TANINOS Y AUTOLIZADO DE LEVADURA

MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se enmarca en la industria alimenticia y agropecuaria, en el área de elaboración y procesamiento de alimentos. Particularmente, se enfoca en la clarificación de bebidas ricas en compuestos fenólicos, incluyendo bebidas alcohólicas fermentadas. Específicamente, la solución propuesta por la invención busca resolver el problema de mejorar la astringencia sensorial de los vinos al momento de la clarificación utilizando una combinación de proteínas y autolizado de levadura.

ANTECEDENTES

En la industria vitivinícola, en general, es necesario realizar tratamientos de clarificación y estabilización antes de embotellar para eliminar la materia insoluble suspendida y asegurar una adecuada conservación de la calidad y características sensoriales del vino, lo que además permite modificar el color y el sabor de las bebidas tratadas. Estos procesos opcionalmente podrían estar apoyados por operaciones de filtrado y flotación para eliminar partículas, sólidos y compuestos precipitados presentes en el vino.

Los procesos de clarificación son menos intensivos en los vinos de crianza debido a que a medida que el vino envejece, sus partículas en suspensión caen gradualmente al fondo del recipiente. Este proceso puede tardar muchos meses o incluso años para producir un vino perfectamente claro, por lo que el proceso se acelera mediante el uso de agentes clarificantes, filtración u otras técnicas.

Un agente clarificante permite precipitar y eliminar sustancias tales como potasio, tartrato de calcio, taninos, azúcares, fenoles, color y proteínas. La reducción de los taninos puede reducir la astringencia en los vinos tintos de consumo temprano. Sin embargo, existe el riesgo de que junto con la precipitación de coloides menos deseables, también precipiten valiosas moléculas, como color, aromas u otros compuestos con propiedades deseables para el vino.

Históricamente, se han utilizado diversas sustancias como agentes clarificantes, ya sea compuestos orgánicos, incluyendo gelatina, caseína, albúmina, cola de pescado, polvo de sangre seca, o bien, productos sintéticos. Dado que los compuestos orgánicos utilizados como clarificantes son generalmente de origen animal, esto restringe el mercado de productos veganos o limita el uso por posibles reacciones alérgicas. A pesar de que existen estudios que muestran que en el vino no quedan cantidades detectadles de agentes clarificantes inorgánicos y solo trazas de agentes proteicos, las regulaciones de etiquetado de vinos en algunos países piden identificar el uso de clarificantes que podrían ser una sustancia potencialmente alergénica, limitando así su posible mercado consumidor.

Se utilizan además minerales pulverizados y materiales sólidos, donde la arcilla bentonita es una de las más habituales, pues permite la absorción de proteínas y de algunas bacterias. Por su parte, el carbón activado vegetal se utiliza para eliminar fenoles que contribuyen al pardeamiento o incluso algunas partículas que producen olores no deseables en el vino. Otros compuestos utilizados son el ferrocianuro de potasio, sílice y caolín.

Algunos productores prefieren clarificar y estabilizar moderadamente sus vinos, por temor a que dichos procesos afecten negativamente el aroma, el sabor, la textura, el color o el potencial de envejecimiento de un vino.

Por lo tanto, la principal limitación de las operaciones de clarificación y estabilización están dadas por el tipo de agentes clarificantes usados y la selectividad que tengan para eliminar los compuestos no deseados, sin alterar las características sensoriales esperadas en el producto obtenido.

ARTE PREVIO

En la industria alimentaria existen diversos artículos e invenciones que abordan el problema de clarificación de vinos.

Por ejemplo, en la publicación de Brossard et al. (2016), de los mismos inventores, se analiza la percepción sensorial de astringencia mediante técnicas de tribología empleando saliva en contacto con las composiciones a evaluar y se compara con la percepción humana. Este documento no aborda el mismo problema técnico de la invención, pues no propone un método de clarificación del vino ni tampoco utiliza los mismos componentes.

Por otra parte, el documento CN102783692A, emplea una composición proteica que contiene amilasa, proteasa ácida, pectinasa y celulasa y se enfoca en disminuir la astringencia y amargor en aceite de oliva y en el jugo de cítricos, a los que se agrega la mezcla de enzimas durante el proceso de elaboración. La tecnología descrita en dicho documento consiste en un complejo enzimático hidrolítico, que actúa hidrolizando polifenoles y con esto disminuye su efecto sensorial. A diferencia de ello, la presente invención utiliza una combinación de proteínas similares a las de la saliva humana junto a un autolizado de levadura, que actúan como precipitantes de taninos; lo cual permite eliminarlos de la matriz de la bebida tratada y con esto disminuir la astringencia. Es decir, se basan en un principio de acción diferente.

En la solicitud de patente RU2195487 (C2), si bien se apunta al mismo problema técnico de la invención, difiere en que se emplea gelatina y extracto de roble para remover los taninos. Es decir, en este documento no se utilizan los mismos componentes de la invención.

En resumen, en el arte previo existen diversas metodologías y agentes para clarificación de vino, sin embargo, no todos ellos son seguros y adecuados para diferentes mercados, ni tampoco aseguran una clarificación selectiva que mejore la astringencia sensorial de los vinos sin afectar negativamente sus propiedades organolépticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Fotografías de las muestras de la mezcla en proporción 1:1 de vino modelo y clarificante: A) Muestra luego de 15 min post mezcla. B) Muestra luego de 30 min post mezcla. C) Muestra luego de 45 min post mezcla. D) Muestra luego de 60 min post mezcla.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención provee un agente clarificante, libre de ingredientes de origen animal, selectivo a taninos altamente reactivos responsables de la astringencia agresiva o secante. El método se basa en la remoción de taninos con una combinación de autolizado de levadura y proteínas sin potencial alergénico, logrando mejorar la astringencia sensorial y sensaciones en boca en vinos tintos, sin afectar otros parámetros de calidad como color y aromas.

La invención consiste en un agente clarificante que se compone de proteínas en combinación con una solución de autolizado de levadura, preferentemente, un autolizado de Saccharomyces cerevisiae.

Las proteínas corresponden a las proteínas de la saliva humana que presentan mayor interacción con los taninos del vino. Entre ellas se encuentran: a-amilasa, proteínas ricas en prolina básicas (PRPb), proteínas ricas en prolina ácidas (PRPa), cistatina y mucina. Estas serán utilizadas en distintas proporciones para la clarificación de vinos tintos, combinadas con una solución de autolizado de levadura, preferentemente de Saccharomyces cerevisiae.

En una realización preferente de la invención, el agente clarificante para la remoción de compuestos fenólicos desde bebidas ricas en compuestos fenólicos comprende únicamente la proteína a-amilasa en combinación con la solución de autolizado de levadura. Opcionalmente, el agente clarificante comprende además una proteína seleccionada de entre proteínas ricas en prolina básicas (PRPb), proteínas ricas en prolina ácidas (PRPa), cistatina y mucina.

Las proteínas se adicionan en una concentración de entre 1 a 30 g/hL, preferentemente entre 5 a 20 g/hL, más preferentemente a una concentración entre 5 a 15 g/hL.

En estudios previos de los inventores se concluyó que en vinos con astringencia más agresiva o secante se presenta una mayor reactividad de las proteínas de la saliva con los taninos del vino disminuyendo la lubricación oral y afectando la percepción de textura en boca. De esta manera, de acuerdo con el conocimiento de los inventores, actualmente no existe en el mercado un clarificante que comprenda entre sus componentes proteínas específicamente seleccionadas por una reactividad similar a la de las proteínas de la saliva, ya que ninguno de los productos comerciales se basa en la calidad sensorial de la astringencia.

Además, durante el desarrollo de la invención se observó que las proteínas purificadas para mediciones de astringencia en vino (ej.: mucina, a-amilasa, etc.), generan una interacción tanino-proteína evidenciadle por la formación de micro-precipitados. Sin embargo, estas por sí solas no son capaces de producir el mismo nivel de interacción tanino-proteína que el conjunto de proteínas de la saliva humana, lo que fue resuelto al producir la combinación de proteínas de acuerdo con la invención con un autolizado de levadura, que permite amplificar el efecto clarificante de la proteína. Esto se aprecia en el Ejemplo 1, donde es posible apreciar que el efecto de la mezcla de a - amilasa y autolizado de levadura es superior al efecto de la a - amilasa por si sola.

El autolizado de levadura se utiliza en una concentración de entre 1 a 40 g/hL, preferentemente entre 5 a 30 g/hL, más preferentemente a una concentración entre 5 a 20 g/hL en base a los gramos de levadura adicionados a la solución de autolizado.

La solución de levaduras autolizadas se realizó siguiendo el siguiente protocolo: La levadura, preferentemente S. cerevisiae, se suspende en una solución tampón y se esteriliza en autoclave. La suspensión resultante se centrifuga y el sobrenadante se diluye en un solvente acuoso, seleccionado de entre agua destilada o una solución compatible con las proteínas a adicionar. El solvente es preferentemente agua destilada.

Los componentes del agente clarificante de acuerdo con la invención son libres de ingredientes de origen animal. Preferentemente, corresponden a ingredientes de origen vegetal o fúngico (levadura).

La invención por tanto provee un agente clarificante para la remoción de compuestos fenólicos desde bebidas ricas en compuestos fenólicos que comprende: a-amilasa en una concentración entre 1 a 30g/hL en combinación con una solución de levaduras autolizadas en una concentración entre 1 a 40g/hL.

El agente clarificante opcionalmente comprende además al menos una proteína seleccionada de entre Proteínas Ricas en Prolina básicas (PRPb), Proteínas Ricas en Prolina ácidas (PRPa), Cistatina y Mucina, en donde las proteínas están en una concentración entre 1 a 30g/hL.

La solución de levaduras autolizadas se elabora a partir de Saccharomyces cerevisiae, donde el autolizado se obtiene a partir de levadura suspendida entre 10-50%p/v, preferentemente al 20% p/v. La levadura es autolizada mediante autoclave a 121°C por un periodo entre 15 a 120 minutos.

La invención provee además un método o procedimiento para la remoción de compuestos fenólicos desde bebidas ricas en compuestos fenólicos, que comprende las etapas de:

- contactar el agente clarificante de la invención con una bebida que contiene compuestos fenólicos; y

- remover los sólidos precipitados o sedimentos tras clarificar las bebidas.

Los sólidos son removidos mediante cualquier método de separación, tales como sedimentación natural, filtración o centrifugación.

El agente clarificante de acuerdo con la invención tiene uso preferentemente en vinos elaborados a partir de vinificaciones altamente extractivas, cepajes de uvas con taninos agresivos, disminución de tiempos de guarda y en general para la optimización de procesos que busquen mejorar las sensaciones en boca. En particular, el agente clarificante de acuerdo con la invención se puede utilizar preferentemente en la clarificación de vinos con cosechas tempranas, vinos afectados por humo de incendios, vinos con mala astringencia y vinos prensa, entre otros.

El agente clarificante de acuerdo con la invención cumple su función de otorgar limpidez, disminución de astringencia secante y amargor en concentraciones similares a las de otros agentes comerciales utilizados.

La composición de acuerdo con la presente invención se caracteriza ventajosamente por lo siguiente:

• Permite un clarificado eficiente, sin afectar negativamente los parámetros organolépticos de intensidad aromática, astringencia, potencial de envejecimiento, sabor, textura, color, volumen/cuerpo y amargor de los vinos clarificados.

• Posee un buen comportamiento desde el punto de vista tecnológico, destacando mejores resultados en filtrabilidad y altura de borras.

• En la mayoría de los parámetros evaluados, la composición de la invención tuvo un comportamiento como clarificante comparable con el mejor de los gold estándar (Vegecoll) y en algunos de ellos tuvo un comportamiento superior (filtrabilidad y altura de borras), en turbidez en dosis media y alta es superior; en taninos, en dosis alta, precipita menos; en estabilidad colorante en dosis alta actúa mejor. En ningún parámetro evaluado, tuvo un comportamiento inferior. En todos estos aspectos, el efecto de la composición de la invención se intensifica en comparación con la gelatina.

Si bien el alcance de la invención está orientado principalmente a la industria del vino, esto no debe ser entendido como una limitación de la invención, ya que los compuestos, composiciones y métodos de la presente invención podrían ser aplicados en cualquier industria que produzca bebidas ricas en compuestos fenólicos que tengan problemas sensoriales de astringencia. La tecnología descrita se podría aplicar entonces en jugos o extractos de frutas o plantas, bebidas fermentadas (tales como cerveza, sidra o vino) o bebidas alcohólicas destiladas, entre otras. EJEMPLOS

A continuación, se describen ejemplos de realización de la invención a modo ilustrativo, sin que ello limite las variantes técnicas que un experto en la materia pueda incorporar o modificar, y que quedan dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1: Composición de acuerdo con la invención

Se ensayaron 5 tratamientos (cada uno con su réplica experimental) utilizando Vegecoll, Gelatina de cerdo, levadura autolizada, a-amilasa, y una mezcla de a-amilasa + levadura autolizada, según se muestra en la tabla a continuación. La mezcla de a-amilasa + levadura autolizada (Mezcla) corresponde al agente clarificante de la presente invención. Para evaluar y comparar la eficacia de cada clarificante, se incluyó un control sin clarificar. Luego de la clarificación cada uno de los tratamientos fue evaluado en los siguientes parámetros fisicoquímicos:

• Intensidad colorante (IC)

• Matiz

• Antocianas

• índice de polifenoles totales (DO280)

• Estabilidad colorante

• Velocidad máxima de filtrabilidad

• Altura de borras

Tabla 1: Listado de tratamientos Ejemplo 1 Tabla 2.1: Tratamiento en Pinot Noir

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey.

Tabla 2.2: Tratamiento en Cabernet Sauvignon

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey.

Tabla 2.3: Tratamiento en Carménére

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey. A partir de los datos presentados, el agente clarificante de acuerdo con la invención (mezcla de a-amilasa y autolizado de levadura), además de mostrar un efecto mejorado respecto de la proteína y autolizado por separado, tuvo un mejor efecto en comparación con el uso de gelatina y contra el gold estándar (Vegecoll).

Estas diferencias son concordantes con lo observado en el Ejemplo 3, en donde se comparan gelatina y Vegecoll respecto del uso de proteína sin asociar al autolizado.

Ejemplo 2: Evaluación del desempeño de una proteína purificada y de clarificantes comerciales en la clarificación de vino

La efectividad en la precipitación de taninos, de las proteínas salivares como agente de manejo de astringencia fueron comparados con los productos que dominan actualmente ese mercado. Se seleccionaron dos clarificantes comerciales: Vegecoll® que corresponde a proteína mixta de arveja/papa (Laffort), y Gelatina de origen porcino (Gélatine Extra N ^Q 1® de Laffort) y como proteína salivar se utilizó la enzima a-amilasa. El método de comparación se realizó con un experimento de formación de complejos precipitados.

Se elaboró un vino modelo que contenía 3g/L de ácido tartárico, 13% v/v de etanol, 1.5 g/L de taninos de uva (Tanin VP Grape® de Laffort) y pH 3.5. También se prepararon los clarificantes comerciales a la concentración de 5 g/hL, valor que está dentro del rango de lo recomendado por sus fabricantes y la solución con a-amilasa también a la concentración de 5 g/hL.

Se prepararon mezclas 1:1 del vino modelo y el clarificante a evaluar y se observaron mediante microscopía óptica en cuatro tiempos: 15 min, 30 min, 45 min y 60 min.

En base a lo observado, la proteína a-amilasa demostró ser un buen candidato de agente precipitante de taninos, debido a que el comportamiento es similar o superior al de los clarificantes más utilizados en la industria actualmente y a las mismas concentraciones. El resultado muestra que los complejos que forman tienen un mayor diámetro, lo que se relaciona con un mayor potencial para precipitar taninos con mayor efectividad, es decir, un nivel de agregación mayor (Figura 1).

Ejemplo 3: Caracterización del patrón a escala laboratorio, en vino, de interacción tanino- proteína

La a-amilasa (de origen no-animal) se comparó con proteína mixta de arveja/papa y gelatina de porcino, en las concentraciones propuestas respectivamente por los fabricantes: a) Vegecoll® de Laffort: dosis recomendada entre 3 a 10 g/hL b) Gélatine Extra N ^Q 1® de Laffort: dosis recomendada 6 a lOg/hL

Se realizó un experimento a escala de laboratorio utilizando vino Cabernet Sauvignon año 2020 de la localidad de Maipo Alto, con un alto contenido fenólico y de tanino. El experimento de clarificación se realizó siguiendo el siguiente protocolo:

1. Se utilizaron probetas de 1000 mL con tapa, a las que se adicionaron 750 mL de vino. Para evitar cualquier reacción de oxidación, el aire del espacio cabeza de la probeta fue removido mediante purga con nitrógeno.

2. Se ensayaron 7 tratamientos (cada uno con su réplica experimental), según se muestra en la siguiente tabla.

3. Luego de preparar los clarificantes en agua, según las instrucciones del fabricante, estos fueron agregados al vino: se homogenizó y se dio un tiempo de decantación por un período de 70 horas a temperatura ambiente.

4. Para evaluar y comparar la eficacia de cada clarificante, se incluyó un control sin clarificar. Luego de la clarificación cada uno de los tratamientos fue evaluado en los siguientes parámetros físico-químicos

• Turbidez (NTU)

• índice de polifenoles totales (DO280)

• Intensidad colorante

• Matiz

• Antocianas

• Concentración de taninos

• Estabilidad colorante Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) y una comparación de medias utilizando Tukey para determinar diferencias entre los diferentes tratamientos de clarificación. El análisis estadístico se realizó con un nivel de significancia de p<0.05 utilizando el programa estadístico XLSTAT (Adinsoft, 2021). a. Efecto de los clarificantes proteicos sobre la turbidez fNTU) de un vino Cabernet

Sauvignon

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey.

Se puede observar que los tratamientos presentan diferencias significativas y aquellos que lograron mayor limpidez fueron Vegecoll en dosis de 10 g/hL y a-amilasa en sus concentraciones de 6 y 10 g/hL. Es decir, a-amilasa logró una limpidez incluso superior a uno de los gold estándar del mercado a una menor dosis. Los tratamientos con gelatina presentaron valores con una alta dispersión, razón por la cual no se incluyen. b. Efecto de los clarificantes proteicos sobre el contenido de polifenoles totales flPT) de un vino Cabernet Sauvignon

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey.

Aunque se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos, los niveles de fenoles totales son parecidos y no se observó un empobrecimiento en polifenoles a consecuencia de los tratamientos. Como era de esperar, la gelatina fue el clarificante con un mayor impacto relativo. Por su parte, la a-amilasa tuvo un comportamiento equivalente a Vegecoll. c. Efecto de los clarificantes proteicos sobre el color y matiz de un vino Cabernet Sauvignon

Efecto sobre la intensidad colorante

Efecto sobre el matiz

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey.

La intensidad colorante (IC), correspondiente a la suma de rojo amarillo y azul (absorbancias a 420, 520 y 620 nm) no mostró diferencias significativas. Es decir, ninguno de los clarificantes ensayados influyó de manera negativa en la intensidad del color del vino analizado. A pesar de lo anterior, los valores de intensidad colorante obtenidos con a-amilasa son levemente superiores a los otros tratamientos.

Por su parte, el matiz que representa el cociente entre amarillo y rojo (A420/A520) mostró diferencias estadísticamente significativas entre sí. Sin embargo, los valores son bastante similares y no muestran una influencia importante de los tratamientos en el matiz del vino tinto y ninguno de ellos es diferente significativamente del testigo. d. Efecto de los clarificantes proteicos sobre el contenido de antocianas fmg/L) de un vino Cabernet Sauvignon

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey.

El efecto de los tratamientos sobre el contenido de antocianas, pigmentos responsables del color rojo en los vinos muestran diferencias significativas y la gelatina fue el tratamiento con el mayor efecto negativo a dosis alta. La a-amilasa se comportó mejor que la gelatina y no es diferente significativamente de Vegecoll; teniendo un comportamiento muy similar a Vegecoll, en particular a dosis alta, en donde la diferencia en el contenido de antocianinas entre ambos tratamientos se mantiene inferior al 1%. e. Efecto de los clarificantes proteicos sobre el contenido de taninosfmg/L) de un vino

Cabernet Sauvignon

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey.

Los taninos, principales responsables de la sensación de astringencia en vinos tintos, fueron evaluados utilizando el ensayo de precipitación de metilcelulosa. Los resultados muestran que no existen diferencias significativas entre los tratamientos realizados. Mostrando así que a-amilasa tiene un comportamiento similar a Vegecoll y Gelatina. f. Efecto de los clarificantes proteicos sobre la estabilidad colorante de un vino Cabernet Sauvignon

* Letras diferentes indican una diferencia significativa (P < 0,05) entre los tratamientos calculados por el método de comparación de medias de Tukey.

La estabilidad colorante se evaluó a través del aumento en la turbidez luego que una muestra de vino se mantiene por 48 horas a 4 ^Q C. Los resultados muestran diferencias significativas entre los tratamientos. Tanto Vegecoll como a-amilasa muestran una mayor estabilidad, en particular con dosis altas y valores de estabilidad similares entre sí. En ambos clarificantes se observa un claro efecto dosis. El tratamiento con gelatina no pudo ser evaluado por una gran dispersión de resultados.

Ejemplo 4: Elaboración de la solución de levaduras autolizadas

El autolizado se realizó siguiendo el siguiente protocolo:

20 g de Levadura comercial S. cerevisiae se suspendieron en 100 ml de tampón de citrato de potasio 0,1 M y metabisulfito de potasio 0,02 M (pH 7).

La mezcla se esterilizó en autoclave (121 °C) durante varios períodos (15-120 min). Las suspensiones resultantes se centrifugaron a 6000g durante 10 min a 4 °C.

Luego, 5 mi de la suspensión de levaduras se depositaron en un matraz Erlenmeyer de 100 mi y se aforó con agua destilada.