SARGASSUM MUTICUM

DESCRIPCIÓN

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la horticultura. En particular, al tratamiento de semillas vegetales para promover la germinación y el desarrollo de la planta en los primeros estadios de crecimiento.

Antecedentes de la invención

El tratamiento de semillas utilizando recubrimientos es una práctica común en horticultura. Los recubrimientos se aplican en la superficie de la semilla para protegerla y mejorar las condiciones de siembra; por ejemplo, a través del tratamiento de superficie con pesticidas para combatir enfermedades e insectos plaga, o el recubrimiento con agentes para retrasar la germinación de las semillas o para mejorar su capacidad para resistir a la sequía, calor, salinidad del suelo u otros factores externos. Otro objetivo de los recubrimientos es incrementar el peso de la semilla para facilitar su manejo.

Cuando el recubrimiento modifica claramente el tamaño y la forma de la semilla, el tipo de tratamiento se conoce como pildoración.

Hasta ahora el recubrimiento de semillas pildoradas ha comprendido ingredientes como arcilla roja, arcilla, perlita, harina fósil, carbonato cálcico, talco, hidróxido cálcico, hidróxido de aluminio o caolín, con o sin la adición de un aglutinante. El recubrimiento de semillas pildoradas suele además comprender sustancias como nutrientes y pesticidas para favorecer el desarrollo de la semilla. En estos casos, las semillas se recubren con un agente activo triturado o en forma de mezcla en polvo, o bien disuelto en una disolución o suspensión con la que se trata la superficie de las semillas.

Aunque el uso de sustancias de síntesis química suele ser eficaz y económico, presenta también grandes inconvenientes ambientales y sanitarios. Con mayor frecuencia, el consumo de alimentos está dirigido por aspectos no sólo relacionados con la seguridad del producto, sino con aspectos sanitarios, nutricionales y ambientales. Se buscan por ello técnicas de producción más naturales que reduzcan el uso de sustancias de síntesis química.

Una forma sostenible a largo plazo para el control de fitopatógenos es el empleo de agentes biológicos o de biocontrol.

Existen formulaciones de agentes biológicos formados por bacterias como Agrobacterium , Pseudomonas, Streptomyces y Bacillus, y por hongos como Gliocladium, Trichoderma, Ampelomyces, Candida y Coniothyrium. Sin embargo, la acción de dichos agentes de biocontrol depende de la cantidad de carbono y/o materia orgánica disponible en el medio, de la temperatura y de otros factores.

Los agentes de biocontrol necesitan una fuente de carbono para poder desarrollarse adecuadamente y así poder proteger a las plantas. Sin embargo, los recursos biológicos usados como fuente de carbono son finitos y extraerlos directamente del ecosistema puede resultar insostenible. Además, los agentes de biocontrol pueden responder de forma distinta a diferentes fuentes de carbono, sobre todo cuando son parte de mezclas complejas de material orgánico. Es posible además que la fuente de carbono interfiera con el crecimiento de la planta.

La solicitud EP 1051075 A2 describe un agente protector de las plantas basado en una preparación de distintas plantas. La EP 0538091 A1 emplea compuestos extraídos de algas marinas para recubrir la semilla. La solicitud US 2019008157 A1 emplea la microalga Chlorella para mejorar la captación de nutrientes del suelo por parte de la planta. La solicitud EP0649279 A1 emplea laminarina, un compuesto extraído del alga parda Laminaria saccharina, combinada con otros productos químicos para acelerar la germinación. Ninguno de estos documentos describe ni sugiere el uso de agentes de biocontrol.

La patente CN 103039439 B sí incorpora Trichoderma, que es es un hongo beneficioso para las plantas utilizado como agente de control biológico contra diversos patógenos vegetales. La composición incluye polietilenglicol y un adhesivo para formar el recubrimiento, sin embargo no utiliza ningún sustrato orgánico.

La solicitud WO 1991007869 A1 se considera como el documento más cercado de la técnica. Describe una semilla recubierta con Trichoderma y un material particulado carbonáceo, en particular, turba, esquisto lignoso, lignita de Sphagnum, carbón activado o mezclas de los mismos. En embargo, estos componentes de suelos húmicos no resultan los más adecuados como fuente de carbono para Trichoderma o para cualquier otro agente de biocontrol.

Por otro lado, el sargazo o Sargassum muticum es un alga de color pardo o verdoso que puede alcanzar varios metros de longitud, con un eje delgado que se ramifica alternamente y un margen entero o algo serrado y sin nervio. En el mejor conocimiento de los inventores, nunca se ha descrito el uso de sargazo como sustrato del agente de biocontrol en recubrimientos de semillas.

El problema de la técnica puede plantearse como la obtención de una fuente de carbono de mejor disponibilidad para un agente de biocontrol en un recubrimiento de semilla. La solución de la presente invención es el uso de sargazo en dicho recubrimiento.

Descripción

La presente invención se refiere a un recubrimiento de semillas que comprende al menos un agente de biocontrol y Sargassum muticum como fuente de carbono. Dicho recubrimiento promueve el crecimiento del agente de biocontrol y mejora las características de crecimiento de la planta.

En la presente invención, se entiende por “agente de biocontrol” o agente biológico un microorganismo con capacidad para reducir la población de un eventual agente patógeno o para evitar sus efectos.

El recubrimiento de semillas de la presente invención puede encontrarse en una cantidad de 3 a 200 kg por cada kg de semilla, es decir, en un porcentaje en peso de 300 a 2.000%, con respecto al peso de la semilla. Por tanto, el recubrimiento de la presente invención se considera un tipo de pildorado de semillas. La cantidad de recubrimiento varía en función del tamaño y forma de la semilla en el mejor conocimiento del experto.

Un aspecto preferible del recubrimiento de la presente invención es que el S. muticum tenga un tamaño de partícula entre 150 y 500 pm. El polvo de S. muticum es obtenible por trituración, molienda, o cualquier método conocido en la técnica para la formación de polvos.

En otro aspecto de la invención, el S. muticum se utilizan en el recubrimiento en forma seca. El S. muticum del recubrimiento de la invención procede del alga entera o de cualquier parte del alga. En un aspecto más preferible, se utilizan residuos del alga producidos en el procesamiento de la misma, en particular en el proceso de extracción de compuestos bioactivos u otras sustancias de interés con agua subcrítica a alta temperatura.

El S. muticum puede representar el 5 hasta el 99,5% en peso del peso total del recubrimiento. Por ejemplo, dicho polvo puede encontrarse en una cantidad de 5 a 10%, de 10% a 20%, de 20% a 30%, de 30% a 40%, de 40% a 50%, de 50% a 60%, de 70% a 80%, de 80% a 90%, o de 90% a 99,5%, en peso, con base en el peso total del recubrimiento. El porcentaje de polvo a utilizar varía de acuerdo con el tamaño de la semilla; por ejemplo, puede ser de entre 60% y 90% para semillas pequeñas, 20% y 60% para semillas medianas y entre 5% y 20% para semillas grandes, con respecto al peso de las semillas.

De acuerdo con la presente invención, el recubrimiento de la semilla comprende al menos un agente de biocontrol. En un aspecto preferible, el agente de control biológico es una bacteria. En otro aspecto es un hongo que forma esporas. Preferiblemente, el agente de biocontrol tiene la capacidad de colonizar el sistema de raíces de la planta a la cual se aplica. Más preferiblemente, los agentes de biocontrol se seleccionan entre al menos una bacteria del género de Agrobacterium, Pseudomonas, Streptomyces o Bacillus, y al menos un hongo del género Gliocladium, Trichoderma, Ampelomyces, Candida o Coniothyrium. Es posible utilizar combinaciones de dos o más agentes de biocontrol conforme a la presente invención. En un aspecto preferido, el agente de biocontrol es Trichoderma spp., y preferiblemente se selecciona de T. harzianum, T. velutinum, o combinaciones de los mismos.

La concentración de agente de biocontrol en el recubrimiento varía de acuerdo con factores como el tipo, propiedades y dimensiones de la semilla. El agente de biocontrol debe estar en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto protector o promotor del crecimiento. UN aspecto preferible de la invención es utilizar de 10 ⁵ a 10 ¹⁰ unidades formadoras de colonia (CFU) por gramo de peso de la semilla.

En otro aspecto preferible, el recubrimiento de semillas comprende además al menos un agente de fijación. El agente de fijación puede necesitarse para fijar el agente de biocontrol y el alga a la superficie de la semilla. En la presente invención se puede utilizar cualquier tipo de agente de fijación siempre que no sea dañino para la semilla o el agente de biocontrol. Por esta razón, un aspecto muy preferible es un agente de fijación acuoso. En otro aspecto más preferible, el agente de fijación está presente en una cantidad de entre 0,5 y 90% en peso con base en el peso total del recubrimiento.

El agente de fijación se puede seleccionar de una sustancia seleccionada de melaza, azúcar granulada, alginatos, goma guar, goma arábiga, goma xantana, goma karaya, mucílago, o combinaciones de los mismos. En otro aspecto, el agente de fijación puede además comprender acetatos de polivinilo, copolímeros de acetato de polivinilo, alcoholes polivinílicos, copolímeros de alcohol de polivinilo, celulosas, incluyendo etilcelulosas y metilcelulosas, celulosas hidroximetilo, hidroxipropilcelulosas, hidroximetilpropil-celulosas, polivinilpirrolidonas, dextrinas, maltodextrinas, polisacáridos, grasas, aceites, proteínas, gomas lacas, copolímeros de cloruro de vinilideno, copolímeros de cloruro de vinilideno, lignosulfonatos de calcio, copolímeros acrílicos, almidones, polivinilacrilatos, zeínas, gelatina, carboximetilcelulosa, quitosano, óxido de polietileno, polímeros y copolímeros de acrilamida, acrilato de polihidroxietilo, metilacrilimida, monómeros de etiloceno, alúmina, alginatos, poliacrilato de metilo, polímeros y copolímeros de acetato de vinilo, metilcelulosa, celulosa, polivinilpirrolidona, o combinaciones de los mismos.

En otro aspecto preferible, la composición de recubrimiento consiste en un agente de biocontrol y S. muticum como fuente de hidratos de carbono. En otro aspecto más preferible, incluye además un agente de fijación.

S. muticum presenta la ventaja técnica de proporcionar un mayor crecimiento del agente de biocontrol y, por tanto, de mejorar de las características de crecimiento de la semilla y proteger contra fitopatógenos, con respecto a la turba.

La presente invención es útil para mejorar las características de crecimiento de las semillas, promover la germinación y el desarrollo de la planta en los primeros estadios de crecimiento y proteger cultivos agrícolas frente daños de enfermedades y plagas. Debido a que el recubrimiento y las semillas recubiertas conforme a la presente invención se pueden valer únicamente de agentes de biocontrol y S. muticum como sustrato, tienen la ventaja de que evita la utilización de compuestos de síntesis química.

En otro aspecto preferible más, el recubrimiento de la presente invención incluye un relleno de bentonita, caolín, arcilla, talco, perlita, sílices, polvo de cuarzo, montmorillonita, carbón activado, carbohidratos, almidones, harinas, tierra de diatomeas, o combinaciones de los mismos. La presente invención también se refiere a una semilla recubierta con el recubrimiento de semillas descrito. Por tanto, otro aspecto preferible más es una semilla recubierta, cuyo recubrimiento comprende S. muticum y al menos un agente de biocontrol.

La semilla de la presente invención puede ser cualquier semilla vegetal sin importar su forma o tamaño. Preferiblemente, la semilla en cuestión pertenece a una planta de interés agronómico, por ejemplo una planta hortícola como tomate, calabacín o pimiento; una planta forrajera como alfalfa o trébol; un cereal como avena, maíz o trigo; una leguminosa como soja, judía, guisante o altramuz, una planta oleaginosa como colza o girasol, una planta de aprovechamiento industrial como algodón, remolacha o tabaco, o de cualquier planta ornamental o silvestre.

En otro aspecto preferible, la semilla a recubrir tiene un tamaño de 1 a 20 mm. En otro aspecto más, es una semilla pequeña, con un tamaño menor a 3 mm, tal como una semilla de brócoli, colza o alfalfa. En otro aspecto más, la semilla a recubrir es una semilla mediana, que tiene un tamaño de 3 mm hasta 10 mm, tal como una semilla de lenteja o trigo. En otro aspecto más, es una semilla grande, con un tamaño mayor que 10 mm, tal como una semilla de maíz, judía, garbanzo, girasol o melón.

Un aspecto preferible de la presente invención es una semilla recubierta en al menos un 50% de su superficie, preferiblemente en al menos el 80% o en al menos el 90% de la superficie de las semillas, lo más preferible recubierta en el 100% de su superficie.

Otra realización preferible más es un método de recubrimiento de una semilla con el recubrimiento de la invención. Para recubrir la semilla es necesario poner en contacto los componentes del recubrimiento de semillas con la superficie de la semilla. Para fijar el agente de biocontrol y el S. muticum a la superficie de la semilla puede necesitarse un agente de fijación. La puesta en contacto de cada uno de los componentes del recubrimiento de semillas, incluyendo S. muticum, agente de biocontrol, y, en su caso, agente de fijación y/o cualquier otro componente opcional o adicional, puede ocurrir simultánea o secuencialmente.

En un aspecto preferible más, el recubrimiento de las semillas se realiza en una sola etapa, poniéndola en contacto con una mezcla de todos los componentes del recubrimiento de la invención. También es posible añadir secuencialmente los componentes del recubrimiento hasta formar la semilla recubierta de la presente invención. Por ejemplo, tratándose de un recubrimiento de la invención que utiliza agente de fijación, el método puede realizarse en dos etapas: primero, se pone en contacto con la superficie de las semillas una mezcla de agente de fijación y ya sea el agente de biocontrol o S. muticum, y posteriormente, se pone en contacto la semilla con el componente restante. En un aspecto adicional, la puesta en contacto se acompaña de agitación mecánica con el fin de mejorar la eficiencia y/o velocidad del recubrimiento.

El método de la presente invención puede comprender, además, una etapa de secado de la semilla recubierta, con el fin de promover o acelerar la fijación del recubrimiento y la manipulación de las semillas recubiertas.

El recubrimiento de las semillas puede llevarse a cabo en cualquier aparato adecuado para el tratamiento de las mismas, incluyendo en una mezcladora concreta o un tambor rotatorio o lecho fluidizado. El recubrimiento se puede realizar por lotes o en un proceso continuo.

Ejemplos

Ejemplo 1. Desarrollo de asilamientos del agente de biocontrol Tríchoderma spp. en Sargassum.

Se estudió el efecto que tiene S. muticum en el desarrollo de un agente de biocontrol de la especie Tríchoderma spp. Para ellos se eligieron turba, Laminaría ochroleuca y S. muticum como sustratos de desarrollo, y Tríchoderma harzianum que ha demostrado su capacidad de biocontrol.

Se molieron todos los sustratos hasta obtener un tamaño de partícula inferior a 500 pm, y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 20 min para eliminar cualquier organismo que pudieran tener. En placas Petri de 60 mm de diámetro se pesaron 5 g de cada sustrato. Se añadieron 5 mi de agua destilada autoclavada a 121°C 20 min. Se preparó una solución de esporas de T. harzianum con una concentración de 2*10 ⁷ esporas/ml y se añadió 1 mi de esa solución a cada placa Petri. Se sellaron las placas con Parafilm y se incubaron durante 15 días a 25 °C. Se hicieron 3 repeticiones por tratamiento. Trascurrido este periodo se conservaron a -80°C hasta su procesado.

Para la obtención de la cantidad de Tríchoderma desarrollado en los sustratos se extrajo el ADN de cada placa con FavorPrep Soil DNA Isolation Kit (Favorgen Biotech Corporation) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizó qPCR de cada extracción usando Step One Plus™ (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se empleó el gen a-actina como referencia para el análisis.

Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Concentración de ADN obtenida en los distintos sustratos

Los resultados muestran que el desarrollo de Trichoderma es mucho mayor cuando se utiliza el alga S. muticum, en comparación con turba e incluso con otra alga, como es L. ochroleuca. Con estos resultados se puede decir que S. muticum promueve el desarrollo del agente de biocontrol.

Ejemplo 2. Efecto del pildorado de semillas con S. muticum en la germinación

Se emplearon distintos tipos de semillas para la evaluación del pildorado, teniendo en cuenta su forma y tamaño. Se pretendió comprobar el efecto del pildorado realizado antes de la siembra en la germinación. Por ello se evaluaron semillas de distintas formas y tamaños como pueden ser:

- Semillas pequeñas < 3 mm: brócoli, colza, alfalfa y similares

- Semillas medianas 3 - 10 mm: lenteja, trigo, y similares

- Semillas grandes > 10 mm: maíz, judía, garbanzo, girasol, melón y similares

Se realizó una prueba de germinación en el laboratorio. Las semillas se desinfectaron con un ciclo de limpieza de 20 minutos en solución de hipoclorito de sodio al 10% y 3 lavados en agua destilada autoclavada para destruir los patógenos presentes en la cubierta de la semilla y evitar el crecimiento de hongos. Las semillas se dejaron secar en campana de flujo laminar durante 20 min. Posteriormente se realizó el pildorado siguiendo el siguiente procedimiento: 1) las semillas a recubrir se colocaron en un aparato adecuado para el recubrimiento de semillas; 2) se añadió un porcentaje del peso de las semillas de un agente de fijación acuoso (goma arábiga); 3) se agitó hasta que las semillas quedaron bien recubiertas; 4) se añadió un porcentaje del peso de las semillas del polvo de S. muticum ; 5) se agitó hasta que las semillas quedaron bien recubiertas.

Para semillas pequeñas (< 3 mm), se utilizó 60 % de S. muticum y 30% de agente de fijación del peso de semillas. Para semillas medianas (3-10 mm), 20 % de S. muticum y 15% de agente de fijación del peso de semillas. Para semillas grandes (> 10 mm), 7% de S. muticum y 3% de agente de fijación del peso de semillas.

Posteriormente, se recogieron las semillas y se dejaron secar para su manipulación. Como control, se utilizó la semilla sin pildorar.

Se realizaron 3 repeticiones de 10 semillas para melón y 20 semillas para el resto, de tamaño similar sin daño observable que se distribuyeron homogéneamente en placas de Petri (80-100 mm de diámetro en función del tamaño de la semilla) sobre dos papeles de filtro añadiendo 1-15 mi de agua destilada autoclavada según el tipo de semilla. Las placas se sellaron con Parafilm para evitar pérdidas de humedad y se mantuvieron en la oscuridad durante 12 días a 22 ± 1 °C, revisando la germinación diariamente.

Se consideró que las semillas estaban germinadas cuando las radículas tenían más de 3 mm. Se tomaron los datos de germinación de la semilla (porcentaje del número de semillas agregadas), la longitud de la raíz de las plántulas emergidas, así como el peso fresco de las radículas emergidas que se midió cuando se había alcanzado el 95 % de las semillas germinadas o bien durante 3 días consecutivos no se habían producido nuevas germinaciones. También se calcularon los siguientes índices:

Germinación (Tratamiento} Longitud raía (tratamiento}

(4) índice germinación X X 100

Germinación (control) Longitud mis (control)

Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Germinación de las distintas semillas recubiertas con S. muticum y sus controles cuando han sido pildoradas y sembradas en el mismo día. Germinación GR ¹ Biomasa BR ² Longitud LRR ³

Semilla IG ⁴

(%) (%) (mg) (%) raíz (mm) (%)

Tamaño pequeño

C ⁵ 58,33 ± 3,33 a 2,49 ±0,14 a 24,72 ± 1,81 b

Alfalfa 105,71 129,14 134,81 142,51

T ⁶ 61,67 ± 10,93 3,22 ± 0,48 a 33,33 ± 2,33 a a

C 65,00 ±5,00 a 3,67 ± 0,23 a 36,73 ± 3,03 a

Brócoli 94,87 99,58 101,40 96,20

T 61 ,67 ±8,33 a 3,65 ± 0,23 a 37,25 ± 3,84 a

C 90,00 ± 10,00 4,13 ±0,24 a 54,79 ± 3,93 a a

Colza 79,63 107,72 114,72 91,35

T 71 ,67 ±6,67 a 4,45 ± 0,40 a 62,86 ± 6,61 a

Tamaño medio

C 88,33 ±4,41 a 7,47 ±0,13 a 13,60 ± 0,61 a

Lenteja 90,57 94,00 90,41 81,88

T 80,00 ±2,89 a 7,02 ± 0,17 b 12,29 ± 0,49 a

C 100,00 ± 0,00 7,29 ±0,16 a 17,43 ± 0,63 a a

Trigo 100,00 93,36 78,62 78,62

T 100,00 ± 0,00 6,81 ±0,19 a 13,70 ±0,46 a b

Tamaño grande

C 98,33 ±1,67 a 74,84 ± 0,78 13,96 ± 0,67 a a

Garbanzo 98,31 96,72 70,54 69,34

T 96,67 ±1,67 a 72,38 ± 0,65 9,85 ± 0,50 b b

C 95,00 ±0,00 a 17,91 ± 0,32 21,16 ± 1,02 a a

Girasol 77,19 99,14 57,96 44,74

T 73,33 ± 6,67 b 17,75 ± 0,38 12,26 ± 1,04 a b

C 98,33 ±1,67 a 114,72 ± 43,07 ± 3,44 2,63 a b

Judía 100,00 98,62 120,32 120,32 T 98,33 ±1,67 a 113,14 ± 51 ,83 ±2,79 2,96 a a

C 95,00 ±0,00 a 48,80 ± 0,96 21,12 ± 1,40

Maíz 98,25 97,86 74,62 73,31 a a T 93,33 ± 1 ,67 a 47,75 ± 1 ,13 15,76 ± 0,92 a b

C 73.33 ± 14,53 12,68 ± 0,53 41 ,77 ± 4,50

3 3 3

Melón 59,09 102,28 120,28 71 ,07

T 43.33 ± 17,64 12,97 ± 0,74 50,24 ± 6,23 a a a

¹ Germinación relativa

² Biomasa relativa

³ Longitud relativa de la raíz

⁴ índice de germinación

⁵ Control

⁶ Tratamiento con S. muticum

Observando los resultados, el alga S. muticum, no inhibió la germinación de las semillas estudiadas a excepción del melón que fue inferior al 60 % respecto al control. En el resto de los casos o fue igual al control o superior al mismo. En cuanto al desarrollo de biomasa, no se presentaron desarrollos inferiores al control, destacando la alfalfa que fue 129 %. En cuanto a la longitud radicular, no se presentó desarrollos bajos respecto al control, en algunos casos fueron muy superiores alcanzando por ejemplo un 134 % respecto al control. En cuanto al índice de germinación, destacando la judía y la alfalfa con un índice superior al 100 %.

Con estos resultados se demuestra que S. muticum no resulta un agente inhibidor de la germinación de las semillas que han sido pildoradas y sembradas en el mismo día, llegando incluso a favorecerla en algunas de ellas.

Ejemplo 3. Efecto del pildorado de semillas con S. muticum en la germinación transcurrido un mes desde el pildorado

Se emplearon distintos tipos de semillas para la evaluación del pildorado realizado con un mes de antelación a la siembra, teniendo en cuenta su forma y tamaño. Se pretendió comprobar el efecto del pildorado realizado mucho tiempo antes de la siembra por si pudiera endurecerse e impedir la germinación. Por ello se evaluaron semillas de distintas formas y tamaños como pueden ser:

- Semillas pequeñas < 3 mm: brócoli, colza, alfalfa y similares

- Semillas medianas 3 - 10 mm: lenteja, trigo, y similares

- Semillas grandes > 10 mm: maíz, judía, garbanzo, girasol, melón y similares Se realizó una prueba de germinación en el laboratorio. Las semillas se desinfectaron con un ciclo de limpieza de 20 minutos en solución de hipoclorito de sodio al 10% y 3 lavados en agua destilada autoclavada para destruir los patógenos presentes en la cubierta de la semilla y evitar el crecimiento de hongos. Las semillas se dejaron secar en campana de flujo laminar’ durante 20 minutos. Posteriormente se realizó el pildorado siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.

Se realizaron 3 repeticiones de 10 semillas, de tamaño similar sin daño observable que se distribuyeron homogéneamente en placas de Petri (80-100 mm de diámetro en función del tamaño de la semilla) sobre dos papeles de filtro añadiendo 1-15 mi según el tipo de semillas agua destilada autoclavada. Las placas se sellaron con Parafilm para evitar pérdidas de humedad y se mantuvieron en la oscuridad durante 12 días a 22 ± 1 °C, comprobando la germinación diariamente.

Se consideró que las semillas estaban germinadas cuando las radículas tenían más de 3 mm. Se tomaron los datos de germinación de la semilla (porcentaje del número de semillas agregadas), la longitud de la raíz de las plántulas emergidas, así como el peso fresco de las radículas emergidas se midió cuando se había alcanzado el 95 % de las semillas germinadas o bien durante 3 días consecutivos no se habían producido nuevas germinaciones. También se calcularon los índices de germinación relativa (%), biomasa relativa (%), longitud relativa raíz (%) e índice germinación (%) conforme se indica en el Ejemplo 2.

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 3.

Tabla 3: Germinación de las distintas semillas recubiertas con S. muticum y sus controles cuando han sido pildoradas y sembradas un mes tras el recubrimiento.

Germinación GR ¹ BR ² Longitud raíz LRR ³

Semilla Biomasa (mg) IG ⁴

(%) (%) (%) (mm) (%)

Tamaño pequeño

C ⁵ 36,67 ± 8,82 b 209,0 4,71 ± 0,69 a 45,94 ± 6,97 a

Alfalfa 68,04 92,59 209,09

T ⁶ 76,67 ± 6,67 a 9 3.20 ± 0,27 b 42,54 ± 4,68 a

C 73,33 ± 6,67 a 3,05 ± 0,37 a 111 ,7 28,44 ± 5,52 b 151 ,4

Brócoli 9545 9545

T 70,00 ± 5,77 a 3,41 ± 0,34 a 8 43,08 ± 5,35 a 9

C 63,33 ± 17,64 a 3.21 ± 0,37 a 56,98 ± 13,76

107,0 107,0

Colza a 90,77 107,02

2 2

T 67,78 ± 17,46 a 3,44 ± 0,40 a 51 ,72 ± 9,00 a Tamaño medio

C 79,26 ± 0,74 b 117,7 10,73 ±0,39 a 18,69 ± 1,45 a

Lenteja 94,74 66,64 117,76

T 93,33 ±3,33 a 6 10,16 ±0,38 a 12,46 ± 0,88 b

C 93,33 ±3,33 a 103,5 9,88 ±0,41 a 22,97 ± 1,63 a

Trigo 89,54 91,67 103,57

T 96,67 ±3,33 a 7 8,85 ±0,40 a 21,06 ± 1,29 a

Tamaño grande

C 83,33 ± 3,33 b 116,0 86,34 ± 1,90 a 14,44 ± 1,77 a

Garbanzo 97,93 85,61 116,00

T 96,67 ±3,33 a 0 84,55 ± 1,53 a 12,36 ± 1,18 a

C 80,00 ±10,00 a 34,14 ± 1,21 a 28,03 ±2,57 a

Girasol 70,83 93,72 74,87 70,83 T 56,67 ±18,56 a 32,00 ±2,79 a 20,98 ±3,13 a

C 93,33 ±3,33 a 103,5 113,64 ±7,00 a 101,6 25,13 ±3,41 a

Judía 70,39 103,57

T 96,67 ±3,33 a 7 115, 52 ±5,11 a 5 17,69 ± 1,03 b

C 100,00 ±0,00 a 52,46 ±1,27 a 101,5 29,91 ±2,47 a

Maíz 97,22 67,47 97,22 T 97,22 ±2,78 a 53,25 ±1,56 a 1 20,18 ± 2,28 b

C 20,00 ±10,00 a 216,6 24,12 ±0,91 a 28,74 ± 7,90 a 120,2

Melón 76,84 216,67

T 43,33 ±12,02 a 7 18,54 ± 1,49 b 34,56 ±2,83 a 5

¹ Germinación relativa

² Biomasa relativa

³ Longitud relativa de la raíz

⁴ índice de germinación

⁵ Control

⁶ Tratamiento con S. muticum

Observando los datos de germinación de semillas que habían sido pildoradas un mes antes de la siembra, el alga S. muticum no inhibió la germinación de las semillas estudiadas, siendo, incluso favorecida en el caso de alfalfa y garbanzo. El pildorado no redujo significativamente el desarrollo vegetativo ni de la producción de biomasa ni de la longitud del sistema radicular. En cuanto, al índice de germinación, todas las semillas estudiadas presentaron valores altos, destacando la alfalfa y el melón como los más altos.

Con estos resultados se demuestra que S. muticum no resulta un agente inhibidor del crecimiento de la planta a partir de semillas que han sido pildoradas y sembradas en el mismo día, llegando incluso a favorecerla en algunas de ellas.

Ejemplo 4. Efecto del pildorado de semillas con el agente de biocontrol Tríchoderma y S. muticum en la germinación Se emplearon distintos tipos de semillas para la evaluación del pildorado, teniendo en cuenta su forma y tamaño. Se pretendió comprobar el efecto del pildorado realizado antes de la siembra en la germinación. Por ello se evaluaron semillas de distintas formas y tamaños como pueden ser:

- Semillas pequeñas < 3 mm: colza y similares

- Semillas medianas 3 - 10 mm: trigo, y similares

- Semillas grandes > 10 mm: judía y similares

Las semillas se desinfectaron con un ciclo de limpieza de 20 minutos en solución de hipoclorito de sodio al 10% y 3 lavados en agua destilada autoclavada para destruir los patógenos presentes en la cubierta de la semilla y evitar el crecimiento de hongos. Las semillas se dejaron secar en campana de flujo laminar durante 20 min. Posteriormente las semillas se impregnaron con una solución formada por 75 % v/v de goma arábiga como agente de fijación y 25 % v/v solución de esporas de Tríchoderma (8*10 ⁷ esporas/ml). Después fueron recubiertas con polvo de alga S. muticum. Las semillas control no tenían recubrimiento.

Se realizaron 3 repeticiones de 10 semillas, de tamaño similar sin daño observable que se distribuyeron homogéneamente en macetas de polipropileno de 250 mi de capacidad con sustrato (80% turba rubia, 20% turba negra y pH 5.5). Se regaron cada maceta previamente a la siembra hasta que llegó a capacidad de campo. Se mantuvieron en cámara de cultivo a 22 ± 1 °C y se regaron cada 2 días con 25 mi de agua. Se consideró que las semillas estaban germinadas cuando las radículas tenían más de 3 mm.

Se tomaron los datos de germinación de la semilla (porcentaje del número de semillas agregadas), la longitud de la raíz de las plántulas emergidas, así como el peso fresco de las radículas emergidas se midió cuando se había alcanzado el 95 % de las semillas germinadas o bien durante 3 días consecutivos no se habían producido nuevas germinaciones. También se calcularon los índices de germinación relativa (%), biomasa relativa (%), longitud relativa raíz (%) e índice de germinación, conforme se indica en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Germinación de las distintas semillas recubiertas con S. muticum y el agente de biocontroi.

GR ¹ BR ² LRR ³

Semilla Germinación Biomasa (mg) Longitud raíz IG ⁴

(%) (%) (%) Tamaño pequeño

C ⁵ 23,33 ± 3,33 a 214, 34,76 ± 7,53 a 154,8 46,11 ± 9,00 a

Colza 69,00 147,86

T ⁶ 50,00 ± 15,28 a 29 53,83 ± 14,73 a 8 31 ,82 ± 7,75 a

Tamaño medio

130,84 ± 12,55

C 23,33 ± 12,02 b 100,43 ± 18,07 a

400, a 116,9 110,8

Trigo 443,51

00 153,00 ± 23,31 4 8

T 93,33 ± 3,33 a 111 ,36 ± 6,72 a a

Tamaño grande

1.990,51 ±

C 90,00 ± 10,00 a 117,93 ± 8,19 a

92,5 136,04 b 134,0 111 ,6

Judía 103,37

9 2.667,95 ± 3 4

T 83,33 ± 3,33 a 131 ,66 ± 10,50 a

201 ,01 a

¹ Germinación relativa

² Biomasa relativa

³ Longitud relativa raíz

⁴ índice de germinación

⁵ Control

⁶ Tratamiento con S. muticum y Trichoderma sp.

Observando los resultados del efecto del pildorado de semillas con el agente de biocontrol Trichoderma y S. muticum en las tres semillas de estudio, la germinación presentó unos valores muy altos en las tres semillas, destacando el trigo con un valor superior al 400 %, al igual que la producción de biomasa y en la longitud del sistema radicular.

Con estos resultados se demuestra que S. muticum y la combinación con un agente de biocontrol favorece el desarrollo de las semillas respecto al control.