PROTEIQUES LAITIERS

DESCRIPTION

Domaine technique de l’invention

La présente invention concerne un procédé d’élimination des protéines lactosylées de concentrés protéiques laitiers, et le produit obtenu par ledit procédé appauvri en lactose et en protéines lactosylées.

Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.

Etat de la technique

Chaque année 650 millions de tonnes de lait sont produites dans le monde. Pour assurer la conservation du lait et diversifier ses spectres d’utilisations, différentes méthodes industrielles (par exemple : lyophilisation ou atomisation) permettent de produire près de 6 millions de tonnes de poudre de lait écrémé ou entier par an dans le monde, notamment pour l’alimentation infantile.

Les poudres laitières sont obtenues à l’issue d’une succession d’étapes unitaires dont la première est la formulation du concentré : ajustement en protéines, lipides, minéraux, lactose. Des traitements thermiques sont appliqués afin d’assurer une qualité microbiologique du produit. Des opérations de concentration (réduction de la teneur en eau) et de séchage par atomisation sont ensuite réalisées afin de produire une poudre laitière dont l’activité de l’eau est compatible avec une conservation du produit à température ambiante pendant plusieurs mois.

Le brunissement non enzymatique via la réaction de Maillard constitue le principal obstacle à la fabrication et la conservation d’une poudre de lait de bonne qualité, et a lieu à chaque fois que des protéines sont mises en contact de sucres aux fonctions réductrices. Ainsi le lactose, présent à hauteur de 5 g pour 100 g de lait, est à l’origine de la réaction de Maillard, induisant un brunissement de la poudre de lait, une perte nutritionnelle (via la destruction des lysines, acides aminés essentiels qui réagissent avec le lactose), et des modulations organoleptiques (via les produits de la réaction de Maillard). Il apparait donc comme clairement établi à ce jour que la teneur en lactose dans une matrice protéique laitière va influer sur le développement de la réaction de Maillard, et a fortiori sur le brunissement des poudres. Dans ce contexte, de nombreuses études illustrent le lien entre un appauvrissement en lactose de poudres de protéines de lait et la limitation de leur brunissement lors du stockage. Par conséquent, on constate qu’il existe toujours un besoin de produire des poudres laitières ne présentant pas les désavantages des poudres laitières de l’art antérieur (/.e. brunissement, perte nutritionnelle, perte organoleptique), même en cas de stockage prolongé.

Description de l’invention

En réalisant une analyse plus fine du brunissement des poudres, les Inventeurs ont été les premiers à révéler que si la diminution de la quantité de lactose fait chuter le brunissement initial d’une poudre dès lors son séchage, l’amplitude de brunissement se déroulant durant le stockage n’est pas améliorée par rapport au niveau de brunissement initial de la poudre (article soumis). Ainsi, appauvrir un concentré protéique laitier en lactose permet (1 ) de limiter la formation de protéines lactosylées durant le séchage et (2) de limiter le brunissement initial de la poudre lors du séchage, mais n’a pas d’impact sur le développement du brunissement durant le stockage. Par conséquent, appauvrir un concentré protéique laitier en lactose et en protéines lactosylées, permet donc (1 ) de s’assurer de limiter le brunissement initial de la poudre lors du séchage du concentré protéique, mais aussi (2) de limiter la formation d’intermédiaires réactifs qui évolueront vers des composés avancés de la réaction de Maillard (AGE), et ainsi (3) de réduire le brunissement résiduel qui se déroule durant le stockage.

Les Inventeurs ont donc mis en évidence que si la teneur en lactose est déterminante pour le niveau de brunissement de la poudre induit par l’étape initiale de la réaction de Maillard, le brunissement supplémentaire qui se produit pendant le stockage est essentiellement indépendant de la teneur en lactose.

De fait, si la lactosylation des lysines constitue la première étape de la réaction de Maillard, une fois que cette lactosylation est initiée, elle entraine inévitablement une cascade de réactions conduisant in fine à la production de pigments bruns. Les Inventeurs ont fait l’hypothèse qu’en supprimant un intermédiaire essentiel, les réactions de dégradation ne pourraient plus avoir lieu. Les Inventeurs sont ainsi les tous premiers à avoir mis en évidence que lors du vieillissement d’une poudre de lait, le développement de la réaction de Maillard dépend davantage du taux initial en protéines lactosylées que de la concentration en lactose dans la poudre, illustrant pour la première fois le rôle néfaste de ces protéines lactosylées lors du vieillissement. De plus, durant le stockage, les Inventeurs ont mis en évidence que les protéines lactosylées détectées sont inversement proportionnelles au brunissement de la poudre, ce qui confirme que ces protéines sont bien impliquées dans les étapes ultérieures de la réaction de Maillard (e.g. formation des produits de glycation avancés (AGEs) et production de mélanoïdines). Dans ce contexte, les Inventeurs ont mis au point un système d’élimination des protéines lactosylées de concentrés protéiques laitiers dans le but (1 ) de limiter le brunissement des poudres de lait en réduisant la réaction de Maillard et sa propagation durant le stockage, (2) d’améliorer la qualité nutritionnelle des poudres de lait en réduisant la destruction des lysines, et (3) de favoriser une meilleure stabilité organoleptique des poudres de lait lors de leurs conservations.

Cette technologie constitue la première méthode d’élimination des protéines lactosylées de concentrés protéiques laitiers responsables de la formation de composés intermédiaires ou finaux de la réaction de Maillard (composés de Heyns et Amadori, hydroxyméthylfurfural (HMF), malénoïdines, etc...). Cette invention permet de proposer au grand public des produits possédant une meilleure conservation, et de meilleurs propriétés nutritionnelles et organoleptiques. En effet, les principaux pays producteurs de poudres laitières se trouvent notamment en Europe et exportent leurs produits vers la Chine, l’Afrique ou l’Indonésie par exemple. Le transport se faisant le plus souvent par bateau, il a été mis en évidence (relevés de sondes introduites dans les cargaisons) que des variations de températures étaient subies par les produits. La réaction de Maillard se déroulant très fortement lors d’un stockage à haute température et/ou à haute humidité, cette technologie constitue un moyen efficace de prévention de la dégradation des poudres lorsque de tels stockages doivent être réalisés.

Pour mener à bien l’élimination des protéines lactosylées de concentrés protéiques laitiers, la technologie mise au point a essentiellement reposé sur l’utilisation d’une lectine, famille de protéines possédant comme propriété commune l’interaction avec des sucres. En particulier la galectine-3 humaine (GAL-3), et plus particulièrement son domaine C-terminal nommé CRDSAT qui possède la capacité d’interagir spécifiquement avec le lactose, ainsi que ses dérivés lactosylés et N-acétyl- lactosylés. Cette protéine CRDSAT a été décrite dans la Demande internationale WO 2017/194888) [1],

Selon un mode de réalisation, le procédé technologique se déroule alors en 3 étapes. (1 ) Réduction de la teneur en lactose libre des concentrés protéiques laitiers (afin de ne pas saturer les sites de fixation de la protéine CRDSAT) qui peut être réalisée par n’importe quel procédé connu de l’Homme du métier, par exemple selon les 3 approches efficaces suivantes : (i) diafiltration sur membrane de 3 kDa ou de 10 kDa, (ii) gel filtration via l’emploi d’une colonne de chromatographie de type dessalage/échangeuse de tampon (e.g. une chromatographie d’exclusion stérique des molécules de masse moléculaire inférieure à 3 kDa ou 5 kDa), et (iii) l’utilisation d’une enzyme de type lactase pour cliver le lactose libre en glucose + galactose. (2) Incubation du concentré protéique laitier avec un support (e.g. une résine de chromatographie) sur lequel est immobilisé la protéine CRDSAT (support CRD, e.g. résine CRD) dont la structure tridimensionnelle « all-0 fold » est synonyme d’une forte stabilité de la protéine. Rétention des protéines lactosylées en une seule étape permise du fait de la très grande affinité du CRDSAT pour ces dernières. Puis séchage du concentré protéique laitier en absence de lactose et de protéines lactosylées. (3) Régénération du support CRD (résine CRD) par une solution de lactose et lavages extensifs, pour sa réutilisation pour la préparation d’un nouvel extrait protéique laitier. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé technologique peut s’affranchir de l’étape 1 ) qui devient ainsi optionnelle. La présente invention a donc pour objet un procédé d’élimination des protéines lactosylées d’un concentré protéique laitier initial, ledit procédé comprenant : a) au moins une étape d’épuisement en lactose du concentré protéique laitier de départ pour former un concentré protéique laitier appauvri en lactose ; b) une étape d’incubation du concentré protéique laitier appauvri en lactose issu de l’étape a) sur un support greffé avec une lectine ou une partie de lectine liant les protéines lactosylées, et de rétention des protéines lactosylées sur ledit support ; c) une étape de récupération de l’éluat comprenant ou consistant en le concentré protéique laitier appauvri en lactose et en protéines lactosylées issu de l’étape b). Selon un mode de réalisation particulier du procédé d’élimination des protéines lactosylées d’un concentré protéique laitier initial, ledit procédé ne réalise pas l’étape a) avant les étapes b) et c). On entend par « concentré protéique laitier de départ ou initial » au sens de la présente invention, un concentré de protéines de lait : MPC (Milk Protein Concentrate), MPI (Milk Protein Isolate), WPI (Whey Protein Isolate), PPCN (Phosphocaséinates natifs), ou encore de caséinates. De tels concentrés protéiques laitiers peuvent comprendre des teneurs en protéines lactosylées très variables en fonction de type de protéines contenues (caséines, protéines solubles), de l’origine du lait, son temps de stockage avant concentration/séchage, des traitements thermiques déjà subis (cas d’illustration dans l’Exemple 1 (cf. ci- dessous) : le concentré protéique laitier contenait initialement 27 % de 0- lactoglobuline sous forme lactosylée).

On entend par « concentré protéique laitier appauvri en lactose » au sens de la présente invention, un concentré dont la teneur initiale en lactose est comprise entre 1 et 10 %, et dont cette teneur est encore diminuée grâce à l’étape a) d’au moins 50 % par rapport à la teneur du concentré protéique laitier initial, de préférence une teneur en lactose diminuée de 80 % à 99 % par rapport à la teneur du concentré protéique laitier initial. Par exemple, un concentré protéique laitier comprenant initialement de 1 à 10 % de lactose qui est appauvri en lactose selon le procédé de la présente invention, aura in fine une concentration en lactose de 0,5-5 %, préférentiellement de moins de 1 % de lactose.

On entend par « support » au sens de la présente invention, tout support capable de lier de manière covalente ou non covalente la lectine ou la partie de lectine liant les protéines lactosylées. Par exemple, le support de greffage de l’étape b) est choisi dans le groupe constitué par les celluloses, les polysaccharides, les supports organiques ou inorganiques, minéraux (SiO2), le verre ; se présentant sous la forme de résines, billes, perles, blocs, fils, tissus, dont la surface peut être poreuse ou non. Par exemple, s’il s’agit d’une résine de chromatographie, le couplage lectine-résine, peut être effectué de manière covalente sur une résine de type CNBr (Bromure de cyanogène) Sepharose (Cytiva®), ou NHS (N-hydroxysuccinimide) Sepharose (Cytiva®), ou NHS (N-hydroxysuccinimide) agarose (Pierce®), ou de manière non covalente, avec tout type de méthode d’interaction d’affinité permettant de retenir CRDSAT sur une résine de chromatographie, exemple : une résine de type Immobilized Metal Affinity Chromatography (Ni-Sepharose, Cytiva® ; Ni-NTA, Quiagen®). Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon la présente invention, ledit procédé comprend en outre une étape d) de séchage du concentré protéique laitier appauvri en lactose et en protéines lactosylées de l’étape c).

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, l’étape a) est réalisée par au moins une diafiltration sur membrane de 3 kDa ou de 10 kDa et/ou une chromatographie d’exclusion stérique des molécules de masse moléculaire inférieure à 3 kDa ou 5 kDa et/ou l’utilisation d’une enzyme de type lactase afin de cliver le lactose libre.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon la présente invention, la lectine ou partie de lectine greffée sur le support utilisé à l’étape b) est une galectine ou partie de galectine liant les protéines lactosylées, de préférence la galectine-3 humaine ou partie de galectine-3 humain liant les protéines lactosylées. Préférentiellement la partie de galectine-3 humaine comprend ou consiste en le domaine CRDSAT de séquence SEQ ID NO :1 (MSATGAYPA TGPYGAPAGP LIVPYNLPLP GGWPXiMLIT ILGTVKPNAN RIALDFQRGN DVAFHFNPRF NENNRRVIVC NTKLDNNWGR EERQSVFPFE SGKPFKIQVL VEPDHFKVAV NDAHLLQYNH RVKKLNEISK LGISGDIDLT SX ₂ SYTMI; où X1 est R ou K et/ou X ₂ est A ou T).

Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon la présente invention, le support est régénéré à l’issue de l’étape b) avec une solution de lactose puis un lavage extensif dans un tampon au pH de l’extrait laitier (généralement pH=6,8, totalement compatible avec le CRD).

La présente invention a encore pour objet un concentré protéique laitier obtenu par le procédé selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit concentré protéique laitier comprend une teneur appauvrie en lactose et une proportion en protéines lactosylées réduite, par rapport à celles du concentré protéique laitier initial. En particulier, le concentré protéique laitier selon la présente invention a une teneur en protéines lactosylées diminuée d’au moins 50 % par rapport à la teneur du concentré protéique laitier initial, de préférence une teneur en protéines lactosylées diminuée de 50 % à moins de 100 % par rapport à la teneur du concentré protéique laitier initial. Par exemple, un concentré protéique laitier comprenant initialement environ 1 -60% de protéine lactosylées, de préférence environ 27 % de protéines lactosylées, qui est traité selon le procédé de la présente invention, aura in fine une concentration en protéines lactosylées d’environ 0-30%, de préférence une concentration en protéines lactosylées d’environ 0-13,5 % (par exemple d’environ 13 % après un passage sur une résine/colonne de chromatographie comme illustré dans la Figure 2). En particulier, le concentré protéique laitier selon la présente invention a une teneur en lactose diminuée d’au moins 50 % par rapport à la teneur du concentré protéique laitier initial, de préférence une teneur en lactose diminuée de 80 % à 99 % par rapport à la teneur du concentré protéique laitier initial. Par exemple, un concentré protéique laitier comprenant initialement de 1 à 10 % de lactose qui est traité selon le procédé de la présente invention, aura in fine une concentration en lactose de 0,5-5 %, préférentiellement de moins de 1 %.

Le concentré protéique laitier obtenu par le procédé selon la présente invention permet de retarder le brunissement des poudres de protéines de lait, et ainsi limite l’ensemble des effets indésirables dus à la réaction de Maillard et au brunissement des poudres durant leur stockage.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

[Figure 1] représente la capture de protéines lactosylées de concentré laitier par chromatographie sur résine couplée avec le domaine CRDSAT de la galectine-3 humaine (puits 4 et 6) après élimination préalable du lactose par chromatographie d’exclusion de taille (PD10) (puits 1 à 2) : 1 : INP av PD10 : Fraction protéique avant élimination du lactose par PD10 ; 2 : INP ap PD10 : Fraction protéique après élimination du lactose par PD10 ; 3 : FT T- : protéines de lait non retenues sur résine vierge ; 4 : FT CRD : protéines de lait non retenues sur résine couplée avec CRDSAT ; 5 : Elution T- : protéines relarguées de la résine vierge après élution par 100 mM de lactose ; 6 : Elution lactose : protéines relarguées de la résine CRDSAT après élution avec 100 mM de lactose.

[Figure 2] représente le niveau de lactosylation des protéines mesuré par chromatographie en phase liquide haute pression couplée à la une analyse par spectrométrie de masse (LC-MS) et la quantification relative des formes natives et lactosylées de la p-lactoglobuline (B-LG). (A) quantification des formes natives et lactosylées au fur et à mesure du protocole. (B) lactosylation de la B-LG initiale (C) lactosylation de la B-LG après élimination des protéines lactosylées. (D) lactosylation de la B-LG retenue sur les billes CRD. [Figure 3] représente la spécificité d’interaction du domaine CRDSAT pour les protéines lactosylées. 1 : INP av PD10 : Fraction protéique avant élimination du lactose par PD10 ; 2 : FT CRD : protéines de lait non retenues sur billes CRDSAT ;

3 : Elution lactose : protéines liées sur résine CRDSAT après élution avec 100 mM de lactose ; 4 : Glycoprotéines du lait : Glycoprotéines de lait bovin ; 5 : Contrôle négatif : soybean trypsin inhibitor (protéine purifiée non glycosylée) ; 6 : Contrôle positif : Horseradish peroxidase (protéine purifiée hautement glycosylée).

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : PROCEDE D’ELIMINATION DES PROTEINES LACTOSYLEES DE CONCENTRES PROTEIQUES LAITIERS

Les concentrés protéiques laitiers sont composés généralement de 20 à 30 % de matière sèche, et sont constitués principalement de protéines et de lactose. Les protéines ainsi que le lactose sont tous deux présents à des concentrations de l’ordre du milli Molaire (mM) dans le concentré.

Pour les besoins de l’expérience, une poudre de protéines laitières avec un ratio 80/20 (caséines/protéines sériques) représentatif des proportions protéiques du lait bovin a été utilisée. Cette poudre possède une proportion de protéines lactosylées dues aux pré-traitements (traitements thermiques, évaporation sous vide (concentration)) appliqués sur le concentré laitier.

Elimination du lactose

L’élimination du lactose est requise pour ne pas saturer les sites de fixation du domaine CRDSAT de la galectine-3 humaine.

La première méthode a consisté à éliminer le lactose par diafiltration, et a reposé sur l’utilisation d’un appareil de type Stirred Cell (Millipore). Le concentré a été placé dans un réacteur sur une membrane en cellulose régénérée avec un cut-off de 3 kDa. La masse molaire d’une molécule de lactose étant de 342 Da, le lactose a traversé la membrane de diafiltration grâce à un flux d’azote poussant le liquide sous la membrane. Les protéines de taille supérieure à 3 kDa ont donc toutes été retenues au-dessus du filtre.

La seconde méthode a reposé sur l’emploi d’une colonne de chromatographie de type HiTrap Desalting (GE) ou PD-10 Desalting (GE). Les molécules présentes dans le concentré ont traversé la colonne en fonction de leurs masses et a permis d’éliminer les molécules de taille inférieure à 5000 Da, donc le lactose.

Les deux méthodes ci-dessus ont été très efficaces pour éliminer le lactose, la méthode par gel filtration étant plus rapide que la méthode par diafiltration (20 minutes vs 4 heures, respectivement) a été préférée.

Une troisième méthode repose sur l’utilisation d’une enzyme de type lactase afin de cliver le lactose libre en glucose + galactose.

Elimination des protéines lactosylées

Le domaine CRDSAT a été produit sous forme de protéine recombinante purifiée chez E. coiï. Sa fixation sur une résine type NHS activated (Pierce) (résine CRD) a été efficace à plus de 65 %, soit un rendement très correct pour ce type de greffage. L’immobilisation d’une molécule de CRDSAT sur la résine (résine CRD) a donc permis de retenir environ 1 g de protéines lactosylées. L’obtention de poudres de lait dépourvues de protéines lactosylées - en fonction des applications et besoins ultérieurs - a permis d’augmenter le rendement.

La résine CRD a été utilisée soit dans un système ouvert pour des purifications dites en « batch », soit en mode « packée » dans une colonne de chromatographie. Le concentré a été mis en contact avec la résine CRD qui a retenu les protéines lactosylées.

Après séparation de la résine CRD, le concentré a alors été prêt à être séché.

Sur un gel SDS-PAGE illustrant les étapes de réalisation de l’expérience, 15 pg de protéines ont été déposés, avant et après élimination du lactose (Figure 1 par gel filtration, pistes 1 et 2). Cette étape n’a pas induit de rétention spécifique de protéines. Le lait, appauvri en lactose a été déposé après avoir été mis en contact avec une résine de contrôle (résine T-, Figure 1 , piste 3) ou une résine CRD (Figure 1 , piste 4). Pour identification, les protéines lactosylées retenues par le domaine CRDSAT ont été éluées des résines et déposées à volume constant (Figure 1 , pistes 5 et 6). Cela a révélé que la résine vierge retient très peu de protéines de manière non spécifique (piste 5), et que la plupart des protéines peuvent être lactosylées au cours des différentes opérations unitaires réalisés durant le processus de fabrication des poudres et ont été efficacement retenues sur la résine CRD (piste 6).

La proportion en protéines lactosylées a été suivie par spectrométrie de masse LC- MS en suivant la lactosylation de la p-lactoglobuline (Figure 2). L’analyse a révélé que l’échantillon de lait mis en contact avec la résine CRD contient a minima 2 fois moins de protéines lactosylées qu’initialement (Figure 2A, B, C). Ainsi pour ce test, l’échantillon laitier est passé de 27 % à seulement 13 % de protéines lactosylées. L’analyse de la B-LG retenue sur la résine CRD a montré un très large enrichissement en protéines lactosylées (Figure 2D). L’immobilisation des protéines lactosylées sur la résine CRD a donc été efficace puisqu’elle a permis, dès les premiers tests, d’éliminer plus de 50 % des protéines lactosylées. Ce rendement peut encore être augmenté en passant plusieurs fois l’échantillon sur la colonne pour diminuer la concentration en protéines lactosylées.

La spécificité d’interaction du domaine CRDSAT pour les protéines lactosylées a été testée par l’utilisation d’une coloration des protéines retenues sur la résine CRD avec de l’acide périodique/fushine afin de colorer les protéines glycosylées. Le profil en protéine (coloration au bleu de Coomassie, Figure 3, à gauche) a été différent entre un mélange de protéines glycosylées du lait (piste 4) et les protéines retenues par le domaine CRDSAT (piste 3), confortant l’observation que le domaine CRDSAT n’a pas retenu les protéines naturellement glycosylées du lait. Ceci a été confirmé par la coloration à l’acide périodique/fushine (Figure 3, à droite). Cette méthode a permis la détection des protéines glycosylées en réagissant avec les diols vicinaux des sucres présents sur les protéines glycosylées. Piste 4, un fort signal a correspondu aux protéines glycosylées du lait. Pistes 1 et 2, les protéines glycosylées n’ont pas été suffisamment enrichies pour être détectées avec cette méthode. Piste 3, le lactose n’étant qu’un diholoside, cette méthode n’a pas été suffisamment sensible pour mettre en évidence des protéines lactosylées, confirmant que le domaine CRDSAT est bien spécifique des protéines lactosylées.

Régénération de la résine CRD

La résine CRD a été régénérée avec une solution de lactose puis par un lavage extensif dans un tampon au pH de l’extrait laitier (généralement, pH=6,8, totalement compatible avec le domaine CRDSAT). Liste des références

1 . Demande internationale WO 2017/194888