Beschreibung

Die Erfindung betrifft einen retroviralen Vektor für den Gentransfer eines IL6-Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen zur Behandlung des multiplen Myeloms. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

Das multiple Myelom, oder auch Plasmozytom, ist eine unheilbare maligne Erkrankung der Antikörper-sezernierenden B-Zelle mit einer jährlichen Inzidenz von 4 Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner in Deutschland. Hauptlokalisation der Plasmazytomzellen sind Knochen und Knochenmark, wo sie zu Osteolysen bzw. Verdrängung der Hämatopoese, mit den Folgen Anämie, Leukozytopenie und Thrombozytopenie führen. Trotz der Einführung unterschiedlicher Polychemotherapieprotokolle und der Strahlentherapie besteht für das multiple Myelom nach wie vor kein kurativer Ansatz. Die mittlere Überlebenszeit nach Erkrankungsbeginn beträgt 3 Jahre (W. Siegenthaler et al., Lehrbuch der inneren Medizin, 3. Auflage (1992), S. 723-727).

In den letzten Jahren konnte mit Interleukin-6 (IL6) ein Zytokin charakterisiert werden, das für das Wachstum von Plasmazytomzellen von entscheidender Bedeutung ist. So konnte vor kurzem gezeigt werden, daß es nicht möglich ist, bei transgenen IL6 "knock-out" Mäusen, also Mäusen, die kein funktionelles IL6 Gen mehr besitzen, Plasmozytome zu induzieren oder bereits etablierte (syngene) Plasmozytomzellen zu propagieren, während dies bei nicht-'^nock-out" Mäusen ohne weiteres möglich war. ( Hubert, D.M., M. Kopf, B.A. Mock, G. Köhler, and S. and Rudikoff. 1995. Interleukin-6 is essential for in

vivo development of B neoplasms. J. Exp . Med . : 182:243- 248),. Erste klinische Einsätze von IL-6- neutralisierenden Antikörpern führten zu vorübergehenden partiellen Remissionen .( Klein, B., Wijdenes, J. , Zhang, X.G., Jourdan, M. , Boiron, J.M. , Brochier, J. , Liautard, J., Merlin, M. , Clement, C. , Morel-Fournier, B. et al. 1991. Murine anti-interleukin-6 antibody therapy for a patient with plasma cell leukemia. Blood. 78:1198- 1204.3).. Allerdings ist aufgrund der hohen lokalen IL6- Konzentration im Knochenmark nicht zu erwarten, daß die systemische Gabe von Antikörpern zu einer ausreichenden Antagonisierung führt, so daß klinische Versuche in dieser Richtung keinen Erfolg versprechen.

Die Erfindung hat das Ziel, eine gentherapeutische Strategie zur Bekämpfung des multiplen Myeloms mit Hilfe von IL6-Antagonisten zu entwickeln. Mit dieser Strategie soll erreicht werden, daß die biologisch wirksame Konzentration dieses Antagonisten im Knochenmark bei einer klinischen Anwendung ausreichend hoch ist, um das vorhandene IL6 zu neutralisieren.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Vektor zu konstruieren, der nach Transfer in autologe hämatopoetische Stammzellen einen geeigneten IL6- Antagonisten stark und stabil zur Expression bringt.

Die Erfindung wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Wesentliche Basis der Erfindung ist ein retroviraler Ausgangsvektor, bevorzugt ein MoMLV-Derivat, besonders bevorzugt der Vektor pSFlN, der für den Gentransfer in hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen eine besonders hohe Expressionsstärke zeigt. In diesen Vektor wird mit in der Gentechnik an sich bekannten Methoden das Gen eines IL6-Antagonisten und ein Suizid- bzw. ein Selektionsgen eingebaut. Als Suizidgen sind vor allem das Thymidinkinasegen und das Cytosin-Desaminasegen

geeignet. Als Selektionsgen werden bevorzugt das Puromycin-, das Neomycin-Acetyltransferasegen oder das mdr-1-Gen eingesetzt.

Das Gen des IL6-Antagonisten und das Suizid- bzw. Selektionsgen liegen bevorzugt auf derselben mRNA, werden also von demselben für Stammzellen besonders geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und werden dennoch getrennt translatiert. Somit könnten im Falle des Suizidgens bei unvorhergesehenen Nebenwirkungen des therapeutischen Gens, z.B. auf die normale Hämatopoese des Patienten, gezielt diejenigen Zellen abgetötet werden, die den IL6- Antagonisten produzieren. Im Falle des mdr-1-Gens werden Stammzellen, die unter dem Selektionsdruck einer Chemotherapie hohe Mengen an mdr-1 produzieren, auch gleichzeitig große Mengen IL6-Antagonist exprimieren.

Von besonderer Bedeutung für die Wirkung des Vektors ist die Auswahl des IL6-Antagonisten. Grundsätzlich können alle bekannten IL6-Antagonisten eingesetzt werden, bevorzugt sind jedoch an bis zu 20 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten Antagonisten.

Eine wichtige Ausführungsform des Vektors ist die Einfügung des Gens des an 7 Kodons mutierten IL6- Antagonisten folgender Sequenz (Mutationen sind durch kleine Buchstaben gekennzeichnet) :

1 CCACGAtCCC AGCTATGAAC TCCTTCTCCA CAAGCGCCTT CGGTCCAGTt

51 GCCTTCTCCC TGCGGCTGCT CCTGGTGTTG CCTGCTGCCT TCCCTGCCCC

01 AGTACCCCCA GGAGAAGATT CCAAAGATGT AGCCGCCCCA CACAGACAGC

51 CACTCACCTC TTCAGAACGA ATTGACAAAC AAATTCGCgA CATCCTCGAC

01 t tCATCTCAG CCCTGAGAAA GGAGACATGT AACAAGAGTA ACATGTGTGA

51 AAGCAGCAAA GAGGCACTGG CAGAAAACAA CCTGAACCTT CCAAAGATGG

01 CTGAAAAAGA TGGATGCTTC CAATCTGGAT TCAATGAGGA GACTTGCCTG

5 1 GTGAAAATCA TCACTGGTCT TTTGGAGTTT GAGGTATACC TAGAGTACCT

0 1 CCAGAACAGA TTTGAGAGTA GTGAGGAACA AGCCAGAGCT GTGCAGATGA

S I GaACAAAAGa CCTGATCCAG TTCCTGCAGA AAAAGGCAAA GAATCTAGAT

0 1 GCAATAACCA CCCCTGACCC AACCACAAAT GCCAGCCTGC TGACGAAGCT

51 GCAGGCACAG AACCAGTGGC TGCAGGACAT GACAACTCAT CTCATTCTGC

0 1 GCAGCTTTAA GGAGTTCCTG atccgCAGCC TGAGGGCTCT TCGGgcAATG

5 1 TAGCATcGat ACC

tt ( Gen 1 ) u

Eine weitere wichtige Ausführungsform ist ein an 12 Kodons Mutationen enthaltender IL6-Antagonist

( zusätzlich myc-Tag) folgender Sequenz (Mutationen sind durch kleine Buchstaben gekennzeichnet) :

1 CCAGGAtCCC AGCTATGAAC TCCTTCTCCA CAAGCGCCTT CGGTCCAGTT 51 GCCTTCTCCC TGGGGCTGCT CCTGGTGTTG CCTGCTGCCT

TCCCTGCCCC 101 AGTACCCCCA GGAGA AGATT CCAAAGATGT AGCCGCCCCA

CACAGACAGC 151 CACTCACCTC TTCAGAACGA ATTGACAAAC AAATTCGGgA

CATCCTCGAC 201 ttCATCTCAG CCCTGAGAAA GGAGACATGT AACAAGAGTA

ACATGTGTGA 251 AAGCAGCAAA GAGGCACTGG CAGAAAACAA CCTGAACCTT

CCAAAGATGG 301 CTGAAAAAGA TGGATGCTTC CAATCTGGAT TCAATGAGGA

GACTTGCCTG 351 GTGAAAATCA TCACTGGTCT TTTGGAGTTT GAGGTATACC

TAGAGTACCT 401 CCAGAACAGA TTTGAGAGTA GTGAGGAACA AGCCAGAGCT

GTGCAGATGA 451 GaACAAAAGa CCTGATCCAG TTCCTGCAGA AAAAGGCAAA

GAATCTAGAT 501 GCAATAACCA CCCCTGACCC AACCACAAAT GCCAGCCTGC

TGACGAAGCT 551 GCAGGCACAG AACCAGTGGC TGCAGGACAT GACAACTCAT

CTCATTCTGC 601 GCAGCTTTAA GGAGTTCCTG atccgCAGCC TGAGGGCTCT

TCGGgcAATG 651 gaacagaaac tgatctccga agaagatctg taatagatcg atacc

( SANT 7 = Gen 2 ^K )

Eine bevorzugte Kombination der Merkmale des Vektors ist die Verwendung

- des retroviralen Ausgangsvektors pSFlN,

- des Gens des an 7 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten der Sequenz ₍ Gen 1"

- und eines Suizid- bzw. Selektionsgens.

Eine weitere wichtige Kombination ist ein Vektor

- pLXSN als retroviralem Ausgangsvektor,

- dem Gen 2 als IL 6-Antagonisten,

- dem Gen für Neomycin-Acetyltransferase als Selektionsgen und

- dem Simian Virus 40 early Promotor (SV40) alε internem Promotor zur Transkription des Selektionsgens im Ausgangsvektor.

Der Aufbau der erfindungsgemäßen Vektoren ist in den Abbildungen 1 und 2 schematisch dargestellt.

Die Verpackung des Vektors erfolgt mit Hilfe bekannter viraler Vektor-Verpackungslinien, welche nicht- replikationsfähige Retroviren generieren können. Die Auswahl der verwendeten Virushülle hat erhebliche Auswirkungen auf die Effizienz des Gentransfers. Besonders geeignet sind die Linien FLY13 und GP+envAml2.

Die Anwendung des Vektors erfolgt in der Weise, daß hämatopoetische Stammzellen aus peripherem Blut bzw. Knochenmark von Patienten durch Zytokin stimuliert werden, der Transfer des Vektors in diese Stammzellen erfolgt und sie anschließend, bevorzugt durch intravenöse Injektion, wieder in den Patienten zurückgegeben werden. Da hämatopoetische Stammzellen nach systemischer Gabe bevorzugt im Knochenmark ^' homen ^' , ist die Expression des IL6-Antagonisten in diesem Organ gesichert.

Der erfindungsgemäße Vektor hat eine hohe Gen¬ expressionsrate in hämatopoetischen Stammzellen und ist dadurch effektiv einsetzbar. Er ermöglicht einen kurativen Ansatz zur Behandlung des multiplen Myeloms, der bisherigen Therapieverfahren potentiell überlegen ist.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Anwendungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel I

1) Die cDNA des in der Literatur beschriebenen humanen IL6- Antagonisten wurde mittels RT-PCR hergestellt. Es wurden dabei auf Grundlage der humanen Interleukin-6 Sequenz Punktmutationen eingeführt, die zu folgenden sieben Aminosäuren-Austauschen führen: Pos 31 (Aspartat für Tyrosin), Pos 35 (Phenylalanin für Glycin), Pos 118 (Arginin für Serin), Pos 121 (Aspartat für Valin) , Pos 175 (Isoleucin für Glutamin) , Pos 176 (Arginin für Serin) , Pos 183 (Alanin für Glutamin) Lit. : Savino, R. , Ciapponi, L. , Lahm, A. , Dematis, A. , Cabibbo, A. , Toniatti, C. , Delmastro, P. , Altamura, S., and Ciliberto, G. 1994. Rational design of a receptor super-antagonist of human IL-6. EMBO.J. 13::5863- 5870.

2) Die cDNA des IL6-Antagonisten wurde im nächsten Schritt in den von Baum et al. beschriebenen retroviralen Vektor pSFlN( Baum, c, Hegewisch.Becker, S., Eckert, H-G., Stocking, C. , and Ostertag, W. 1995. Novel retroviral vectors for efficient expression of the multidrug resistance (mdr-1) gene in early hematopoietic cells. J. Virol . 69: 7541-7547; Patentanmeldung PCT/EP95/03175) kloniert. Dieser Vektor ist ein MoLMV- Derivat und enthält regulatorische Elemente der Viren FUCF und MESV , die dazu führen, daß die mit diesem Vektor pSFlN transferierten Gene besonders stark in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen exprimiert werden. Dieser Vektor ist daher in Bezug auf Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen bisherigen Vektoren überlegen und daher für einen möglichen gentherapeutischen Einsatz des IL6-Antagonisten in hämatopoetische Staramzellen besonders geeignet. Um den 116-Antagonisten von endogenem IL6 unterscheiden zu

können, wurde der Antagonist mit einem myc-Tag ausgestattet. Auf diese Art und Weise ist es leicht möglich, die IL6-Antagonisten-Expression im Serum oder Knochenmark des Patienten mittels immunologischer Methoden (z.B. ELISA) nachzuweisen. Das Neomycin- Resistenzgen im pSFlN wurde durch ein Puromycin- Resistenzgen ersetzt und über eine IRES Sequenz mit dem IL6-Antagonisten verbunden. Der neue durch den Einbau des IL6-Antagonisten resultierende Vektor wird pSF-IL- 6AP bezeichnet.

3) Um den Vektor für eine mögliche therapeutische Anwendung am Menschen sicherer zu machen, wurde in einem weiteren Schritt ein Suizidgen, die Herpes simplex Thymidinkinase, in den Vektor eingebaut. Dies ermöglicht die Abtötung der durch den Vektor genmodifizierten Zelle im Patienten durch die systemische Gabe von Ganciclovir. Um die gleichzeitige Expression von IL6-Antagonist und Tk-Gen zu gewährleisten, wurden beide cDNAs im Vektor über eine IRES (Inter-Ribosomale-Erkennungsstelle) Sequenz verbunden. Auf diese Art und Weise liegen beide Gene auf derselben mRNA , werden also von demselben für Stammzellen besonders geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und werden dennoch getrennt translatiert. Somit könnten im Falle unvorhergesehener Nebenwirkungen des therapeutischen Gens z.B. auf die normale Hämatopoese des Patienten gezielt diejenigen Zellen abgetötet werden, die den IL6- Antagonisten produzieren. Der neue durch den Einbau des Tk-Suizidgens resultierende Vektor wird pSF-IL-6AT bezeichnet.

4) Um eine in vivo Selektion von Stammzelllen erzielen zu können, wurde das Multidrug Resistenzgen (radr-1) zusätzlich in den Vektor eingebaut. Auf diese Art und Weise können durch eine Chemotherapie, die im Rahmen der konventionellen Plasmozytomtherapie angewendet wird, diejenigen Stammzelllen im Patienten angereichert

werden, die auch den IL6-Antagonisten tragen. Dies würde zur Erhöhung der IL6-Antagonisten-Konzentration im Patienten führen und die therapeutische Wirksamkeit des Vektors erhöhen. Um die gleichzeitige Expression von IL6- Antagonist und mdr-1-Gen zu gewährleisten, wurden beide cDNAs im Vektor über eine IRES (Inter-Ribosomale- Erkennungsstelle) Sequenz verbunden. Auf diese Art und Weise liegen beide Gene auf derselben raRNA , werden also von demselben für Stammzellen besonders geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und werden dennoch getrennt translatiert. Somit werden Stammzellen, die unter dem Selektionsdruck einer Chemotherapie hohe Mengen an mdr-1 exprimieren auch gleichzeitig große Mengen IL6- Antagonist exprimieren. Der neue durch den Einbau des mdr-1-Gens resultierende Vektor wird pSF-IL- 6AM bezeichnet.

5) Die Vektor-DNA wird mit Hilfe der retroviralen Verpackungszelllinien FLY13 und FLYRD18 zu Viren verpackt. Diese Verpackungslinien haben den Vorteil, daß sie wesentlich höhere (lθ-100fach) Virustiter erzeugen als bislang verwendete Linien (Cosset et al., Journ. Virol.69: 7430-36, 1995). Dies führt zu einer Verbesserung der Gentransfereffizienz in hämatopoetische Stammzellen. Ein weiterer Vorteil dieser Linien besteht darin, daß sie virale Vektoren produzieren, die in humanem Serum stabil sind. Da bei einer klinischen Anwendung der Gentransfer in humanem Serum als Kultivierungsmedium durchgeführt werden muß, sind diese Verpackungslinien für diesen Zweck sehr gut geeignet. Beim Gentransfer in primäre hämatopoetische Stammzellen wird der virushaltige Überstand der Verpackungslinien verwendet. Die Stammzellen werden vorher 24 Stunden mit einem Zytokin-Cocktail (Brugger et al., Blood 81:2579- 84, 1993) behandelt. Danach wird der Virusüberstand dazugegeben und für 48 Stunden kultiviert. Die führt zu einer Gentransfereffizienz von 10-20%.

6) Die Anwendung der Erfindung ist vor allem zur Behandlung des multiplen Myeloms vorgesehen. Da gezeigt wurde, daß das Zytokin IL6 ein essentieller Wachstumsfaktor für Plasmotytomzellen ist und der Entzug dieses Faktors zum Absterben der malignen Zellen führt, stellt die Expression hoher Konzentrationen des IL6-Antagonisten im Knochenmark mittels Gentransfer in Stammzellen einen kurativen Ansatz zur Behandlung des multiplen Myeloms dar und ist deshalb bisherigen Therapieverfahren potentiell überlegen.

Beispiel II

1. Die c-DNA des Sant 7 ( = _/( Gen 2 ) (Lit. Sporeno et al., Blood, Vol. 87 (1996), S. 4510-4519) wurde, wie bereits im Beispiel I beschrieben, mit Hilfe einer RT-PCR mit mutagenen Primern konstruiert. Dadurch entstehen zusätzlich zu den im Beispiel I aufgeführten Änderungen folgende Aminosäure- Austausche:

Pos. 57 (Aspartat für Leucin) , Pos. 59 (Phenylalanin für Glutamat) , Pos. 60 (Tryptophan für Asparagin) . Pos. 75 (Tyrosin für Glutamin), Pos. 76 (Lysin für Serin)

Die Schritte 2-4 erfolgen analog Beispiel I.

5. Die Vektor-DNA wird mit Hilfe der retroviralen Verpackungslinie GP+envAml2 (Markowitz et al., virology 167, 400-406, 1988) zu Viren verpackt. Diese Verpackungslinie hat den Vorteil, daß die Titer nicht wesentlich unter denen der Fly liegen

- die hier verwendete Virushülle besonders zur Infektion hämatopoetischer Stammzellen geeignet ist (Xu et al., Exp.- Hematology 22(2), Feb 223-30, 1994).

Die weitere Bearbeitung erfolgt gemäß Beispiel I.

O 97/29201 PO7DE97/00231

11

Diese zusätzlichen 5 Mutationen im Interleukin 6 Molekül erhöhen die Wirksamkeit des IL6 Rezeptor-Antagonisten etwa um Faktor 60 (Sporeno et al.). Die nun verbesserte Antagonisten-Version kann nun analog Beispiel I in den oben aufgeführten Vektoren zum Einsatz kommen, wobei Position und Größe des IL-6 Rezeptorantagonisten innerhalb des Konstruktes unverändert bleiben.

Ein weiterer Vorteil der Anwendung des Sant 7 ist die Tatsache, daß für diese Variante zum jetzigen Kenntnisstand jede biologische Restaktivität am IL-6 Rezeptor ausgeschlossen werden kann, was für andere Ausführungen nicht gewährleistet sein muß.

Beispiel III

Die c-DNA der in Beispiel I und II eingesetzten IL-6- Antagonisten („Gen 1 und „Gen 2 ^l ) wurde in den retroviralen Vektor pLXSN, ebenfalls ein MoMLV-Derivat, kloniert. Dieser Vektor enthält außer dem viralen Vektor LTR noch einen weiteren internen Promoter (SV 40 oder CMV) für die unabhängige Transkription des Resistenzgens, in diesem Fall das Gen für die Neomycin-Resistenz. Diese bewährte Vektorkonstruktion erlaubt die in-vitro-Selektion infizierter Stammzellen mittels Neomycin oder Neomycin- Analoga und wurde schon mit Erfolg in mehreren Stammzell- Gentherapiestudien eingesetzt (z. B. Xu et al. , Experimental Hematology 22:223-230 (1994)), so daß die Funktion dieses Vektors im oben genannten System gesichert ist, auch wenn er nicht speziell für hohe transkriptioneile Aktivität in humanen hämatopoetischen Stammzellen ausgelegt ist.

Die Verpackung dieser retroviralen Vektoren erfolgt analog zu Beispiel I und II in den dort verwendeten Verpackungszellinien, auch das Infektionsprotokoll ändert sich nicht (mit Ausnahme der Verwendung von Neomycin als Selektionsantibiotikum) .