하나의 양태로서, (a) 에탄올 또는 니코틴을 포함하는 배양액 내에 발달 초기의 뇌세포를 배양하는 단계; GABA _B 수용체 및 단백질 키나제 A-α의 발현이 증가된 세포를 선별하는 단계; (c) 선별된 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (d) GABA _B 수용체 및 단백질 키나제 A-α의 발현을 감소시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 임신 중 알코올 노출에 의해 유발되는 태아 신경 질환에 대한 치료제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "임신 중 알코올 노출에 의해 유발되는 태아 신경 질환"이란, 임신 중 태아의 알코올 노출에 의해 야기되는, 태아의 뇌 발달 과정에 이상이 발생하여 시각계 또는 청각계의 형성된 기형을 유발하거나 신경전달계의 기증장애 등을 일으켜 발생된 신경 질환을 의미하며, 신경 세포 분화에 치명적인 장애를 초래하여 사춘기, 성인까지 계속되는 장애를 의미한다. 태아 성장기 동안 에탄올 노출은 세포구축학적 이상을 포함한 태아알코올증후군 (fetal alcohol syndrome, FAS) 및 태아알코올효과 (fetal alcohol effect, FAE) 및 알코올 관련 신경발달 장애 (alcohol related neurodevelopmental disorders, ARANDS)의 결과로서 광범위한 구조적이고 기능적인 뇌 이상을 유발한다. 바람직하게 상기 알코올 노출에 의한 신경 질환이란, 태아 알코올 증후군, 알코올 관련 신경발달 장애, 간질 (epliepsy), 정신분열증 (schizophrenia), 공황장애 (panic disorder), 우울증 (depression), 정신지체 (mental retardation), 헌팅턴 무도병 (huntington's disease), 경직 (spasticity), 약물 중독 (drug addiction) 및 신경 퇴행성 질환 (mental degeneration)등을 포함하나, 상기 예에 의해 본 발명의 임신 중 알코올 노출에 의해 유발되는 태아 신경 질환의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 용어 "에탄올"이란, 탄소 2개의 에탄 (ethane)에서 수소 원자 하나가 하이드록시기로 치환된 알코올의 한 종류로서, 에틸알코올 (ethyl alcohol)이라고도 한다. 무색의 가연성 화합물로서 용매, 소독제, 연료 등으로 많이 사용되며, 신경계와 관련하여서 에탄올을 섭취할 경우 대뇌의 기능 억제로 인해 흥분 상태가 되고, 이후 중추신경 억제의 효과가 나타난다. 에탄올이 함유된 알코올성 음료를 지나치게 자주 마시면 습관성이 생기고 중독에 이르게 되며, 에탄올을 섭취한 모체는 태아에게 부정적 영향을 미친다고 알려져 있다. 이러한 에탄올은 예방 가능한 선천성 장애 (preventable cause of birth defects), 정신 지체 (mental retardation) 및 신경 발달 장애 (neurodevelopmental disorders)를 일으키는 주요 요인 중 하나로서, 임산부의 에탄올 섭취는 장기 인지 (long-term cognitive), 신경 행동 장애 (neurobehavioral disruption), 성장 결핍 (growth deficits), 및 간질 (epilepsy) (Berman and Hannigan, 2000; Mattson, 2001, Kelly et al., 2000, Sampson et al., 2000; Autti-Ramoet al., 2000)을 나타내는 중추 신경 시스템 (central nervous system)의 발달 (Zhou et al. 2000; McGoey et al., 2003; Guerri, 2002)에 손상을 일으키는 것으로 알려져 있으나, 임산부에 있어서 알코올이 어떠한 경로에 의해 태아의 신경질환을 야기시키는지 명확하게 규명되지 못하고 있으며, 특히 GABA _B1 수용체 및 GABA _B2 수용체와 관련하여서는 알려진 바가 없다.

본 발명에서 사용된 용어 "니코틴"이란, 가짓과의 식물에서 발견되는 식물의 2차 대사물질인 알칼로이드의 일종으로 염기성 유기 화합물이다. 주로 담배에서 많이 발견되며 토마토, 감자, 가지와 피망에도 적은량이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한 코카나무의 잎에서 코카인과 같이 나오기도 한다. 대개 말린 담배잎의 0.6%에서 3.0%정도의 무게를 구성하는 물질로 담배의 뿌리에서 합성되어 잎에 축적된다. 니코틴은 곤충에 강력한 신경독성을 발휘하여 살충기능으로 작용한다. 저농도에서 (보통 담배는 약 1mg의 니코틴을 함유) 니코틴은 포유류에게 각성효과를 보이며, 이는 흡연이 습관성이 되는 주요 요소 중의 하나가 된다. 니코틴은 자극을 유발하며 이를 통해 이완, 기민, 진정, 각성효과를 보이는데, 흡연시 니코틴이 스며든 피가 수 초(second) 이내에 폐로부터 두뇌에 전달되고, 즉각적으로 아세틸콜린, 노르에피네프린, 에피네프린, 바소프레신, 알기닌, 도파민, 베타엔돌핀 등 수많은 화학 전달물질의 배출을 자극한다. 연구 결과에 따르면, 낮은 수준의 혈중 니코틴 농도는 신경 전달을 자극하고, 높은 혈중 니코틴 농도는 활동전위의 경로를 둔화시켜 가벼운 진정 효과를 일으킨다고 알려져 있으며, 낮은 복용량의 경우 잠재적으로 두뇌의 노르에피네프린과 도파민의 활동을 강화하여 정신흥분제가 전형적으로 보여주는 마약 효과를 유발한다. 이러한 니코틴의 효과와 관련하여 니코틴과 GABA 분비 이상에 대한 연구는 알려진 바 없으며, 특히 임신 중 니코틴 노출에 의해 유발되는 태아 신경 질환과 관련하여 니코틴과 GABA와의 관계는 아직까지 명확하게 알려진 바가 없다. 본 발명자들은, 뇌 발달 초기의 세포가 니코틴에 노출되는 경우, GABA 수용체의 발현이 증가됨을 확인하는 한편, 해당 세포에 후보 물질을 투여하는 경우 GABA 수용체의 발현량이 정상으로 회복될 수 있음을 확인하였으며, 구체적으로 회복 가능한 물질이 비타민 C일 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 "GABA 수용체"란 GABA와 결합하여 이온 채널의 개발 여부를 조절함으로써, 흥분성 또는 억제성 신호를 전달한다고 알려진 단백질로서, 그 소단위체로서 GABA _A 및 GABA _B 가 존재한다고 알려져 있고, GABA _B 수용체는 다시 GABA _B1 및 GABA _B2 로 나누어질 수 있다. 이전의 연구들은 시냅스 전 GABA _B 수용체 (presynaptic GABA _B Receptor)가 흥분성 (excitatory) 및 억제성 (inhibitory) 신경전달물질 모두의 분비를 조절하는 것으로 보고하고 있다. GABA _A 및 GABA _B 수용체는 모두 신경 흥분능 (neuronal excitability) 및 간질화 (epileptogenesis)와 관련되어 있으며, 전신 경련 발작 (generalized convulsive seizures)의 조절에서 GABA _A 수용체의 관여에 대해서는 상당한 부분이 알려져 있으나 (Mohler et al., 1996), 간질 과정 (epileptic processes)에서의 GABA _B 수용체의 역할에 대해서는 잘 알려져 있지 않다 (Libri et al., 1998). 또한 GABA _B 수용체와 관련하여, 알코올 또는 니코틴과 관련된 구체적인 기작 또는, 상기 물질들이 GABAB 수용체의 발현을 조절함으로써 임신 중 태아의 신경 발달에 영향을 미칠 수 있다고 보고된 바는 없다.

본 발명의 "단백질 키나제 A-α"란, GABA 수용체에서 이차 메신저 (second messenger)로 작용한다고 알려진 단백질로서, cAMP를 포함한 다양한 세포 내 변화를 유발할 수 있고, 단백질 키나제 A-α 인산화 단계의 변화를 통해 단백질 키나제를 활성화시킬 수 있으며, 다운스트림 유전자 발현 변화를 조절할 수 있다. 급성 에탄올 노출은 cAMP-신호 네트워크의 다양한 성분을 조절하고 시험관 내에서의 연구는 에탄올이 Gαs 서브유닛 활성화의 비율을 증가시키고 아데닐사이클라제 (AC)와 Gαs의 상호작용을 증가시키며, cAMP 및 단백질 키나제 A에 대한 증가시킴을 나타낸다. GABA _B 수용체의 조절 효과는 GABA _B 수용체와 함께 관찰되는 행동변화의 기초가 된다. 본 발명에서는 이와 같이 유전자 발현을 조절하는 단백질 키나제 A-α의 약물에 대한 발현 양상을 관찰하였다 (도3 및 도 4). 이는 에탄올이 전체 단백질 키나제 A-α의 양에 어떤 영향도 끼치지 않는다는 이전의 연구와는 상이하며, 더욱이 단백질 키나제 A-α에 대한 GABA _B 수용체의 조절효과를 조사하기 위해 본 발명자들은 단백질 키나제 A-α에 대한 발현 변화를 조사한 결과, 바클로펜 및 파클로펜 처리는 에탄올 처리보다 상위에서 단백질 키나제 A-α 변화를 조절할 수 있다는 것을 밝혀내었다.

본 발명에서 사용되는 GABA _B1 수용체, GABA _B2 수용체 또는 단백질 키나제 A-α 단백질 발현량의 변화를 확인하는 방법은 당업계에서 사용되는 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 상기 물질들의 발현 확인은 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서의 발현을 확인함으로써 수행될 수 있으며, mRNA 양을 측정하기 위한 예로써 RT-PCT, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (real time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블롯 (Northern blotting) 및 DNA 칩 등을 들수 있으나, 상기 예에 의해서 확인 방법이 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질의 발현 확인은 GABA _B1 수용체 , GABA _B2 수용체 또는 단백질 키나제 A-α 단백질 각각에 대한 특이적 항체를 이용하여 면역 측정법에 의해 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역 분석법 (radioimmunoassay, RIA), 방사선 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), FACS 및 단백질 칩 (protein chip)등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한 단백질의 양을 확인하는 방법으로서 항체를 이용하는 경우에는, 표적 단백질에 특이적이고 검출 가능한 표지에 연결된 제2항체를 첨가할 수 있으며, 검출은 또한 제2항체를 첨가한 후, 제2항체에 대한 결합 친화도를 가지며, 검출 가능한 표지에 연결된 제3항체를 첨가할 수도 있다. 제2항체 또는 제3항체에 검출될 수 있는 표지는 적절한 발색성 기질과 배양시 발색을 나타내는 효소가 사용될 수 있다. 검출 가능한 부분은 분광학적, 효소적, 광화학적, 생화학적, 생체전자공학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단으로 검출가능한 조성물을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 형광 마커 및 염료, 자성 표지, 연결된 효소, 질량 분광 태그, 스핀 표지, 전자 전달 공여자 및 수용자 등이 있으나 상기 예들에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 웨스턴 블롯을 이용하여 GABA _B1 수용체 , GABA _B2 수용체 또는 단백질 키나제 A-α 발현량의 변화를 확인하였다.

본 발명에서 사용된 용어 "대조군"이란, 알코올 또는 니코틴을 투여하지 않은 세포를 가진 집단을 의미하며, 알코올 또는 니코틴을 투여하거나 투여된 실험군 개체와 GABA _B1 수용체, GABA _B2 수용체 및 단백질 키나제 A-α 단백질 발현량 비교를 위해 사용된다.

또한 본 발명에서 사용된 용어, "후보 물질" 이란 임신 중 알코올 또는 니코틴 노출에 의한 신경 질환을 치료하는 활성을 테스트할 약제를 의미하며, GABA _B1 수용체, GABA _B2 수용체 및 단백질 키나제 A-α의 발현을 직접 또는 간접적으로 변화시킴으로써 상기 질환을 치료할 수 있는 능력을 측정하는 대상으로서, 예컨대 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함한다. 이러한 후보 물질은 또한 천연 물질 뿐 아니라 합성 물질을 모두 포함한다. 바람직하게 본 발명에서는 니코틴 노출에 있어서, 후보물질로 비타민 C를 투여함으로써 GABA _B 의 발현을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 사용된 용어, "발달 초기의 뇌 세포"란 분화를 거쳐 개체로 성장하는 시기의 세포로서, 특히 뇌세포가 발달을 시작하는 임신 중기의 뇌세포이다. 이러한 발달 초기의 뇌 세포는 개체에 따른 전체적 임신 기간에 따라 달리 설정될 수 있으며, 랫트의 경우 임신 15주 내지 임신 20주 사이의 개체로부터 수득될 수 있다. 더욱 바람직하게 랫트의 경우 상기 세포는 임신 17.5주의 모체로부터 태아의 뇌세포를 분리하여 사용할 수 있다.

발달 초기의 뇌 세포에 에탄올 또는 니코틴의 투여 후 GABA _B 수용체 (GABA _B1 수용체 및 GABA _B2 수용체) 및 단백질 키나제 A-α의 발현 증가를 확인하는 한편, 상기 세포에 후보 물질을 처리하여 상기 단백질들의 발현이 감소하는 경우, 처리된 후보 물질을 임신 중 알코올 노출에 의해 유발되는 태아 신경 질환 치료제로 결정할 수 있게 된다. 바람직하게는 사용되는 뇌 세포는 신경 발달 초기의 뇌 세포를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 랫트의 신경 발달 초기 뇌 세포를 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 랫트의 임신 17.5일의 피질 및 해마로 부터 분리한 세포일 수 있고, 에탄올 또는 니코틴에 노출되는 시간은 필요에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게 노출 시간은 단기 노출 또는 장기 노출로 구분되어 그 효과를 비교 사용할 수 있고, 단기 및 장기 노출 시간의 기준은 개체의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 랫트의 경우에 있어서 단기 노출시간은 20분이고, 장기 노출시간은 1시간일 수 있으며, 관찰에 더욱 바람직한 시간은 에탄올에 20분 노출시킨 경우일 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명자들은 임신 17.5일에 시험관 내의 GABA _B1 , GABA _B2 수용체 및 단백질 키나제 A-α에서 에탄올, 바클로펜, 파클로펜, 니코틴, 비타민 C, 에탄올과 비타민 C의 병용 및 니코틴과 비타민 C의 병용에 따른 발현 변화를 측정하였다. GABA _B1 , GABA _B2 수용체는 피질 및 해마에서 차별 발현을 나타내었다. GABA _B1 , GABA _B2 수용체는 해마에서 상기 약물에 의해서 증가되었다. 피질에서 상기 수용체들은 20분 동안 상기 약물에 노출됨으로써 유의적으로 발현이 증가되었다. 1시간 동안의 노출에 의해 상기 수용체의 증가시, GABA _B1 수용체는 발현이 상당히 감소된 니코틴과 비타민 C 병용을 제외한 모든 약물에 대해서 증가된 발현을 나타낸 반면에, GABA _B2 수용체 발현은 약물 노출 1시간 후 에탄올 및 파클로펜에 대해서는 증가하였지만 다른 약물에 대해서는 현저히 감소되었다.

이러한 측정 결과는 약물 투여에 따른 피질 및 해마의 성장기 동안 GABA _B1 , GABA _B2 수용체 및 단백질 키나제 A-α의 조절 효과를 제시하고 있다. 본 발명의 측정 결과는 단백질 키나제 A-α가 GABA _B1 , GABA _B2 수용체 분포와 상당히 중복됨을 나타내고, 이는 약물 투여가 단백질 키나제 A-α 전자 조절 경로의 연관을 나타내는 GABA _B1 , GABA _B2 수용체의 영향을 규명한 것이다.

본 발명은 GABA _B1 및 GABA _B2 수용체 단백질이 피질 및 해마에서 차별 발현 패턴을 보인다는 것과 GABA _B 수용체 활성은 에탄올 및 니코틴 처리시 단백질 키나제 A-α의 발현 변화를 조절할 수 있다는 것을 증명한다. 급성 에탄올 섭취는 GABA _B 수용체 활성을 증가시킬 수 있고, 이것의 상호작용은 해마 GABAergic 시냅스의 전반적인 에탄올 민감성을 조절한다. 에탄올이 해마 및 다른 뇌 영역에서 GABA 분비를 증가시킨다는 관찰과 관련된 이러한 발견은 GABAergic 뉴런전달의 에탄올 조절의 추가 증거를 제공하고, 비타민 C는 알코올과 니코틴의 해로운 효과에 대항하는 뉴런보호 효과를 제공한다. 더욱이 이러한 결과는 초기 발달 성장기 동안 에탄올 및 니코틴 섭취로 인한 세포 분화, 이동 및 뉴런 성숙 변화에 대해 GABA _B 수용체가 관련되어 있다는 견해를 제공하고, 약물은 단백질 키나제 A-α 전사 조절 경로와 관련된 것으로 여겨지는 GABA _B 수용체에 영향을 끼친다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 비타민 C를 포함하는 임신 중 니코틴 노출에 의해 유발되는 태아 신경 질환치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 설명한 바와 같이, 니코틴에 노출시킨 발달 초기의 뇌세포는 니코틴 단독 노출에 비해 비타민 C를 병용투여하여 노출시킨 경우 GABA _B 의 발현 증가를 억제시킬 수 있음을 확인하였고, 이러한 결과를 바탕으로 태아의 신경 발달 초기에 있어서, 니코틴의 노출에 대해 비타민 C가 신경 발달 과정을 정상적으로 이루어질 수 있게 유도함으로서 니코틴의 GABA _B 발현 증가작용으로 부터 보호하는 기능을 수행할 수 있음을 확인하였다.

또한 바람직하게 본 발명의 비타민 C를 포함하는 조성물은 보다 효과적인 치료를 위하여 적절한 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 멸균 주사용액의 형태, 연고제 등의 외용제, 좌제 등으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이러한 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 경구, 정맥내, 피하, 피내, 비강내, 복강내, 근육내, 경

피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 상기 투여량에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명하다.