Estado de la técnica anterior Resulta bien conocido el hecho de que los compuestos capaces de liberar en el organismo óxido nítrico (NO) manifiestan en muchos casos algún tipo de actividad a nivel del sistema vascular, por ejem- plo vasodilatación o inhibición de la agregación de las plaquetas, que los hace potencialmente benefi- ciosos para el tratamiento de diferentes trastornos relacionados con disfunciones del sistema circulato- rio.

Se ha descrito también que determinados derivados que contienen un grupo S-nitrosotiol, dado que son capaces de liberar NO en el organismo, mani- fiestan también propiedades aprovechables desde el punto de vista médico. Así, Radomski et al., Br. J.

Pharmacol. (1992) 107,745-749, describen la activi- dad inhibidora de la activación de las plaquetas del S-nitrosoglutatión (GSNO). Golino et al, Circulation Research, 71, No 6 (1992), describen la actividad

inhibidora de la activación de las plaquetas de la S-nitrosocisteína, asignándole un efecto antitrom- bótico. Smith et al., Meth. Find. Exp. Clin. Pharma- col. (1994), 16,5, describen que el GSNO produce un fuerte efecto relajante sobre las arterias. En la solicitud de patente W095/12394 se describe el uso de S-nitrosoaductos de péptidos, entre ellos la S- nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), como agentes protectores contra las inflamaciones vasculares de origen traumático. En la solicitud de patente W095/07691 se describe el uso de diferentes S- nitrosotioles, particularmente el GSNO, en el tratamiento y prevención de la deposición de las plaquetas y la formación de trombos en la superficie vascular dañada. En la solicitud de patente W093/09806 se describen proteínas o residuos de ami- noácidos S-nitrosados, capaces de liberar NO, que manifiestan una actividad relajante de la muscula- tura lisa y un efecto inhibitorio sobre la agrega- ción plaquetaria.

En la patente europea EP-B1-412699 se des- criben S-nitrosotioles que responden a la fórmula general y su empleo como agentes terapéuticos para las en- fermedades cardiovasculares, en particular, como agentes antihipertensivos y para el tratamiento de la angina pectoris. Si bien el número de posibles compuestos asignables a dicha fórmula general es

enorme, mientras que en la descripción sólo se en- cuentran descritos explícitamente unas decenas de productos, y únicamente se aportan datos sobre su acción vasodilatadora, sin mencionar ningún efecto relacionado con la actividad de las plaquetas.

Los S-nitrosotioles descritos en los docu- mentos mencionados no resuelven por si solos todos los complejos problemas que plantea el tratamiento de los trastornos vasculares, especialmente a nivel cardiovascular, siendo necesario el desarrollo de nuevos principios activos que manifiesten acciones más potentes y eficaces.

Objeto de la invención El objeto de la invención son unos nuevos compuestos S-nitrosotioles, derivados de la penici- lamina o el glutatión, que presentan, simultánea- mente, una potente acción vasodilatadora y una ele- vada eficacia como inhibidores de la agregación plaquetaria.

Es también objeto de la presente invención el uso de los nuevos compuestos en la preparación de medicamentos para el tratamiento de trastornos rela- cionados con disfunciones del sistema circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular.

Descripción de la invención Los compuestos objeto de la invención son S-nitrosotioles derivados de la penicilamina o del glutatión, y sus sales farmacéuticamente aceptables, que responden a la fórmula general (I)

en la que : A y B son grupos fenilo o bien, conjuntamente, conforman el resto-CH2-Q-CH2-constituyendo un anillo de seis unidades en el que Q representa un átomo de oxígeno o de azufre o un resto N- R3, en el que R3 es hidrógeno o un grupo alquilo Cl-C4; Ri es un resto acilo, que puede ser un acilo alifático C1-C5 o un resto de ácido glutámico unido por medio de su carboxilo no aminoací- dico ; R2 es un grupo hidroxilo o un resto de glicina unido mediante un enlace peptidico ; de manera que cuando R1 es un resto acilo alifático R2 es un grupo hidroxilo, y cuando R1 es un resto de ácido glutámico R2 es un resto de glicina.

Por tanto, los compuestos objeto de la in- vención resultan asignables a las fórmulas generales (II) o (III)

en las que A y B tienen los valores indicados ante- riormente y R4 es un grupo alquilo Cl-C4, o a sus sales farmacéuticamente aceptables.

Ejemplos concretos de compuestos preferi- dos que forman parte del objeto de la presente in- vención son los siguientes : Acido N-acetil-2-amino-2- [4- (4-S-nitrosomercaptote- trahidropiran)] acético (1).

Acido N-acetil-2-amino-2- [4- (4-S-nitrosomercapto-l- metilpi-peridin)] acético (2).

Acido N-acetil-2-amino-3-bencil-3-S-nitrosomercapto- 4-fe-nilbutanoico (3). N[N-y-L-glutamil-2-amino-2- (4- (4-S-nitrosomer- capto) tetrahi-dropiran)) acetil] glicina (4). N[N-y-L-glutamil-2-amino-2- (4- (4-S-nitrosomercapto- 1-metil-piperidin)) acetil] glicina (5).

N[N-y-L-glutamil-2-amino-3-bencil-3- (4-metilbencil- S-nitro-somercapto)-4-fenilbutanoil] glicina (6).

Para el experto resulta obvio que los com- puestos objeto de la presente invención presentan centros quirales y que ello permite distinguir entre los posibles isómeros y/o las mezclas de los mismos, debiendo entenderse que forman parte del objeto de la invención tanto las mezclas de isómeros como los isómeros puros, que pueden ser obtenidos a partir de dichas mezclas mediante el empleo de técnicas con-

vencionales, bien conocidas por el experto, o medi- ante síntesis asimétricas también al alcance de di- cho experto.

Los compuestos objeto de la presente in- vención pueden obtenerse de diferentes maneras en función de su estructura básica.

Así, los compuestos asignables a la fór- mula general (II) pueden obtenerse de acuerdo con la secuencia de etapas que se representa en el siguiente esquema.

Es decir, partiendo de los clorhidratos de los aminoácidos, que a su vez pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos, por ejemplo los descri- tos en las solicitudes de patente alemanas DE-A- 3023830 y DE-A-2801849, se procede a acilar el ni- trógeno aminoacídico mediante técnicas convenciona- les, por ejemplo con un cloruro de ácido, y como etapa final se introduce el grupo nitroso en el azu- fre mercaptánico, también utilizando técnicas de ni- trosación convencionales.

Por su parte, los compuestos asignables a la fórmula general (III), se pueden obtener mediante la secuencia de etapas que se representa en el siguiente esquema.

Es decir, se parte de los mismos clorhi- dratos de aminoácidos que en el caso anterior y se protege el grupo mercaptano mediante la formación de un tioéter de p-metilbencilo. A continuación se pro- tege el nitrógeno aminoacídico mediante la conocida técnica Boc y luego se forma el tripéptido con los restos de ácido glutámico y glicina (aminoácido C- terminal), en fase sólida, mediante técnicas bien conocidas por el experto y descritas, por ejemplo, por : Barany, G. et al., The Peptides, 2,1, Gross, E.

Meienhofer, Eds. Academic Press, NY (1980); Stewart, J. M. et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, CA (1969); Bodanszky, M. Et al., Pep- tide Synthesis, 2nd ed., Wiley, NY (1976).

La formación del tripéptido consta de las siguientes etapas : a) Anclaje del aminoácido C-terminal glicina (Gly), en forma de terc-butoxicarbonil (Boc) derivado, a una resina de p- metilbencilhidrilamina/poliestireno.

b) Desprotección del grupo Boc con ácido tri- fluoroacético y neutralización. c) Incorporación del aminoácido modificado in- termedio protegido. d) Evaluación de la reacción de acoplamiento mediante ninhidrina (Kaiser, E. et al., Anal. Biochem., 34,595 (1970)). e) Repetición de las etapas anteriores para el residuo de y-glutámico (y-Glu) que se incor- pora como Boc-derivado O bencil protegido (Boc-Glu-OBzl). f) Acidolisis con HF anhidro para desproteger el tripéptido y liberarlo de la resina. g) Purificación y caracterización de los pro- ductos finales.

Una vez formado el tripéptido se procede, como etapa final, a la nitrosación del grupo mercap- tano ya liberado de su grupo protector.

Los ensayos efectuados muestran que los nuevos compuestos S-nitrosados objeto de la inven- ción poseen una actividad vasodilatadora comparable, como mínimo, con la del GSNO, y en algunos casos muy superior, y además presentan un efecto inhibidor de la agregación plaquetaria que también resulta ser similar o superior al propio del GSNO, en alguno de los casos considerablemente superior.

Ello hace que los compuestos objeto de la presente invención puedan ser utilizados de manera muy eficaz en la preparación de medicamentos con efecto vasodilatador y antitrombótico para el tratamiento de disfunciones del sistema circulato- rio, especialmente a nivel cardiovascular y coro- nario.

Por ello, los compuestos de la fórmula general (I), así como sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden ser utilizados, mediante el em- pleo de las técnicas galénicas convencionales, para preparar medicamentos que pueden ser administrados por diferentes vías.

A modo de ejemplo se puede señalar que por via oral pueden administrarse en forma de preparados farmacéuticos tales como comprimidos, cápsulas, jarabes y suspensiones. Por via parenteral en forma de soluciones o emulsiones, etc. Pueden adminis- trarse también por via tópica en forma de cremas, pomadas, ungüentos, etc., y también por via trans- dérmica, por ejemplo por medio de parches y aposi- tos. También pueden aplicarse directamente al recto, en forma de supositorios. Las preparaciones pueden contener transportadores aceptables fisiológica- mente, excipientes, activadores, agentes quelantes, estabilizadores, etc. En el caso de inyectables pueden incorporarse tampones fisiológicamente aceptables, agentes solubilizantes o isotónicos. La dosis diaria puede variar dependiendo de la sintoma- tología, de la edad, del peso corporal de los pa- cientes, del modo de administración, etc., y la do- sis normal diaria para una persona adulta puede es- tar comprendida entre 0,1 y 500 mg, pudiendo ser ad- ministrada en una sola dosis o dividida en varias tomas al dia.

En los ejemplos que se exponen en esta de- scripción se detallan los procedimientos apropiados para obtener varios de los compuestos asignables a la fórmula general (I). A la vista de dichos ejem- plos, para el experto en la materia resulta evidente y directa la manera de obtener los compuestos no

ejemplificados expresamente, mediante la aplicación de modificaciones de los métodos expuestos, propias del conocimiento común general de los expertos en la materia.

Así pues, los ejemplos que se exponen a continuación no deben ser interpretados en el sen- tido de limitar el alcance de la presente invención, sino como una explicación adicional, más detallada, que facilite al experto en la materia una mejor com- prensión de la misma.

Ejemplos En los ejemplos que siguen a continuación se utilizan las siguientes abreviaturas : AcOEt acetato de etilo AcOH ácido acético Boc terc-butoxicarbonilo Bzl bencilo DCC diciclohexilcarbodiimida DCM diclorometano DIEA N-etildiisopropilamina DIP-CI sonda introducción directa-ionización quimica DMF dimetilformamida DMSO-d6 dimetilsulfóxido hexadeuterado EDTA Na2 ácido etilendiaminotetraacético sal sódica EtOH alcohol etílico EtOEt éter etílico FAB bombardeo átomos rápidos CGMP Guanosina 3', 5' monofosfato ciclico HPLC cromatografía liquida de alta resolu- ción MeCN acetonitrilo

MeOH alcohol metílico MS espectrometría de masas ODQ [lH- [1,2,4] oxadizol [4-3a] quinoxalin- 1-ona] PyAOP hexafluorofosfato de 7-azabenzotria- zol-1-il-oxitris (pirrolidino) fos- fonio tBuOH alcohol terc-butílico TFA ácido trifluoroacético Los clorhidratos de los aminoácidos de partida se sintetizan según los procedimientos de- scritos en las solicitudes de patente alemanas DE-A- 3023830 y DE-A-2801849.

Los espectros de resonancia magnética nu- clear han sido realizados en un aparato Varian Gem- ini-200.

En los espectros de 1H-RMN se indica la frecuencia de trabajo y el disolvente utilizado para llevar a cabo el espectro. La posición de las señales se indica en 8 (ppm), utilizando como refer- encia la señal de los protones del disolvente. Se toman como valores de referencia 7.24 ppm para el cloroformo y 2.49 ppm para el dimetilsulfóxido deu- terado. Entre paréntesis se indica el número de pro- tones correspondientes a cada señal medidos por in- tegración electrónica y el tipo de señal usando las siguientes abreviaturas : s (singulete), d (doblete), t (triplete), dd (doblete de dobletes), sa (señal ancha), sc (señal compleja), d. e. D20 (desaparece al realizar el espectro tras añadir unas gotas de agua deuterada).

En los espectros de 13C-RMN se indica la frecuencia de trabajo y el disolvente utilizado en cada espectro. La posición de las señales se indica

en 8 (ppm), utilizando como referencia la señal de los protones del disolvente. Se toman como valores de referencia 77.00 ppm para el cloroformo y 39.50 ppm para el dimetilsulfóxido deuterado.

También se han realizado experimentos de resonancia magnética nuclear usando la secuencia de pulsos APT (Attached Proton Test).

Cuando se realizan análisis por HPLC para determinar la pureza de algunas muestras, las condi- ciones utilizadas son las siguientes : A-Gradiente general Columna : RP-C18, Symmetry 150x3,9 mm, 5, 100 A Fase móvil : H2O+H3PO4 0.1%/CH3CN + 5% H2O + 0. 1% H3 P04 Temperatura : ambiente Flujo 1 mL/min Volumen inyección : 10 tL B-Isocrático Columna : RP-C18, Symmetry 150x3,9 mm, 5, 100 A Fase móvil : 50% de H20+H3PO4 0.1% y 50% de CH3CN + 5% H2O + 0.1% H3P04 Temperatura : ambiente Flujo 1 mL/min Volumen inyección : 10 tL En la preparación de los tripéptidos se emplean técnicas de cromatografía preparativa y HPLC para purificar el crudo y la identidad del pro- ducto se confirma por espectrometría de masas y el análisis de aminoácidos. La pureza de los tripépti- dos se analiza mediante HPLC en las siguientes con- diciones : columna de tipo C18 Nucleosil, 250 x 4 mm, 120 A, 10 pm; flujo de 1 mL/min; eluyentes A = H20 (+0.045% TFA) y B = CH3CN (+0.036% TFA).

Los espectros de ultravioleta (UV) se han registrado en un espectrofotómetro Shimadzu UV-160A.

Para cada uno de los compuestos se indica la longi- tud de onda (X) expresada en nm, y la absortividad molar (s) de cada una de ellas expresada en cm-1 mol- L.

En la cromatografía liquida de alta re- solución (HPLC) se ha utilizado un detector de ul- travioleta de fotodiodos de Hewlett-Packard 1040 A.

Ejemplo 1.-Obtención del ácido N-acetil-2-amino- 2- [4- (4-S-nitrosomercaptotetrahidropi- ran)] acético (1).

Etapa 1) En un matraz de 250 mL provisto de agi- tación magnética se introducen 4.0 g. (17.6 mmol) del clorhidrato del ácido 2-amino-2- [4- (4- mercaptotetrahidropiran)] acético, y 60 mL de disolu- ción de hidróxido potásico 0.5N. A continuación de añaden 3.07 g. (21.8 mmol) de carbonato potásico an- hidro y 60 mL de MeCN. La mezcla se enfría con un baño de hielo y se adiciona gota a gota 1.42 mL (19.7 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en 25 mL de MeCN. Finalizada la adición se añade hidróxido potásico 0.5N hasta pH 9-10. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación se añade ácido clorhídrico 2N hasta pH=6 y se

elimina el disolvente a presión reducida. El sólido obtenido se seca a vacío sobre pentóxido de fósforo.

Se suspende en 150 mL de EtOH absoluto y se agita a temperatura ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con EtOH absoluto. Se elimina el disol- vente a presión reducida. Se obtienen 3.98 g de crudo del producto intermedio, ácido N-acetil-2- amino-2- [4- (4-mercaptotetrahidropiran)] acético, que se somete a varias cromatografías preparativas de fase reversa para obtener 80 mg de producto del 90% de pureza (HPLC gradiente A, R=205 nm).

1H-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 7.40 (1H, d, J=lOHz, NH), 4.13 (1H, d, J=lOHz, CH), 3.75-3.50 (4H, s. c., CH2), 1.90-1.80 (4H, s. c., CH2), 1.65 (3H, s, CH3).

13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 171.50 (CO-N), 168.90 (CO), 63. 69 (CH2), 63. 27 (CH2), 62.80 (CH), 49.18 (C), 37.58 (CH2), 36.12 (CH2), 23.01 (CH3). <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Etapa 2) Se disuelven 80 mg (0.34 mmol) del ácido N-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> acetil-2-amino-2- (4- (4-mercaptotetrahidropiran)) acético en 4000 tL de MeOH. Se añaden 500 pL de disolución de HCl 1 N y 136 u. L de disolución de NaNO2 5 M. Se trata la disolución resultante durante 1 minuto en un baño de ultrasonidos y se añaden a continuación 50 u. L de disolución de NaOH 10 N y 14 iL de H20.

De la disolución resultante se separa una alícuota A de 470 u. L y al resto se le añade agua abundante, se congela y se liofiliza para obtener 190 mg de un sólido B higroscópico ligeramente hu- medecido.

HPLC (gradiente A) :

# 220 nm : pureza fracción A 68% X 339 nm : pureza fracción A 95%.

RMN fracción B : 1H-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.00-7.50 (1H, s. c., NH), 4.50-4.00 (1H, s. c., CH), 3.80-3.40 (4H, s. c., CH2), 2.40-1. 80 (4H, s. c., CH2), 1.88 (3H, s, CH3).

13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 173.00 (CO), 169.52 (CO), 67. 69(CH2-O), 63.45 (CH), 53.78 (C), 32.17 (CH2), 22. 80 (CH3).

Ejemplo 2.-Obtención del ácido N-acetil-2-amino- 2- [4- (4-S-nitrosomercapto-l- metilpiperidin)] acético (2). Etapa 1) En un matraz de 250 mL provisto de agi- tación magnética se introducen 3.69 g. (13 mmol) del diclorhidrato del ácido 2-amino-2- [4- (4-mercapto-l- metilpiperidin)] acético, y 30 mL de disolución de hidróxido potásico 0.5N. A continuación de añaden 2.2 g. (16 mmol) de carbonato potásico anhidro y 30 mL de MeCN. La mezcla se enfría con un baño de hielo y se adiciona gota a gota 1.0 mL (14 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en 10 mL de MeCN. Fi- nalizada la adición se añade hidróxido potásico 0.5N hasta pH 9-10. Se agita la mezcla a temperatura am- biente durante 2 horas. A continuación se añade ácido clorhídrico 2N hasta pH=6 y se elimina el

disolvente a presión reducida. El sólido obtenido se seca a vacío sobre pentóxido de fósforo. Se suspende en 100 mL de EtOH absoluto y se agita a temperatura ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con EtOH absoluto. Se elimina el disolvente a pre- sión reducida. Se obtienen 2.8 g de crudo del pro- ducto intermedio, ácido N-acetil-2-amino-2- [4- (4- mercapto-1-metilpiperidin)] acético, que se somete a varias cromatografías preparativas de fase reversa para obtener 0.5 g de producto del 99% de pureza (HPLC gradiente A, A=210 nm).

1H-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.35 (1H, d, J=lOHz, NH), 4.43 (1H, d, J=lOHz, CH), 3.35-3.00 (4H, s. c., CH2), 2.70 (3H, s, CH3), 2.20-1.90 (4H, s. c., CH2), 1.85 (3H, s, CH3).

13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 170.55 (CO-N), 170.05 (CO), 61.77 (CH), 49. 33 (CH2), 49. 28 (CH2), 46.38 (C), 42.26 (CH3), 33.05 (CH2), 33.14 (CH2), 22.42 <BR> <BR> <BR> <BR> (CH3).<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Etapa 2) Se disuelven 50 mg (0.20 mmol) del ácido N-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> acetil-2-amino-2- [4- (4-mercapto-l- metilpiperidin)] acético en 800 jjLL de disolución de HC1 1 N. Se añaden 80 pL de disolución de NaN02 5 M.

Se trata la disolución resultante durante 1 minuto en un baño de ultrasonidos y se añaden a continua- ción 80 pL de disolución de NaOH 10 N y 40 pL de H20.

De la disolución resultante se separa una alícuota A de 100 pL y el resto se congela y se lio- filiza para obtener 79 mg de un sólido B.

HPLC (gradiente A) : # 230 nm : pureza fracción A 90%; pureza frac- ción B 93% Á. 334 nm : pureza fracción A 98%; pureza frac- ción B 98% RMN fracción B : 1H-RMN (200 Mhz, D20) : 4.71 (1H, s, CH), 2.70- 2.20 (8H, sc, CH2), 1. 95 (3H, s., CH3-N), 1.71 (3H, s, CH3-CO).

13C-RMN (50 Mhz, D20 : 172.51 (CO), 171.52 (CO), 61.08 (CH), 58.18 (C), 48.09 (CH2-N), 48.01 (CH2-N), 42.18 (CH3-N), 30.44 (CH2), 29.85 (CH2), 20.17 (CH3-CO).

Ejemplo 3.-Obtención del ácido N-acetil-2-amino- 3-bencil-3-S-nitrosomercapto-4- fenilbutanoico (3).

Etapa 1) En un matraz de 100 mL provisto de agi- tación magnética se introducen 2.0 g. (5.9 mmol) del ácido 2-amino-3-bencil-3-mercapto-4-fenilbutanoico, y 20 mL de disolución de hidróxido potásico 0.5N. A continuación de añaden 1.0 g. (7.2 mmol) de car- bonato potásico anhidro y 20 mL de MeCN. La mezcla se enfría con un baño de hielo y se adiciona gota a

gota 0.5 mL (6. 5 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en 8 mL de MeCN. Finalizada la adición se añade hidróxido potásico 1N hasta pH 12-13. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación se añade ácido clorhídrico 2N hasta pH=6 y se elimina el disolvente a presión reducida.

El crudo obtenido se suspende en 100 mL de EtOH ab- soluto y se agita a temperatura ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con EtOH absoluto. Se elimina el disolvente a presión reducida. El residuo se recristaliza de agua. La parte insoluble se fil- tra y se descarta. El filtrado se congela y se lio- filiza. Se obtienen 1.64 g del producto intermedio, N-acetil-2-amino-3-bencil-3-mercapto-4- fenilbutanoico. Rendimiento : 81%.

1H-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 7.68 (1H, d, J=8Hz, NH), 7.35-7.05 (10H, sc, CHar), 4.36 (1H, d, J=8Hz, CH), 3.42-3.02 (2H, sc, CH2-Car), 2.95-2.55 (2H, sc, CH2), 1.82 (3H, s, CH3) 13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 172.94 (CO-N), 169.08 (CO), 138.55 (Car), 138.16 (Car), 132.36 (2CHar), (2CHar), 126. 44 (CHar), 126.26 (CHar), 60.16 (CH), 55.62 (C), 43.70 (CH2), 42.94 (CH2), 23.14 (CH3). <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Etapa 2) Se disuelven 0.62 g (1.8 mmol) del ácido N- acetil-2-amino-3-bencil-3-mercapto-4-fenilbutanoico en 25 mL de MeOH. Se añaden 25 mL de disolución de HC1 1 N y una disolución de 250 mg de NaN02 en 25 mL de H2O. Se agita la disolución resultante durante 35 minutos a temperatura ambiente, se filtra y se lava

con agua. Tras secar a presión reducida en presencia de P205 se obtienen 0.33 g de un sólido.

HPLC (isocrático B) : <BR> <BR> <BR> <BR> k 220 nm : pureza 91%<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> X 342 nm : pureza 100% 1H-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.77 (1H, d, J=lOHz, NH), 7.28-7.00 (10H, sc, CHar), 5.33 (1H, d, J=lOHz, CH), 4.12-3.90 (2H, sc, CH2), 3.88-3.38 (2H, sc, CH2), 1.86 (3H, s, CH3) ¹³C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 171.55 (CO-N), 169.67 (CO-0), 135.51 (Car), 135.27 (Car), 131.52 (CHar) 131.41 (CHar), 128.15 (CHar), 128.05 (CHar), 127.04 (CHar), 65.13 (CH), 56.11 (CH), 40.91 (CH2), 40.15 (CH2), 22.29 (CH3).

Ejemplo 4.-Obtención de N [N-y-L-glutamil-2- amino-2- (4- (4-S-nitrosomercap- to) tetrahidropiran)) ace-til] glicina (4).

Etapa 1) En un matraz de 250 mL provisto de agi- tación magnética se mezclan 5.8 g (25.5 mmol) de clorhidrato del ácido 2-amino-2- (4- (4- mercaptotetrahidropiran)) acético, 4.7 g (25.5 mmol) de a-bromo-p-xileno y 100 mL de una mezcla H20/EtOH 3 : 1. Se añaden 11 mL de trietilamina, se crea una atmósfera de argon y se agita la mezcla durante 18 h a temperatura ambiente. Se añaden 50 mL más de H20/EtOH 3 : 1 y se agita durante 2 h más. La suspen- sión resultante se filtra y se lava con 100 mL de agua y 50 mL de EtOH. Se obtiene un sólido que se seca a presión reducida. Se añaden 300 mL de ácido clorhídrico concentrado sobre el sólido y se elimina el disolvente a presión reducida. Se repite el mismo tratamiento ácido una segunda vez, obteniendo un sólido que se seca a presión reducida. Se obtienen 1.59 g del producto intermedio de interés.

1H-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.80-8.30 (3H, sa, H3N+), 7.26 (2H, d, J=8 Hz, CHar), 7.12 (2H, d, J=8 Hz, CHar), 4.03 (1H, s, CH-N), 3.85-3.55 (6H, sc, CH2-Car, CH2-O), 2.26 (3H, s, CH3), 2.05-1.08 (4H, sc, CH2).

13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 168.98 (CO), 136.64 (Car), 133.80 (Car), 129.55 (CHar), 129.29 (CHar), 62.36 (CH2-0), 59.85 (CH-N), 49.15 (C) 32.03 (CH2), 31.19 (CH2), 30. 84 (CH2), 20. 69 (CH3). <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Etapa 2) Se suspenden 1004 mg del clorhidrato del ácido 2-amino-2- (4- (4- (p-metilbencilmercapto) tetra- hidropiran)) acético (3.029 mmol) en 20 ml de tBuOH/H20 2 : 1 y se adiciona NaOH al 5% hasta pH=9. A continuación se añaden 3 equivalentes de Boc2O y se

deja reaccionar por espacio de 30 min, transcurridos los cuales se ajusta de nuevo el pH a 9. La reacción se prolonga 30 min más y se vuelve a corregir el pH.

Se comprueba que la reacción se ha completado por cromatografía en capa fina (CCF) comparando con el aminoácido de partida.

El producto se aisla realizando dos tratamientos consecutivos de extracción con 50 mL de hexano. La fase acuosa se acidifica con HCI 1N hasta pH=2. A continuación se realizan tres etapas de ex- tracción con 60 mL de AcOEt cada una. La solución de AcOEt se seca con MgS04 anhidro y, tras la elimi- nación del disolvente por evaporación, se redisuelve el producto en DCM y se vuelve a evaporar. Esta etapa se repite dos veces más, tras las cuales se obtienen 1191 mg (3.015 mmol) del producto interme- dio N-Boc protegido.

El producto se caracteriza por : a) CCF, con CHC13/MeOH/AcOH 85 : 10 : 5 como fase móvil.

El Rf=0.48, no observándose señal del producto de partida. b) HPLC en gradiente de 10% a 100% de MeCN en 30 min + isocrático al 100% de MeCN durante 5 min. La pureza resultante es del 96 % (220nm). c) Espectrometría de masas (MS) por técnica FAB : Mcalculado=395, (M+H+) experimental=396.0 d) RMN (CDC13) : 7.18 (2H, d, J=8 Hz) 7.09 (2H, d, J=8 Hz), 5.54 (1H, d, J= 11.2 Hz), 4.44 (1H, d, J=8.3 Hz), 3.69 (1H, d, J=11.2 Hz), 3.57 (1H, d, J=11.2 Hz), 3.75-3.98 (4H, sa), 2.32 (3H, s), 1.26-2.19 (4H, sa), 1.46 (9H, s). <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Etapa 3) El tripéptido se prepara por técnicas de síntesis en fase sólida, partiendo de 1595 mg de una

Boc-Gly-OCH2-Pam-resina (Neosystem, n° ref. RP00801) de sustitución 0.63 mmol/g. La escala de trabajo es de 1.005 mmol.

El protocolo general para la adición de los restantes aminoácidos es el siguiente : 1) Se hincha la resina con 5 lavados de 0.5 min con DCM.

2) Desprotección del grupo Boc con TFA al 40% en DCM, lxl min + 1x20 min.

3) Lavados con DCM, 5x 0.5 min.

4) Test de ninhidrina.

5) Lavados con DMF, 3xl min.

6) Acoplamiento por espacio de 1.5 horas.

7) Lavados con DMF, 3x1 min.

8) Lavados con DCM, 5x 0.5 min.

9) Test de ninhidrina.

En caso de que el test de ninhidrina re- sulte positivo en la última etapa, se procede a rea- coplar, repitiendo los pasos 5-8.

El acoplamiento se realiza con 6 equiva- lentes (eq) de DIEA, 3 eq. de Boc-aminoácido y 3 eq. de agente activante, que en nuestro caso es PyAOp (hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1-il-oxitris (pirrolidino) fosfonio). Para el acoplamiento de y-Glu se utilizó Boc-Glu- (a-OBzl).

Finalizado el ensamblaje de la secuencia, la peptidilresina resultante se somete a acidolisis con HF/p-cresol (9 : 1) durante 1 hora a 0'C. Tras la evaporación, el residuo sólido se extrae con éter anhidro y a continuación se aisla el péptido por ex- tracción con AcOH 10%. Una vez reducido el volumen por evaporación, el crudo se liofiliza y se carac- teriza por : a) HPLC en gradiente de 5% a 65% de MeCN en 30 min.

b) MS por técnica Electrospray : Mcalc=377, (M+H+)ex-=378.2 Se cuantifica el péptido contenido en el crudo por análisis de aminoácidos : m=329 mg (0.873 mmol). En todas las cuantificaciones peptídicas se utiliza el análisis de aminoácidos, añadiendo un pa- trón externo de Ile (Isoleucina) a la muestra a hidrolizar.

Se procede a la purificación del tripéptido (en dos lotes) mediante HPLC a escala preparativa. El sistema utilizado es el siguiente : -Columna : C18 Nucleosil, 200x20 mm, 120 A, 10 ) J. m.

-Eluyentes : A=H20 (+0.1 % TFA), B=MeCN (+0.1 % TFA).

-Gradiente : Isocrático 0% B durante 40 min + gradiente de 0% a 10% B en 40 min.

-Flujo : 25 ml/min.

Se obtienen en total 227 mg (0.602 mmol) del tripéptido intermedio que se caracterizan por : a) HPLC en gradiente de 5% a 45% de MeCN en 20 min. La pureza resulta ser del 95 % (220 nm). El pico minoritario a 8.4 min disminuye en proporción relativa, hasta extinguirse, al diluir progresivamente la muestra aplicada.

Por dicho motivo se concluye, que corresponde a agregación del tripéptido (y no a oxi- dación) y por tanto se considera como pro- ducto válido. b) MS por técnica Electrospray : Mcalc=377 <BR> <BR> <BR> (M+HT)exp=378.2<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Etapa 4) A una disolución de 14.2 mg (0.38 mmol) del tripéptido obtenido en la etapa 3 en 800 LL de HC1

1N se le añaden 76 pL de una disolución de NaN02 0.5M. Se mantiene la agitación en baño de ultrasoni- dos a temperatura ambiente durante 1 minuto. A con- tinuación se adicionan 80 tL de una disolución de NaOH ION. La disolución obtenida se congela y se liofiliza. El sólido obtenido se caracteriza por : 1H-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.90-8.50 (2H, sa, NH), 5.35 (1H, d, J=10 Hz, CH), 4.10-3.00 (3H, sc, CH2, CH), 1.95-1.65 (4H, sc, 2CH2).

13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 172.18 (CO-N), 171. 21 (CO-N), 168. 40 (CO-0), 63. 03 (CH2), 62.31 (C), 59. 56 (CH), 53.19 (CH), 41. 20 (CH2), 32. 94 (CH2), 31.71 (CH2), 31.41 (CH2), 27.12 (CH2).

HPLC (Método A) : X 220nm (pureza 94%) ; 334nm (pureza 95%) <BR> <BR> <BR> UV : X 346 nm s (H20) 502 cm-1 mol-1 L<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Ejemplo 5.-Obtención de N [N-y-L-glutamil-2-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> amino-2- (4- (4-S-nitrosomercapto-l- metilpiperidin)) acetil] glicina (5). Etapa 1) En un matraz de 100 mL provisto de agi- tación magnética se mezclan 6.4 g (23 mmol) de di-

clorhidrato del ácido 2-amino-2- (4- (4-mercapto-l- metilpiperidin)) acético, 4.3 g (23 mmol) de a- bromo-p-xileno y 40 mL de una mezcla H20/EtOH 1 : 1.

Se añaden 13 mL de trietilamina, se crea una atmós- fera de argon y se agita la mezcla durante 42 h a temperatura ambiente. De la disolución resultante se elimina el disolvente a presión reducida y al crudo obtenido se le añaden 20 mL de EtOH absoluto. Se ob- tiene un sólido que se filtra y se lava con EtOH ab- soluto y EtOEt sucesivamente. Se seca a presión re- ducida. Se obtienen 2.11 g del producto intermedio, clorhidrato del ácido 2-amino-2- (4- (4- (p-metilben- cilmercapto)-1-metilpiperidin)) acético. Rendimiento : 29.6.

El espectro NMR se registra en D20 y se toma como referencia 4.75 ppm para HDO.

1H-RMN (200 Mhz, D20) : 7.28 (2H, d, J=8 Hz, CHar), 7.15 (2H, d, J=8 Hz, Char), 3.64-3.74 (2H, sc, CH2-Car), 3.62 (1H, s, CH-N), 3.4-3.1 (4H, sc,, CH2-N), 2.76 (3H, s, CH3-N), 2.24 (3H, s, CH3), 2.15- 1.92 (4H, sc, CH2).

13C-RMN (50 Mhz, D20) : 173.15 (CO), 141.00 (Car), 136.39 (Car), 132. 58 (CHar), 131.95 (CHar), 63.57 (CH-N), 52.48 (CH2) +, 50.65 (C), 45.66 (CH3-N), 34.05 (CH2), 32.35 (CH2), 31.28 (CH2), 22.77 (CH3).

Etapa 2) Se parte de 1016 mg (2.958 mmol) del inter- medio obtenido en la etapa anterior y se procede de la manera ya descrita en la etapa 2 del ejemplo 4.

Se obtienen 1016 mg (2.490 mmol) del intermedio N- Boc protegido que se caracteriza por : a) CCF (fase móvil CHCI3/MeOH/AcOH 85 : 10 : 5). Rf= 0.32, sin observarse señal del producto de partida.

b) HPLC en gradiente de 10% a 100% de MeCN en 30 min. La pureza es del 96% (220 nm). c) MS por técnica FAB : MCalc=408 (M+H+) eXp=408.9 d) MS por técnica Electrospray : (M+H) ex=409.3 <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Etapa 3) El intermedio tripéptido se obtiene, utili- zando el método descrito en la etapa 3 del ejemplo 4, partiendo de 794 mg de la resina ya mencionada.

La escala de trabajo es de 0.5 mmol. Debido a las dificultades de solubilización que presenta el Boc-derivado se opta por utilizar N-metilmorfolina como base (3 equivalentes) en lugar de DIEA en el acoplamiento del mencionado aminoácido. Después de la incorporación de yGlu, el tripéptido queda ensam- blado y se procede a la escisión del enlace péptido-resina por acidolisis al igual que en los casos anteriores. Se obtiene finalmente un crudo en AcOH 10% que se liofiliza y se cuantifica posterior- mente, obteniendo un resultado de 137 mg (0.351 mmol) del tripéptido intermedio, que se caracteriza por : a) HPLC, gradiente isocrático 0% durante 10 min + 5% o65% de MeCN en 30 min. Se constata que el producto inyectado en disolución acé- tica elue con el frente, así pues, se hace necesario liofilizar alícuotas para eliminar este ácido y redisolver el liofilizado en HCl lmM. De esta forma puede observarse cro- matográficamente el péptido, que elue a 6.8 min en el gradiente utilizado. b) MS por técnica Electrospray : Mcalc=390 (M+H+)exp=391.2 Se procede entonces a la purificación del crudo, mediante HPLC a escala preparativa con los

parámetros ya descritos en el ejemplo 4. Se aplica también un isocrático al 0% de B durante 40 min se- guido de un gradiente de 0% a 10% de B en 40 min. De esta forma se obtiene la cantidad de 107 mg (0.274 mmol) de producto, caracterizado mediante : a) HPLC en gradiente de 0% a 0% en 10 min mas 0% a 30% en 20 min. La pureza es del 94% (220 nm). Se comprueba que el pico adicional a 8.0 min corresponde también en este caso a agre- gación, asignándose por ello como producto correcto. b) MS por técnica Electrospray : Mcalc=390 <BR> <BR> <BR> (M+H+) exp=391.1<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Etapa 4) Partiendo de 10.0 mg (0.026 mmol) del in- termedio tripéptido obtenido en la etapa anterior, se efectúa la nitrosación, de la manera ya descrita en la etapa 4 del ejemplo 4, utilizando 52 pL de NaN02 0.5 M. El producto obtenido se caracteriza por : 13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 171.57 (CO-N), 170.99 (CO-N), 170.76 (CO-N), 168.20 (CO-0), 60.23 (C), 59.53 (CH), 51.57 (CH), 49.02 (CH2), 42.20 (CH3), 41.59 (CH2), 30.49 (CH2), 29.75 (CH2), 29.31 (CH2), 26.05 (CH2) HPLC (Método B) : k 220 nm (pureza 74%); X 334 nm (pureza 88%).

UV : X 346 nm s (H20) 198 cm-1 mol-1 L Ejemplo 6.-Obtención de N [N-y-L-glutamil-2- <BR> <BR> <BR> <BR> amino-3-ben-cil-3- (4-metilbencil-S-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> nitrosomercapto)-4- fenilbutanoil] glicina (6).

Etapa 1) En un matraz de 100 mL provisto de agi- tación magnética se mezclan 1.25 g (3.7mmol) de clorhidrato del ácido 2-amino-3-bencil-3-mercapto-4- fenilbutanoico, 0.68 g (3.7 mmol) de a-bromo-p- xileno y 40 mL de una mezcla H20/EtOH 1 : 1. Se añaden 1.6 mL de trietilamina y se disuelve la mayor parte del sólido en suspensión. Se crea una atmós- fera de argon y se agita la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Se elimina el etanol y parte de la trietilamina a presión reducida. La suspensión acuosa resultante se filtra obteniéndose un sólido blanco. Se purifica mediante cromatografía de co- lumna en fase reversa con CH3CN-H20. Se añaden 100 mL de MeOH-ácido clorhídrico concentrado 1 : 1 sobre el sólido obtenido y se elimina el disolvente a pre- sión. Se obtienen 0.5 g del producto intermedio, clorhidrato del ácido 2-amino-3-bencil-3- (4- metilbencilmercapto)-4-fenilbutanóico.

1H-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.95-8.50 (3H, sa, H3N+), 7.45-7.25 (10H, sc, CHar), 7.08 (2H, d, J=10 Hz, CHar), 6.98 (2H, d, J=10 Hz, CHar) 4.05 (1H, s, CH-N), 3.55-3.0 (4H, sc, CH2-C6H5, CH2-Car), 2.90- 2.60 (2H, sc, CH2), 2.20 (3H, s, CH3).

13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 168.70 (CO), 136.53 (Car), 136.00 (Car), 134.94 (Car), 132.50 (Car), 131.18 (CHar), 129.169 (CHar), 128.90 (CHar), 128.26 (CHar), 128.02 (CHar), 127.07 (CHar), 57.06 (CH-N), 53.64 (C) 42.22 (CH2), 41.65 (CH2), 31.90 (CH2-S <BR> <BR> <BR> <BR> 20.48 (CH3).<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Etapa 2) Se parte de dos fracciones del intermedio obtenido en la etapa anterior (180 mg del 83% de pureza y 530 mg del 94% de pureza) y se procede de la manera ya descrita en la etapa 2 del ejemplo 4.

Se obtienen 733 mg (1.45 mmol) del intermedio N-Boc protegido que se caracteriza por : a) CCF (CHC13-MeOH-HOAc 85 : 10 : 5), Rf=0.63. b) HPLC Gradiente de 10% a 100% MeCN, 30 min, iso- crático 100%, 5 min, pureza : 91% (220 nm) c) EM-MALDI-TOF (Espectro de masas) : Matriz de ácido dihidroxibenzoico, MCalc=505 (M+H+) eXp-528.585 (M+Na) d) RMN : Se confirma la presencia del grupo Boc.

Etapa 3) El intermedio tripéptido se obtiene, utili- zando el método descrito en la etapa 3 del ejemplo 4, partiendo de 0.43 mmol de la resina ya mencio- nada. Tras la etapa de escisión acidolítica se aisla un crudo que contiene 14.4 mg (29.96 jn. mol) de inter- medio tripéptido que se caracteriza por : a) HPLC analítica gradiente de 5% a 65% en 30 min, pureza aproximada 95%. b) EM-electrospray Mcalc=487 (M+H+), Mexp=488.3 Etapa 4) Partiendo de 5.7 mg (0.012 mmol) del inter- medio tripéptido obtenido en la etapa anterior, se efectúa la nitrosación, de la manera ya descrita en

la etapa 4 del ejemplo 4, utilizando 24 pL de NaNO2 0.5 M. El producto obtenido se caracteriza por : HPLC (Método A) : X 220 nm pureza 68%; X 334 nm pureza 86%.

UV : X 345 nm s (H20) 368 cm-1 mol-1 L.

Ejemplo 7.-Ensayos in vitro de vasodilatación.

La metodología seguida en los ensayos es substancialmente coincidente con la descrita en las siguientes referencias bibliográficas : * Furchgot, R. F."Methods in nitric oxide re- search". Feelisch & Stamler eds. John Wiley &Sons, Chichester, England, pp 567-581.

* Trongvanichnam, K, et al. Jpn J. Pharmacol.

1996; 71 : 167-173.

* Salas, E., et al. Eur. J. Pharmacol. 1994; 258 : 47-55.

Los diferentes compuestos se ensayan a cinco concentraciones diferentes, en un rango de concentraciones comprendido entre 0,001 y 10 mM, utilizando de 6 a 9 anillos arteriales para cada compuesto. Los resultados obtenidos se comparan con los proporcionados por el S-nitrosoglutatión (GSNO), usado como producto de referencia.

Los resultados se exponen a continuación en la tabla 1, y se expresan en CE50 (concentración efectiva 50), es decir la concentración de cada com- puesto ensayado que produce una vasodilatación de un 50% en el anillo arterial previamente contraído con 1 HM de norepinefrina. Tabla 1.-Ensayos de vasodilatación Compuesto (media SD) GSNO 1.56 0.55 Producto obtenido en el ejemplo 1 0. 35 0.05 Producto obtenido en el ejemplo 2 0. 024 0.003 Producto obtenido en el ejemplo 3 0.63 0.21 Producto obtenido en el ejemplo 41. 73 0.27 Producto obtenido en el ejemplo 5 1. 89 0.82

Como se observa en la tabla, todos los compuestos ensayados manifiestan una potente activi- dad vasodilatadora, similar o superior a la del pro- ducto de referencia GSNO, siendo de destacar que el compuesto 2 muestra una actividad vasodilatadora muy superior a la de dicho producto de referencia.

Ejemplo 8.-Ensayos in vitro de inhibición de la agregación de las plaquetas.

La metodología seguida en los ensayos es substancialmente coincidente con la descrita en las siguientes referencias bibliográficas : * Loscalzo J, et al. En : Methods in nitric oxide research (Feelisch M, Stamler JS, eds.) John Wiley & Sons, Chichester, Eng- land, pp 583-591.

* Radomski MW, et al. Br J Pharmacol 1987; 92 : 181-187.

* Salas E, et al. Br J Pharmacol 1994; 112 : 1071-1076.

Los compuestos se ensayan a cuatro concen- traciones distintas, utilizando de 5 a 23 donantes

de plaquetas diferentes. Los resultados obtenidos se comparan con los proporcionados por el S- nitrosoglutatión (GSNO), usado como producto de ref- erencia.

Los resultados se exponen a continuación en la tabla 2, y se expresan en CI50 (concentración inhibitoria 50), es decir la concentración de cada compuesto ensayado que inhibe en un 50% la agrega- ción obtenida con una concentración submaximal de colágeno (1 pg/mL). Tabla 2.-Ensayos de inhibición de la agregación de las plaquetas. Compuesto (media SD) GSNO 0.48 0.19 Producto obtenido en el ejemplo 1 0. 07 + 0.02 Producto obtenido en el ejemplo 2 0.19 0.02 Producto obtenido en el ejemplo 3 0.24 0.027 Producto obtenido en el ejemplo 4 0.20 0.12 Producto obtenido en el ejemplo 5 0.047 0.011 Producto obtenido en el ejemplo 6 0.35 0.11 Como se observa en la tabla 2, todos los compuestos ensayados manifiestan una potente activi- dad inhibitoria de la agregación de las plaquetas, similar o superior a la del producto de referencia GSNO, siendo de destacar que los compuestos 1 y 5 muestran una actividad inhibidora muy superior a la de dicho producto de referencia.

Ejemplo 9.-Ensayos in vitro de incremento de los niveles intraplaqueta de GMPc.

El compuesto obtenido en el ejemplo 5 (5) se ensaya in vitro para comprobar su capacidad de incrementar los niveles intraplaquetarios de GMPc en una preparación de plaquetas lavadas humanas.

La metodología seguida en los ensayos es substancialmente coincidente con la descrita en las referencias bibliográficas citadas en el ejemplo 8.

El compuesto se ensaya a cuatro concentra- ciones diferentes, utilizando 5 donantes de plaquetas distintos. Los datos obtenidos se comparan con los proporcionados por el GSNO (producto de ref- erencia) y con los valores basales. Los resultados obtenidos, que se muestran en la tabla 3, se expre- san en pmol/109 plaquetas. Tabla 3.-Ensayos de incremento de los niveles in- traplaqueta de GMPc. [pM] GMPc (pmol/109 plaquetas) GSNO Compuesto 5 3 27.6 6.0 ___ 1 2 4 0.5 0.5 0.1 10.1 1 0.4 0.5 1.33 0.38 El compuesto 5 aumenta los niveles intra- plaquetarios de GMP de manera similar a la del GSNO de referencia. Es de destacar que para valores próximos a la IC50 el compuesto 5 induce unos nive-

les de GMPc más bajos que el GSNO cuando se utilizan concentraciones próximas a su IC50- Ejemplo 10.-Ensayo in vitro de bloqueo de la in- hibición de la agregación de las plaquetas.

La metodología seguida en los ensayos es substancialmente coincidente con la descrita en las referencias bibliográficas citadas en el ejemplo 8, completada con la referencia : * Moro MA, et al. Pr Nat Acad Sc USA. 1996 ; 93 : 1480-5.

El ODQ se ensaya in vitro para bloquear la inhibición de la agregación de las plaquetas en una preparación de plaquetas lavadas humanas lograda por los compuestos obtenidos.

El compuesto obtenido en el ejemplo 5 (5) se ensaya a tres concentraciones diferentes, en presencia o ausencia de ODQ (1 uM), utilizando 5 do- nantes de plaquetas diferentes. Los resultados ob- tenidos se comparan con los proporcionados por el producto de referencia (GSNO) y con los valores en ausencia de ODQ. Los resultados obtenidos, que se muestran en las tablas 4 y 5, se expresan como por- centaje de inhibición sobre la agregación maxima.

Tabla 4.-Producto de reterencia (GSNO) [uM] I inhibición sin ODQ % inhibición con ODQ 192. 650. 932. 650.9 0.3 79. 3317 3. 33 0. 1 34. 2+25 0 Tabla 5.-Compuesto 5 [pM] % inhibición sin ODQ % inhibición con ODQ 0. 3 96 0 0.1 96 0 0.03 831. 4 0.01 17 0 0.003 0 0

El ODQ (1 uM) es capaz de bloquear el efecto inhibidor del GSNO y del compuesto 5 cuando se utiliza la dosis IC50 de los compuestos. A dosis superiores a las de la IC50, el efecto inhibidor de la agregación es mejor bloqueado en el caso del com- puesto 5 que en el caso del compuesto de referencia.