Peptides RumC présentant une activité antimicrobienne

L'invention concerne les peptides RumC1 , RumC2 et RumC3 présentant une activité antimicrobienne, ainsi que les gènes codant pour ces peptides et isolés de Ruminococcus gnavus E1.

Certaines souches bactériennes ont la capacité de libérer des substances ayant un effet bactériostatique ou bactéricide sur leurs compétiteurs. Ces substances antimicrobiennes peuvent être de nature organique, par exemple acides organiques ou peroxyde d'hydrogène (Ross et al., Int. J. Food Microbiol. 79, 3-16, 2002), ou de nature peptidique. On distingue, en outre, les peptides antimicrobiens synthétisés par voie enzymatique qui forment la classe des antibiotiques (Mootz et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1 , 543-551 , 1997; Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598- 606, 1999), et les peptides produits par la voie ribosomique qui forment la classe des bactériocines (Jacob et al., Ann. Inst. Pasteur (Paris) 84, 222-224, 1953).

Les bactériocines suscitent un intérêt grandissant dans le monde de la recherche et de l'industrie ; elles pourraient fournir des solutions alternatives à l'utilisation d'antibiotiques, notamment dans l'élevage (Luchansky, Antonie Van Leeuwenhoek 76, 335, 1999 ; O'Sullivan et al., Biochimie 84, 593-604, 2002).

De nombreux systèmes d'expression hétérologues de ces bactériocines se sont développés depuis quelques années. Notamment, Morisset et al. (Morisset ét al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 4672-4680, 2004) ont exprimé des variants de la mésentricine Y105, bactériocine de classe Ma produite par Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Y105, chez Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum DSM20484. De même, Flynn et al. (Microbiol., 148, 973-984, 2002) ont réalisé l'expression de ABP-118, bactériocine de classe Mb produite à l'origine par Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118, chez les hôtes Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis et Bacillus cereus.

En outre, plusieurs essais ont été menés pour exprimer des bactériocines chez la bactérie Escherichia coli (McCormick et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 4757-4766, 1998; Garneau et al., Appl. Environ. Microbiol., 69, 1352-1358, 2003; Biet ét al., Microbiol., 144, 2845-2854, 1998 ;

Miller et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 14-20, 1998; Richard et al., J. Bacteriol., 186, 4276-4284, 2004; Kloche et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 67:532-538, 2005), la levure Saccharomyces cerevisiae (Schoeman et al., Yeast, 15, 647-656, 1999; Van Reenen ét al., Int. J. Food Microbiol., 81 , 29-40, 2003) et chez des bactéries lactiques (Rodriguez et al., Int. J. Food Microbiol., 80, 101-116, 2003).

De nombreux travaux sont donc menés en vue de l'identification de nouvelles bactériocines et en vue de la production de ces bactériocines.

L'écosystème digestif est constitué par une microflore abondante et très complexe regroupant des bactéries, des levures et des Archeae. Ce microbiote est essentiellement anaérobie et l'on retrouve principalement des bactéries des genres Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, Bifidobacterium et Fusobacterium (Suau et al., Appl. Environ. Microbiol. 65, 4799-4807, 1999). La microflore a un impact important sur la santé de l'hôte. Elle est notamment impliquée dans la toxification et la détoxication de composés ^" métaboliques issus de l'alimentation (Hughes and Rowland Microbial Ecology Health Disease 2, 179-185, 2000). Elle est également capable de moduler l'expression de fonctions entérocytaires (Bry et al., Science 273,1380-1383, 1996 ; Hooper et al., Science 291 , 881-884, 2001 ). Enfin, elle joue un rôle primordial dans la protection de l'hôte contre l'envahissement par des bactéries exogènes potentiellement pathogènes (Ducluzeau et al., Microbial Ecology and Intestinal Infections, 1988 ; Fons et al., Microbial Ecology in Health and Disease 2, 240-246, 2000).

Parmi les pathogènes intestinaux connus, on trouve Clostridium perfringens, bactérie à Gram positif, anaérobie stricte, capable de sporuler et très répandue dans l'environnement. Ce pathogène peut provenir de l'alimentation, mais peut aussi être présent à faible concentration dans l'intestin et se mettre à proliférer et sécréter des toxines sous l'effet d'un stress. Les souches de Clostridium perfringens sont classées en 5 toxinotypes en fonction des toxines qu'elles produisent (Petit et al., Trends Microbiol. 7, 104-110, 1999). Les souches de C. perfringens de type A sont responsables de maladies gastro-intestinales chez l'Homme. En 1997, plus de 245000 cas d'infections à C. perfringens ont été recensés aux Etats-Unis. Ceci a conduit à l'hospitalisation de 41 personnes dont 7 n'ont pas survécu (Mead et al., Emerg. Infect. Dis. 5, 607-625, 1999). Les souches de C. perfringens de type A et C peuvent être respectivement à l'origine d'entérite nécrotique chez les volailles

et les porcs. Chez les volailles, l'entérite nécrotique est une pathologie aiguë, d'évolution rapide dont la mortalité peut atteindre 1 à 2% par jour. En plus de son incidence sur le bien-être des animaux, cette pathologie peut donc avoir une influence économique non négligeable. Jusqu'en 1999, cette maladie était bien contrôlée par l'usage d'antibiotiques comme facteurs de croissance. Mais, l'Union européenne a interdit leur emploi dans l'alimentation animale par crainte de sélectionner les bactéries résistantes et donc de voir diminuer l'efficacité des antibiotiques chez l'Homme. Depuis cette interdiction, l'entérite nécrotique provoquée par Clostridium perfringens chez la volaille et le porc, n'est plus contrôlée en Europe. Le nombre de cas déclarés au Réseau National d'Observations Epidémiologiques en Aviculture (RNOEA) (AFSSA Ploufragan) a considérablement augmenté en 1999 et 2000 (Valancony, Bulletin des GTV 12, 9-12, 2001 ).

A ce jour, la recherche de solutions alternatives pour contrôler et traiter cette maladie est donc de première importance.

Ruminococcus gnavus est une bactérie anaérobie stricte appartenait à la famille des Lachnospiraceae, dans l'ordre des Clostridiales. Dabard et al. (Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001 ) ont montré que la souche Ruminococcus gnavus E1 , isolée à partir de la flore dominante de l'Homme, est capable de produire une substance antimicrobienne, appelée ruminococcine A ou RumA, qui s'accumule dans le surnageant de culture. Il s'agit d'une bactériocine appartenant à la famille des lantibiotiques, active contre différentes souches de Clostridium sp. pathogènes. Gomez et al. (J. Bacteriol., 184, 18-28, 2002) ont montré que l'expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de la ruminococcine A est induite en présence de trypsine. Les mêmes auteurs montrent également que certaines enzymes digestives pourraient inhiber l'induction de la production de RumA.

Les inventeurs se sont donc intéressés à d'autres bactériocines.

La présente invention concerne les peptides RumC1 , RumC2 et RumC3 présentant une activité antibactérienne contre Clostridium perfringens, ainsi que les gènes codant pour ces peptides.

Description des séquences

SEQ ID No. 1 : Séquence peptidique conservée des peptides RumC de Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No. 2 : Séquence peptidique des peptides RumC de Ruminococcus gnavus E1 déterminée expérimentalement par la méthode de dégradation d'Edman

SEQ ID No. 3 : Séquence peptidique des peptides RumC de Ruminococcus gnavus E1 déterminée expérimentalement par la méthode de dégradation d'Edman

SEQ ID No. 4 : Séquence peptidique du peptide RumC1 de Ruminococcus gnavus E1 déduite de SEQ ID No. 7

SEQ ID No. 5 : Séquence peptidique du peptide RumC2 de Ruminococcus gnavus E1 déduite de SEQ ID No. 8

SEQ ID No. 6 : Séquence peptidique du peptide RumC3 de Ruminococcus gnavus E1 déduite de SEQ ID No. 9

SEQ ID No. 7 : Séquence nucléotidique du gène rumC1 de Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No. 8 : Séquence nucléotidique du gène rumC2 de Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No. 9 : Séquence nucléotidique du gène rumC3 de Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No. 10, 11 et 12 : Séquences peptidiques déterminées expérimentalement

Description de l'invention

La présente invention concerne un peptide ayant une activité antimicrobienne et caractérisé en ce qu'il comprend un peptide choisi parmi les peptides suivants : le peptide de la séquence SEQ ID No. 1 , un peptide comprenant un peptide présentant au moins 80 % d'identité avec le polypeptide de la SEQ ID No. 1 , le peptide de la séquence SEQ ID No. 2, et un peptide comprenant un peptide présentant au moins 80 % d'identité avec le polypeptide de la SEQ ID No. 2. Selon un mode de réalisation de la présente invention, ce peptide comprend en outre le peptide de la séquence SEQ ID No. 3. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, ce peptide comprend un peptide choisi parmi les peptides de séquences SEQ ID No. 4, 5 ou 6.

La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour une activité antimicrobienne caractérisé en ce qu'il est comprend un polynucléotide choisi parmi le polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 7, 8 ou 9, un polynucléotide qui s'hybride au polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 7, 8 ou 9 et un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que ci-dessus défini.

La présente invention concerne également une cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide tel que ci-dessus défini et une séquence terminatrice dans le même organisme hôte.

La présente invention concerne encore un vecteur comprenant un polynucléotide tel que ci-dessus défini et/ou une cassette d'expression telle que ci-dessus définie.

La présente invention concerne aussi un organisme hôte transformé avec un polynucléotide tel que ci-dessus défini, une cassette d'expression telle que ci-dessus définie et/ou un vecteur tel que ci-dessus défini.

La présente invention concerne une souche de Ruminococcus gnavus déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) le 19 décembre 2006 sous le numéro CNCM I-3705, ainsi qu'une souche bactérienne à l'état isolée non modifiée génétiquement produisant un peptide tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne un mélange protéique ou moût de fermentation susceptible d'être obtenu par un organisme hôte ou par la souche ci-dessus définie.

La présente invention concerne également une composition comprenant un peptide tel que ci-dessus défini, un organisme hôte tel que ci- dessus défini, une souche telle que ci-dessus définie, un moût de fermentation d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini ou un moût de fermentation d'une souche telle que ci-dessus définie. Selon un mode de réalisation de la présente invention, la composition se présente sous forme liquide ou sous forme de poudre.

La présente invention concerne également un additif nutritionnel comprenant un peptide tel que ci-dessus défini, un organisme hôte tel que ci- dessus défini, une souche telle que ci-dessus définie, un moût de fermentation d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini ou un moût de fermentation tel que ci-dessus défini. Selon un mode de réalisation de la présente invention, l'additif se présente sous forme liquide ou sous forme de poudre.

La présente invention concerne aussi un aliment pour animaux caractérisé en ce qu'il comprend une base nutritionnelle pour animaux et un additif nutritionnel tel que ci-dessus défini.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un peptide tel que défini ci-dessus, d'un organisme hôte tel que défini ci-dessus, d'une souche telle que définie ci-dessus, d'un moût de fermentation d'un organisme hôte tel que défini ci-dessus ou d'un moût de fermentation d'une souche telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un médicament, d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux. Selon un mode de réalisation de la présente invention, ce médicament ou cet additif nutritionnel est destiné à prévenir ou traiter l'entérite nécrotique chez les volailles ou chez les porcs. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, ce médicament ou cet additif nutritionnel est destiné à prévenir ou traiter les maladies gastrointestinales chez l'Homme.

Enfin, la présente invention concerne également l'utilisation non thérapeutique d'un peptide tel que défini ci-dessus pour traiter les animaux. Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide provient d'une souche endogène ou d'une souche exogène de l'animal. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le peptide provient d'une souche endogène de l'animal et la production du peptide par ladite souche endogène est favorisée. Selon un autre mode de réalisation encore de la présente invention, le peptide provient d'une souche endogène de l'animal et la croissance de ladite souche endogène est favorisée.

Peptides

La présente invention concerne donc des peptides ayant une activité antimicrobienne. De préférence, ces peptides sont isolés de

Ruminococcus gnavus, par exemple une souche Ruminococcus gnavus mutante. A titre indicatif, ces peptides peuvent être isolés à partir de la souche de Ruminococcus gnavus déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F- 75015 Paris) le 19 décembre 2006 sous le numéro CNCM I-3705, c'est-à-dire la souche LEM 9-17.

On entend par "activité antimicrobienne" la capacité à inhiber la croissance ou le développement de bactéries cibles ou la capacité à tuer des bactéries cibles. Les techniques de mesure de l'activité antimicrobienne sont connues de l'homme du métier. L'activité antimicrobienne est mise en évidence dans la présente invention par un test d'activité sur la souche Clostridium perfringens CpA mise en culture sur milieu gélose. L'échantillon contenant l'un des peptides de l'invention est déposé dans des puits formés dans le milieu gélose. L'activité antimicrobienne est mise en évidence lorsqu'est formé un halo d'inhibition autour du puits.

Les séquences peptidiques des peptides RumC1 , RumC2 et RumC3 de Ruminococcus gnavus E1 sont respectivement représentées par les séquences SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 et SEQ ID No. 6. Ces séquences sont respectivement déduites des séquences nucléotidiques des gènes rumC1, rumC2 et rumC3 représentées respectivement par les séquences SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 et SEQ ID No. 9.

L'invention se rapporte également à des fragments de ces peptides RumC1 , RumC2 et RumC3 de Ruminococcus gnavus E1 , ayant une activité antimicrobienne. Le terme "fragment" d'un peptide désigne un peptide comprenant une partie mais pas la totalité du peptide dont il est dérivé. L'invention concerne ainsi les peptides des séquences SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 et SEQ ID No. 3.

Ces fragments conservent leur activité antimicrobienne. L'invention concerne donc les fragments biologiquement actifs. Le terme "fragment biologiquement actif désigne un fragment d'un polypeptide conservant la fonction du polypeptide dont il est dérivé.

L'invention se rapporte également à des peptides ayant une activité antimicrobienne et présentant au moins 80%, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'acides aminés identiques avec l'un quelconque des peptides des séquences SEQ ID No. 1 , 2 ou 3.

Les méthodes de préparation des peptides de séquences SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 et SEQ ID No. 3 sont connues de l'homme du métier.

Les peptides RumC sont sécrétés (ou relargués) par les bactéries dans l'environnement extracellulaire. Il est possible que l'un quelconque des peptides de séquences SEQ ID No. 4, 5 et/ou 6 comprenne un peptide signal d'un nombre déterminé d'acides aminés. Dans ce cas, l'invention concerne également le peptide mature obtenu après clivage du peptide signal. Selon un mode de réalisation de la présente invention, l'invention se rapporte aux peptides dont les séquences sont comprises entre la position 20 et la position 63 des séquences SEQ ID No. 4, 5 et 6.

Dans un autre mode de réalisation, le peptide signal potentiel du peptide SEQ ID No. 4, 5 ou 6 peut être remplacé par un peptide signal hétérologue pour réaliser l'expression et la sécrétion de ce peptide par un organisme hôte hétérologue.

L'invention a aussi pour objet un peptide ayant une activité antimicrobienne et présentant au moins 80 % d'identité avec le peptide de la SEQ ID No. 4, 5 ou 6. Selon un mode de réalisation de la présente invention, ce peptide est isolé à partir d'une souche de Ruminococcus gnavus. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, ce peptide est isolé à partir d'autres souches de Ruminococcus ou d'autres bactéries. Alternativement, ce peptide peut être obtenu par synthèse chimique.

L'invention a pour objet un peptide présentant au moins 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'acides aminés identiques avec l'un quelconque des peptides des séquences SEQ ID No. 4, 5 ou 6.

Par "acides aminés identiques", on entend des acides aminés invariants ou inchangés entre deux séquences. Ces peptides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport aux peptides représentés par les séquences SEQ ID No. 4, 5 ou 6. Sont considérés comme acides aminés inchangés entre deux

séquences des acides aminés modifiés après transcription par exemple déshydratation, formation de ponts monosulfures, lanthionines...

L'invention a également pour objet des peptides présentant au moins 80%, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% de similarité avec l'un quelconque des peptides des séquences SEQ ID No. 4, 5 ou 6.

Par "similarité", on entend la mesure de la ressemblance entre séquences protéiques ou nucléiques. Ces peptides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport aux peptides représentés par les séquences SEQ ID No. 4, 5 ou 6. Le degré de similarité entre deux séquences, quantifié par un score, est basé sur le pourcentage d'identités et/ou de substitutions conservatrices des séquences.

Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre polypeptides sont connues de l'homme du métier. L'alignement des séquences est par exemple réalisé au moyen de Vector NTi 9.1.0, programme d'alignement AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) ou en utilisant l'outil CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

Les peptides selon l'invention peuvent être isolés ou purifiés de leur environnement naturel. Les peptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des bactéries exprimant naturellement ces peptides, la production de peptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ainsi, les peptides des séquences SEQ ID No. 1 à 6 de la présente invention peuvent être isolés à partir de la souche de Ruminococcus gnavus déposée à la CNCM le 19 décembre 2006 sous le numéro CNCM I-3705. Dans un autre mode de réalisation, les peptides de la présente invention sont isolés à partir d'organisme hôtes recombinants exprimant un peptide RumC selon l'invention ou un fragment du peptide RumC présentant une activité antimicrobienne.

L'invention a également pour objet des protéines de fusion, des protéines recombinantes ou des protéines chimères comprenant les peptides selon l'invention.

Les peptides de l'invention peuvent être isolés à partir de contenu caecal de rat monoxénique hébergeant la souche Ruminococus gnavus E1 et à partir d'une souche de Ruminococcus gnavus mutante, plus précisément la

souche de Ruminococcus gnavus déposée à la CNCM le 19 décembre 2006 sous le numéro CNCM I-3705. Ces peptides présentent une activité antimicrobienne, mise en évidence par un test d'activité sur Clostridium perfringens.

La spectrométrie de masse a permis de déterminer la masse moléculaire approximative du peptide RumC selon l'invention. La masse moléculaire se situe entre 4000 et 4600 Da, plus précisément entre 4100 et 4500 Da.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide est adapté à une utilisation en nutrition ou en pharmacie, par exemple une utilisation en nutrition animale.

On entend par "peptide adapté à l'utilisation dans la nutrition ou la pharmacie", un peptide dont les caractéristiques sont telles qu'il convient pour la nutrition ou la pharmacie. Les caractéristiques essentielles à une utilisation en nutrition ou en pharmacie sont notamment le pH auquel le peptide peut résister. En effet, le pH du système digestif des animaux et de l'Homme est acide et il est donc essentiel que le peptide soit résistant à ce pH. Une autre caractéristique essentielle à une utilisation en nutrition est la température à laquelle la substance antimicrobienne est active. En effet, la mise en forme de substance antimicrobienne dans un médicament, un additif nutritionnel ou un aliment pour animaux, par exemple, implique des traitements et une température supérieure à la température ambiante. L'activité des antimicrobiens utilisés doit donc être stable dans les conditions des procédés, notamment les conditions de températures.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide, ou un mélange de peptides selon l'invention, présente une activité antimicrobienne à pH neutre et conserve son activité antimicrobienne à un pH acide, par exemple inférieur à 7, de préférence inférieur à 4,4.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide, ou un mélange de peptides selon l'invention, présente une activité antimicrobienne à 37°C et conserve cette activité à des températures inférieures et supérieures à la température ambiante, par exemple supérieure à 50 ⁰ C.

L'invention concerne également un peptide présentant une activité antimicrobienne, isolé à partir de contenu caecal de rat monoxénique ou à partir d'une souche Ruminococcus gnavus mutante, présentant une

activité contre les souches Clostridium perfringens, ayant une masse moléculaire comprise entre 4000 et 4600 Da telle que déterminée par spectrométrie de masse et étant résistante à un pH inférieur ou égal à 7. Selon un mode de réalisation, le peptide comprend la séquence SEQ ID No.1 et/ou la séquence SEQ ID No.2. Selon un autre mode de réalisation, il comprend en outre le peptide de la séquence SEQ ID No. 3. Avantageusement, le peptide comprend un peptide choisi parmi l'un quelconque des peptides de séquence SEQ ID No. 4, 5 ou 6.

L'invention concerne également un peptide présentant une activité antimicrobienne, susceptible d'être obtenu à partir d'une souche Ruminococcus gnavus mutante, par exemple la souche de Ruminococcus gnavus déposée à la CNCM le 19 décembre 2006 sous le numéro CNCM I- 3705. Selon un mode de réalisation, le peptide présente une activité antimicrobienne à l'égard des souches de Clostridium perfringens. Selon un autre mode de réalisation, il présente une masse moléculaire comprise entre 4000 et 4600 Da telle que déterminée par spectrométrie de masse, préférentiellement comprise entre 4100 et 4500 Da. Selon un autre mode de réalisation, le peptide présente une activité antimicrobienne à pH neutre et conserve son activité antimicrobienne à un pH acide, par exemple inférieur à 7, de préférence inférieur à 4,4. Selon un mode de réalisation, le peptide comprend la séquence SEQ ID No.1 et/ou la séquence SEQ ID No.2. Selon un autre mode de réalisation, il comprend en outre le peptide de la séquence SEQ ID No. 3. Avantageusement, le peptide comprend un peptide choisi parmi l'un quelconque des peptides de séquence SEQ ID No. 4, 5 ou 6.

L'invention concerne également un peptide présentant un potentiel antimicrobien isolé à partir de contenu caecal de rat monoxénique, correspondant au chromatogramme de la figure 4A, obtenu à 214nm par HPLC en phase inverse, présentant une activité contre différentes souches de Clostridium perfringens, en particulier de toxinotype A.

Polynucléotides

L'invention concerne aussi des polynucléotides codant pour une activité antimicrobienne. De préférence, ces polynucléotides codent pour une activité antimicrobienne de Ruminococcus.

Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide" une chaîne nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaîne nucléotidique double brin pouvant être de type ADN complémentaire ou génomique. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les polynucléotides modifiés.

Les polynucléotides de la présente invention peuvent être isolés ou purifiés de leur environnement naturel. Les polynucléotides de la présente invention peuvent également être préparés par synthèse chimique ou par des techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans leur ouvrage intitulé "Molecular cloning: a laboratory manual", édition : CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989.

L'invention se rapporte au polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 7, 8 ou 9. L'invention se rapporte également au polynucléotide qui s'hybride au polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 7, 8 ou 9. L'invention se rapporte également au polynucléotide codant pour un peptide présentant une activité antimicrobinenne tel que ci-dessus défini.

L'invention concerne aussi un polynucléotide présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'identité avec le polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 7, 8 ou 9. Ce polynucléotide code pour une activité antimicrobienne. Selon un mode de réalisation, le polynucléotide code pour une activité antimicrobienne à l'égard des souches Clostridium perfringens.

Par "nucléotides identiques", on entend des nucléotides invariants ou inchangés entre deux séquences. Ce polynucléotide peut présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide de référence.

L'invention concerne aussi un polynucléotide présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% de similarité avec le polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 7, 8 ou 9.

Ce polynucléotide code pour une activité antimicrobienne. Selon un mode de réalisation, le polynucléotide code pour une activité antimicrobienne à l'égard des souches Clostridium perfringens.

Par "similarité", on entend la mesure de la ressemblance entre séquences protéiques ou séquences nucléiques. Ce polynucléotide peut présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide de référence. Le degré de similarité entre deux séquences, quantifié par un score, est basé sur le pourcentage d'identités et/ou de substitution conservatrices des séquences.

Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre les séquences d'acides nucléiques sont connues de l'homme du métier. L'alignement des séquences est par exemple réalisé au moyen de Vector NTi 9.1.0, programme d'alignement AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) ou en utilisant l'outil CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

L'invention concerne aussi des polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective avec le polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 7, 8 ou 9. De préférence, l'hybridation sélective est effectuée dans des conditions de moyenne stringence et préférentiellement dans des conditions de forte stringence. Par "séquence capable de s'hybrider de manière sélective", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont connues de l'homme du métier. En général, la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30 ⁰ C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 6O ⁰ C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant : 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 μg/ml sperme de saumon dénaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon

2X SSC, 0,1 % SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01 % SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1 %SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans leur ouvrage intitulé "Molecular cloning: a laboratory manual", édition : CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989). De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. Dans le cas présent, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective avec le polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 7, 8 ou 9. codent pour une activité anti-microbienne.

L'invention se rapporte de manière générale aux polynucléotides codant pour les peptides selon l'invention. En raison de la dégénérescence du code génétique, différents polynucléotides peuvent coder pour un même polypeptide.

Cassettes d'expression

Selon un mode de réalisation de l'invention, un polynucléotide codant pour un peptide selon l'invention est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour les polypeptides selon l'invention.

Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un peptide par une cellule hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression.

Ces cassettes d'expression comprennent dans le sens de la transcription:

- un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte ;

- un polynucléotide selon l'invention ;

- une séquence terminatrice fonctionnelle dans le même organisme hôte.

Tout type de séquence promotrice peut être utilisée dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène d'intérêt. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles.

Parmi les promoteurs fonctionnels dans les champignons, on citera notamment celui de glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase d'Aspergillus nidulans (Roberts ét al., Current Genêt. 15, 177-180, 1989).

Parmi les promoteurs fonctionnels dans les bactéries, on citera notamment celui de la RNA polymérase du bacteriophage T7 (Studier et al., Methods in enzymology, 185, 60-89, 1990).

Parmi les promoteurs fonctionnels dans les levures, on citera le promoteur du gène GAL1 (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88, 1731-1735, 1991 ) ou les promoteurs GAL4 et ADH de S.cerevisiae. Tous ces promoteurs sont décrits dans la littérature et bien connus de l'homme du métier.

Pour l'expression dans Pénicillium funiculosum, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant un promoteur histone H4B, un promoteur acide aspartyl protéase ou un promoteur csl13 (WO 00/68401 ).

Pour l'expresssion dans la levure Pichia pastoris, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant le promoteur AOX1 inductible par le méthanol (Tschopp et al., Biotechnology, 5, 1305-1308, 1987) ou le promoteur constitutif fort GAP (Waterham et al., Gène 186, 37-44, 1997).

Pour l'expression dans Schizosacchromyces pombe, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant le promoteur de régulation Nmt1 reprimé par la thiamine et actictivé en abscence de thiamine (Maundrell, J. Biol. Chem. 265, 10857-10864, 1989)

Les cassettes d'expression selon la présente invention peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression des polypeptides ou des polynucléotides comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences signal permettant la sécrétion des polypeptides produits par l'organisme hôte. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans la cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer").

En outre, les cassettes d'expression selon la présente invention peuvent inclure toute autre séquence nécessaire à la sécrétion des polypeptides produits par l'organisme hôte telles que des séquences signal.

Pour la sécrétion par Pichia pastoris, on peut par exemple utiliser la séquence du facteur α comme signal de sécrétion.

Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de I ¹ ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée.

Pour l'expression dans Pénicillium funiculosum, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant un terminateur histone H4.B, un terminateur acide aspartyl protease ou un terminateur csl13 (WO 00/68401 ).

La présente invention a également pour objet un polynucléotide comprenant une cassette d'expression selon l'invention, avantageusement les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur.

Vecteurs

La présente invention concerne également des vecteurs de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte comprenant au moins un polynucléotide ou une cassette dépression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment correspondre à un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont connues de l'homme du métier. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte afin d'induire notamment l'expression d'un polynucléotide ou d'un peptide peut être utilisé. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés en fonction de l'organisme hôte à transformer, et en fonction de la technique de transformation mise en œuvre.

Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte en vue de la réplication du vecteur et/ou de l'expression d'un peptide selon l'invention dans l'organisme hôte.

L'invention concerne aussi une méthode pour préparer un peptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes:

- on transforme un organisme hôte avec un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon l'invention et/ou avec un polynucléotide selon l'invention,

- on isole les peptides produits par l'organisme hôte.

Organismes hôtes

La présente invention a également pour objet, un procédé de transformation d'un organisme hôte par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide, d'au moins une cassette d'expression ou d'au moins un vecteur selon l'invention. Le polynucléotide peut être intégré dans le génome de l'organisme hôte ou se répliquer de manière stable dans l'organisme hôte. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont connus de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature.

La présente invention concerne également un organisme hôte transformé avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.

Par "organisme hôte", on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures et les champignons. En particulier, par "organisme hôte", on entend un organisme non humain. De manière avantageuse, les levures sont choisies parmi par exemple Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisae, Yarrowia lipolytica et Schwanniomyces occidentalis. Les champignons sont par exemple choisis parmi les Aspergillus, les Trichoderma et les Pénicilliums, préférentiellement parmi Pénicillium funiculosum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii et Trichoderma koningii. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'organisme hôte est une souche de Pénicillium funiculosum dans laquelle on exprime ou sur-exprime un peptide selon l'invention. Dans un autre mode de réalisation, l'organisme hôte est une souche de Debaryomyces castellii dans laquelle on exprime ou sur-exprime un peptide selon l'invention. Dans un autre mode encore de réalisation, l'organisme hôte est une souche de Ruminococcus gnavus dans laquelle on exprime ou sur-exprime un peptide selon l'invention.

Les techniques de construction de vecteurs, de transformation d'organismes hôtes et d'expression de protéines hétérologues dans ces organismes sont largement décrites dans la littérature notamment par

Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans l'ouvrage intitulé "Molecular cloning: a laboratory manual", édition : CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 ou par Ausubel et al., dans l'ouvrage intitulé "Current Protocols in Molecular Biology", édition : Greene Publishing Associates, Inc., and John Wiley and Sons, NY, 1992.

Souches

La nouvelle souche de Ruminococcus gnavus a été déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) le 19 décembre 2006 sous le numéro CNCM I-3705. La CNCM est une autorité de dépôt internationale selon l'Article 7 du Traité de Budapest.

La nouvelle souche a été obtenue par mutagenèse aléatoire de la souche R. gnavus L14. Cette souche est un mutant spontané de R. gnavus E1 ayant perdu la capacité de produire RumA in vitro mais synthétisant toujours RumC in vivo. Un agent alkylant puissant, le N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine (NG) a été utilisé pour la mutagènese. Aucune modification génétique n'a été obtenue par les techniques de recombinaison utilisant un ADN ou un ARN d'une autre origine.

Le milieu de culture de la souche LEM 9-17 est de préférence est milieu BHI supplémenté en extrait de levure et en hémine (BHI-YH).

Mélange protéique, moût de fermentation

L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un peptide présentant une activité antimicrobienne selon l'invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mise en culture d'une souche de Ruminococcus gnavus ou d'un organisme hôte transformé selon l'invention dans des conditions d'induction de l'expression du peptide, et b) récupération du surnageant de culture comprenant le peptide.

La séparation du peptide à partir du surnageant de culture peut être réalisée par la charge, la taille et/ou le caractère hydrophobe. L'homme du métier connaît les différentes techniques permettant la séparation en fonction de la charge, de la taille et/ou du caractère hydrophobe des différents constituants d'un milieu.

Ce surnageant de culture ou moût de fermentation peut ensuite être concentré ou lyophilisé pour la formulation d'un additif alimentaire ou d'un aliment pour animaux. Le procédé peut comprendre des étapes supplémentaires de purification de la substance antimicrobienne à partir du surnageant de culture.

Si l'organisme hôte ne secrète pas la substance antimicrobienne dans le milieu de culture, une étape supplémentaire de casse des cellules et de purification de l'extrait cellulaire peut être nécessaire.

Les peptides de l'invention peuvent également être obtenus à partir du contenu caecal de rat monoxénique.

Composition

Les compositions selon l'invention comprennent un peptide selon l'invention, un organisme hôte selon l'invention, une souche selon l'invention, un moût de fermentation d'un organisme hôte selon l'invention ou un moût de fermentation d'une souche selon l'invention. Les compositions se présentent sous forme liquide ou sous forme de poudre. Ces compositions comprennent différents ingrédients.

Les compositions liquides peuvent, par exemple, comprendre un autre agent antimicrobien, par exemple de l'acide sorbique ou un sel d'acide sorbique, de l'acide benzoïque ou un sel d'acide benzoïque, de l'acide fumarique ou un sel d'acide fumarique. Les compositions de l'invention peuvent en outre comprendre du sorbitol. Le sorbitol est un agent de stabilisation et de formulation. Les compositions de l'invention peuvent également comprendre des agents anticongelants, par exemple l'éthylène glycol, le glycérol, le propylène glycol et le propane-1 ,2-diol.

Les compositions sous forme de poudre comprennent un support. Ce support peut être choisi parmi la farine de blé, l'amidon, la maltodextrine, le gypsum et les rafles de maïs.

Les compositions selon l'invention présentent une activité antimicrobienne. Elles fournissent des solutions alternatives à l'utilisation d'antibiotiques. Elles peuvent par exemple être utilisées dans l'élevage des animaux ou comme médicament pour l'Homme.

Les compositions de la présente invention comprennent au moins un peptide selon l'invention mais elles peuvent également comprendre d'autres

substances comme des vitamines, des principes actifs autres, des acides aminés ou des sels minéraux.

Les compositions selon l'invention permettent par exemple de prévenir ou traiter l'entérite nécrotique chez les volailles ou chez les porcs et de prévenir ou traiter les maladies gastro-intestinales chez l'Homme.

Les compositions de l'invention sont, par exemple, ajoutées aux aliments pour animaux ou sont par exemple associées à une base nutritionnelle. La présente invention donc concerne aussi les aliments pour animaux comprenant une composition selon l'invention. Ces aliments se présentent habituellement sous la forme de farines ou de granulés dans lesquels sont incorporés les compositions présentant une activité antimicrobienne. La présente invention a également pour objet des aliments pour animaux comprenant un peptide selon l'invention, un organisme hôte selon l'invention ou un moût de fermentation/surnageant de culture d'un organisme hôte selon l'invention.

Par "aliment", on entend tout ce qui peut servir à la nourriture des animaux. Par "base nutritionnelle", on entend tout ce qui constitue l'essentiel de la ration alimentaire de l'animal, constitué à titre d'exemple par un mélange de céréales, de protéines et de matières grasses d'origine animale et/ou végétale. Habituellement, ces bases nutritionnelles comprennent par exemple du maïs, du blé, du pois et du soja. Ces bases nutritionnelles sont adaptées aux besoins des différentes espèces animales auxquelles elles sont destinées. Il peut par exemple s'agir de volailles (poules pondeuses, poulets de chair, dindes et canards) ou de porcs (porcs croissance et finition, porcelets).

Utilisation des peptides

La présente invention concerne également l'utilisation d'un peptide selon l'invention, d'un organisme hôte selon l'invention, d'une souche selon l'invention, d'un moût de fermentation d'un organisme hôte selon l'invention ou d'un moût de fermentation d'une souche selon l'invention pour la fabrication d'un médicament.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un peptide selon l'invention, d'un organisme hôte selon l'invention, d'une souche selon l'invention, d'un moût de fermentation d'un organisme hôte selon l'invention ou d'un moût de fermentation d'une souche selon l'invention comme

additif nutritionnel ou, en association avec d'autres composés, comme aliment pour animaux.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, ce médicament ou cet additif nutritionnel est destiné à prévenir ou traiter l'entérite nécrotique chez les volailles ou chez les porcs.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, ce médicament ou cet additif nutritionnel est destiné à prévenir ou traiter les maladies gastro-intestinales chez l'Homme.

Description des figures

Figure 1 : chromatogramme obtenu par tamisage moléculaire sur Sephadex G- 75 de la fraction soluble contenue dans 10g de contenus caecaux de rats monoxéniques hébergeant la souche R gnavus E1 ; en abscisse, volume d'élution en ml_; en ordonnée, absorption à 280 nm; l'aire hachurée correspond aux fractions actives contre C. perfringens (fractions 325 à 358)

Figure 2A : chromatogramme obtenu par tamisage moléculaire de protéines standard sur Sephadex G-75 ; en abscisse, volume d'élution en ml_; en ordonnée, absorption à 280 nm; a : albumine 67kDa ; b : ovalbumine 43 kDa ; c : chymotrypsine : 25 kDa ; d : ribonucléase A 13,7 kDa Figure 2B : droite étalon log (MM) = f(Ve) obtenue à partir des chromatogrammes de la figure 2A ; en abscisse, volume d'élution en mL; en ordonnée, logarythme de masse moléculaire

Figure 3 : chromatogramme obtenu par HPLC sur une colonne échangeuse de cations de la fraction GF active; en ordonnée, coté gauche, absorption à 214 nm; en ordonnée, côté droit, concentration en NaCI en M; en abscisse, temps en minutes

Figure 4A : chromatogramme obtenu par HPLC en phase inverse de la fraction CM active; en ordonnée, coté gauche, absorption à 214 nm; en ordonnée, côté droit, pourcentage d'acétonitrile éluant; en abscisse, temps en minutes Figure 4B et 4C : spectre de masse des fractions issues de I ¹ HPLC en phase inverse; en abscisse, masse/charge; en ordonnée, intensité du signal

Figure 5 : schéma du protocole de purification de RumC à partir de contenus caecaux de rats monoxéniques hébergeant la souche R. gnavus E1

Figure 6 : chromatogramme obtenu par FPLC sur une résine échangeuse de cations de la fraction SN 9-17 dessalé; en abscisse, temps en minutes; en ordonnée, absorption à 214 nm a : absorption à 214 nm b : concentration en NaCI c : conductivité d : débit en mL/min

Figure 7 : spectres de masse des différentes fractions au cours de la purification de la RumC; en abscisse, masse/charge; en ordonnée, intensité du signal

Figure 7A : SN 9-17

Figure 7B : fraction CM active

Figure 7C : R 10kDa

Figure 8 : spectre de masse de la fraction GF 47-50 ; en abscisse, masse/charge; en ordonnée, intensité du signal

Figure 9 : schéma du protocole de purification de RumC à partir de la souche mutante LEM 9-17

Exemples

Matériel et méthodes

1. Souches bactériennes et milieux de culture

La souche Rυminococcus gnavus E1 , productrice de RumC, a été isolée du microbiote fécal dominant d'un adulte sain (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001 ).

La souche R. gnavus L14 est un mutant spontané de R. gnavus E1 ayant perdu la capacité de produire RumA in vitro mais synthétisant toujours RumC in vivo.

La souche Ruminococcus gnavus déposée à la CNCM le 19 décembre 2006 sous le numéro CNCM I-3705 est issue de la mutagenèse aléatoire de la souche L14, elle est capable de produire RumC in vitro, sur milieu gélose supplémenté en trypsine (500 μg/ml; mais pas en milieu liquide). Il s'agit de la souche LEM 9-17.

La souche utilisée comme cible pour les tests d'activité est la souche

Clostridium perfringens CpA (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-

4118, 2001 ).

Ces quatre souches sont cultivées en anaérobiose, dans une chambre de type

"Fréter" en atmosphère contrôlée (85% N ₂ , 10% H ₂ , 5% CO ₂ ). Elles sont incubées à 37°C dans du milieu BHI supplémenté en extrait de levure et en hémine (BHI-YH).

BHI-YH liquide : 37 g/L de BHI (Brain Heart Infusion, Difco Laboratories)

5 g/L d'extrait de levure (Yeast Extract, Fluka)

5 mg/L d'hémine (Hemin, Sigma) BHI-YH gélose : idem + 15 g/L d'agar (BACTO™ agar, Difco Laboratories)

2. Test d'activité antimicrobienne à partir d'un échantillon liquide Pour effectuer un test d'activité antimicrobienne à partir d'un échantillon liquide, 10 ⁴ à 10 ⁵ cellules de C. perfringens CpA sont étalées sur milieu gélose. Après 30 min à température ambiante, des puits de 6 mm de diamètre sont percés dans la gélose à l'aide d'une pipette pasteur. Les échantillons de volume inférieur à 100 μL sont ensuite déposés dans les puits et les boîtes sont incubées pendant 16 à 24H à 37°C. Si l'échantillon contient une substance antimicrobienne dirigée contre C. perfringens CpA, la croissance des bactéries est inhibée, ce qui entraîne la formation d'un "halo d'inhibition" autour du puits.

Le test d'activité peut également être réalisé en déposant directement 10μl_ de l'échantillon à tester sur la gélose préalablement ensemencée avec C. perfringens.

3. Test d'activité antimicrobienne à partir de colonies se développant en milieu gélose

Après 24H de culture sur milieu gélose supplémenté ou non avec 50μg/ml_ de trypsine, la souche potentiellement productrice d'une substance antimicrobienne est recouverte de milieu gélose "mou" (contenant 7,5 g d'agar/L) contenant la souche cible. Cette gélose molle est préparée en mélangeant extemporanément 5 ml_ de milieu gélose en surfusion avec 5 ml_ de milieu liquide contenant 10 ⁴ à 10 ⁵ cellules de la souche cible. Les boîtes de pétri sont alors à nouveau incubées pendant 16 à 24H à 37°C. Un halo d'inhibition est observé autour des colonies produisant une substance anti-microbienne.

4. Elimination des débris cellulaires et résidus d'alimentation des contenus caecaux

10 g de contenu caecal sont dilués dans 30 mL de PBS (NaCI 137 mM, KCI 2,68 mM, Na ₂ HPO ₄ 8,1 mM, KH ₂ PO ₄ 1 ,47 mM, pH 7,4) puis centrifugés à 10000g et à 4°C pendant 15 min. Le culot contenant les débris cellulaires et les résidus de l'alimentation est éliminé.

5. Unités de filtration par centrifuqation

11 s'agit de membranes filtrantes permettant la séparation des protéines en deux fractions, en fonction de leur masse moléculaire après centrifugation. Ces systèmes peuvent aussi être utilisés pour concentrer ou dessaler des échantillons.

Plusieurs fabricants proposent ce genre de produit. Dans la plupart des cas les membranes sont constituées de cellulose régénérée mais il peut aussi s'agir de polyéthersulfone. Le choix du système se fait en fonction du volume des échantillons à traiter et du seuil de coupure des membranes (Tableau 1 ). Ces unités de filtration ont été utilisées selon les consignes fournies par le fabricant

pour le choix du type de rotor et la vitesse de centrifugation. Toutefois, les temps de centrifugation ont été variables en fonction de la viscosité de l'échantillon.

Tableau 1 : Caractéristiques des unités de filtration utilisées au cours des essais de purification de RumC

* produit de la marque Millipore ; ^** produit de la marque Sartorius

6. Tamisage moléculaire sur SEPHADEX G-75

Le tamisage moléculaire du surnageant de contenu caecal est réalisé sur une colonne de Sephadex G-75 (2,4 x 187 cm). L'échantillon (dont le volume est d'environ 2% du volume de la colonne) est déposé sur la colonne, l'élution étant effectuée à 4°C à un débit de 1 mL/min à l'aide de PBS et 600 fractions de 2 mL sont collectées. Un chromatogramme est obtenu par lecture de l'absorption à 280 nm de chaque fraction.

7. Tamisage moléculaire sur FPLC

Le tamisage moléculaire de la fraction CM active est réalisé sur le système FPLC. L'échantillon est chargé sur une colonne HiLoad 26/60 Superdex 30 pg (GE Healthcare). L'élution est réalisée à un débit de 2,5 mL/min avec du PBS. Le matériel protéique élue est détecté par mesure de la variation d'absorption à

280 nm. Les fractions correspondant à 2 min d'élution sont collectées automatiquement.

8. HPLC sur colonne de CM échanqeuse de cations

L ¹ HPLC échangeuse de cations est réalisée sur une chaîne WATTERS 600S CONTROLLER munie de l'injecteur WATERS 616 PUMP. L'échantillon (0,5 mL) est chargé sur une colonne semi-préparative CM-3SW SPHEROGEL de TSK. L'élution est réalisée à pH5 dans un tampon acétate de sodium 20 mM et à un débit de 0,8 mL/min, en utilisant un gradient de concentration en NaCI de 0 à 1 M. Pendant les 20 premières minutes, l'élution est effectuée en mode isocratique sans NaCI et ensuite par un gradient linéaire de concentration en NaCI de 0 à 0,5 M pendant 30 min. L'élution se poursuit alors pendant 5 min dans des conditions isocratiques, puis un saut jusqu'à une concentration de 1 M en NaCI est réalisé en 1 min, avant de poursuivre pendant 15 min dans des conditions isocratiques et, enfin, de revenir aux conditions initiales. Le matériel protéique élue est détecté par mesure de l'absorption à 280 ou 214 nm à l'aide du WATERS 486 TUNABLE ABSORBANCE DETECTOR. Les fractions sont collectées automatiquement puis dessalées à l'aide des systèmes AMICON® ULTRA PL-5.

9. FPLC sur colonne échanqeuse de cations

Les chromatographies échangeuses de cations sont réalisées sur une chaîne FPLC. L'échantillon est chargé sur une colonne Hi-Prep 16/10 CM FF (GE Healthcare). L'élution est réalisée à pH5 dans un tampon acétate de sodium 20 mM, en utilisant un gradient de concentration en NaCI de 0 à 0,4 M. Pendant 50 minutes, l'élution est effectuée en mode isocratique sans NaCI, à un débit de 2 mL/min. L'élution se poursuit ensuite à un débit de 5 mL/min par un gradient linéaire de concentration en NaCI de 0 à 0,4 M en 40 min. Le matériel protéique élue est détecté par mesure de la variation d'absorption à 280 nm. Des fractions de 1 min sont collectées automatiquement puis dessalées sur Sep-pak®C18 Cartridges.

10. HPLC en phase inverse

L'HPLC en phase inverse est réalisée sur une chaîne Alliance Watters 1690 Séparations Module. L'échantillon (100 μL) préalablement acidifié avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA) est chargé sur une colonne analytique Vydac 218TP52 250x2. L'élution est réalisée à débit constant (0,5 mL/min). Après 10 min d'élution en mode isocratique à 15% d'acétonitrile, un gradient linéaire de 15% à 30 % d'acétonitrile est appliqué en 60 min. Puis un saut à 70% d'acétonitrile est réalisé en 1 min et l'élution est poursuivie pendant 19 min dans des conditions isocratiques, avant de revenir aux conditions initiales. Le matériel protéique élue est détecté par mesure de la variation d'absorption à 214 nm à l'aide du Waters 996 Photodiode Array Detector. Des fractions de 0,5 mL sont collectées automatiquement. L'acétonitrile est évaporé à l'aide d'un Speed Vac Concentrator (Savant).

11. Spectrométrie de masse

Les analyses de spectrométrie de masse ont été réalisées au plateau protéomique Timone (Faculté de pharmacie, Marseille, France). Les spectres de masse de type Maldi ont été obtenus sur un spectromètre ETTAN MALDI-TOF PRO (GE Healthcare,- Uppsala, SUEDE) utilisé en mode linéaire positif avec extraction retardée. Les échantillons sont co-cristallisés avec une solution de 5mg/mL d'acide α-cyano-4-hydroxycinnamique sur la cible du Maldi par la méthode de la goutte sèche. Les spectres sont acquis avec un potentiel d'accélération de 20KV et une puissance laser réglée au niveau minimum permettant d'obtenir un bon signal. La calibration des spectres est obtenue en mode externe par acquisition d'un mélange de peptides standard de masses connues (Pepmix4, Laserbiolabs, Nice, France). Pour certains échantillons difficiles à cristalliser, la co-cristallisation est réalisée à l'aide d'une solution d'acide 2,5 dihydroxy-benzoïque.

12. Séquençage d'Edman

Cette technique est basée sur la réaction d'un groupement aminé terminal libre d'une protéine avec l'isothiocyanate de phényle (C ₆ H ₅ N=C=S). Ce composé cyclique effectue une attaque nucléophile en milieu basique sur le premier résidu acide aminé de la protéine. Le dérivé phénylthiocarbamyl (PTC) du peptide est ensuite clivé par hydrolyse. On obtient l'anilino-thiazolinone (ATZ) du premier acide aminé et la protéine ayant perdu cet acide aminé. L ¹ ATZ- acide aminé est ensuite converti en phénylthiohydantoïne (PTH) acide aminé. Les PTH-acides aminés obtenus successivement sont séparés et identifiés par RP-HPLC en mesurant l'absorption à 280nm et en comparant les temps d'élution.

Le cycle de réaction peut être répété et conduit ainsi à la séquence de la protéine.

13. Mutaqenèse aléatoire

Une culture de 14mL de la souche L14 incubée pendant 24H à 37°C est répartie dans 7 tubes de 2mL puis les tubes sont centrifugés à 5800g pendant 10 min. Les culots cellulaires sont lavés, à deux reprises, avec 2mL de tampon citrate 0,1 M (acide citrique 21 mg/mL, NaOH 8,8mg/mL, pH5,5) puis repris dans du tampon citrate contenant des concentrations croissantes en N-methyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidine (NG), agent mutagène puissant.

Tableau 2 : Volumes des solutions utilisées lors des dessalages sur SEP-PAK

[NG] finale en μg/mL 0 25 50 100 200 400 1000

Les tubes sont ensuite incubés pendant 30 min à 37°C avant d'être centrifugés 10min à 5800g. Le culot est lavé avec du tampon phosphate 0,1 M (KH ₂ PO ₄ 13,6mg/mL, NaOH 2,32mg/mL, pH7) puis repris dans du milieu BHI-YH liquide.

14. Dessalage sur SEP-PAK®C18 Cartridqes (Waters)

Selon les modèles, ces colonnes se présentent sous forme de seringues dans lesquelles la phase est coulée, ou de mini-colonnes fixées au bout d'une seringue. Le débit des tampons est assuré par une pompe péristaltique. Dans un premier temps, la colonne est équilibrée par passage d'H ₂ O puis de CH ₃ CN et enfin d'H ₂ O contenant 0,05% de TFA. L'échantillon préalablement acidifié avec 0,05% de TFA est ensuite déposé. L'élution est réalisée en 3 étapes, par ajouts successifs d'H ₂ O - TFA 0,05%, de CH ₃ CN 40% - TFA 0,05% et de CH ₃ CN - TFA 0,05%.

Trois fractions sont donc collectées : la fraction correspondant aux protéines non retenues par la colonne et aux sels (fraction NR), la fraction contenant les protéines éluées avec 40% de CH ₃ CN (fraction 40% ACN) et la fraction contenant les protéines éluées avec 100% de CH ₃ CN (fraction 100% ACN). Le solvant est évaporé à l'aide d'un Speed Vac Concentrator ou d'un Rotavapor selon le volume.

Le tableau 3 indique les volumes de chaque solution utilisée pour le dessalage de fractions issues de la purification de RumC (cf. Résultats et discussion). Ces volumes dépendent du volume de phase du SEP-PAK.

Tableau 3 : Volumes des solutions utilisées lors de SEP-PAK en fonction des applications

15. Test de résistance à la température

Des parties aliquotes d'une fraction contenant RumC sont chauffées, chacune à une température différente, à l'aide d'un bloc chauffant pendant 5 ou 15 min, puis conservées à 4°C. Elles sont ensuite soumises à un test d'activité antimicrobienne.

16. Test de résistance au pH

Des parties aliquotes d'une fraction contenant RumC sont diluées environ 10 fois dans le tampon désiré. Après 10 min à température ambiante, chaque solution est déposée sur une unité de filtration Vivaspin 500 3kDa puis centrifugée selon les consignes du fabricant. Du tampon est ajouté à la fraction retenue par le Vivaspin 500 puis l'unité de filtration est de nouveau centrifugée. Le volume de chacune des fractions retenues par le Vivaspin 500 3 kDa, c'est- à-dire contenant RumC, est ajusté à l'aide de tampon pour correspondre au volume de départ. Les différentes fractions sont ensuite conservées à 4°C avant d'être soumises à un test d'activité antimicrobienne. Les filtres des Vivaspin 500 3 kDa ne supportent pas des pH supérieurs à 9. Seuls des tampons de pH acide ou neutre ont donc été testés. Leur composition est la suivante : Tampon pH2 : KCI 50 mM - HCI 13mM Tampon pH4,4 : tampon acétate de sodium 0,2 M pH4,4 Tampon pH7 : KH ₂ PO ₄ 50 mM - NaOH 39 mM

Résultats et discussion

1. Purification de RumC à partir de contenus caecaux

Bien que la souche Ruminococcus gnavus E1 soit cultivable, RumC n'est pas produite in vitro dans les conditions de culture testées. Pour purifier RumC, il

faut donc travailler à partir de contenus caecaux de rats monoxéniques hébergeant la souche E1 ou créer une souche mutante de R. gnavus capable de produire RumC in vitro (voir partie 2).

1.1. Dilution du contenu caecal de rat monoxénique

La première étape a consisté à diluer le contenu caecal dans du PBS.

1.2. Elimination des débris cellulaires

Au cours de la seconde étape de purification les bactéries, les débris cellulaires et les résidus alimentaires sont éliminés par centrifugation du contenu caecal.

1.3. Concentration

La solution est ensuite concentrée sur système AMICON® ULTRA-15 PL-5 avant d'être déposée sur une colonne de tamisage moléculaire.

1.4. Test d'activité antimicrobienne

Toutes les fractions obtenues ont été testées sur la souche C. perfringens CpA, ce qui a confirmé la présence d'une substance anti-C. perfringens dans les contenus caecaux de rats monoxéniques.

Un contrôle négatif a été réalisé avec des contenus caecaux de rats axéniques (sans germe). Aucune activité anti-C. perfringens n'a été détectée. La substance anti-C. perfringens présente dans les contenus caecaux de rats monoxéniques est donc bien spécifique de R. gnavus E1.

Par la suite, chaque essai de purification a été suivi par des tests d'activité anti- C. perfringens. Dans un premier temps, seule la présence ou l'absence de l'activité était recherchée en s'assurant que les résultats négatifs n'étaient pas liés au seuil de sensibilité de la technique. Des tests quantitatifs ont été réalisés dans un deuxième temps, lorsque le protocole définitif a été mis au point.

1.5. Tamisage moléculaire sur une colonne de SEPHADEX G-75

Un tamisage moléculaire a été réalisé sur une colonne de SEPHADEX G-75 (2,4 x 187 cm). L'élution a été suivie par lecture de l'absorption à 280 nm de chacune des 600 fractions de 2 ml_ collectées.

Des tests d'activité antimicrobienne ont été réalisés sur les fractions préalablement concentrées à l'aide de MICROCON® YM-3.

Les fractions 325 à 358 se sont avérées actives contre C. perfringens et ont été regroupées pour former la nouvelle fraction GF active (aire hachurée de la figure 1 ).

Un contrôle réalisé avec des contenus caecaux de rats axéniques a conduit à un profil d'élution comparable à celui obtenu avec les contenus caecaux de rats monoxéniques, mais aucune activité anti-C. perfringens n'a pu être détectée.

1.6. Evaluation de la taille de RumC

Afin d'évaluer la taille de RumC présente dans la fraction GF active, des protéines standards de masses moléculaires connues ont été déposées sur la même colonne de Sephadex G-75 et les volumes d'élution respectifs ont été mesurés (figure 2A). Une droite étalon définissant la proportionnalité entre le logarithme de la masse moléculaire (log (MM)) d'une substance et son volume d'élution (Ve) a alors été tracée (figure 2B). Avec un volume d'élution moyen de 683 ml_, la substance antimicrobienne n'est pas comprise dans la gamme des protéines standards choisies, mais en extrapolant, sa masse moléculaire a pu être évaluée approximativement à 5200 Da.

1.7. Chromatographie sur résine échangeuse de cations

A partir de la fraction GF active, une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de carboxyméthyl (CM) - SPHEROGEL™ a été envisagée à l'aide d'un système HPLC. L'élution a été faite par un gradient de concentration en NaCI, à pH5 et suivie à 214 nm (figure 3).

L'activité est retrouvée entre les minutes 32 et 38 (fraction CM active), ce qui correspond à une concentration en NaCI de 0,2 à 0,3M. Cette technique a

permis d'éliminer des contaminants dans la fraction non retenue, notamment tous les pigments jaunes.

L'analyse par spectrométrie de masse de la fraction CM active montre qu'elle contient un peptide unique d'environ 4200 Da (résultat non montré).

Cette fraction a été soumise à un séquençage N-terminal. Les onze premiers acides aminés ont ainsi pu être déterminés : AGVIX(N/S)GTXAV (SEQ ID No.

10). Cette séquence ne présente aucune homologie forte avec des protéines connues.

Le séquençage a également mis en évidence deux séquences minoritaires.

1.8. Chromatographie en phase inverse par HPLC Différents pics d'absorption à 214 nm ont été obtenus.

L'activité a été mise en évidence dans les 2 fractions désignées par a (ou "double pic") et b (ou "pic isolé") (Figure 4A). L'analyse par spectrométrie de masse de ces 2 fractions a révélé la présence de 3 peptides majoritaires dont les masses moléculaires respectives sont comprises entre 4230 et 4460 Da (Figure 4B et 4C).

La purification de RumC à partir de contenus caecaux a été une nouvelle fois réalisée en utilisant les 3 chromatographies mises au point, c'est-à-dire tamisage moléculaire, échangeuse de cations et phase inverse. Les profils d'élution obtenus sont comparables à ceux des premiers essais de mise au point. La méthode de purification de RumC est donc reproductible et peut être ainsi adoptée.

Le schéma récapitulatif de la purification de RumC à partir de contenus caecaux est représenté Figure 5.

1.9. Rendements et facteurs de purification

Par convention, on définit le nombre d'unités arbitraires d'activité (UAA) présentes dans une solution comme étant l'inverse de la dernière dilution active. Un test d'activité anti-C. perfringens a donc été réalisé sur des dilutions en cascade (de 2 en 2) de chaque fraction active issue de la purification.

Le facteur de purification est obtenu en comparant les activités spécifiques, exprimées en UAA / mg de protéines, de chaque fraction. Une estimation de la quantité de protéines dans les différentes fractions a été déduite de la mesure de leur absorption à 280 nm en utilisant un coefficient d'extinction massique

E°' ^1% de 1 ,8.

Le Tableau 4 donne les rendements en activité et les facteurs de purification des étapes du protocole de purification de RumC à partir des contenus caecaux de rats monoxéniques.

Tableau 4 : Rendements en activité et facteurs de purification lors de la préparation de RumC "in vivo" à partir de 10g de contenus caecaux de rats monoxéniques

nd = non déterminé V : volume total de la fraction en mL

A. anti-CpA : activité anti-C. perfringens c'est-à-dire nombre total d'unités d'activité contenues dans la fraction niprotéines : masse de protéines dans la fraction exprimée en mg AS : activité anti-C. perfringens spécifique en UAA/mg AS = A. anti-CpA / mprotéines

Rdt : rendement en activité de la purification

Rdt = 100 X A. anti-CpA Fraction étudiée / A. anti-CpA Homogénat

F purif : facteur de purification

F purif = AS Fraction étudiée / AS SN

1.10. Détermination de la séquence peptidique

Bien que les masses moléculaires des produits présents dans les fractions

"double pic" et "pic isolé" soient différentes, le séquençage selon Edman a permis d'établir une seule séquence N-terminale majoritaire : AGXIXSGSVAV

(SEQ ID No. 3).

Dans les 2 fractions concernées, une séquence minoritaire de 17 résidus a également été mise en évidence : AGPAYXVGYXGNNGAVT(SEQ ID NO. 2).

2. Création d'une souche mutante par mutagenèse aléatoire

La technique retenue a été une mutagenèse aléatoire de la souche R. gnavus

L14. Cette souche est un mutant spontané de R. gnavus E1 ayant perdu la capacité de produire RumA in vitro mais synthétisant toujours RumC in vivo.

Cette souche a été exposée à un agent alkylant puissant, le N-méthyl-N'-nitro-

N-nitrosoguanidine (NG). _ - _ _

Les parties aliquotes d'une même culture de la souche L14 ont ainsi été exposées à des concentrations en NG croissantes (0 à 1000 μg/mL). Après traitement, les différentes suspensions cellulaires ont été diluées puis étalées sur boîtes de pétri. Le dénombrement des colonies après culture a permis d'estimer la concentration des cellules vivantes dans les différentes suspensions.

Par comparaison avec la concentration du témoin (tube 1 , sans traitement NG), un taux de mortalité a pu être déterminé pour chaque traitement. Il semble que le traitement avec la NG ait été efficace : les taux de mortalité sont compris entre 50 et 99% et augmentent avec la concentration.

Afin de rechercher le ou les mutants d'intérêt, près de 860 colonies sélectionnées au hasard parmi les clones ayant survécu aux différents

traitements, ont été repiquées sur milieu gélose supplémenté en trypsine puis soumises à un test d'activité anti-C. perfringens.

Quatre-vingt trois clones se sont révélés potentiellement producteurs d'une substance anti-C. perfringens sur milieu gélose en présence de trypsine. Parmi eux, 20 ont été sélectionnés pour une caractérisation plus poussée.

Dans un premier temps, il a été vérifié que les mutations affectant les clones n'avaient pas restauré l'organisation chromosomique au niveau de rumA, par le biais d'une PCR.

Les 20 clones sélectionnés ont ensuite subi des tests d'activité ar\i\-Clostridium perfringens sur milieu gélose et en milieu liquide, en présence ou en l'absence de trypsine.

Sur milieu gélose supplémenté en trypsine, un halo d'inhibition est présent autour de 7 des 20 clones testés.

Par contre, sur milieu gélose sans trypsine, aucun clone ne produit de substance anti-C. perfringens : la trypsine est donc toujours indispensable à la synthèse de la bactériocine.

Aucune substance anti-C. perfringens n'est produite par les clones cultivés en milieu liquide, même en présence de trypsine.

3. Purification à partir de la souche mutante.

Des essais de production et de purification ont été réalisés sur un des 7 clones producteurs : le mutant 9-17.

Les essais ont été réalisés sur gélose molle avec des concentrations variables en cellules et en trypsine. Après culture du mutant, la gélose a été broyée puis centrifugée pour récupérer un surnageant (SN 9-17). Ce surnageant a alors été testé contre C. perfringens et s'est avéré actif. Une analyse par spectrométrie de masse a été réalisée sur ce surnageant actif (Figure 7A).

3.1. Chromatographie sur résine échangeuse de cations à l'aide du système FPLC

Avant de réaliser la chromatographie échangeuse d'ions, il faut dessaler l'échantillon.

Les premiers essais ont montré qu'un dessalage du SN 9-17 sur AMICON n'était pas suffisant. Un dessalage de l'échantillon sur SEP-PAK est donc à envisager comme étape préliminaire de purification.

L'élution des protéines du SEP-PAK est réalisée avec une solution d'acétonitrile à 40 %. Après évaporation de l'acétonitrile au rotavapor, la solution est équilibrée à pH5 en la diluant dans du tampon acétate de sodium 20 mM - pH5. A partir de 65 ml_ de SN 9-17, on obtient 50 ml_ de SN 9-17 dessalé équilibré à pH5 qui sont chargés sur une colonne de carboxyméthyl- Sepharose, échangeuse de cations.

Le gradient de concentration de 0 à 0,4 M en NaCI a été effectué en 40 minutes. L'activité anti-C. perfringens est détectée dans les fractions éluées avec 0,2 à 0,3 M en NaCI, bien que très peu de matériel protéique ne soit présent dans ces fractions si l'on se réfère à la variation d'absorption à 280 nm (Figure 6). Ceci avait déjà été observé lors de la purification de RumC à partir de contenus caecaux. Les fractions actives ont été regroupées puis dessalées et concentrées sur SEP-PAK. L'analyse par spectrométrie de masse de cette fraction ("fraction CM active") confirme le gain de purification important apporté par la chromatographie échangeuse de cations et montre que les contaminants ont tous une masse moléculaire inférieure à 2500 Da (Figure 7B).

3.2. Tamisage moléculaire de la fraction CM

Le tamisage moléculaire de la fraction CM active a été réalisé grâce au système FPLC sur une colonne permettant la séparation de peptides de masse inférieure à 10 kDa. L'élution est suivie par lecture de la variation d'absorption à 280 nm, la quantité de matériel protéique est faible et la séparation s'avère peu satisfaisante (non montré). L'activité anti-C. perfringens a tout de même été testée dans les fractions collectées. Seule 5% de l'activité chargée est retrouvée après le tamisage. Cette technique n'a donc pas été retenue pour la purification. En revanche, la fraction active ("GF 47-50") a été analysée par

spectrométrie de masse et s'est révélée quasi-pure avec un peptide de 4235 Da (Figure 8).

3.3. Filtration de la fraction CM

Une autre tentative pour éliminer les contaminants de la fraction CM active a été entreprise à l'aide d'unités de filtration. Comme RumC est retenue par les filtres de 5 kDa (malgré une masse moléculaire légèrement inférieure), un premier essai a été réalisé avec une unité de filtration VIVASPIN 500 dont le seuil de coupure est 5 kDa. Malheureusement, les impuretés sont elles aussi retenues par le filtre bien que leurs masses moléculaires soient inférieures à 2,5 kDa. En effet, l'analyse par spectrométrie de masse ne révèle aucun gain de purification (résultats non montrés). Un deuxième essai a donc été tenté avec une unité de filtration MICROCON dont le seuil de coupure est 10 kDa. En effet, malgré sa masse moléculaire, on a observé précédemment que RumC pouvait être retenue par des filtres de 10 kDa ("fraction R 1OkDa"). L'analyse par spectrométrie de masse confirme les résultats antérieurs et permet de montrer qu'une grande partie des contaminants est éliminée dans la fraction non retenue (Figure 7C).

3.4. Chromatographie en phase inverse sur système HPLC de la fraction R 1OkDa

La fraction R 10 kDa contenant les 3 pics RumC (4235 Da, 4324 Da et 4456 Da) a ensuite été soumise a une HPLC en phase inverse. Les conditions de débit et de gradient sont identiques à celles mises au point pour la purification de RumC à partir de contenus caecaux, le résultat obtenu est comparable : 2 fractions différentes sont actives contre C. perfringens, une fraction "double pic" et une fraction "pic isolé".

3.5. Rendements et facteurs de purification

Pour évaluer le protocole de purification, des tests d'activité quantitatifs ont été réalisés en utilisant des dilutions en cascade de 2 en 2 de chaque fraction

active. Le nombre d'unités arbitraires d'activité (UAA) contenues dans chaque fraction a ensuite été calculé et le rendement de la purification a été déduit (Tableau 5). On observe une perte importante de la substance active au cours des étapes de dessalage du surnageant de culture, de la chromatographie échangeuse de cations suivie d'un autre dessalage. Il est vraisemblable que la perte ait eu lieu au cours de la chromatographie échangeuse de cations mais cela ne remet pas en cause la validité du protocole.

Tableau 5 : Rendements de la purification de RumC à partir du surnageant de culture du mutant 9-17.

V : volume total de la fraction en mL

A. anti-CpA (activité anti-C. perfringens) ; nombre total d'unités d'activité contenues dans la fraction en UAA.

Rendement = 100 x A. anti-CpA Fraction étudiée / A. anti-CpA _S N9-i7 ; exprimé en %.

Un autre critère important pour évaluer un protocole de purification est la mise en évidence du gain de purification apporté par chaque étape. Le facteur de purification est déterminé en comparant les activités spécifiques (UAA / mg de protéines) à chaque étape, mais pour cela il faut mesurer la masse de protéines contenu dans chaque fraction. Le suivi de purification a été réalisé par spectrométrie de masse en raison de la sensibilité de cette méthode permettant de ne pas "consommer" trop de matériel biologique. Bien que cette méthode ne soit pas quantitative, le gain de purification a été mis en évidence de manière très nette.

3.6. Spectrométrie de masse

Les fractions "double pic" et "pic isolé" ont été analysées par spectrométrie de masse. Les résultats obtenus sont identiques à ceux obtenus avec les fractions issues de la purification à partir de contenus caecaux : la fraction "double pic contient les peptides de 4324 Da et 4456 Da alors que la fraction "pic isolé" contient le peptide de 4235 Da.

3.7. Séquençage

Ces fractions ont donc été séquencées.

Pour la fraction "pic isolé", la séquence obtenue est identique à la séquence déjà déterminée : AGXIXSGSVAV (SEQ ID No. 3). Une séquence minoritaire apparaît au 5 ^ème cycle : AGPAY (SEQ ID No. 11 ).

En ce qui concerne la fraction "double pic", on note de légères différences :

AGXVXSGSJAV (SEQ ID No. 12). La séquence minoritaire est identique :

AGPAY (SEQ ID NO. 11 ).

Le schéma récapitulatif pour la purification de RumC à partir de la souche mutante est représenté à la figure 9.

L'obtention de RumC purifié est grandement simplifiée.

4. Caractérisation des peptides RumC

4.1. Activité antimicrobienne à l'égard de différentes souches L'activité antimicrobienne de RumC a été testée contre différentes souches pathogènes à Gram + et à Gram -, en utilisant dans un premier temps du surnageant concentré de contenu caecal de rat monoxénique pour la souche R. gnavus E1 (SN CCE1 ). D'autres tests ont ensuite été réalisés avec les 2 fractions purifiées contre les souches sensibles au SN CCE1. Les résultats sont présentés dans le tableau 6.

Tableau 6 : Résultats des tests d'activité de RumC contre différentes souches pathogènes

Activité antimicrobienne

Toutes les souches Clostridium perfringens testées sont sensibles au peptide RumC.

4.2. Pouvoir antimicrobien contre C. perfringens

Le pouvoir antimicrobien de RumC a également été évalué en estimant la concentration minimale inhibitrice de chaque fraction purifiée RumC "in vivo" et en la comparant avec celle du métro nidazo le, antibiotique de référence utilisé contre C. perfringens.

Pour cela, des dilutions en cascade de 2 en 2 des fractions "double pic" et "pic isolé" ont été préparées (jusqu'à la dilution 1/512). Des tests d'activité anti-C. perfringens ont été réalisés à partir de ces différentes dilutions ainsi que de solutions de métronidazole à différentes concentrations (résultats non montrés).

D'après ce test, la concentration minimale inhibitrice du métronidazole est de

25 μg/mL. Ce résultat est en accord avec les résultats obtenus précédemment par Dabard et al. (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118,

2001 ).

En ce qui concerne les fractions "double pic" et "pic isolé", seules les solutions concentrées (dilution 1 ) sont actives. Bien que la concentration de ces solutions ne soit pas connue avec précision, elle peut être estimée, grâce au séquençage d'Edman, à environ 40 μg/mL.

Le pouvoir antimicrobien de RumC contre C. perfringens semble donc comparable à celui du métronidazole.

4.3. Résistance à la température

Les premiers essais préliminaires de résistance de RumC à la chaleur ont été réalisés en incubant une même quantité de peptide pendant 15 min à différentes températures. Pour les 2 fractions de RumC "in vivo" ("double pic" et "pic isolé"), un traitement de 15 min à 75°C n'a aucun effet sur l'activité. Par contre à 100 ⁰ C, le peptide est entièrement inactivé en 15 min.

Ces essais ont été complétés à l'aide d'échantillons de RumC purifiés à partir de surnageant de culture de la souche 9-17. Le temps d'incubation aux différentes températures a été de 5 min. Le temps d'incubation à 100 ⁰ C a été de 15 min.

La première température testée a été 80 ⁰ C. Le premier test a été effectué avec la fraction CM active, fraction pré-purifiée contenant les 3 peptides.

Contrairement aux fractions "double pic" et "pic isolé", la fraction CM active résiste à un traitement de 15 min à 100 ⁰ C.

La fraction GF47-50 a ensuite été testée. Cette fraction pure contenant uniquement le peptide de 4235 Da est sensible au traitement de 15 min à

100 ⁰ C. Elle est en outre sensible à un traitement de 5 min à 90 ⁰ C (Tableau 7).

Tableau 7 : Tableau récapitulatif des tests de résistance à la température.

R = résistant ; s = sensible ; / = non testé

4.4. Résistance au pH

La résistance au pH des peptides présents dans la fraction CM active a également été testée à pH 2, pH 4,4 et pH 7.

L'activité observée à pH 2 est comparable à celle observée à pH7. Après incubation de 24H à 4°C, aucune perte d'activité n'est observée à pH2.

Les peptides de la présente invention sont donc résistants au pH acide et conviennent notamment à la nutrition animale ou au domaine des médicaments.