Die vorliegende Erfindung betrifft ein Sekretionssystem auf Basis einer Signalsequenz aus einem Hydrophobin-Protein aus Trichoderma reesei, das die Sekretion von rekombinanten Proteinen aus eukaryotischen Zellen, insbesondere Hefezellen, vermittelt. Das Sekretionssystem eignet sich besonders für die Anwendung in der Molekularbiologie und in der Biotechnologie.

Bei der Herstellung rekombinanter Proteine durch eukaryotische Zellen, wie z. B. Hefezellen wie Pichia pastoris, ist es von Vorteil, wenn das Protein aus der Zelle in das Medium sezerniert wird. Dadurch wird die Aufreinigung des Proteins erheblich erleichtert, da aufwändige Bearbeitungsschritte, wie z. B. der Aufschluss der Zellen, entfallen. Da Hefen oft nur geringe Mengen an eigenem Protein ausschleusen, ist das sezernierte rekombinante Protein außerdem im Kulturüberstand in relativer Reinheit zu finden. Dies gestattet es, das Protein mit einfachen Verfahren schnell und effizient zu reinigen.

Damit ein rekombinant zu exprimierendes Protein (Zielprotein) erfolgreich aus der Zelle ausgeschleust werden kann , muss es eine Signalsequenz enthalten, durch weiche das betreffende Protein in das Endoplasmatische Retikulum als Eintrittsstelle für den sekretorischen Pathway geleitet wird. Sofern das Zielprotein kein authentisches Sekretionssignal besitzt, wird üblicherweise das Zielprotein mittels molekularbiologischer Methoden mit einer bekannten Signalsequenz fusioniert.

Ein Peptid, welches einen effizienten Transport von rekombinanten Proteinen durch die Cytoplasmamembran ermöglicht, ist daher ein nützliches Werkzeug in der Biotechnologie. Im Stand der Technik wurde bisher hauptsächlich die Signalsequenz des Pheromons a-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae als Sekretionssignal verwendet. Die Signalsequenz der sauren Phosphatase aus Pichia pastoris gehört ebenfalls zu den kommerziell erhältlichen Sekretionssignalen (Cereghino JL, Cregg JM. 2000. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Review FEMS Microbiol. Rev. 24: 45-66).

Alternativen zu den bereits bekannten Strategien zur Sekretion sind wünschenswert, insbesondere solche, welche auf möglichst kurzen Signalpeptiden beruhen, da diese die Klonierung und Expression der entsprechenden Fusionsproteine erleichtern.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Sekretionssignale anzugeben, mit deren Hilfe die Ausschleusung bzw. der Transport von rekombinant exprimierten Proteinen aus eukaryotischen Zellen, insbesondere Hefen wie Pichia pastoris, aber auch Säugerzellen, in das Kulturmedium in vielen verschiedenen Zelltypen mit hoher Effizienz vermittelt wird.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines Peptids, dessen Aminosäuresequenz der N-terminalen Teilsequenz eines Hydrophobins aus Trichoderma reesei oder einer funktionellen Variante davon mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, entspricht, als Sekretionssignal. Das Peptid ist dabei in der Lage, die Sekretion eines heterologen Fusionsproteins aus einer eukaryotischen Wirtszelle zu vermitteln.

Hydrophobine stellen eine Familie von oberflächenaktiven Proteinen dar, welche von filamentösen Pilzen gebildet werden. Bemerkenswert ist ihre Eigenschaft, selbstständig an hydrophil/hydrophoben Grenzflächen in robusten Schichten zu assemblieren. Hydrophobine sind in der Lage, hydrophile Oberflächen hydrophob zu machen und umgekehrt. Ferner verringern Hydrophobine die Oberflächenspannung an der Grenzschicht gasförmig/flüssig.

Im Sinn der vorliegenden Erfindung ist eine N-terminale Teilsequenz eines Hydrophobins eine Teilsequenz des Hydrophobins, welche die freie, nicht an einer Peptidbindung beteiligte Aminogruppe umfasst.

Die Erfinder haben überraschend gefunden, dass unter der Verwendung von eukaryotischen Wirtszellen Fusionsproteine, die an ihrem N-Terminus eine N-terminale Teilsequenz aus einem Hydrophobin aus Trichoderma reesei enthalten, mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Sekretionssignals effizient durch den Sekretionsapparat der Wirtszelle geleitet und schließlich aus der Wirtszelle in das Kulturmedium sezerniert werden.

Insbesondere überraschend war dabei, dass die erfindungsgemäßen Sekretionssignale die Sekretion auch aus anderen Wirtsorganismen als Trichoderma reesei, aus dem die Sekretionssignale ursprünglich stammen, vermitteln, da solche Sekretionssignale üblicherweise speziesspezifisch wirken. Vorzugsweise vermitteln die erfindungsgemäßen Sekretionssignale daher die Sekretion von Fusionsproteinen aus Wirtszellen, die keine Trichoderma reese/ ^' -Zelien sind.

Vorzugsweise ist das Hydrophobin aus Trichoderma reesei ausgewählt aus den Proteinen HFBI (Genbank Accession No. P52754.1 ) und HFBII (Genbank Accession No. P79073.1 ).

Bevorzugt umfasst die N-terminale Teilsequenz wenigstens die zehn N-terminalen Aminosäuren der Aminosäuresequenz von HFBI (SEQ ID No. 1 ) oder wenigstens die fünfzehn N-terminalen Aminosäuren der Aminosäuresequenz von HFBII (SEQ I D No. 14) oder eine funktionellen Variante davon mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %.

Besonders bevorzugt ist die N-terminale Teilsequenz ausgewählt aus einer der Sequenzen der SEQ ID No. 1 bis 14 oder einer funktionellen Variante davon mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %.

SEQ ID No. 1 MKFFAIAALF

SEQ ID No. 2 MKFFAIAALF A

SEQ ID No. 3 MKFFAIAALF AA

SEQ ID No. 4 MKFFAIAALF AAA

SEQ ID No. 5 MKFFAIAALF AAAA

SEQ ID No. 6 MKFFAIAALF AAAAV

SEQ ID No. 7 MKFFAIAALF AAAAVA

SEQ ID No. 8 MKFFAIAALF AAAAVAQ

SEQ ID No. 9 MKFFAIAALF AAAAVAQP

SEQ ID No. 10 MKFFAIAALF AAAAVAQPL

SEQ ID No. 1 1 MKFFAIAALF AAAAVAQPLE

SEQ ID No. 12 MKFFAIAALF AAAAVAQPLE D

SEQ ID No. 13 MKFFAIAALF AAAAVAQPLE DR

SEQ ID No. 14 MQFFAVALFA TSALA

Im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Signalsequenzen werden unter funktionellen Varianten im Sinne dieser Erfindung Aminosäuresequenzen mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90%, verstanden, die als Sekretionssignal geeignet sind, d. h. welche die Ausschleusung von heterolog exprimierten Fusionsproteinen aus eukaryotischen Zellen, bevorzugt Hefen, besonders bevorzugt Pichia pastoris, vermitteln. Insbesondere allele Varianten sind von dem Begriff der funktionellen Variante eingeschlossen.

Bevorzugt sind Sequenzen mit den SEQ ID No. 1 bis 10, besonders bevorzugt Sequenzen mit den SEQ ID No. 1 bis 5, ganz besonders bevorzugt Sequenzen mit den SEQ ID No. 1 bis 3, oder funktionelle Varianten davon mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %.

Ein Fusionsprotein im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, das wenigstens zwei Abschnitte aufweist, die in der Natur nicht in Form von aneinander fusionierten Polypeptiden vorkommen. Die Erzeugung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins erfolgt in vitro, aber auch in vivo, durch bekannte molekularbiologische Methoden. Zu diesem Zweck werden die Protein-kodierenden Abschnitte zweier oder mehrerer Nukleinsäuren im übereinstimmenden Leseraster miteinander verbunden und als Hybrid- oder Fusionsgen in einer geeigneten Wirtszelle oder einem geeigneten zellfreien Expressionssystem exprimiert. Dazu werden vorzugsweise übliche Expressionsvektoren verwendet, die für das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodieren. Diese Expressionsvektoren werden in eine geeignete Zelle oder ein geeignetes zellfreies System eingebracht, in der bzw. dem dann das Fusionsprotein produziert wird.

Zweckmäßigerweise umfasst ein Fusionsprotein im Sinne der Erfindung wenigstens das erfindungsgemäße Sekretionssignal und ein zu exprimierendes Protein (Zielprotein).

Unter Zielprotein wird im Zusammenhang mit der Erfindung neben einem Volllängenprotein auch ein Proteinfragment, eine Proteindomäne, ein Hybridprotein oder ein Peptid verstanden.

Da Fusionsproteine per Definition artifiziell erzeugt werden und daher in dieser Form in der Natur nicht vorkommen, werden sie in Zellen üblicherweise heterolog exprimiert, d. h. die Fusionsproteine werden in Wirtszellen erzeugt, die solche Fusionsproteine natürlicherweise nicht produzieren würden. Die natürlich vorkommenden Hydrophobine aus Trichoderma reesei sind daher keine Fusionsproteine im Sinne der Erfindung.

Die neuen Sekretionssignale, welche von den Proteinen HFBI (gelegentlich auch als Hydrophobin 1 bezeichnet) bzw. HFBII (Hydrophobin 2) aus Trichoderma reesei abgeleitet sind, besitzen die Funktion einer Signalsequenz mit der Fähigkeit, ein Zielprotein , an welches die Signalsequenz N-terminal fusioniert ist, effektiv aus einer Zelle auszuschleusen. Die erfindungsgemäßen, von HFBI bzw. HFBII abgeleiteten Sekretionssignale leiten die Sekretion von Zielproteinen in eukaryotischen Zellen, bevorzug in Hefen, ein, wenn diese Signalsequenzen N-terminal an ein Zielprotein , wie z. B. Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) fusioniert werden. Die Stärke der Sekretion ist vergleichbar mit derjenigen des kommerziell erhältlichen a-Faktors-Signalpeptides.

Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Sekretionssignals werden Proteine effizient und in hohem Maß in den Kulturüberstand abgegeben. Da Hefen per se nur geringe Mengen Protein ausschleusen, ist eine Aufreinigung eines Proteins aus dem Kulturüberstand vorteilhaft wesentlich einfacher und schneller als aus dem Lysat der Zellen. Außerdem entfalten die erfindungsgemäßen Sekretionssignale ihre sekretorische Wirkung vorteilhaft in verschiedenen eukaryotischen Wirtszellen, insbesondere in Hefen.

Das erfindungsgemäße Sekretionssignal wird üblicherweise während der Sekretion aus der Wirtszelle abgespalten, so dass vorteilhafterweise nur das Zielprotein aus der Wirtszelle in das umgebende Medium abgegeben wird. Die Sekretion von Proteinen ist jedoch nicht obligat an die Abspaltung des Sekretionssignals gekoppelt. So ist es nicht zwingend notwendig, dass in jeder Art von Wirtszelle, in der das Fusionsprotein exprimiert wird, das Sekretionssignal bei der Sekretion des Fusionsproteins abgespalten wird.

Wird eine Wirtszelle zur Expression des Fusionsproteins eingesetzt, in welcher keine Abspaltung des Sekretionssignals während der Sekretion erfolgt, so kann das Zielprotein durch die Verwendung einer artifiziellen Proteaseschnittstelle erhalten werden. Diese wird zwischen das Sekretionssignal u nd das Zielprotein klon iert. Dadurch kann das Sekretionssignal nach der Aufreinigung durch eine geeignete Protease von dem Zielprotein abgespalten werden.

Das erfindungsgemäße Sekretionssignal eignet sich besonders für die rekombinante Herstellung von glykosylierten Zielproteinen. Eukaryotische Proteine sind häufig glykosyliert, d. h. sie werden nach der Translation durch spezifische Enzyme mit Zuckern verknüpft. Die Glykosylierung spielt sowohl für die Konformation als auch fü r d ie Funktion vieler eukaryotischer Proteine des sekretorischen Pathways eine bedeutende Rolle. Da Prokaryonten über kein vergleichbares Glykosylierungssystem verfügen, werden glykosylierte Proteine regelmäßig in eukaryotischen Wirtszellen exprimiert. Dies allein genügt jedoch nicht, um eine Glykosylierung zu gewährleisten. Da die Glykosylierung ausschließlich im sekretorischen Pathway stattfindet, muss sichergestellt werden, dass das rekombinant exprimierte Zielprotein auch in den sekretorischen Pathway gelangt, damit es glykosyliert werden kann. Dies ist durch die Fusionierung des Zielproteins mit dem erfindungsgemäßen Sekretionssignal vorteilhaft möglich.

Die Herstellung von Fusionsproteinen aus Zielprotein und Sekretionssignal erfolgt mit dem Fachmann geläufigen molekularen Methoden. Dazu wird ein für das Zielprotein kodierendes Nukleinsäuremolekül unter der Beachtung des Leserahmens derart an das 3'-Ende eines für ein erfindungsgemäßes Sekretionssignal kodierendes Nukleinsäuremolekül kloniert, dass ein Nukleinsäuremolekül entsteht, welches für ein Fusionsprotein kodiert, das an seinem N- Terminus das erfindungsgemäße Sekretionssignal und C-terminal davon das Zielprotein enthält.

Bestandteil der Erfindung sind daher auch die für ein erfindungsgemäßes Sekretionssignal gemäß einer der Sequenzen mit den SEQ ID No. 1 bis 14 oder einer funktionellen Variante davon kodierenden Nukleinsäuremoleküle.

Bevorzugt sind dies die Nukleinsäuremoleküle gemäß den SEQ ID No. 15 bis 28. SEQ ID No. 15 ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT

SEQ ID No. 16 ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC

SEQ ID No. 17 ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC

SEQ ID No. 18 ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT

SEQ ID No. 19 ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

SEQ ID No. 20

GTT

ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

SEQ ID No. 21

GTT GCC

ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

SEQ ID No. 22

GTT GCC CAG

ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

SEQ ID No. 23

GTT GCC CAG CCT

ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

SEQ ID No. 24

GTT GCC CAG CCT CTC

ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

SEQ ID No. 25

GTT GCC CAG CCT CTC GAG

ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

SEQ ID No. 26

GTT GCC CAG CCT CTC GAG GAC

ATG AAG TTC TTC GCC ATC GCC GCT CTC TTT GCC GCC GCT GCC

SEQ ID No. 27

GTT GCC CAG CCT CTC GAG GAC CGC

ATG CAG TTC TTC GCC GTC GCC CTC TTC L.0 ACC AGG GCC CTG

SEQ ID No. 28 GCT

Besonders bevorzugt sind die Sequenzen mit den SEQ I D No. 15 bis 24, ganz besonders bevorzugt die Sequenzen mit den SEQ ID No. 15 bis 19.

Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes existieren zahlreiche weitere Nukleinsäuremoleküle, welche für die erfindungsgemäßen Sekretionssignale kodieren und die ebenfalls von der Erfindung umfasst sind und für den Fachmann leicht ableitbar sind.

Bestandteil der Erfindung sind desweiteren Fusionsproteine, welche ein erfindungsgemäßes Sekretionssignal und ein Zielprotein umfassen, sowie die für solche Fusionsproteine kodierenden Nukleinsäuremoleküle. Das Fusionsprotein enthält gegebenenfalls weitere Abschnitte, wie z. B. eine Proteaseschnittstelle oder einen Proteintag, die sich entweder zwischen dem Sekretionssignal und dem Zielprotein oder C-terminal vom Zielprotein befinden können.

Das 5'-Ende der für das Zielprotein kodierenden Nukleinsäure muss daher nicht direkt und unmittelbar an das 3'-Ende des für das erfindungsgemäße Sekretionssignal kodierenden Nukleinsäuremoleküls kloniert sein. Gegebenenfalls befinden sich dazwischen noch andere Nukleinsäureabschnitte, die entweder die Funktion eines Linkers, d. h. eines Verbindungsstücks, übernehmen oder die für funktionelle Aminosäuresequenzen kodieren, welche im zu exprimierenden Fusionsprotein bestimmte Aufgaben erfüllen, beispielsweise eine Proteaseschnittstelle oder eine Antikörperbindungsstelle (z. B. Myc-Tag, HA-Tag).

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Fusionsproteine posttranslational modifiziert, z. B. glykosyliert, phosphoryliert oder acetyliert, sein.

Vorteilhaft sind die neu entwickelten Sekretionssignale sehr kurz und durch einen geeigneten Primer artifiziell vor jedes beliebige Nukleinsäuremolekül und in jeden beliebigen Vektor klonierbar. Sie sind somit molekularbiologisch extrem einfach handhabbar.

Bestandteil der Erfindung ist daher auch die Verwendung eines Oligonukleotids, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das zu einem für ein Sekretionssignal gemäß den SEQ ID No. 1 bis 13 kodierenden Nukleinsäuremolekül komplementär ist, als Primer in einer Polymerasekettenreaktion (PCR, Polymerase chain reaction).

Mittels der Polymerasekettenreaktion können Nukleinsäuremoleküle amplifiziert, d . h . vermehrt, werden. Primer enthalten eine Nukleotidsequenz, die zu einem flankierenden Abschnitt des zu amplifizierenden Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, und dienen in der Polymerasekettenreaktion nach Hybridisation mit der zu amplifizierenden Nukleotidsequenz als Startpunkt für die Nukleinsäure-replizierenden Enzyme, wie z. B. die DNA-Polymerase.

Um ein für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kodierendes Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, umfasst ein solches Oligonukleotid bevorzugt zusätzlich eine mindestens 12 Nukleotide lange Sequenz, welche zu dem 5'-Ende des zu amplifizierenden, für das Zielprotein kodierenden Nukleinsäuremoleküls komplementär ist und die Hybridisierung des Primers mit der zu amplifizierenden Sequenz erlaubt.

Gegebenenfalls enthält das Oligonukleotid Schnittstellen für Restriktionsenzyme, um nach abgeschlossener Polymerasekettenreaktion d i e Kl on i e ru n g des amplifizierten Nukleinsäuremoleküls in einen Klonierungsvektor oder Expressionsvektor bzw. eine Expressionskassette zu ermöglichen. Das Oligonukleotid ist bevorzugt entweder eine Desoxyribonukleinsäure, eine Ribonukleinsäure oder eine andere Nukleinsäure, beispielsweise mit einem artifiziellen Rückgrat, wie z. B. Peptidnukleinsäure (PNA) oder Morpholino.

Das Fusionsprotein aus Sekretionssignal und Zielprotein wird nach der Expression in der Wirtszelle in das die Wirtszelle umgebende Medium transportiert. Dazu muss die für dieses Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure in einer Wirtszelle exprimiert werden. Gegenstand der Erfindung ist daher auch eine Expressionskassette, ein Expressionsvektor oder ein artifizielles Chromosom, die eine für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kodierende Nukleinsäuremolekül umfassen.

Artifizielle Chromosomen sind Vektoren, die natürlichen Chromosomen nachgebildet sind und insbesondere zur genetischen Modifikation von Hefen verwendet werden. Sie umfassen Sequenzelemente, welche für die Stabilität und Vermehrung des Chromosoms notwendig sind: Replikationsursprungsorte, ein Centromer, das die Verteilung auf die Tochterzellen gewährleistet, und Telomersequenzen, welche die Enden des artifiziellen Chromosoms bilden.

Eine erfindungsgemäße Expressionskassette, ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor oder ein erfindungsgemäßes artifizielles Chromosom enthält zweckmäßigerweise einen Promotor, d. h. eine Nukleotidsequenz, welche die regulierte Expression der für das erfindungsgemäße Expressionsprotein kodierenden Nukleinsäure ermöglicht. Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Expressionsvektoren oder artifiziellen Chromosomen enthalten bevorzugt weitere funktionale Sequenzbereiche, wie z. B. eine Replikationsstartpunkt, Operatoren, Terminationssignale, oder für Selektionsmarker, Repressoren oder Aktivatoren kodierende Nukleotidsequenzen.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine eukaryotische Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Expressionskassette, einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor oder ein erfindungsgemäßes artifizielles Chromosom umfasst. Der Begriff Wirtszelle umfasst tra nsient (d . h . vorü bergehend) transfizierte Zellen (z. B. durch mRNA), plasmid- transformierte Wirtszellen oder artifizielle Chromosomen enthaltende Wirtszellen sowie auch Wi rtsze l l en , i n d e n e n d i e erfi n d u n g sg e m ä ße Expressionskassette oder der Expressionsvektor stabil in das Genom integriert ist. Der Begriff Wirtszelle umfasst bevorzugt keine humanen embryonalen Stammzellen.

Bevorzugte Wirtszellen sind Hefen, insbesondere Pichia pastoris. Aber auch die Verwendung anderer dem Fachmann geläufiger Hefen, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Hansenula polymorpha ist möglich. Außerdem sind Zellen höherer Eukaryonten, wie z. B. humane Zellen, beispielsweise HeLa-Zellen (Zellen des Zervix-Karzinoms) als Wirtszellen geeignet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors oder eines erfindungsgemäßen artifiziellen Chromosoms zur Transformation oder Transfektion von eukaryotischen Wirtszellen sowie die Verwendung der so erzeugten eukaryotischen Wirtszellen zur rekombinanten Expression eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.

Anhand nachfolgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken.

Figur 1 zeigt einen Western Blot. EGFP, welches C-terminal mit einem c-myc-Tag markiert war, wurde mittels eines Anti-c-myc-Anti körpers detektiert. Fig. 1 a) zeigt Proteine nach Zellaufschluss, Fig. 1 b) Proteine aus dem Kultur-Überstand (1 .8 ml_ der TCA-Fällung).

Fig. 2 zeigt die Mittelwerte der Fluoreszenz, die intrazellulär in Pichia pastoris mittels Flowzytometer gemessen wurde. In Zellen, in welchen EGFP mit dem erfindungsgemäßen Sekretionssignal fusioniert war, ist das intrazelluläre Fluoreszenzsignal im Vergleich zu Zellen, die EGFP ohne Sekretionssignal exprimierten, deutlich reduziert.

Fig. 3 zeigt die Mittelwerte der Fluoreszenz, die intrazellulär in S. cerevisiae mittels Flowzytometer gemessen wurde.

Fig. 4 zeigt eine mikroskopische Aufnahme der S. cerevisiae Kontrollstämme (alpha-EGFP = Kontrollstamm für Sekretion, EGFP = Kontrollstamm für intrazelluläre Expression).

Fig. 5 zeigt eine mikroskopische Aufnahme der S. cerevisiae Stämme, welche EGFP fusioniert mit der kurzen (K-EGFP) und der langen (L-EGFP) Signalsequenz des HFBI exprimieren.

Fig. 6 zeigt eine mikroskopische Aufnahme eines S. cerevisiae Stamms, welcher EGFP fusioniert mit der Signalsequenz des HFBII exprimiert.

Fig. 7 zeigt die Mittelwerte der Fluoreszenz, die intrazellulär in S. pombe mittels Flowzytometer gemessen wurde.

Fig. 8 zeigt eine mikroskopische Aufnahme eines S. pombe Stamms mit intrazellulärer EGFP-Expression. Fig. 9 zeigt mikroskopische Aufnahmen von S. pombe Stämmen, die EGFP exprimieren, welches mit der kurzen (K-EGFP) Signalsequenz des HFBI fusioniert ist.

Fig.10 zeigt mikroskopische Aufnahmen von S. pombe Stämmen, die EGFP exprimieren, welches mit der langen (L-EGFP) Signalsequenz des HFBI fusioniert ist.

Fig. 11 zeigt mikroskopische Aufnahmen eines S. pombe Stammes, der EGFP exprimiert, das mit der Signalsequenz des HFBII (h2-EGFP) fusioniert ist.

Fig. 12 ze i gt ei n e mikroskopische Untersuchung von HeLa-Zellen, welche EGFP exprimieren, das mit der langen Signalsequenz des HFBI (L-EGFP) bzw. mit keiner Signalsequenz (EGFP) fusioniert ist.

Ausführungsbeispiele:

Auf experimenteller Ebene wurden DNA-Konstrukte mittels molekularbiologischer Methoden hergesteilt, welche für Fusionsproteine kodieren, die N-terminai eines der angegebenen Sekretionssignale enthalten:

L- Sekretionssignai (lang) SEQ ID No. 27

S'-ATGAAGTTCTTCGCCATCGCCGCTCTCTTTGCCGCCGCTGCCGTTGCCCAGCCT CTC GAGGACCGC-3'

K-Sekretionssignal (kurz) SEQ. ID No. 21

5'-ATGAAGTTCTTCGCCATCGCCGCTCTCTTTGCCGCCGCTGCCGTTGCC-3' h2-EGFP (Sekretionssignai HFBII) SEQ. ID No. 28

5'-ATGCAGTTCTTCGCCGTCGCCCTCTTCGCCACCAGCGCCCTGGCT-3'

Als beispielhaftes Zielprotein diente EGFP. Die entsprechenden Konstrukte wurden mit den jeweiligen Negativkontrollen (EGFP ohne Sekretionssignai) und ggf. auch Positivkontrollen (alpha-EGFP = EGFP, das mit dem kommerziell erhältlichen alpha-Faktor-Signalpeptid fusioniert war) in die jeweiligen Hefen (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe) sowie in humane HeLa Zellen transformiert. Beispiel 1 : Sekretion von Fusionsprotein aus der Hefe Pichia pastoris

In Fig. 1 ist ein Western-Blot mit anschließender immunologischer Detektion (c-Myc-Tag am E G F P ) d a rg este l lt . D i eser B l ot verd e u tl i ch t d as P ote n ti a l d er n e u e n tdeckten Sekretionssequenzen. Der Überstand der Kultur wurde nach der Kultivierung der Stämme durch Zentrifugation von den Zellen getrennt. Im Teil a der Fig. 1 ist der in den Zellen befindliche EGFP-Anteil dargestellt. Es wurden jeweils 20 pg Proteine des Lysats der Zellen aufgetragen. Teil b dokumentiert die in den Kulturüberstand sezernierten Mengen an EGFP. Es wurden die aus dem Kulturüberstand gefällten Proteine aufgetragen.

Als Kontrolle für die Expression von sezerniertem EGFP wurde das Reporterprotein EGFP mit dem kommerziellen α-Faktor fusioniert und in den Hefestämmen Pichia pastoris SMD1 168H und Pichia pastoris GS1 15 unter der Kontrolle des GAP-Promotors exprimiert und analysiert (alpha-EGFP; Spur 4 und 5).

Wie in Fig. 1 zu erkennen ist, wird EGFP in den Zellen hergestellt (Fig.1 a) und effektiv ausgeschleust (Fig. 1 b). Der Kontrollstamm (Pichia pastoris GS1 15) für die Expression von nicht-sezernierte m E G F P ( S p u r 6 ) , i n d e m EG FP ohne ei n erfi nd u ngsgemäßes Sekretionssignal unter der Kontrolle des GAP-Promotors exprimiert wird, zeigt im Gegensatz dazu kein Signal in Teil b, sondern nur in Fig. 1 a, also im Lysat der Zellen.

Die Spur 7 zeigt als Kontrolle die entsprechenden Fraktionen von Wildtyp-Zellen des Stammes Pichia pastoris SMD 1 168H, welche weder im Lysat der Zellen noch im Überstand ein Signal zeigen.

Spur 1 zeigt den Stamm, der die kurze Signalsequenz (K) am N-Terminus des EGFP trägt. Hier ist im Lysat der Zellen (Fig.1 a) und auch im Überstand (Fig. 1 b) ein deutliches Signal zu erkennen. Das Sekretionssignal führt offensichtlich zu einer sehr effektiven Sekretion von EGFP. Auch im Fall der Zellen, in denen die lange Signalsequenz (L) mit EGFP fusioniert ist (Spur 2), oder im Fall des h2-EGFP Fusionskonstruktes (Spur 3), ist zu erkennen, dass sich ein hoher Anteil an gebildetem EGFP außerhalb der entsprechenden Zellen befindet.

Die Ergebnisse der Analysen mittels Flowzytometer (Fig. 2) zeigen im Fall des intrazellulär exprimierenden Kontrollstamms (EGFP ohne Sekretionssignal) ein starkes Fluoreszenzsignal, welches vom EGFP in den Zellen ausgelöst wird.

Im Fall der Kontrollstämme für Sekretion (alpha-EGFP) ist hingegen eine deutlich geringere Fluoreszenzintensität messbar, welches auf ein effizientes Ausschleusen des Zielproteins aus den Zellen hindeutet. Die von HFBI abgeleiteten Signalsequenzen (L-EGFP und K- EGFP) sowie die vom HFBII abgeleitete Signalsequenz (h2-EGFP) zeigen ebenfalls in der Flowzytometer-Messung sehr geringe Fluoreszenzintensitäten, welche auf eine Sekretion des Zielproteins EGFP in den Kulturüberstand schließen lassen.

Beide Sekretionssignale L und K, abgeleitet vom Hydrophobin HFBI aus Trichoderma reesei, sowie das h2-Sekretionssignal, abgeleitet vom Hydrophobin HFBII aus Trichoderma reesei, sind in der Hefe Pichia pastoris bezüglich ihrer Effizienz mit dem kommerziell erhältlichen a- Faktor vergleichbar.

Ausführungsbeispiel 2: Sekretion von Fusionsprotein aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Die Ergebnisse der Flowzytometer-Analyse (Fig. 3) zeigen eine effiziente Ausschleusung des Modellproteins EG FP aus den Zel len . Der Kontrollstamm für die intrazelluläre Expression des EGFP (Fig. 3, EGFP, Säule 4) zeigt ein Fluoreszenzsignal von großer Intensität, wohingegen der Kontrollstamm für Sekretion (Fig. 3, alpha-EGFP, Säule 5) ein geringes Signal zeigt, was auf die Sekretion des EGFP aus der Zelle in das Medium schließen lässt. Als Negativkontrolle wurde der Wild typstamm wt-BY4741 verwendet, der kein EGFP exprimiert (Fig. 3, EGFP, Säule 6).

Das EGFP verbleibt im Fall des intrazellulär exprimierenden Stamms in der Zelle und akkumuliert dort. Wird EGFP aus der Zelle sezerniert, dann weist diese - wie an dem Kontrollstamm alpha-EGFP zu sehen - nur eine sehr geringe Fluoreszenz auf.

Die Stäm me mit den vom HFBI und HFBII abgeleiteten Sekretionssignalen (K-EGFP, L-EGFP und h2-EGFP) liegen in ihrer Fluoreszenzintensität eher im Bereich des Kontrollstamms für Sekretion (alpha-EGFP). Die mikroskopischen Aufnahmen verdeutlichen dies:

Fig. 4 zeigt die Kontrollstämme. Im Fall des alpha-EGFP Stamms, der das EGFP mit Hilfe des alpha-Faktor-Sekretionssignals sezerniert, ist deutlich zu sehen, dass das EG FP in Vakuolen-ähnlichen Strukturen zu finden ist. Dies legt nahe, dass es in den sekretorischen Pathway der Hefezelle gelangt und ausgeschleust wird. Der Kontrollstamm für intrazelluläre EGFP-Expression ( E G F P ) zeigt ein e d iffuse Vertei l u n g d es E G F Ps i m gesamten Cytoplasma.

Die Stämme mit den von Hydrophobin abgeleiteten Sekretionssignalen (K-EGFP, L-EGFP und h2-EGFP) sind in Fig. 5 und 6 dargestellt. Das EGFP befindet sich wie im Falle des alpha-EGFP in allen drei Stämmen in Vakuolen-ähnlichen Strukturen der Zellen. Dies deutet auf eine gleiche Prozessierung bzw. Sekretion des EGFP hin.

Die Versuchsergebnisse aus Flowzytometrie und Mikroskopie lassen darauf schließen, dass die neuartigen Sekretionssignale auch im Fall von S. cerevisiae zu effizienten Sekretion rekombinanter Proteine führen.

Ausführunqsbeispiel 3: Sekretion aus der Hefe Schizosaccharomyces pombe

In S. pombe wurden analoge Ergebnisse zu den zuvor beschrieben Experimenten mit S. cerevisiae erhalten. Sowohl die Ergebnisse der Flowzytometrie-Messungen als auch die der mikroskopischen Untersuchungen zeigen, dass das EGFP in S. pombe Stämmen, in denen EGFP fusioniert mit den neuartigen Sekretionssignalen (K-EGFP, L-EGFP und h2- EGFP) exprimiert wird, in den sekretorischen Pathway der Hefe gelangt und effizient aus den Zellen ausgeschleust wird. Es kommt zu einer Verminderung der Fluoreszenzintensität im Vergleich zum intrazellulär exprimierenden Kontrollstamm (EGFP) (Fig. 7). Als Negativkontrolle wurde der Wildtyp-Stamm wt-HE620 verwendet, der kein EGFP exprimiert.

Mikroskopische Aufnahmen zeigen eindeutig dass sich das EGFP in den mit den neuartigen Konstrukten transformierten Zellen ( K-EGFP, L-EGFP und h2-EGFP) (Fig. 9 bis 1 1 ) in Kompartimenten-ähnlichen Strukturen befindet, während es in der Kontrolle (EGFP) frei im Cytoplasma verteilt ist (Fig. 8). Das lässt den Rückschluss zu, dass EGFP in diesen Zellen in den sekretorischen Pathway gelangt.

Ausführungsbeispiel 4: Sekretion aus humanen HeLa Zellen

Au ch i m Fa l l d es h u ma n en Express ionssystems in HeLa Zellen konnte mittels mikroskopischer Untersuchungen (Fig. 12) gezeigt werden, dass die Signalsequenz des HFBI (L-EGFP) zu einer Vermittlung des Zielproteins in den sekretorischen Pathway (EGFP befindet sich in Vesikeln) führt, was auf eine effiziente Ausschleusung des Proteins schließen lässt. Im Vergleich dazu zeigen intrazellulär exprimierende HeLa Zellen eine Lokalisation des EGFPs im gesamten Innenraum der Zellen.