La recristalización acida y formación de complejos con cloro, magnesio y sulfato producen un complejo de clorhidrato de enrofloxacina recristalizado de alta solubilidad, lo cual brinda por vía oral concentraciones séricas máximas (Cmax) y áreas bajo la curva de concentración (AUC) vs. tiempo mayores que las logradas con la enrofloxacina base.

Asimismo, la recristalización acida y formación de complejos con cloro, magnesio y sulfato producen un complejo de clorhidrato de enrofloxacina recristalizado de alta solubilidad, lo cual brinda por vía subcutánea concentraciones séricas máximas (Cmax) y áreas bajo la curva (AUC) de concentración vs. tiempo mayores que las logradas con la enrofloxacina base.

Un aspecto peculiar de la presente invención es proveer una composición farmacéutica empleada en medicina veterinaria, en donde dicha composición farmacéutica comprende: de 10% a 99.9% en peso del total de dicha composición del complejo recristalizado clorhidrato de enrofloxacina dihidratado; y de 0.1 a 90% en peso de la composición total de sustancias auxiliares habituales, que son sustancias farmacéuticas no tóxicas conocidas como excipientes, tales como diluyentes desintegrantes _, lubricantes, deslizantes, colorantes, aglutinantes, modificadores de la viscosidad, espesantes, promotores de la absorción, inhibidores del crecimiento de cristales, agentes complejantes, agentes de estabilidad a la luz, antioxidantes y conservadores, entre otros. Los espesantes se seleccionan del grupo que comprende: carbomero 971 , carbomero 974, copolímeros de carbomero tipo A y B, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, polivinilpirrolidona y gelatina. Los conservadores se seleccionan del grupo que comprende: ésteres del ácido p- hidroxibenzoico, fenoles, clorobutanol, alcohol bencílico, etanol, butanol, 1 ,3- butanodiol, sales de clorhexidina, ácido benzoico y sales. Los antioxidantes se seleccionan del grupo que comprende: ácido ascórbico, L-cisteína, ácido tiodipropiónico, ácido tioláctico, monotioglicerol, galato de propilo, metabisulfito de sodio o sulfito de sodio. Los agentes agentes complejantes se seleccionan del grupo que comprende: sales de ácido etilendiaminotetraacético, fosfatos, acetatos y citratos. Los inhibidores del crecimiento cristalino se selccioan del grupo que comprende: polivinilpirrolidona.

Asimismo, se provee el uso de dicha composición farmacéutica para fabricar un medicamento útil para tratar y prevenir enfermedades infecciosas de tipo bacteriana. En donde dicho medicamento puede tener las siguientes formas farmacéuticas: tabletas de liberación inmediata, tabletas dispersables, tabletas orodispersables, tabletas de liberación modificada, capsulas, suspensiones liquidas y polvo para reconstituir polvos y g _r anulados, ungüentos, geles, supositorios, lociones elixires y soluciones estériles y no estériles.

Además de las formas farmacéuticas arriba descritas, el medicamento puede tener las siguientes presentaciones:

■ Presentación en forma de polvo para administración en agua de bebida;

■ Presentación para reconstituir en concentraciones de 5, 10, 15, 20 y 50% del complejo recristalizado de la presente invención, para administración, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intradérmica; ^■ Presentación para reconstituir al 10 y 20% del complejo recristalizado para administración oral;

^■ Presentación en jeringa intramamaria en dosis de 100 mg hasta 1 g/dosis

^■ Presentaciones al 5, 10 y 20 % del complejo recristalizado para aplicación oftálmica y ótica.

La presente invención será mejor entendida a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se presentan únicamente con fines ilustrativos para permitir la comprensión cabal de las modalidades de la presente invención, sin que ello implique que no existen otras modalidades no ilustradas que puedan llevarse a la práctica con base en la descripción detallada arriba realizada.

En razón de lo anterior, los ejemplos que a continuación se presentan deben ser tomados únicamente como ilustrativos más no limitativos de la presente invención:

Ejemplo 1

Se preparo un litro de una solución 5M de sulfato de magnesio a la cual se le adicionaron 90g de enrofloxacina preparando una dispersión gruesa de enrofloxacino. La mezcla se mantuvo en agitación mecánica constante durante 2 horas.

Posteriormente se adicionaron bruscamente 300 mi de una mezcla 50:50 de agua y ácido clorhídrico concentrado. La agitación mecánica se mantuvo durante 4 horas.

Posteriormente se concentro el producto mediante filtración con presión negativa a través de membrana con poro de 0.45 μιη. La pasta obtenida se lavo en el siguiente orden: primero con 250 mi de alcohol etílico y posteriormente con 500 mi de acetona. Finalmente la pasta se seco al vacío para obtener el producto, en donde el rendimiento del producto fue de 60 a 100%.

Ejemplo 2

Se preparo un litro de una solución 5 M de cloruro de magnesio adicionándole 90g de enrofloxacina preparando una dispersión gruesa de enrofloxacina. La mezcla fue agitada mecánicamente durante 2 horas.

Posteriormente se adicionaron 300ml de una mezcla 50:50 de agua y ácido clohidrico concentrado. La agitación mecánica se mantuvo durante 4 horas.

Posteriormente se concentro el producto mediante la filtración con presión negativa a través de membrana con poro de 0.45 μιη. La pasta obtenida se lavo en el siguiente orden: primeramente con 500 mi de alcohol etílico y seguidamente con 250 mi de acetona.

Finalmente la pasta se seco al vacío para obtener el producto, en donde el rendimiento del producto fue de 60 a 100%. Ejemplo 3

Se preparo un litro de una solución 5 M de cloruro de magnesio y se adicionaron 80g de enrofloxacina preparando una dispersión gruesa de enrofloxacina. La mezcla fue agitada mecánicamente durante 2 horas, Posteriormente se adicionaron 300ml de una mezcla 50:50 de agua y ácido sulfúrico concentrado. La agitación mecánica se mantuvo durante 4 horas. Posteriormente se concentro el producto mediante la filtración con presión negativa a través de membrana con poro de 0.45 μηι. La pasta obtenida se lavo en el siguiente orden: primeramente con 500 mL de alcohol etílico y seguidamente con 250 mL de acetona.

Finalmente la pasta se seco al vacío para obtener el producto, en donde el rendimiento del producto fue de 60 a 100%.

El complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado que se describe en la modalidad particularmente preferida de la presente invención y que se representa con la fórmula (I) puede ser utilizado en composiciones farmacéuticas útiles para fabricar un medicamento antibiótico empleado en el tratamiento de enfermedades infecciosas de tipo bacteriano,, ya que presenta las siguientes ventajas:

• Lograr una elevada biodisponibilidad en rumiantes, equinos, cerdos, aves y otras especies no convencionales como hámsters, hurones, entre otros.

• Una elevada área bajo la curva (AUC) que brinda variables de AUC/CMI mucho muy superiores a la enrofloxacina base.

• No causa irritación o lesión alguna posterior a su aplicación subcutánea (SC) o intramuscular (IM) en cerdos.

A continuación se presentan estudios llevados a cabo en campo para demostrar la farmacocinética del complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la presente invención, en cuyos resultados se puede apreciar claramente la eficacia de dicho complejo recristalizado de enrofloxacina. Cabe señalar que en los estudios que a continuación se detallan, el complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la presente invención se ha identificado como "ENR-CC", y la enrofloxacina de referencia u original como "ENR-O", esto para simplificar y facilitar la descripción, en el entendido que al hacer referencia a ENR-CC se estará haciendo referencia al complejo recristalizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado y ENR-0 a la enrofloxacina de referencia u original. Habiendo hecho la aclaración pertinente, se procede a describir los estudios que son:

I. FARMACOCINETICA DE ENR-CC EN AVES COMERCIALES

Se preparó ENR-CC de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito.

La dosis administrada vía oral con sonda directo en el proventrículo tanto de ENRO, así como de ENR-CC, fue de 10 mg/kg.

Material y métodos:

A continuación se muestran los materiales y métodos empleados en los estudios de la farmacocinética por vía oral (PO, del latín Per Os) de ENR-CC en pollos de engorda:

por 30 minutos) dentro de la cámara de luz UV, hasta dejar enfriar.

Ya solidificado el medio de cultivo se procedió a sembrarlo con el estándar bacteriano. Para la preparación del estándar bacteriano, en un tubo de tapón de rosca estéril se colocaron 5 mi de agua destilada y se le incorporó cultivo bacteriano joven resembrado de Escherichia coli, 24 horas antes. Por medio de los estándares de Me Farland se realizaron los ajustes necesarios a la dilución hasta obtener una concentración al 0.5 de Me Farland. La turbidez al 0.5 de McFarland se obtuvo por medio de un espectrofotómetría a una transmitancia del 60 ± 5 %, que corresponde a una concentración bacteriana de aproximadamente 1x10 ¹⁴ Para realizar las diluciones de la curva estándar, se pesaron 20 g de estándar de ENRO-CC (98% de pureza), se colocaron en un matraz y se aforo a 100 mi con agua desionizada (para su disolución fue necesario agregar 0.5ml de una solución de 0.1 N de NaOH, previo a la adición del agua desionizada). Se marcaron 10 tubos de 5ml (del 1 al 10) y uno de 15ml con el número 0. En el tubo marcado con el número 0 se colocaron 9ml de agua desionizada y en los demás tubos se introdujo 1 ml en cada uno. Del matraz se tomo 1 mi y se agrego en el tubo 0, se homogeneizó y de este se tomo 1 mi y se agregó al tubo 1 , se homogeneizó y se tomo 1 mi y se agrego al tubo 2 y así se continuo hasta completar los 10 tubos. Hecho esto se procedió a hacer los pocilios con un sacabocados para cada muestra así como para el estándar del fármaco. Se tomaron 100μΙ de cada dilución del estándar con una pipeta y se fueron colocando en los pocilios correspondientes al mismo. Posteriormente se tomaron 100μΙ de cada suero con una pipeta y se fueron colocando en cada uno de los pocilios asignados según la hora de la toma de muestra y el número de individuo al que pertenecía cada una. Se tapó cada placa y se dejaron reposar durante 24 horas a 37°C. Pasado el tiempo de espera, se procedió a esterilizar nuevamente cada placa en la cámara de luz UV durante 30 minutos. Se realizaron las lecturas de milímetros de halo de inhibición por pozo por placa con ayuda de un Vernier digital.

Sensibilidad La sensibilidad de la técnica analítica es de 0.06 g/ml

Procesamiento Una vez obtenidos los datos de actividad/concentración se de los procedió por medio del programa Origin Lab Pro 8 © se procedió a resultados obtener la curva estándar de ENR-CC, para posteriormente convertir los resultados en halos de inhibición en pg/ml de ENR- CC, los cuales fueron procesados mediante el programa PKAnalist para obtener los valores farmacocinéticos de cada uno de los animales de cada grupo.

Modelo PKAnalyst software (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City,

Farmacocinético USA) Modelo 8.

Modelo Kruskal-Wallis Dunn test

estadístico Resultados:

En la figura 5 de los dibujos que se acompañan, así como en el Cuadro 1 , se presentan los resultados obtenidos para ENR-CC por vía oral y el comparativo con ENR- O. En el Cuadro 2 se presentan los valores farmacocinéticas obtenido en los 2 grupos.

Cuadro 1

Promedio ± 1 DE de las concentraciones séricas de enrofloxacina base y ENR-CC vía oral en pollos, dosificados a razón de 10 mg/kg Cuadro 2

Valores farmacocinéticos de los 2 grupos de enrofloxacina en pollo de engorda a dosis de

10 mg/kg

Conclusiones:

Dado que la enrofloxacina es un antibacteriano concentración dependiente y debe lograr de 10 a 12 veces la CMI para los patógenos específicos, la sensibilidad de la Salmonella sp en aves se encuentra en un rango de 0.128 - 1.0 g/ml (de la más sensible a las resistentes) la ENR-0 cubre el 20 % del rango, en contraste la ENR-CC cubre el 90 % de dicho rango. Si se considera el valor de AUC/CMI > 125 la ENR-0 no cubre el rango de actividad, en contraste la ENR-CC cubre más del 50%, siendo que esta variable se aplica para productos de liberación modificada.

La ENR-0 mantiene concentraciones séricas por 8 horas, mientras que la ENR- CC por al menos 24 h.

II. CONCENTRACIONES EN TEJIDOS DE ENR-CC EN AVES COMERCIALES

Se preparó el ENR-CC de acuerdo al procedimiento descrito.

La dosis administrada vía oral con sonda directo en el proventrículo tanto de ENR- O, así como de ENR-CC, fue de 10 mg/kg.

Material y métodos: A continuación se muestran los materiales y métodos empleados en los estudios de residuos de ENR-0 y ENR-CC PO en ollos de engorda:

pocilios asignados según la hora de la toma de muestra y el número de individuo al que pertenecía cada una. Se tapó cada placa y se dejaron reposar durante 24 horas a 37°C. Pasado el tiempo de espera, se procedió a esterilizar nuevamente cada placa en la cámara de luz UV durante 30 minutos. Se realizaron las lecturas de milímetros de halo de inhibición por pozo por placa con ayuda de un Vernier digital.

Sensibilidad La sensibilidad de la técnica analítica es de 0.06 g/mll

Procesamiento Una vez obtenidos los datos de actividad/concentración se de los procedió por medio dei programa Origin Lab Pro 8 © se procedió a resultados obtener la curva estándar de la enrofloxacina, para posteriormente convertir los resultados en halos de inhibición en pg/ml de enrofloxacina, los cuales fueron procesados mediante el programa PKAnalist para obtener los valores farmacocinéticos de cada uno de los animales de cada grupo.

Modelo PKAnalyst software (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City,

Farmacocinético USA) Modelo 8.

Modelo ruskal-Wallis Dunn test

estadístico

Resultados:

En las figuras 6 a 10 de los dibujos que se acompañan se presentan los resultados obtenidos para los tejidos con la ENR-CC por vía oral y el comparativo con ENR-O.

Conclusiones:

Las concentraciones de ENR-CC en pulmón y saco vitelino son mucho mayores en animales dosificados con ENR-CC (concentraciones terapéuticas), además de lograr más tiempo de estancia en dichos tejidos.

III. FARMACOCINETICA DE ENR-CC ADMINISTRADA VÍA SC Y PO EN PERROS

Se preparó el complejo ENR-CC de acuerdo al procedimiento descrito.

Material y métodos:

Se resumen los materiales y métodos de la siguiente manera:

Material y Característica

Método

Animales 24 perros criollos. Peso promedio 17.5 ± 8.5 kg;

Grupos Divididos aleatoriamente en 4 grupos: 1) SC producto original, 2)

SC ENR-CC, 3) PO producto original y 3) PO ENR-CC. La dosis en las vías PO fue de 10 mg/kg y para la IM de 5 mg/kg

Dosis y vía 5mg/kg vía subcutánea en el pliegue escapular y la PO 5 mg/kg. Cada animal fue pesado y dosificado individualmente

Muéstreos 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 18, 24, 36 y 48

(tiempo)

Muestras Se toman al menos 3ml de sangre por tiempo, se centrifugan a

4000 rpm, se obtiene el suero, se marca e inmediatamente se congelan a -4 °C.

Muestreo A partir de un catéter permanente en vena cefálica o safena y con

10 Ul de heparina como anticoagulante

Análisis Todas las muestras se procesaron por triplicado. La determinación de enrofloxacina en cada muestra de plasma se llevo a cabo mediante un método microbiológico cualitativo / cuantitativo de difusión en agar, descrito por Bennet et al. Para preparar el medio de cultivo se utilizó agar MacConkey (Bioxon) a razón de 40g/L, a una temperatura de 540°C por 5 minutos y esterilizado en autoclave (15 libras, 121°C, por 15 minutos). El agar estéril se virtió en recipientes de vidrio (esterilizadas previamente mediante luz UV por 30 minutos) dentro de la cámara de luz UV, hasta dejar enfriar. Ya solidificado el medio de cultivo se procedió a sembrarlo con el estándar bacteriano. Para la preparación del estándar bacteriano, en un tubo de tapón de rosca estéril se colocaron 5 mi de agua destilada y se le incorporó cultivo bacteriano joven resembrado de Escherichia coli, 24 horas antes. Por medio de los estándares de Me Farland se realizaron los ajustes necesarios a la dilución hasta obtener una concentración al 0.5 de Me Farland. La turbidez al 0.5 de McFarland se obtuvo por medio de un espectrofotómetría a una transmitancia del 60 ± 5 %, que corresponde a una concentración bacteriana de aproximadamente 1x10 ¹⁴ Para realizar las diluciones de la curva estándar, se pesaron 20 g de estándar de enrofloxacina (98% de pureza), se colocaron en un matraz y se aforo a 100 mi con agua desionizada (para su disolución fue necesario agregar 0.5ml de una solución de 0.1 de NaOH, previo a la adición del agua desionizada). Se marcaron 10 tubos de 5ml (del 1 al 10) y uno de 15 mililitros con el número 0. En el tubo marcado con el número 0 se colocaron 9ml de agua desionizada y en los demás tubos se introdujo 1 ml en cada uno. Del matraz se tomo 1 mi y se agrego en el tubo 0, se homogeneizó y de este se tomo 1 mi y se agregó al tubo 1 , se homogeneizó y se tomo 1 mi y se agrego al tubo 2 y así se continuo hasta completar los 10 tubos. Hecho esto se procedió a hacer los pocilios con un sacabocados para cada muestra así como para el estándar del fármaco. Se tomaron 100 μΙ de cada dilución del estándar con una pipeta y se fueron colocando en los pocilios correspondientes al mismo. Posteriormente se tomaron 100 μΙ de cada suero con una pipeta y se fueron colocando en cada uno de los pocilios asignados según la hora de la toma de muestra y el número de individuo al que pertenecía cada una. Se tapó cada placa y se dejaron reposar durante 24 horas a 37°C. Pasado el tiempo de espera, se procedió a esterilizar nuevamente cada placa en la cámara de luz UV durante 30 minutos. Se realizaron las lecturas de milímetros de halo de inhibición por pozo por placa con ayuda de un Vernier digital.

Sensibilidad La sensibilidad de la técnica analítica es de 0.06 g/ml

Procesamiento Una vez obtenidos los datos de actividad/concentración se de los procedió por medio del programa Origin Lab Pro 8 © se procedió a resultados obtener la curva estándar de la enrofloxacina, para posteriormente convertir los resultados en halos de inhibición en g/ml de enrofloxacina, los cuales fueron procesados mediante el programa PKAnalist para obtener los valores farmacocinéticos de cada uno de los animales de cada grupo.

Modelo PKAnalyst software (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City,

Farmacocinético USA) Modelo 8.

Modelo Kruskal-Wallis Dunn test

estadístico

Resultados:

En la figura 11 de los dibujos que se acompañan, así como en el Cuadro 3, se presentan los resultados obtenidos para la ENR-CC por las dos vías utilizada y el comparativo con ENR-O. En el Cuadro 4 se presentan los valores farmacocinéticas obtenido en los 4 grupos.

Cuadro 3

Perfiles séricos de concentración de enrofloxacina vs. tiempo en perros después de la aplicación de la ENR-CC. y de la enrofloxacina original, administradas vía SC y oral a dosis de 5 mg/kg.

Cuadro 4

Valores farmacocinéticos de los 4 grupos de enrofloxacina en perros Conclusiones:

Dado que la enrofloxacina es un antibacteriano concentración dependiente y debe lograr de 10 a 12 veces la CMI para los patógenos específicos, las sensibilidad de patógenos específicos para perros se muestran en el Cuadro 5 y van de 0.03 g/ml a 0.5 μg/ml, la ENR-0 cubre menos del 50 % por vía SC, pero por vía oral menos del 10% del rango para los diversos patógenos, en contraste la ENR-CC tanto por vía PO como SC cubren el 100 % de dicho rango. Si se considera el valor de AUC/CMI > 125 la ENR-0 por vía oral no cubre el rango de actividad, en contraste la ENR-CC por las dos vías evaluadas cubre el 100 %, siendo que esta variable se aplica para productos de liberación modificada.

La ENR-0 mantiene concentraciones séricas por 8 horas, mientras que la ENR- CC por al menos 36 h

Cuadro 5

CMI de los patógenos comunes en infecciones tratadas con enrofloxacina en perros IV. FARMACOCINÉTICA DE LA ENR-CC ADMINISTRADA VÍA SC EN CABALLOS Se preparó el complejo ENR-CC de acuerdo al procedimiento descrito.

La enrofloxacina no es un antibacteriano de uso común en equinos, existe evidencia sustancial para poder indicarla por 3 - 5 días seguidos en los adultos de esta especie sin que se manifiesten efectos colaterales. Está contraindicada en potros por el efecto adverso relacionado a sus articulaciones dado por la desmineralización de las superficies articulares y artritis deformante. Por lo anterior se presenta aquí la farmacocinética PO de la ENR-CC en caballos.

Material y métodos:

Se resumen los materiales y métodos de la siguiente manera:

Material y Característica

Método

Animales 18 caballos Cuarto de Milla. Peso promedio 17.5 kg;

Grupos Divididos aleatoriamente en 2 grupos: 1 ) SC producto original, 2)

SC ENR-CC, a dosis de 5 mg/kg

Dosis y vía 5mg/kg vía subcutánea en el pliegue escapular. Cada animal fue

pesado y dosificado individualmente

Muéstreos 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 18, 24, 36 y 48

(tiempo)

Muestras Se toman al menos 5 mi de sangre por tiempo, se centrifugan a

4000 rpm, se obtiene el suero, se marca e inmediatamente se congelan -4 °C.

Muestreo A partir de un catéter permanente en vena cefálica o safena, protegido por collar isabelino y vendaje y con 10 Ul de heparina como anticoagulante

Análisis Todas las muestras se procesaron por triplicado. La determinación de enrofloxacina en cada muestra de plasma se llevo a cabo mediante un método microbiológico cualitativo / cuantitativo de difusión en agar, descrito por Bennet et al. Para preparar el medio de cultivo se utilizó agar MacConkey (Bioxon) a razón de 40g/L, a una temperatura de 540°C por 5 minutos y esterilizado en autoclave (15 libras, 121°C, por 15 minutos). El agar estéril se virtió en recipientes de vidrio (esterilizadas previamente mediante luz UV por 30 minutos) dentro de la cámara de luz UV, hasta dejar enfriar. Ya solidificado el medio de cultivo se procedió a sembrarlo con el estándar bacteriano. Para la preparación del estándar bacteriano, en un tubo de tapón de rosca estéril se colocaron 5 mi de agua destilada y se le incorporó cultivo bacteriano joven resembrado de Escherichia coli, 24 horas antes. Por medio de los estándares de Me Farland se realizaron los ajustes necesarios a la dilución hasta obtener una concentración al 0.5 de Me Farland. La turbidez al 0.5 de McFarland se obtuvo por medio de un espectrofotómetría a una transmitancia del 60 ± 5 %, que corresponde a una concentración bacteriana de aproximadamente 1x10 ¹⁴ . Para realizar las diluciones de la curva estándar, se pesaron 20 g de estándar de enrofloxacina (98% de pureza), se colocaron en un matraz y se aforo a 100 mi con agua desionizada (para su disolución fue necesario agregar 0.5ml de una solución de 0. de NaOH, previo a la adición del agua desionizada). Se marcaron 10 tubos de 5ml (del 1 al 10) y uno de 15 mililitros con el número 0. En el tubo marcado con el número 0 se colocaron 9ml de agua desionizada y en los demás tubos se introdujo 1ml en cada uno. Del matraz se tomo 1 mi y se agrego en el tubo 0, se homogeneizó y de este se tomo 1 mi y se agregó al tubo 1 , se homogeneizó y se tomo 1 mi y se agrego al tubo 2 y así se continuo hasta completar los 10 tubos. Hecho esto se procedió a hacer los pocilios con un sacabocados para cada muestra así como para el estándar del fármaco. Se tomaron 100 μΙ de cada dilución del estándar con una pipeta y se fueron colocando en los pocilios correspondientes ai mismo. Posteriormente se tomaron 100 μΙ de cada suero con una pipeta y se fueron colocando en cada uno de los pocilios asignados según la hora de la toma de muestra y el número de individuo al que pertenecía cada una. Se tapó cada placa y se dejaron reposar durante 24 horas a 37°C. Pasado el tiempo de espera, se procedió a esterilizar nuevamente cada placa en la cámara de luz UV durante 30 minutos. Se realizaron las lecturas de milímetros de halo de inhibición por pozo por placa con ayuda de un Vernier digital.

Sensibilidad La sensibilidad de la técnica analítica es de 0.06 g/ml

Procesamiento Una vez obtenidos los datos de actividad/concentración se de los procedió por medio del programa Origin Lab Pro 8 © se procedió a resultados obtener la curva estándar de la enrofloxacina, para posteriormente convertir los resultados en halos de inhibición en g/ml de enrofloxacina, los cuales fueron procesados mediante el programa PKAnalist para obtener los valores farmacocinéticos de cada uno de los animales de cada grupo.

Modelo PKAnalyst software (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City,

Farmacocinético USA) Modelo 8.

Modelo Kruskal-Wallis Dunn test

estadístico

Resultados:

En la figura 12 de los dibujos que se acompañan, así como en el Cuadro 6, se presentan los resultados obtenidos para la ENR-CC y el comparativo con ENR-O. En el Cuadro 7 se presentan los valores farmacocinéticas obtenido en los 2 grupos.

Cuadro 6

Perfiles séricos de concentración de enrofloxacina vs. tiempo en caballos Cuarto de Milla después de la aplicación de la ENR-CC. y de la enrofloxacina original, administradas vía SC y oral a dosis de 10 y 5 mg/kg.

Cuadro 7

Valores farmacocinéticos de los 2 grupos de enrofloxacina en caballos Cuarto de Milla Conclusiones:

Dado que la enrofloxacina es un antibacteriano concentración dependiente y debe lograr de 10 a 12 veces la CMI para los patógenos específicos, las sensibilidad de patógenos específicos para caballos se encuentra en un rango de 0.06 pg/mL a 1.0 pg/mL la ENR-0 cubre menos del 50 %, en contraste la ENR-CC cubre el 100 % de dicho rango.

La ENR-0 mantiene concentraciones séricas por 8 horas, mientras que la ENR- CC por al menos 36 h.

V. FARMACOCINÉTICA DE LA ENR-CC ADMINISTRADA VÍA SC EN BOVINOS Material y métodos:

Se resumen los materiales y métodos de la siguiente manera:

Material y Característica

Método

Animales 20 bovinos F1 de aproximadamente 315 ± 42 kg;

Grupos Divididos aleatoriamente en 2 grupos: 1) SC producto original, 2)

SC ENR-CC.

Dosis y vía 7.5 mg/kg vía subcutánea en la tabla del cuello, cada animal fue pesado y dosificado individualmente

Muéstreos 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 18, 24, 36 y 48

(tiempo)

Muestras Se toman al menos 5ml de sangre por tiempo, se centrifugan a

4000 rpm, se obtiene el suero, se marca e inmediatamente se congelan a -4 °C.

Muestreo Se tomaron las muestras en la yugular o en el maslo de la cola.

Análisis Todas las muestras se procesaron por triplicado. La determinación de enrofloxacina en cada muestra de plasma se llevo a cabo mediante un método microbiológico cualitativo / cuantitativo de difusión en agar, descrito por Bennet et al. Para preparar el medio de cultivo se utilizó agar MacConkey (Bioxon) a razón de 40g/L, a una temperatura de 540°C por 5 minutos y esterilizado en autoclave (15 libras, 121°C, por 15 minutos). El agar estéril se virtió en recipientes de vidrio (esterilizadas previamente mediante luz UV por 30 minutos) dentro de la cámara de luz UV, hasta dejar enfriar. Ya solidificado el medio de cultivo se procedió a sembrarlo con el estándar bacteriano. Para la preparación del estándar bacteriano, en un tubo de tapón de rosca estéril se colocaron 5 mi de agua destilada y se le incorporó cultivo bacteriano joven resembrado de Escherichia coli, 24 horas antes. Por medio de los estándares de Me Farland se realizaron los ajustes necesarios a la dilución hasta obtener una concentración al 0.5 de Me Farland. La turbidez al 0.5 de McFarland se obtuvo por medio de un espectrofotómetría a una transmitancia del 60 ± 5 %, que corresponde a una concentración bacteriana de aproximadamente 1x10 ¹⁴ . Para realizar las diluciones de la curva estándar, se pesaron 20 g de estándar de enrofloxacina (98% de pureza), se colocaron en un matraz y se aforo a 100ml con agua desionizada (para su disolución fue necesario agregar 0.5 mi de una solución de 0.1 N de NaOH, previo a la adición del agua desionizada). Se marcaron 10 tubos de 5 mi (del 1 al 10) y uno de 15 mililitros con el número 0. En el tubo marcado con el número 0 se colocaron 9ml de agua desionizada y en los demás tubos se introdujo 1ml en cada uno. Del matraz se tomo 1 mi y se agrego en el tubo 0, se homogeneizó y de este se tomo 1 mi y se agregó al tubo 1 , se homogeneizó y se tomo 1 mi y se agrego al tubo 2 y asi se continuo hasta completar los 10 tubos. Hecho esto se procedió a hacer los pocilios con un sacabocados para cada muestra así como para el estándar del fármaco. Se tomaron 100 μΙ de cada dilución del estándar con una pipeta y se fueron colocando en los pocilios correspondientes al mismo. Posteriormente se tomaron 100 μΙ de cada suero con una pipeta y se fueron colocando en cada uno de los pocilios asignados según la hora de la toma de muestra y el número de individuo al que pertenecía cada una. Se tapó cada placa y se dejaron reposar durante 24 horas a 37°C. Pasado el tiempo de espera, se procedió a esterilizar nuevamente cada placa en la cámara de luz UV durante 30 minutos. Se realizaron las lecturas de milímetros de halo de inhibición por pozo por placa con ayuda de un Vemier digital.

Sensibilidad La sensibilidad de la técnica analítica es de 0.06 pg/ml

Procesamiento Una vez obtenidos los datos de actividad/concentración se de los procedió por medio del programa Origin Lab Pro 8 © se procedió a resultados obtener la curva estándar de la enrofloxacina, para posteriormente convertir los resultados en halos de inhibición en pg/ml de enrofloxacina, los cuales fueron procesados mediante el programa PKAnalist para obtener los valores farmacocinéticos de cada uno de los animales de cada grupo.

Modelo PKAnalyst software (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City,

Farmacocinético USA) Modelo 8.

Modelo Kruskal-Wallis Dunn test

estadístico

Resultados:

En la figura 13 de los dibujos que se acompañan, así como en el Cuadro 8, se presentan los resultados obtenidos para la ENR-CC por vía SC y el comparativo con ENR-O. En el cuadro 9 se presentan los valores farmacocinéticas obtenido en los 2 grupos. Cuadro 8

Perfiles séricos de concentración de enrofloxacina vs. tiempo en caballos Cuarto de Milla después de la aplicación de la ENR-CC. y de la enrofloxacina original, administradas vía SC y oral a dosis de 10 y 10 mg/kg.

Cuadro 9

Valores farmacocinéticos de los 2 grupos de enrofloxacina en bovinos F1 Conclusiones:

Dado que la enrofloxacina es un antibacteriano de concentración dependiente y debe lograr de 10 a 12 veces la CMI para los patógenos específicos, las sensibilidad de patógenos específicos para bovinos se encuentra en un rango de 0.06 pg/ml a 0.5 g/ml, la ENR-O cubre menos del 50 %, en contraste la ENR-CC cubren el 100 % de dicho rango.

La ENR-O mantiene concentraciones séricas por 8 horas, mientras que la ENR- CC por al menos 24 h.

Vi. FARMACOCINETICA DE LA ENR-CC ADMINISTRADA VÍA IM Y PO EN CERDOS Material y métodos:

Se resumen los materiales y métodos de la siguiente manera:

Material y Característica

Método

Animales 40 cerdos FIYork-Landrace de aproximadamente 73.35 ± 8.5 kg;

Grupos Divididos aleatoriamente en 4 grupos: 1) IM producto original, 2) IM

ENR-CC, 3) PO producto original y 3) PO ENR-CC. La dosis en la vía PO fue de 10 mg/kg y para la IM de 10 mg/kg

Dosis y vía 10 mg/kg vía subcutánea en la tabla del cuello y la PO 10 mg/kg.

Cada animal fue pesado y dosificado individualmente

Muéstreos 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 18, 24, 36 y 48

(tiempo)

Muestras Se toman al menos 5 mi de sangre por tiempo, se centrifugan a

4000 rpm, se obtiene el suero, se marca e inmediatamente se congelan a -4 °C.

Muestreo En la yugular

Análisis Todas las muestras se procesaron por triplicado. La determinación de enrofloxacina en cada muestra de plasma se llevo a cabo mediante un método microbiológico cualitativo / cuantitativo de difusión en agar, descrito por Bennet et al. Para preparar el medio de cultivo se utilizó agar MacConkey (Bioxon) a razón de 40g/L, a una temperatura de 540°C por 5 minutos y esterilizado en autoclave (15 libras, 121°C, por 15 minutos). El agar estéril se virtió en recipientes de vidrio (esterilizadas previamente mediante luz UV por 30 minutos) dentro de la cámara de luz UV, hasta dejar enfriar. Ya solidificado el medio de cultivo se procedió a sembrarlo con el estándar bacteriano. Para la preparación del estándar bacteriano, en un tubo de tapón de rosca estéril se colocaron 5m! de agua destilada y se le incorporó cultivo bacteriano joven resembrado de Escherichia coli, 24 horas antes. Por medio de los estándares de Me Farland se realizaron los ajustes necesarios a la dilución hasta obtener una concentración al 0.5 de Me Farland. La turbidez al 0.5 de McFarland se obtuvo por medio de un espectrofotómetría a una transmitancia del 60 ± 5 %, que corresponde a una concentración bacteriana de aproximadamente 1x10 ¹⁴ . Para realizar las diluciones de la curva estándar, se pesaron 20 g de estándar de enrofloxacina (98% de pureza), se colocaron en un matraz y se aforo a 100 mi con agua desionizada (para su disolución fue necesario agregar 0.5 mi de una solución de 0.1N de NaOH, previo a la adición del agua desionizada). Se marcaron 10 tubos de 5ml (del 1 al 10) y uno de 15 mililitros con el número 0. En el tubo marcado con el número 0 se colocaron 9ml de agua desionizada y en los demás tubos se introdujo 1ml en cada uno. Del matraz se tomo 1 mi y se agrego en el tubo 0, se homogeneizó y de este se tomo 1 mi y se agregó al tubo 1 , se homogeneizó y se tomo 1 mi y se agrego al tubo 2 y así se continuo hasta completar los 10 tubos. Hecho esto se procedió a hacer los pocilios con un sacabocados para cada muestra así como para el estándar del fármaco. Se tomaron 100 μΙ de cada dilución del estándar con una pipeta y se fueron colocando en los pocilios correspondientes al mismo. Posteriormente se tomaron 100 μΙ de cada suero con una pipeta y se fueron colocando en cada uno de los pocilios asignados según la hora de la toma de muestra y el número de individuo al que pertenecía cada una. Se tapó cada placa y se dejaron reposar durante 24 horas a 37°C. Pasado el tiempo de espera, se procedió a esterilizar nuevamente cada placa en la cámara de luz UV durante 30 minutos. Se realizaron las lecturas de milímetros de halo de inhibición por pozo por placa con ayuda de un Vernier digital.

Sensibilidad La sensibilidad de la técnica analítica es de 0.06 g/ml

Procesamiento Una vez obtenidos los datos de actividad/concentración se de los procedió por medio del programa Origin Lab Pro 8 © se procedió a resultados obtener la curva estándar de la enrofloxacina, para posteriormente convertir los resultados en halos de inhibición en μg/ml de enrofloxacina, los cuales fueron procesados mediante el programa PKAnalist para obtener los valores farmacocinéticos de cada uno de los animales de cada grupo.

Modelo PKAnalyst software (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City,

Farmacocinético USA) Modelo 8.

Modelo Kruskal-Wallis Dunn test

estadístico

Resultados:

En la figura 14 de los dibujos que se acompañan, así como en el Cuadro 10, se presentan los resultados obtenidos para la ENR-CC por las dos vías utilizadas y el comparativo con el producto original. En el Cuadro 11 se presentan los valores farmacocinéticas obtenido en los 4 grupos. Cuadro 10

Perfiles séricos de concentración de enrofloxacina vs. tiempo en cerdos después de la aplicación de la ENR-CC. y de la ENR-O, administradas vía IM y oral a dosis de 5 y 10 mg/kg, respectivamente.

Cuadro 11

Valores farmacocinéticos de los 4 grupos de enrofloxacina en cerdos Conclusiones:

Dado que la enrofloxacina es un antibacteriano de concentración dependiente y debe lograr de 10 a 12 veces la CMI para los patógenos específicos, las sensibilidad de patógenos específicos para cerdos se encuentra en un rango de 0.06 g/mL a 1.0 Mg/mL la ENR-0 IM cubre menos del 50 %, en contraste la ENR-CC cubre el 100 % de dicho rango tanto por vía PO como IM.

La ENR-0 mantiene concentraciones séricas por 8 horas, mientras que la ENR- CC por al menos 24 h.

VII. FARMACOCINETICA DE LA ENR-CC ADMINISTRADA VÍA SC EN CABRAS Material y métodos:

Se resumen los materiales y métodos de la siguiente manera:

Material y Característica

Método

Animales 20 caprinos criollos de aproximadamente 18.5 ± 1.2 kg;

Grupos Divididos aleatoriamente en 2 grupos: 1) SC producto pionero, 2)

SC ENR-CC.

Dosis y vía 10 mg/kg vía subcutánea en la tabla del cuello, cada animal fue pesado y dosificado individualmente

Muéstreos 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 18, 24, 36 y 48

(tiempo)

Muestras Se toman al menos 5 mi de sangre por tiempo, se centrifugan a

4000 rpm, se obtiene el suero, se marca e inmediatamente se congelan a -4 °C.

Muestreo Se tomaron las muestras en la yugular.

Análisis Todas las muestras se procesaron por triplicado. La determinación de enrofloxacina en cada muestra de plasma se llevo a cabo mediante un método microbiológico cualitativo / cuantitativo de difusión en agar, descrito por Bennet et al. Para preparar el medio de cultivo se utilizó agar MacConkey (Bioxon) a razón de 40g/L, a una temperatura de 540°C por 5 minutos y esterilizado en autoclave (15 libras, 121°C, por 15 minutos). El agar estéril se virtió en recipientes de vidrio (esterilizadas previamente mediante luz UV por 30 minutos) dentro de la cámara de luz UV, hasta dejar enfriar. Ya solidificado el medio de cultivo se procedió a sembrarlo con el estándar bacteriano. Para la preparación del estándar bacteriano, en un tubo de tapón de rosca estéril se colocaron 5 mi de agua destilada y se le incorporó cultivo bacteriano joven resembrado de Escherichia coli, 24 horas antes. Por medio de los estándares de Me Farland se realizaron los ajustes necesarios a la dilución hasta obtener una concentración al 0.5 de Me Farland. La turbidez al 0.5 de McFarland se obtuvo por medio de un espectrofotómetría a una transmitancia del 60 ± 5 %, que corresponde a una concentración bacteriana de aproximadamente 1x10 ¹⁴ . Para realizar las diluciones de la curva estándar, se pesaron 20 g de estándar de enrofloxacina (98% de pureza), se colocaron en un matraz y se aforo a 100 mi con agua desionizada (para su disolución fue necesario agregar 0.5 mi de una solución de 0.1 N de NaOH, previo a la adición del agua desionizada). Se marcaron 10 tubos de 5ml (del 1 al 10) y uno de 15 mililitros con el número 0. En el tubo marcado con el número 0 se colocaron 9ml de agua desionizada y en los demás tubos se introdujo 1 ml en cada uno. Del matraz se tomo 1 mi y se agrego en el tubo 0, se homogeneizó y de este se tomo 1 mi y se agregó al tubo 1 , se homogeneizó y se tomo 1 mi y se agrego al tubo 2 y así se continuo hasta completar los 10 tubos. Hecho esto se procedió a hacer los pocilios con un sacabocados para cada muestra así como para el estándar del fármaco. Se tomaron 100 μΙ de cada dilución del estándar con una pipeta y se fueron colocando en los pocilios correspondientes al mismo. Posteriormente se tomaron 100 μΙ de cada suero con una pipeta y se fueron colocando en cada uno de los pocilios asignados según la hora de la toma de muestra y el número de individuo al que pertenecía cada una. Se tapó cada placa y se dejaron reposar durante 24 horas a 37°C. Pasado el tiempo de espera, se procedió a esterilizar nuevamente cada placa en la cámara de luz UV durante 30 minutos. Se realizaron las lecturas de milímetros de halo de inhibición por pozo por placa con ayuda de un Vernier digital.

Sensibilidad La sensibilidad de la técnica analítica es de 0.06 g/ml

Procesamiento Una vez obtenidos los datos de actividad/concentración se de los procedió por medio del programa Origin Lab Pro 8 © se procedió a resultados obtener la curva estándar de la enrofloxacina, para posteriormente convertir los resultados en halos de inhibición en g/ml de enrofloxacina, los cuales fueron procesados mediante el programa PKAnalist para obtener los valores farmacocinéticos de cada uno de los animales de cada grupo.

Modelo PKAnalyst software (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City,

Farmacocinético USA) Modelo 8.

Modelo Kruskal-Wallis Dunn test

estadístico

Resultados:

En la figura 15 de los dibujos que se acompañan, así como en el Cuadro 12, se presentan los resultados obtenidos para la ENR-CC y el comparativo con el producto original. En el cuadro 13 se presentan los valores farmacocinéticas obtenido en los 2 grupos. Cuadro 12

Perfiles séricos de

concentración de enrofloxacina vs. tiempo en cabras criollos después de la aplicación de la ENR-CC.

y de la(ENR-0, administradas vía SC 10 mg/kg.

Cuadro 13

Valores farmacocinéticos de los 2 grupos de enrofloxacina en cabras Aún cuando en la anterior descripción se ha hecho referencia a ciertas modalidades del complejo recristralizado de clorhidrato de enrofloxacina dihidratado de la presente invención, debe hacerse hincapié en que son posibles numerosas modificaciones a dichas modalidades, pero sin apartarse del verdadero alcance de la invención, tales como; la concentración de sus componentes, las sales de iones metálicos, el ácido para la acidificación; entre muchas otras modificaciones. Por lo tanto, la presente invención no debe ser restringida excepto por lo establecido en el estado de la técnica y por las reivindicaciones anexas.