Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin mittels Mikroorganismen mit veränderter Isocitrat¬ lyase-Aktivität.

Das Vitamin B ₂ , auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vιtamιn-B ₂ -Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhaute, Risse in den Mundwinkeln, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten u.a. Hautschaden, Bmdehautentzun- düngen, verminderte Sehscharfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstilistand und Gewichtsab¬ nahme eintreten. Das Vitamin B ₂ hat daher wirtschaftliche Bedeu¬ tung insbesondere als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Daneben wird es aucn als Lebensmittelfarb- stoff, beispielsweise m Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc., ein¬ gesetzt.

Die Herstellung von Riboflavin erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell. Bei den chemischen Herstellungsverfahren wird das Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines End¬ produkt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte - wie beispielsweise D-Ribose - eingesetzt werden müssen.

Eine Alternative zur chemischen Herstellung des Riboflavms bie- tet die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. Als Ausgangsprodukte für die mikrobielle Synthese können nachwach¬ sende Rohstoffe, wie beispielsweise pflanzliche Ole, eingesetzt werden.

Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyn ist bekannt (The Merck Index, Wmdholz et al. , eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983); aber auch Hefen, wie z.B. Candida oder Saccharomyces, und Bakterien, wie Clostridium, sind zur Riboflavmproduktion geeignet. Ribofla- vm-uberproduzierende Bakterienstamme sind beispielsweise m der EP 405370 beschrieben, wobei die Stamme durch Transformation der Riboflavin-Biosynthese-Gene aus Bacillus subtilis erhalten wur¬ den. Diese Prokaryonten-Gene sind aber für em rekombinantes Riboflavm-Herstellungsverfahren mit Eukaryonten wie Saccharomy- ces cerevisiae oder Ashbya gossypii ungeeignet.

In WO 93/03183 ist die Klonierung der für die Riboflavin-Bio¬ synthese spezifischen Gene aus dem eukaryontischen Organismus Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Mittels dieser Gene können rekombinante eukaryontische Mikroorganismen konstruiert werden, die eine effiziente Riboflavinproduktion gestatten.

Häufig liegen jedoch die Ausgangsprodukte und Substrate der Ribo- flavinbiosynthese-Enzyme in dem Mikroorganimus in limitierter Menge vor, so daß trotz Erhöhung der Riboflavinbiosynthese - Aktivität keine Steigerung in der Riboflavinproduktion erreicht wird.

Es bestand daher die Aufgabe ein verbessertes mikrobielles Ver¬ fahren zur Produktion von Riboflavin bereitzustellen, das Mikro- Organismen verwendet, die keine oder eine geringere Substratlimi- tierung besitzen und somit eine erhöhte Riboflavinproduktion er¬ lauben. ι

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelost, daß die verwen- deten Mikroorganismen eine Veränderung in ihrer endogenen Isoci- tratlyaseaktivität besitzen.Die Veränderung ist gegenüber dem un¬ veränderten Ausgangsstamm zu ermitteln. Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, solche Mikroorganismen mit veränderter ICL— Aktivität zu erhalten.

Eine Möglichkeit besteht darin, das endogene ICL-Gen so zu veran¬ dern, daß es für ein Enzym mit gegenüber dem Ausgangsenzym erhöhter ICL-Aktivität codiert. Eine Erhohung der Enzymaktivitat kann beispielsweise erreicht werden, indem durch Veränderung des katalytischen Zentrums ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzyminhibitoren aufgehoben wird. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität durch Erhohung der Enzymsynthese, beispielsweise durch Genamplifikation oder durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymbiosynthese reprimieren, hervorgerufen werden. Die endogene ICL-Aktivität wird vorzugsweise durch Muta¬ tion des endogenen ICL-Gens erhöht. Derartige Mutationen können entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder mutationsauslosenden Chemikalien oder gezielt mittels gentechnischer Methoden wie Deletionen, Insertionen oder Substitutionen.

Die ICL-Genexpression wird durch Erhohen der ICL-Genkopienzahl und / oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren , die die ICL-Genexpression positiv beeinflussen, erhöht. So kann eine Ver- Stärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkrip¬ tionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch

eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA verbessert wird. Zur Erhöhung der Genko¬ pienzahl wird das ICL-Gen in ein Genkonstrukt bzw. in einen Vek¬ tor eingebaut, der vorzugsweise das dem ICL-Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen enthält, insbesondere solche, die die Genexpression verstärken. Anschließend wird ein Riboflavin-produ- zierenden Mikroorganismus mit dem das ICL-Gen enthaltende Genkon¬ strukt transformiert.

Das ICL-Gen wird vorzugsweise aus Mikroorganismen, insbesondere aus dem Pilz Ashbya gossypii, isoliert. Für die Isolierung des Gens kommen aber auch alle weiteren Organismen, deren Zellen die anaplerotische Sequenz des Glyoxylat-Cyclus und damit die Isoci¬ tratlyase enthalten, also auch Pflanzer., in Betracht. Die Isolie- rung des Gens kann durch homologe oder r.eterologe Komplementation einer im ICL-Gen defekten Mutante oder auch durch heterologes Probing oder PCR mit heterologen Primerr. erfolgen. Zur Sub¬ klonierung kann das Insert des komplementierenden Plasmids an¬ schließend durch geeignete Schnitte mit Restriktionsenzymen in der Größe minimiert werden. Nach Sequenzierung und Identifizie¬ rung des putativen Gens erfolgt eine paßgenaue Subklonierung durch Fusions-PCR. Plasmide, die die so erhaltenen Fragmente als Insert tragen, werden in die ICL-Gen-defekte Mutante eingebracht, die auf Funktionalität des ICL-Gens getestet wird. Funktionelle Konstrukte werden schließlich zur Transformation eines Ribofla¬ vin-Produzenten eingesetzt.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind Isocitratlyasegene mit Nu¬ kleotidsequenzen erhältlich, die für die ir. SΞQ ID NO:2 angege- bene Aminosäuresequenz oder deren Alielvariationen kodieren. Al- lelvariationen umfassen insbesondere funktionelle Derivate, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotideπ aus der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die ICL-Aktivität aber erhalten bleibt.

Den Isocitratlyasegenen ist insbesondere ein Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid 176 bis 550 gemäß SEQ ID NO:l oder eine im wesentlichen gleichwirkende DNA-Sequer.z vorgeschaltet. So kann beispielsweise dem Gen ein Promotor vorgeschaltet sein, der sich von dem Promotor mit der angegebenen Nukleotidsequenz durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/ oder Deletion(en) unterscheidet, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit des Promotors beeinträchtigt ist. Des weiteren kann der Promotor auch durch Veränderung seiner Sequenz in seiner Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren aus¬ getauscht werden.

Dem ICL-Gen können des weiteren regulatorische Gensequenzen bzw. Regulatorgene zugeordnet sein, die insbesondere die ICL-Gen- Aktivität erhöhen. So können dem ICL-Gen beispielsweise sog. "enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwir- kung -zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte ICL-Genexpres¬ sion bewirken.

Dem Isocitratlyasegen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne Regulatorgen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Gen¬ struktur enthalten ist.

Durch Klonierung des ICL-Gens sind Plasmide bzw. Vektoren erhält¬ lich, die das ICL-Gen enthalten und - wie bereits oben erwähnt - zur Transformation eines Riboflavin-Produzenten geeignet sind. Die durch Transformation erhältlichen Zellen, bei denen es sich vorzugsweise um transformierte Zellen von Ashbya gossypii han¬ delt, enthalten das Gen in replizierbarer Form, d.h. in zusätzli¬ chen Kopien auf dem Chromosom, wobei die Genkopien durch homologe Rekombination an beliebigen Stellen des Genoms integriert werden, und/oder auf einem Plasmid bzw. Vektor.

Eine weitere Möglichkeit, Mikroorganismen mit veränderter ICL- Aktivität zu erzeugen, besteht darin, Mikroorganismen mit einer Resistenz gegennüber auf ICL hemmend wirkenden Substanzen zu er¬ zeugen und diese zu selektionieren. Hemmstoffe der Isocitratlyase (ICL) sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Handbook of Enzyme Inhibitors, Herausgeber: Hellmut Zollner, Verlag Chemie, Weinheim, 1993, auf Seite 291 aufgeführt. Besonders geeignete Hemmstoffe sind Phosphoenolpyruvat (PEP) , 6-P-Gluconat, Maleat, insbesondere aber Itaconat und Oxalat.

Werden nunmehr Riboflavin produzierende Mikroorganismen-Stamme in Gegenwart solcher Hemmstoffe kultiviert, zeigt sich überraschen- derweise, daß die Riboflavinbildung gehemmt ist. Dies äußert sich auf Kulturplatten in der Ausbildung von Kolonien, die nicht gelb werden, sondern weiß bleiben. Mit diesem System sind daher Stämme leicht erkennbar, die gegen eine Isocitratlyase-Hemmung resistent sind, da solche Stämme auch in Gegenwart von Hemmstoff Riboflavin bilden und daher gelb gefärbte Kolonien ausbilden. Derartige

Stämme können entweder durch Spontanmutation entstehen oder indem entsprechende Mutationen durch gängige Methoden, wie beispiels¬ weise chemisch oder durch UV-Bestrahlung, induziert werden. Es können somit Mikroorganismen-Stämme gewonnen werden, die einen erhöhten Anteil an Riboflavin in das Kulturmedium ausscheiden. Als resistenter Stamm mit erhöhter Riboflavinbildung wurde ins-

besondere der bei der DSM unter der Nr. 10067 hinterlegte Ashbya gossypii-Stamm erhalten.

Als Mikroorganismus werden in dem erfindungsgemaßen Verfahren bevorzugt Pilze eingesetzt. Geeignete Pilze sind beispielsweise solche, die in Indian Chem Engr. Section B. Voi 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 aufgeführt sind.

Insbesonders sind solche der Gattungen Pichia, Eremothetium und Ashbya, besonders Ashbya gossypii geeignet.

Es können aber auch andere Mikroorganismen als Pilze, beispiels¬ weise Bakterien, insbesondere die, die m Indian Chem Engr. Section B. Voi 37, No 1,2 (1995) auf Seite 16, Tabelle 6 aufge- fuhrt sind, eingesetzt werden.

Beispiel 1:

Erstellung einer genomischen Genbank aus Ashbya gossypii

Zur Erstellung einer genomischen DNA-Bank wurde chromosomale DNA nach der Methode von Wright und Philippsen (1991, Gene 109: 99-105) isoliert. Die DNA wurde partiell mit Sau 3A verdaut und mit einem Saccharose-Dichtegradienten fraktioniert. Die größten Fragmente (Figur 4) wurden mit dem Barn HI geschnittenen E.coli,S.cerevisiae Shuttlevektor YEp 352 (J.E. Hill et al.,1993, Yeast 2: 163-167) ligiert. Mit diesem Ligationsansatz wurde E.coli DH5 a transformiert Von Platten mit Ampicillin und X-Gal wurden 3600 Kolonien isoliert, die durch ihre weiße Farbe als Klone mit Insert tragendem Plasmid erkennbar waren. Die Untersu- chung von dreißig solcher zufällig ausgewählter Klone ergab, daß tatsachlich alle ein Plasmid trugen, diese Inserts im Großen- bereich 7-18 kb hattten und alle Inserts verschieden waren, was anhand der Restiktionsmuster erkennbar war. Aufgrund einer Genom¬ große von 7 x 10 ³ kb für Ashbya gossyn liegt die Wahrschemlich- keit, das uedes Gen in dieser Genbank enthalten ist, bei 97 % - 99,99 %. Je 100 Klone wurden auf einer Agarplatte in großen Aus¬ strichen kultiviert und danach die Plasmide als Pool präpariert. Die Genbank bestand dementsprechend aus 36 Plasmidpools.

Beispiel 2:

Selektion des lcll-tragenden Genbankfragments

Mit den Plasmidpraparationen der Genbank wurde die Hefe Saccharo- myces cerevisiae ICLld ura3(fs) (E. Fernändez et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204: 983-990) transformiert. Diese Mutante ist im ICLl-Gen disruptiert und besitzt im ura3-Gen eine Mutation im Leserahmen. Dieser Genotyp fuhrt dazu, daß der Stamm nicht auf

Ethanol als Kohlenstoffquelle wachsen kann und eine Uracil-Auxo- trophie zeigt. Im ersten Schritt wurden die mit der Genbank transformierten Hefezellen auf Minimalmedium mit Glucose als ein¬ ziger Kohlenstoffquelle selektioniert. Aufgrund des auf dem Plasmid vorhandenen ura3-Gens konnten nur die Zellen wachsen, die ein Plasmid aufgenommen hatten, denn das Minimalmedium enthielt kein Uracil. In diesem Schritt wurden 1900 Klone erhalten. Diese wurden durch Replikaplattierung auf ein Minimalmedium mit Ethanol als einziger Kohlenstoffquelle übertragen. Da zum Wachstum auf Ethanol unbedingt die Isocitratlyase als anaplerotisches Enzym nötig ist, konnten nur die Klone wachsen, die auf dem Plasmid das ICL-Gen trugen. Es konnten zwei Klone isoliert werden, die auf Ethanol wuchsen.

Beispiel 3 :

Überprüfung der Funktionalität des isolierten Genbankfragments

Zur Überprüfung, ob die Komplementierung des chromosomalen ICL- Defekts plasmid-kodiert war, wurden die selektionierten Saccharo- myces-Klone zweimal auf Vollmedium mit Uracil kultiviert und die erhaltenen Zellen auf Platten vereinzelt. Von 16 bzw. 13 zufällig ausgewählten Klonen wuchsen 7 bzw. 5 nicht mehr auf Minimalmedium mit Glucose. Genau diese Klone wuchsen auch nicht mehr auf Mini- malmedium mit Ethanol. Die Kurierung vom Plasmid war also mit dem Verlust der ICLld-Komplementation korreliert.

Aus einem der beiden Klone wurde das Plasmid wieder isoliert Es enthielt ein Insert von etwa 8 kb. Erneute Transformation der Saccharomyces. Mutante führte zur Komplementation aller gefunde- nen Klone. Das 8 kb - Fragment ließ sich durch Sph I auf 2,9 kb, die voll funktionell waren, verkürzen.

Im Rohextrakt der auf Ethanol gewachsenen Transformande war die Isocitratlyase mit einer spezifischen Aktivität von 0,3 U/mg Pro- tein meßbar. Zudem zeigte der Westernblott mit polyklonalen Anti¬ körpern gegen die Ashbya-ICL ein deutliches Signal.

PCR mit von tryptischen Peptiden der ICL abgeleiteten Primern er¬ gab starke Signale der erwarteten Größe. Aus einem zweidimenεio- nalen Elektrophoresegel wurde ein Protein isoliert, mit Trypsin in Peptide zerlegt und durch Edmannabbau ansequenziert. Der Ver¬ gleich der Peptidsequenzen mit Datenbanken ergab eine Identität von über 70 % mit der Isocitratlyase aus Saccharomyces cerevisiae. Davon abgeleitete Primer wurden zur PCR eingesetzt. Von dem ca. 8 kb großen komplementierenden Genbankfragement wur¬ den 3,3 kb sequenziert (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463-5467). Auf der ermittelten Sequenz konnten durch

Datenbankvergleich zwei kodierende Bereiche gefunden werden. Ein Leserahmen von 1680 Basen (SEQ ID NO:l) zeigt eine 65 %ige Iden¬ tität zum ICLl-Gen von Saccharomyces cerevisiae. Das ICL-Gen liegt 375 Basen upstream von einer Sequenz die 84 % Identität zu einer Ser-tRNA von Saccharomyces cerevisiae zeigt (SEQ ID NO:l) .

Beispiel 4:

Funktionalität subklonierter ICL in einem E.coli/Hefe/Ashbya -

Shuttlevektor

Zwei durch Restriktionsverdau erhaltene Fragmente und ein PCR- Produkt des isolierten Genbankfragments (Figur 5) wurden in das von Steiner und Philippsen (1994, Mol. Gen. Genet 242: 263-271) konstruierte Plasmid pAG 100 (Figur 6) kloniert. Bei den Fragmen- ten handelte es sich um ein 2.9 kb Sph I- Fragment ( pAG 100 icl.4) und um ein 2.2 kb Bgl 1 / Eco RV - Fragment (pAG 100 icl.6) . Beide Fragment enthielten die Ser-tRNA. Deshalb wurde zu¬ satzlich eine PCR-Amplifikation des putativen Gens mit daran fu¬ sionierten Barn HI - Schnittstellen (pAG 100 ιcl.8) durchgeführt. Alle drei DNAs wurden in die Barn HI site des Plasmids pAG 100 kloniert. Mit den erhaltenen Plasmiden wurde die Hefemutante Saccharomyces cerevisiae ICLld ura3 (fs) transformiert. Alle drei Konstrukte führten zur vollständigen Komplementation der ICLld- Disruption d.h. trugen funktionelle Gene.

Beispiel 5:

Wirkung der ICL tragenden Plasmide auf die Riboflavinbildung von

Ashbya gossypii

Die Transformation von Ashbya gossypii (Methode: Wright und Phi¬ lippsen, 1991, Gene 109: 99-105) mit den onen erklarten Plasmiden führte zu signifikanten Erhöhungen der Riooflavinbildung. Kulti¬ viert wurde m 500 ml Schuttelkolben mit zwei Schikanen, das 50 ml Medium aus 10 g/I Sojaol, 10 g/I Hefeextrakt und 200 μg/ml Geneticm enthielt. Der Kontrollstamm A.gossypii pAG 100, der em Plasmid ohne Insert enthielt, produzierte in zwei Tagen 18,7 ± 0,1 mg/l Riboflavin. Die Stamme A. gossypii pAG 100.4 und Agossypii pAG 100.6 produzierten 31,2 ± 6,1 mg/I bzw. 31,0 ± 2,0 mg(I Ribo¬ flavin (Figur 7). Eine signifikante Änderung der spezifischen Aktivität der Isocitratlyase war aufgrund der starken Streuung nicht messbar. Der Stamm A. gossypii pAG 100.8 produzierte m einem Medium, das noch durch 3 g/I Glycin supplementiert wurde, innerhalb von drei Tagen 65 ± 5,6 mg/l Riboflavin. Der Kontroll¬ stamm A.gossypii pAG 100 bildete dagegen im direkten Vergleich nur 29,9 ± 1,8 mg/l Riboflavin (Figur 8) . Weder in der spezifi-

sehen Aktivität der Isocitratlyase noch im Myzeltrockengewicht waren signifikante Unterschiede meßbar.

Beispiel 6: 5 Reinigung einer Isocitratlyase (ICL)

Zur Identifizierung von auf ICL hemmend wirkenden Substanzen wurde zunächst die ICL aus Ashbya gossypii gereinigt. Die Isolie¬ rung und Reinigung des Enzyms erfolgte lOnach Wachstum des Pilz-

10 mycels auf Pflanzenöl. Die einzelnen Reinigungsschritte sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt: Demgemäß enthält ein typischer, aus ca. 25 g Mycel hergestellter Rohextrakt, der durch Zellaufschluß mit einer French-Press gewonnen wurde, 220 Einheiten ICL- Aktivität. Etwa 78% davon sind nach Zentrifügation bei 40.000 g

15 gelöst im Überstand wiederzufinden. Eine anschließende fraktio¬ nierte Ammoniumsulfatfällung führt zu einer dreifachen Anreicher¬ ung des Enzyms. Nach einer Gelfiltration mit einer Sephacryl S-300 Säule wird die TCL an den Kationenaustauscher Mono S-Sepha- rose gebunden und mit NaCl eluiert. Das so erhaltene Präparat ist

20 homogen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und hat eine spezifische Aktivität von 18,4 U/mg.

Beispiel 7:

Identifizierung von ICL-Hemmstoffen

25

Mit dem gereinigten Enzym lassen sich in einem colorimetrischen Test (Dixon, H. und Kornberg, H.L. (1959), Biochem. J. 72, 3: Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle) Einflüsse von Substanzen auf die Aktivität messen. In Tabelle 2 und Figur 1

30 sind die Effekte der getesteten Substanzen auf das Enzym zusammengefaßt bzw. dargestellt. Untersucht wurden zum einen Sub¬ stanzen, die als Metaboliten in der Pilzzelle einen hemmenden Ef fekt auf das Enzym haben könnten. Darunter zeigten 6-P-Gluconat und Phosphoenolpyruvat die deutlichsten Hemmwirkungen mit über

35 50% bei einer Konzentration von 10 mM. Erheblich besser wirkten jedoch Itakonat und Oxalat, die vermutlich nicht im Stoffwechsel des Pilzes vorkommen. Bereits eine Konzentration von 1 mmol führte zu 78% bzw. 95% Hemmung.

40 Beispiel 8:

Charakterisierung einer mit Itakonat selektionierten Mutante

Durch UV-Bestrahlung von isolierten Sporen des Pilzes lassen sich Mutationen im Erbmaterial erzeugen. Mit einer Strahlendosis, bei 45 der 10-20% der eingesetzten Sporen überleben, erhält man Mutan¬ ten, die gegen eine Hemmung der Riboflavinbildung durch Itakonat resistent sind. Eine so isolierte Mutante zeigt bei Wachstum auf

Sojaöl eine 25-fache Riboflavinbildung im Vergleich zum Ausgangs¬ stamm (Figur 2 ) . Die spezifische ICL-Aktivität ist während der Ribof lavinbildungsphase um bis zu 15% erhöht (Figur 2). Mit An¬ tikörpern läßt sich zeigen, daß die Proteinmenge erhöht ist. Die ICL aus der Mutante zeigt das gleiche Hemmverhalten durch Itako¬ nat wie der Ausgangsstamm.

Beispiel 9:

Korrelation von Riboflavinbildung und spezifischer ICL-Aktivität

Einen überraschenden Hinweis auf einen kausalen Zusammenhang zwi¬ schen ICL und Riboflavinbildung liefert die Beobachtung, daß der Pilz, wenn Glucose als Substrat angeboten wird, erst nach Ver¬ brauch der Glucose mit der Produktion beginnt. Genau dann wird auch die ICL, die zuvor durch Glucose reprimiert ist, im Rohex¬ trakt meßbar und steigt bis zu Aktivitäten, wie sie bei Wachstum auf Öl gefunden werden, an (Figur 3).

SEQUENZ PROTOKOLL

( 1 ) ALGEMEINE INFORMATION :

(i) ,ANMELDER:

(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft

(B) STRASSE: Carl-Bosch-Strasse 38

(C) ORT: Ludwigshafen

(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: D-67056

(G) TELEPHON: 0621/6048526 (H) TELEFAX: 0621/6043123 (I) TELEX: 1762175170

(A) NAME: Forschungszentrum Juelich GmbH

(B) STRASSE: Leo-Brandt-Strasse

(C) ORT: Juelich

(E) LAND: Germany

(F) POSTLEITZAHL: D-52425

(G) TELEPHON: 02461-61 3004

(ii) ANMELDETITEL: Verfahren zur Herstellung von Riboflavin mittels Mikroorgaismen mit veraenderter Isocitratlyase Aktivitaet

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2

(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 2364 Basenpaare

(B) ART: Nukleins"ure

(C) STRANGFORM: Doppel

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÄLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5 'UTR

(B) LAGE: 1..550

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 551..2233

( ix ) MERKMALE :

(A) NAME/SCHLÜSSEL: 3 'UTR

(B) LAGE: 2234..2364

(xi) .SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

CGAAAGCGCC AAATACCGGA AACGGCACAG GCGCAGCTCT AATAGCCGTT CCACGATAAC 60

TTTGGAAGTT ATGGCACTAT GGCCGAGTGG TTAAGGCGAC AGACTTGAAA TCTGTTGGGC 120

TCTGCCCGCG CTGGTTCAAA TCCTGCTGGT GTCGTTATTT TTGCCGTTTC TTTTTAGATG 180

AAACTCAGGG GCCTTTAGTC CGCCCTTTTG CCCGCTGATT CATCGCCCGC CAGCAACACC 240

GGTTGAGCCG ATCAGCGCAA GAACGCGCAA AGTCACGTAT GGCCCCTAAG AGTTGAGCTC 300

TCCCCCTCGG CTCCTTCCGG GCGCGGAAAA GCCTGCGTCA CCCCATTAAG TCCGAAACCG 360

CGTTCAAGTG TACTTGGTCC GGGCCAATGT GGTTGCCTCA TCCGAGTCAC CGATACGCAG 420

GTGCGCCCGT CGAGTCACCA TTAGGAGTAG AGCATCTGAT TATATATAGG CCTAGTTACA 480

GCGGTAACÄT AGACTGATAG CTCCAGCTCC AGCACTAGCT TGTAGGACAT CTGCGCGACA 540

CCCAGTGAAC ATG TCC CCT TCC GTC AGA GAC GCC CGC AAC GAC CTT GCC 589 Met Ser Pro Ser Val Arg Asp Ala Arg Asn Asp Leu Ala 1 5 10

AGC CTG CAA CAG CAG GCA GCC GCC GAA GCC GAG GAT ATT AGG AGA TGG 637 Ser Leu Gln Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala Glu Asp Ile Arg Arg Trp 15 20 25

TGG AGC CAG CCA CGG TGG GCG GGC ACC AAG CGC GTG TAC ACG GCC GAG 685 Trp Ser Gln Pro Arg Trp Ala Gly Thr Lys Arg Val Tyr Thr Ala Glu 30 35 40 45

GAC ATC GTC AAG CGC CGC GGC ACG TTC CCT GTC GTC GAA TAC CCA TCT 733 Asp Ile Val Lys Arg Arg Gly Thr Phe Pro Val Val Glu Tyr Pro Ser

50 55 60

TCC GTA ATG GCG GAC AAG CTC GTG GAG ACA TTG GCG CGG CAC TCG CGC 781 Ser Val Met Ala Asp Lys Leu Val Glu Thr Leu Ala Arg His Ser Arg 65 70 75

AAC GGC ACG GTT TCA CAG ACG TTC GGA GTG CTC GAC CCA GTG CAA ATG 829 Asn Gly Thr Val Ser Gln Thr Phe Gly Val Leu Asp Pro Val Gln Met 80 85 90

ACG CAA ATG GTG AAG TAT CTG GAC ACG ATT TAC GTG TCT GGC TGG CAA 877 Thr Gln Met Val Lys Tyr Leu Asp Thr Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln 95 100 105

TGC AGC GCC ACG GCT TCG ACC TCG AAC GAG CCT GGG CCC GAT CTC GCG 925 Cys Ser Ala Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Gly Pro Asp Leu Ala 110 115 120 125

GAC TAT CCG ATG GAC ACC GTG CCA AAC AAG GTC GAG CAC CTG TTC ATG 973 Asp Tyr Pro Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Phe Met

130 135 140

GCG CAG CTG TTC CAC GAC CGG AAA CAG CGC GAG GCC CGC CTG TCG TGC 1021 Ala Gln Leu Phe His Asp Arg Lys Gln Arg Glu Ala Arg Leu Ser Cys 145 150 155

ACT ACC CAG CGC GAG CTC GAC CAA TTG GGG CCT GAG ATT GAC TAC TTG 1069 Thr Thr Gln Arg Glu Leu Asp Gln Leu Gly Pro Glu Ile Asp Tyr Leu 160 165 170

AGG CCG ATT GTC GCT GAC GCA GAC ACC GGC CAC GGC GGG CTA ACA GCC 1117

Arg Pro Ile Val Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly Gly Leu Thr Ala 175 180 185

GTC TTT AAA CTC ACG AAG ATG TTC ATC GAG CGC GGT GCA GCC GGT ATC 1165 Val Phe Lys Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile 190 195 200 205

CAC ATG GAG GAC CAG TCC TCC AGC AAC AAA AAG TGC GGG CAC ATG GCG 1213 His Met Glu Asp Gln Ser Ser Ser Asn Lys Lys Cys Gly His Met Ala 210 215 220

GGC CGC TGC GTG ATC CCT GTT CAG GAG CAC ATT AGT CGT TTA GTG ACT 1261 Gly Arg Cys Val Ile Pro Val Gln Glu His Ile Ser Arg Leu Val Thr 225 230 235

GTG CGC ATG TGT GCG GAC GTG ATG CAC TCG AAC CTG GTG CTT GTC GCG 1309 Val Arg Met Cys Ala Asp Val Met His Ser Asn Leu Val Leu Val Ala 240 245 250

AGA ACA GAC TCG GAG GCC GCC ACC TTA CTT AGC TCG AAC ATT GAC GCG 1357 Arg Thr Asp Ser Glu Ala Ala Thr Leu Leu Ser Ser Asn Ile Asp Ala 255 260 265

CGC GAT CAT TAC TAC ATT GTC GGG GCC TCG AAC CCT GAG GTA ACT GTA 1405 Arg Asp His Tyr Tyr Ile Val Gly Ala Ser Asn Pro Glu Val Thr Val 270 275 280 285

CCG CTG ATC GAA GTT TTG GAC GCC GCG CAG CAG GCC GGC GCC TCA GGT 1453 Pro Leu Ile Glu Val Leu Asp Ala Ala Gln Gln Ala Gly Ala Ser Gly 290 295 300

GAC AGA TTG GCT CAG CTA GAG GAG GAC TGG TGC AAG AAG GCC AAG TTG 1501 Asp Arg Leu Ala Gln Leu Glu Glu Asp Trp Cys Lys Lys Ala Lys Leu 305 310 315

AGG CTC TTC CAC GAG GCA TTT GCC GAC CAG GTG AAT GCC AGC CCT TCG 1549 Arg Leu Phe His Glu Ala Phe Ala Asp Gln Val Asn Ala Ser Pro Ser 320 325 330

ATC AAA GAC AAC- GCG GGC GTT ATT GCC AAA TTT AAC TCA CAG ATC GGG 1597 Ile Lys Asp Lys Ala Gly Val Ile Ala Lys Phe Asn Ser Gln Ile Gly 335 340 345

CCA CAG ACA GGC GCG TCG ATC AGA GAG ATG CGC AAA CTG GGC CGC GAG 1645 Pro Gln Thr Gly Ala Ser Ile Arg Glu Met Arg Lys Leu Gly Arg Glu 350 355 360 365

CTG CTC GGG CAG GAC GTC TAC TTC GAC TGG GAC CTG CCT CGC GCT AGA 1693 Leu Leu Gly Gln Asp Val Tyr Phe Asp Trp Asp Leu Pro Arg Ala Arg 370 375 380

GAG GGC TTG TAC CGC TAC AAG GGC GGC ACC CAG TGC GCG ATC ATG CGC 1741 Glu Gly Leu Tyr Arg Tyr Lys Gly Gly Thr Gln Cys Ala Ile Met Arg 385 390 395

GCA CGC GCG TTC GCG CCG TAC GCC GAC CTG GTC TGG TTC GAA TCC AAC 1789 Ala Arg Ala Phe Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Phe Glu Ser Asn 400 405 410

TTC CCT GAC TTC CAG CAG GCT AAG GAG TTT GCG CAG GGC GTG CGC GAG 1837 Phe Pro Asp Phe Gln Gln Ala Lys Glu Phe Ala Gln Gly Val Arg Glu 415 420 425

AAG TTC CCC AAC AAG TGG ATG GCC TAC AAC TTG TCG CCC AGC TTC AAC 1885 Lys Phe Pro Asn Lys Trp Met Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn 430 435 440 445

TGG CCG AAG GCC ATG CCT CCC AAG GAG CAG GAG AAC TAC ATC CAA CGG 1933 Trp Pro Lys Ala Met Pro Pro Lys Glu Gln Glu Asn Tyr Ile Gln Arg 450 455 460

CTG GGC GAG ATC GGA TAT GTG TGG CAG TTC ATC ACG CTA GCC GGC CTG 1981 Leu Gly Glu Ile Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Leu 465 470 475

CAT ACC AAT GCC TTG GCC ATC GAC AAC TTC TCG CGC GAA TTC AGC AGG 2029 His Thr Asn Ala Leu Ala Ile Asp Asn Phe Ser Arg Glu Phe Ser Arg 480 485 490

TTC GGA ATG CGT GCG TAT GCA CAA GGC ATC CAG CAG AGG GAG ATG GAC 2077 Phe Gly Met Arg Ala Tyr Ala Gln Gly Ile Gln Gln Arg Glu Met Asp 495 500 505

GAG GGC GTC GAT GTC CTA AAA CAC CAG AAG TGG GCC GGC GCA GAG TAT 2125 Glu Gly Val Asp Val Leu Lys His Gln Lys Trp Ala Gly Ala Glu Tyr 510 515 520 525

GTT GAC AGC ATT CTC AAG CTT GCC CAG GGC GGT GTG TCT TCG ACA GCC 2173 Val Asp Ser Ile Leu Lys Leu Ala Gln Gly Gly Val Ser Ser Thr Ala 530 535 540

TCG ATG GGT AAG GGT GTA ACC GAA GAG CAG TTC GGC TCC TCA AAC GGT 2221 Ser Met Gly Lys Gly Val Thr Glu Glu Gln Phe Gly Ser Ser Asn Gly 545 550 555

GCC AAA CTA TGATATCATC TCTGAGTCAT TTCTCTCGAC AAGATCCTCG 2270

Ala Lys Leu 560

GCCAGACTTC TGGAATATAT ATAACATCGG GTACCCCGAC ATCCCTGCCT TCCGCAACGT 2330

GCGAAGCAGC TGATACGTAT ACTTTAAACG CACA 2364

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 560 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) 'ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Met Ser Pro Ser Val Arg Asp Ala Arg Asn Asp Leu Ala Ser Leu Gln 1 5 10 15

Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala Glu Asp Ile Arg Arg Trp Trp Ser Gln 20 25 30

Pro Arg Trp Ala Gly Thr Lys Arg Val Tyr Thr Ala Glu Asp Ile Val 35 40 45

Lys Arg Arg Gly Thr Phe Pro Val Val Glu Tyr Pro Ser Ser Val Met 50 55 60

Ala Asp Lys Leu Val Glu Thr Leu Ala Arg His Ser Arg Asn Gly Thr 65 ' 70 75 80

Val Ser Gln Thr Phe Gly Val Leu Asp Pro Val Gln Met Thr Gln Met

85 90 95

Val Lys Tyr Leu Asp Thr Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln Cys Ser Ala 100 105 110

Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Gly Pro Asp Leu Ala Asp Tyr Pro 115 120 125

Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Phe Met Ala Gln Leu 130 135 140

Phe His Asp Arg Lys Gln Arg Glu Ala Arg Leu Ser Cys Thr Thr Gln 145 150 155 160

Arg Glu Leu Asp Gln Leu Gly Pro Glu Ile Asp Tyr Leu Arg Pro Ile 165 170 175

Val Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly Gly Leu Thr Ala Val Phe Lys 180 185 190

Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile His Met Glu 195 200 205

Asp Gln Ser Ser Ser Asn Lys Lys Cys Gly His Met Ala Gly Arg Cys 210 215 220

Val Ile Pro Val Gln Glu His Ile Ser Arg Leu Val Thr Val Arg Met 225 230 235 240

Cys Ala Asp Val Met His Ser Asn Leu Val Leu Val Ala Arg Thr Asp 245 250 255

Ser Glu Ala Ala Thr Leu Leu Ser Ser Asn Ile Asp Ala Arg Asp His 260 265 270

Tyr Tyr Ile Val Gly Ala Ser Asn Pro Glu Val Thr Val Pro Leu Ile 275 280 285

Glu Val Leu Asp Ala Ala Gln Gln Ala Gly Ala Ser Gly Asp Arg Leu 290 295 300

Ala Gln Leu Glu Glu Asp Trp Cys Lys Lys Ala Lys Leu Arg Leu Phe 305 310 315 320

His Glu Ala Phe Ala Asp Gln Val Asn Ala Ser Pro Ser Ile Lys Asp 325 330 335

Lys Ala Gly Val Ile Ala Lys Phe Asn Ser Gln Ile Gly Pro Gln Thr 340 345 350

Gly Ala Ser Ile Arg Glu Met Arg Lys Leu Gly Arg Glu Leu Leu Gly 355 360 365

Gln Asp Val Tyr Phe Asp Trp Asp Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gly Leu 370 375 380

Tyr Arg Tyr Lys Gly Gly Thr Gln Cys Ala Ile Met Arg Ala Arg Ala 385 ' 390 395 400

Phe Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Phe Glu Ser Asn Phe Pro Asp 405 410 415

Phe Gln Gln Ala Lys Glu Phe Ala Gln Gly Val Arg Glu Lys Phe Pro 420 425 430

Asn Lys Trp Met Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn Trp Pro Lys 435 440 445

Ala Met Pro Pro Lys Glu Gln Glu Asn Tyr Ile Gln Arg Leu Gly Glu 450 455 45C

Ile Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Leu His Thr Asn 465 470 475 480

Ala Leu Ala Ile Asp Asn Phe Ser Arg Glu Phe Ser Arg Phe Gly Met 485 490 495

Arg Ala Tyr Ala Gln Gly Ile Gln Gln Arg Glu Met Asp Glu Gly Val 500 505 510

Asp Val Leu Lys His Gln Lys Trp Ala Gly Ala Glu Tyr Val Asp Ser 515 520 525

Ile Leu Lys Leu Ala Gln Gly Gly Val Ser Ser Thr Ala Ser Met Gly 530 535 540

Lys Gly Val Thr Glu Glu Gln Phe Gly Ser Ser Asn Gly Ala Lys Leu 545 550 555 560