"S-Nitroso-und S-Nitro-N-Acyl-L-Cystein-Ester-Derivate als pharmakologische Wirkstoffe und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel" Die Erfindung betriffl neue S-Nitroso-und S-Nitro-N-Acyl-L-Cystein-Ester-Derivate (SNACE-Derivate) als pharmakologische Wirkstoffe und Arzneimittel-insbesondere zur transdermalen Applikationen-, die ein SNACE-Derivat enthalten, zur Prophylaxe und Behandlung einer Reihe von Krankheiten, einschließlich peripherer Verschlußkrankheiten, des Myokardinfarktes, der Angina pectoris, des ischämischen Schlaganfalls, arteriosklerotischer Gefaßveränderungen, der Thrombose (Hemmung der Plattchenaggregation), der Homocysteinämie, sowie der Impotentia coeundi, der Miktionsstörung, des Asthma bronchiale, der Hypertonie, der pulmonalen Hypertonie, der diabetischen Nephropathie, der Mukoviszidose, von Krebs und der Alzheimer-Krankheit.

Eine Vielzahl von Vasodilatatoren sind bekannt, die zur Behandlung von hypertensiven Zuständen, der Angina pectoris, der Impotentia coeundi, der Thrombose und von anderen Krankheiten verwendet werden können. Diese Arzneimittel können nach dem Mechanismus ihrer primären Wirkung in verschiedenen Kategorien eingeteilt werden. Drei wichtige Gruppen dieser Arzneimittel sind die Inhibitoren des Angiotensin Converting Enzyme (ACE), die organischen Nitrate und Stickstoffmonoxid (NO)-Donoren. Während weder ACE-Inhibitoren noch die organischen Nitrate wie z. B. Glyceroltrinitrat (GTN) klinisch bedeutsame antiaggregatorische Wirkstoffe sind, können einige NO-Donoren einschließlich der S-Nitroso- Substanzen (RSNO) sowohl antihypertensiv als auch antiaggregatorisch wirken. Im Gegensatz zu den organischen Nitraten, welche ihre Wirkung erst nach ihrer Metabolisierung in den Zellen zu aktiven Intermediaten entfalten, wirken S-Nitroso- Verbindungen ohne vorherige enzymatische Aktivierung entweder direkt oder nach Freisetzung von NO. Ignarro et al. (Biochem. Biophys. Acta, 631 (1980) 221-231) haben gezeigt, daß die S-Nitroso-Verbindungen von Cystein, Glutathion, Penicillamin und Dithiothreitol in der Lage sind, die lösliche Guanylat-Cyclase (sGC) direkt zu aktivieren. Möglicherweise beruht die Wirkung von organischen Nitraten, von Natriumnitrit und Nitroprussidnatrium auf der Aktivierung der sGC nach intermediärer Bildung von S-Nitroso- Substanzen aus diesen Substanzen und den Thiolen der Zellen. Die Abhangigkeit der Wirkung von organischen Nitraten von ihrem Metabolismus und dem Thiol-Status einer Zelle könnte die Toleranzentwicklung gegen organische Nitrate erklären. Es wurde gezeigt, daß S-Nitroso- Substanzen wie z. B. S-Nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) in vivo am Tier keine Toleranzentwicklung zeigen (Shaffer JE et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 260 (1992) 286- 293). Es ist dokumentiert, daß S-Nitroso-Substanzen wie z. B. S-Nitrosoglutathion in vitro und in vivo am Menschen antihypertensive and antiaggregatorische Wirkungen haben (De Belder et al., Cardiovasc. Res., 28 (1994) 691-694). Für S-Nitrosoglutathion wurde sogar gezeigt, daß seine antiaggregatorische Komponente sehr viel stärker ausgeprägt ist als die antihypertensive (De Belder et al., Cardiovasc. Res., 28 (1994) 691-694). Für S-Nitrosoglutathion wurde auch gezeigt, daß es am Menschen die Embolierate reduziert (Molloy et al., Circulation, 98 (1998) 1372-1375) und daß diese Wirkung über die von Acetylsalicylsaure und Heparin hinausgeht.

Die Mechanismen der antiaggregatorischen Wirkung von S-Nitroso-Substanzen sind bis heute noch nicht vollständig geklärt. Neben dem cGMP-abhangigen Mechanismus werden verschiedene cGMP-unabhängige Mechanismen diskutiert, die auf der Beeinflussung von Enzymaktivitäten bzw. Rezeptoren durch S-Nitroso-Substanzen basieren. Es wurde beispielsweise gezeigt, daß verschiedene S-Nitroso-Substanzen und NO die Enzyme Glyceraldehyd-3-Phosphate-Dehydrogenase (Padgett und Whorton, Am. J. Physiol. 269 (Cell Physiol. 38), (1995) C739-C749), Phosphodiesterase (Maurice und Haslam RJ, Molecular Pharmacol., 37 (1990) 671-681) und Cyclooxygenase hemmen (Tsikas D et al., FEBS Lett., 442 (1999) 162-166).

Die Verwendung von S-Nitroso-Derivaten von ACE-Inhibitoren und Cystein zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten wurde von Loscalzo J und Cooke J (US Patent 5,025,001, 1991) sowie Stamler JS und Loscalzo J (International Application Number PCT/US92/03008) beschrieben.

Zur Zeit sind keine S-Nitroso-und S-Nitro-Substanzen als Medikamente zugelassen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, SNACE-Derivate als Arzneistoffe bzw. pharmakologische Wirkstoffe zur Verfugung zu stellen. Die erfindungsgemäßen SNACE- Derivate eignen sich insbesondere für Arzneimittel zur transdermalen Applikation, da sie durch die Haut resorbiert, und nach Resorption entweder selbst oder als Metabolite (z. B. von Hydrolasen, Deacylasen) direkt oder indirekt als"Pro-Drug"ihre Wirkung entfalten.

Gegenstand der Erfindung sind somit S-Nitroso-und S-Nitro-N-Acyl-L-Cystein-Ester- Derivate der allgemeinen Formel I : in der n = 1 oder n = 2 ist, x = 0,1 oder 2 ist, RI ein Alkylrest (C1-22) ist und R2 ein Acylrest (C2-22) oder O-Acetylsalicylrest oder ein Alkylrest (C1-22) ist, als pharmakologische Wirkstoffe. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Bevorzugt sind die S-Nitroso- (d. h. n = 1 und x = 0) und S-Nitro-Gruppen (d. h. n = 2 und x =<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 0).

Bevorzugt sind Alkyl-und Acylreste mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen.

Beispiele für Alkylreste sind die Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, und tert.-Butylgruppe.

Beispiele für Acylreste sind die Acetyl-, Priopionyl-, und tert.-Butyryl-und O-Acetylsalicyl- Gruppe.

Die besonders bevorzugten Alkyl-und Acylreste sind die Ethyl-, Acetyl-und O- Acetylsalicylgruppe wegen der Ungiftigkeit ihrer Abspaltprodukte Ethanol, Essigsäure und O- Acetylsalicylsäure oder Salicylsäure.

Die pharmakologisch wirksame Gruppe der Verbindungen der allgemeinen Formel I ist die S- Nitroso-Gruppe (-S-N=O) bzw. S-Nitro-Gruppe (S-NO2). Die Alkyl-und Acyl-Reste und die Substituenten am Schwefel der Verbindungen der allgemeinen Formel I beeinflussen in erster Linie die physikochemischen Eigenschaften, z. B. die Penetrationsrate in der Haut, und weniger ihre pharmakologische Aktivität.

Die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I und II erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Veresterung der Carboxylgruppe von Cystein und N-Acylierung bzw. N-Alkylierung der Aminogruppe von Cystein. Ester werden z. B. durch Verwendung von 3 M HCI in den entsprechenden wasserfreien Alkoholen hergestellt. N-Acyl-Derivate werden z. B. durch Verwendung von Anhydriden der entsprechenden Carbonsäuren hergestellt. N Alkyl-Derivate werden z. B. durch Verwendung von Alkylhalogeniden hergestellt. Die Verbindungen der allgemeinen Formel II sind die Vorstufen der entsprechenden Verbindungen mit der allgemeinen Formel 1. Die Nitrosylierung der Thiolgruppe von Cystein-Derivaten der allgemeinen Formel II erfolgt in Salzsäure-saurer Lösung durch stöchiometrische Mengen von Natriumnitrit (Tsikas et al., Anal. Biochem. 244 (1997) 208-220). Die Nitrierung der Thiolgruppe von Verbindungen der allgemeinen Formel II erfolgt z. B. durch Verwendung von Nitroniumtetrafluoroborat (Balazy et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 32009-32015).

Alternativ erfolgt die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Forme) 1 (n = I oder 2 und x = 0) durch S-Transnitrosylierung bzw. S-Transnitrierung der Thiolgruppe der entsprechenden Cystein-Derivate der allgemeinen Formel 11 mit Hilfe von z. B. S- Nitrosoglutathion bzw. S-Nitroglutathion (Tsikas et al., Anal. Biochem. 270 (1999) 231-241).

Diese Methode kann auch für die in situ-Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I im Arzneimittel angewendet werden. Die SNACE-Derivate mit x = 1 und x = 2 werden aus den entsprechenden Derivaten mit x = 0 durch Oxidation z. B. Wasserstoffperoxid hergestellt.

Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel I können zur Pravention der Arteriosklerose, zur Behandlung der Hypertonie und pulmonalen Hypertonie, zur Prävention und Behandlung von Durchblutungsstörungen, z. B. des Hirns, Herzens und der Extremitäten, zur Hemmung der Plättchenaggregation (Thrombozyten-Aggregation), zur Behandlung der Impotentia coeundi und zur Behandlung von Asthma bronchiale, zur Behandlung der Cystischen Fibrose (Mukoviszidose) und von Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen sowie von Krebs, Homocysteinämie und zur Lipidsenkung verwendet werden. Typische Beispiele für Störungen der Hirndurchblutung sind transitorische zerebrale Ischämie, Hörsturz, Schwindelzustände auf der Basis von Durchblutungsstörungen und ischämischer Schlaganfall. Typische Beispiele für Störungen der Herzdurchblutung sind Angina pectoris und Herzinfarkt. Typische Beispiele für Störungen der Durchblutung der Extremitäten sind periphere arterielle Durchblutungsstörungen bei Arteriosklerose, M. Burgers und M. Raynaud sowie Raynaud- Syndrom.

Neben der transkutanen kommen für die Verbindungen der allgemeinen Formel I auch die orale, rektale, intravenöse oder intraarterielle sowie die inhalative Applikationen jeweils auch in Liposomen, Mikroemulsionen und Mikrokapseln in Betracht.

Die Herstellung von Arzneimitteln erfolgt nach üblichen Methoden. Zur Herstellung von Arzneimitteln zur transkutanen Applikation können die Verbindungen der allgemeinen Formel I in der Abwesenheit oder Anwesenheit der entsprechenden Verbindungen der allgemeinen Formel II in einer Gelgrundlage, Salbengrundlage bzw. flüssigen Grundlage ohne oder mit verschiedenen Lösungsvermittlern, Penetrationsbeschleunigern sowie Stabilisatoren eingebracht werden. Als primäre Packmittel werden Sprays, Tuben, Ampullen sowie Einzelportionen verwendet. Nach dem Auftragen auf die Haut oder mit zusätzlichem Okklusionsverband wird der Wirkstoff resorbiert.

Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel I können gegebenenfalls auch mit Stabilisatoren sowie Lösungsvermittlern auf ein Pflaster aufgebracht und appliziert werden.

BEISPIEL 1 A. Herstellung of S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester I. Herstellung der Vorstufe N-Acetelcysteinethylester (NACET).

L-Cysteineethylester-hydrochlorid (9.2 g, 50 mmol) wird in Methylenchlorid (100 ml) suspendiert. Die Suspension wird mit gesättigter NaHCO3 (25 ml) und mit 2 M NaOH (20 ml) alkalisiert. Nach der Phasentrennung wird die organische Phase dekantiert und die verbleibende wäßrige Phase mit Methylenchlorid (30 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden kombiniert, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und filtriert. Die klare Lösung wird mit Essigsäureanhydrid versetzt (insgesamt : 4 g, 39.2 mmol) bis zur Vollständigkeit (kontrolliert mit Dünnschichtchromatographie : Silica, Diethylether : Methanol, 9/1, v/v, unter Verwendung von Cerammoniumnitrat zur Detektion). Das Lösungsmittel wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand auf Silica mit Diethylether zur Elution chromatographiert. Alle Operationen werden bei Raumtemperatur unter einer Argon-Atmosphäre durchgeführt. Weisse Kristalle (6.2 g, Schmelzpunkt : 44.1-44. 5 °C) werden erhalten. Die Verbindung wird mittels Massenspektrometrie, 1H-NMR, IR und Polarimetrie als N-Acetylcysteineethylester identifiziert 191).MG II. Herstellung von S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester (SNACET).

Es wird ein Gemisch aus N-Acetylcysteinethylester (9.55 mg, 50 pmol) und Natriumnitrit (3.45 mg, 50 pmol) in deoxygeniertem, distilliertem, eiskaltem Wasser hergestellt. Diese Lösung wird mit einer deoxygenierten, eiskalten 5 M HCl-Lösung (12 µl, 60 pmol) versetzt.

Unmittelbar nach der Ansäuerung wird die Lösung rot. Die entstandene Substanz wurde mittels MS, 1H-NMR, IR und Spektrophotometrie (Molarabsorptionskoefficient von 780 M- lcm'1 bei einer Wellenlänge von 338 nm der maximalen Absorption) als S-Nitroso-N- acetylcysteinethylester (C7H12N204S MG 220) identifiziert. Die Reinheit der Substanz wird mittels Umkehrphase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC, Detektion bei 338 nm) zu >99 % bestimmt.

B. lIerstellung von S-Nitroso-N-(O-acetvlsalicvl) cvsteinethvlester I. Herstellung der Vorstufe N- (O-Acetylsalicyl) cysteinethylester (ASS-CET).

Cysteinethylester-hydrochlorid (925 mg, 5 mmol) wird in Tetrahydrofuran (30 ml) unter Eiskühlung 2 h lang mit Triethylamin (510 mg) versetzt. Die entstandene Suspension wird mit einer Lösung von Acetylsalicylsaureanhydrid (1.71 g, 5 mmol) in Tetrahydrofuran (10 ml) versetzt und das Gemisch wird 2 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser verdünnt und die Reaktionsprodukte werden mit Diethylether extrahiert. Der Extrakt wird anschließend mit NaHCO3 gewaschen und über wasserfreiem MgS04 getrocknet. Das Lösungsmittel wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand auf Silica mit Diethylether/Petrolether (1/1, v/v) zur Elution chromatographiert. Alle Operationen werden bei Raumtemperatur unter einer Argon-Atmosphäre durchgeführt. Weisse Kristalle (950 mg, Schmelzpunkt : 76-77 °C) werden erhalten. Die Verbindung wird mittels Massenspektrometrie, 1H-NMR, IR und Polarimetrie als N- (O-acetylsalicyl) cysteineethylester identifiziert (Cl4Hl7NO5S, MG3D).

II. Herstellung von S-Nitroso-N- (O-acetylsalicyl) cYsteinethylester (ASS-SNCETI.

Es wird ein Gemisch aus N- (O- acetyl sal i cyl) cystei neethyl ester (15.6 mg, 50 µmol) und Natriumnitrit (3.45 mg, 50 llmol) in deoxygeniertem, destilliertem, eiskaltem Wasser hergestellt. Diese Lösung wird mit einer deoxygenierten, eiskalten 5 M HCl-Lösung (12 ul, 60 mol) versetzt. Unmittelbar nach der Ansäuerung wird die Lösung rot. Die entstandene Substanz wurde mittels MS, 1H-NMR, IR und Spektrophotometrie (Molarabsorptionskoefficient von 800 M-1cm-1 bei einer Welienlange von 338 nm der maximalen Absorption) als S-Nitroso-N- (O-acetylsalicyl) cysteinethylester identifiziert (Cl4Hl6N206S, MG 340). Die Reinheit der Substanz wird mittels Umkehrphase- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC, Detektion bei 338 nm sowie bei 254 nm) zu >99 % bestimmt.

C. Alternative Herstellung von S-Nitroso-N-acetylcvsteinethvlester und S-Nitroso-N-(O- acetylsalicyl)cysteinethylester aus GSNO und NACET bzw. Ases= durch S- Transnitrosvlierung in einem Zweilhasensvstem Es werden Lösungen von NACET (9.55 mg, 50 pmol) bzw. ASS-CET (15.6 mg, 50 pmol) in eiskaltem Methylenchlorid (je 2 ml) hergestellt. Es werden zwei Lösungen von S-Nitroso-L- glutathion 0.5 H20 (GSNO ; je 20.6 mg, je 60 pmol) in eiskaltem deoxygeniertem Wasser (je 1 mi) hergestellt. Die NACET-und ASS-CET-Lösung werden mit den GSNO-Lösungen fiir 5 min mit Hilfe eines Vortex-Mixers intensiv gemischt. Dabei entfarben sich die rötlichen wässrigen Phasen, während die organischen Phasen sich rotlich farben Das ist ein Hinweis für die Umwandlung von GSNO in SNACET bzw. ASS-SNCET. Methylenchlorid wird unter Stickstoff vollständig eingeengt. Es werden jeweils tiefrote ölige Flüssigkeiten erhalten, die nach Aufbewahrung bei-20°C rötliche Kristalle bilden. Die Reinheit der Substanzen wird mittels Umkehrphase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC, Detektion bei 338 nm) zu je >99 % bestimmt ; laut HPLC war kein GSNO in SNACET bzw. ASS-SNCET vorhanden.

Analog erfolgt auch die Herstellung der entsprechenden S-Nitro-Derivaten aus S- Nitroglutathion.

BEISPIEL 2 A. Relaxation des humanen Corpus Cavernosum in vitro durch S-Nitroso-N- acetvlcysteinethylester, S-Nitroso-N- (O-acetvlsalicvl) cysteinethvlester und ihre Metabolite.

S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester (SNACET), S-Nitroso-N- (O- acetylsalicyl) cysteinethylester (ASS-SNCET) und ihre Metabolite S-Nitroso-N-acetylcystein (SNAC) und S-Nitroso-cysteineethylester (SNCET) relaxieren humanes Corpus Cavernosum in vitro in einer Konzentrations-abhängigen Weise (Abb. 1 a).

B. Relaxation der humanen arteria mammaria in vitro durch S-Nitroso-N- acetvlcvsteinethvlester und S-Nitro-N-acetvlcysteinethylester.

S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester (SNACET) und S-Nitro-N-acetylcysteinethylester (SN02-ACET) relaxieren humane arteria mammaria in vitro in einer Konzentrations- abhängigenWeise (Abb. lb).

Die relaxierende Wirkung von SNACE-Derivaten auf das humane Corpus Cavernosum und die humane arteria mammaria zeigt, daß SNACE-Derivate enthaltende Arzneimittel zur Bekämpfung der Impotentia coeundi und von Herzdurchblutungsstörungen als pharmakologische Wirksubstanzen geeignet sind.

BEISPIEL 3 Penetration von S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester (SNACET) durch humane Tunica albuginea in vitro.

Ein Stück einer frisch präparierten humanen Tunica Albuginea wird in einer Franz'Zelle fixiert. Die aktive Oberfläche beträgt 1.77 cm2. Die Acceptorphase (10 ml) besteht aus Hank's Puffer (pH 7.4), Humanalbumin (30 g/I), Penicillin G (100 Einheiten) und Streptomycin (10 ug), und wird mit einem Magnetrührer bei einer konstanten Rotationsgeschwindigkeit gerührt.

Die Penetration wird durch Applikation von Lösungen von SNACET in Dimethylsulfoxid unterschiedlichen Gehaltes (0.25 ml) auf das Hautstück gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden aus der Acceptorphase Proben entnommen und die Konzentration der Summe aus SNACET und seinen Metaboliten wird bestimmt. In der Acceptorphase werden unverändertes SNACET und andere Metabolite einschließlich Nitrit nachgewiesen. Abb. 2 zeigt, daß SNACET die Tunica Albuginea penetriert. Die Penetrationsgeschwindigkeit und die Menge des penetrierten SNACET und seiner Metabolite in der Acceptorphase hängen von der auf die Tunica Albuginea applizierten Menge von SNACET ab. Die lag time beträgt ca. 20 min. Im linearen Bereich betragen die Penetrationsraten 1.0,2.5 und 5.0 llmol SNACET/Stunde.

Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit voller Haut von Brust oder Bauch von gesunden Spendern erzielt.

Die Penetration von SNACE-Derivaten durch Tunica Albuginea und voller Haut verdeutlicht, daß die Applikation von SNACE-Derivate enthaltenden Arzneimitteln auf die Haut zur Resorption des Arzneimittels uber die Haut fi. lhrt, wodurch die SNACE-Derivate und ihre Metabolite Zielorgane erreichen und dort therapeutisch wirksam werden.

BEISPIEL 4 Hypotensive Wirkung von SNACET in vivo in der Ratte.

Einer 400 g wiegenden männlichen, anästhesierten Sprague Dawley Ratte wird S-Nitroso-N- acetylcysteinethylester (SNACET) i. v. appliziert. Vor und nach Beginn der Infusion wird der mittlere arterielle Blutdruck blutig kontinuierlich aufgenommen. Abb. 3 zeigt, daß unmittelbar nach Beginn der Infusion von SNACET der mittlere arterielle Blutdruck in Abhängigkeit von der Infusionsrate abnimmt.

BEISPIEL 5 Inhibition der Aggregation von humanen Btutptattchen in vitro durch S-Nitroso-N- <BR> <BR> <BR> <BR> acetylcysteinethylester (SNA CET) u nd S-Nitroso-N-(O-acetylsalicyl) cystein ethylester (ASS-SNCET).

Kollagen-induzierte (2 ilg/ml) Aggregation und Thromboxanesynthese in humanen gewaschenen Blutplättchen werden durch SNACET in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert (Abb. 4a). Die IC50s für die Inhibition der Plättchenaggregation und der Thromboxanesynthese durch SNACET werden zu 1 bzw. 0.5 µM bestimmt. Kollagen- induzierte (2 µg/ml) Aggregation vn humanen gewaschenen Blutplättchen wird durch ASS- SNCET in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert (Abb. 4b). Die IC5p für die Inhibition der Plättchenaggregation durch ASS-SNCET wird zu 2 µM bestimmt (Abb. 4b).

BEISPIEL 6 In vivo Metabolismus von oral apyliziertem, 15N-markiertem S-Nitroso-N- acetylcysteinethylester (15N-SNACET) in der Ratte.

Einer 480 g wiegenden männlichen Sprague Dawley Ratte wird oral 17.5 mg von 15N- markiertem S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester (15N-SNACET) pro kg Körpergewicht, gelöst in 1 ml einer 10 Gew% Glucose-Lösung in Trinkwasser, verabreicht. Vor und bis zu 24 Stunden nach Applikation wird Urin gesammelt und darin die 5N-Anreicherung von Nitrat, Nitrit and S-Nitroso-Metaboliten von 15N-SNACET mittels GC-MS bestimmt. Abb. 5 zeigt daß weder 15N-SNACET noch andere S-[15N]Nitroso-haltige Metabolite in den Urin ausgeschieden werden. Als Hauptmetabolit von 15N-SNACET wird 15N-Nitrat identifiziert.

15N-Nitrit wird ebenfalls in den Urin ausgeschieden. Die höchste 15N-Anreicherung wird in der Urinprobe gemessen, die innerhalb der ersten zwei Stunden gesammelt wird. Die 15N- Anreicherung im Urin 24 Stunden nach der Gabe von 1 SN-SNACET ist geringfugig größer als die natürliche Häufigkeit von l 5N.

Die Ausscheidung von Nitrat im Urin der Ratte nach oraler Applikation von SNACET verdeutlicht, daß oral verabreichte SNACE-Derivate enthaltende Arzneimittel schnell resorbiert und metabolisiert als Nitrat über den Urin ausgeschieden werden.

ANHANG Abbildung 1 a. Relaxation des humanen Corpus Cavernosum in vitro durch S-Nitroso-N- acetylcysteinethylester (SNACET), S-Nitroso-N-(O-acetylsalicyl) cysteinethylester (ASS- SNCET) und ihre Metabolite SNCET und SNAC. b. Relaxation der humanen arteria mammaria in vitro durch S-Nitroso-N- acetylcysteinethylester (SNACET) und S-Nitro-N-acetylcysteinethylester (SN02ACET) Abbildung 2 Penetration von S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester (SNACET) durch humane Tunica albuginea in vitro in einer Franz'Zelle. Drei verschiedene Mengen getost in Dimethylsulfoxid (jeweils 250 ul) wurden appliziert (s. Legende) Abbildung 3 Hypotensive Wirkung von SNACET in vivo in der Ratte. SNACET wurde i. v. bei den angegebenen Infusionsraten appliziert.

Abbildung 4 a. Inhibition der Kollagen-induzierten (2 pg/ml) Aggregation von humanen gewaschenen Blutplättchen und der Thromboxansynthese in den Plättchen in vitro durch S-Nitroso-N- acetylcysteinethylester (SNACET). b. Inhibition der Kollagen-induzierten (2 µg/ml) Aggregation von humanen gewaschenen Blutplättchen in vitro durch S-Nitroso-N-(O-acetylsalicyl) cysteinethylester (ASS-SNCET).

Die Werte sind Mittelwerte von Untersuchungen mit Plättchen von vier gesunden Probanden.

Abbildung 5 Metabolismus von oral appliziertem 5N-markiertem S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester (17.5 mg/kg Körpergewicht) in einer Ratte. 15N-Anreicherung von Nitrat, Nitrit und für die Summe aus 15N-markiertem S-Nitroso-N-acetylcysteinethylester und seinen Metaboliten im Urin gesammelt vor und bis zu 24 Stunden nach der Applikation.