1.ヒトオーロラカイネースA及びヒトオーロ ラカイネースBプロモーターに対応するPy-Imポ リアミドの合成

(1)ヒトオーロラカイネースA及びヒトオーロ� �カイネースBプロモーターに対応するPy-Imポ� �アミドの設計
I.材料及び方法
 Py-Imポリアミドとして、ヒトオーロラカイ� �ースAプロモーターの-89~-83又はヒトオーロラ カイネースBプロモーターの-25~-18の塩基対に� ��合するように、上記のようなPIP-A:No.47及びPI P-B:No.48を設計した。

(2)Fmoc法を用いたPy-Imポリアミドのマシンアシ スト(機械補助)自動合成
 ピロールイミダゾールポリアミドのマシン� ��シスト自動合成を、連続フローペプチド合� ��機Pioneer(商標)(アプライドバイオシステムズ )を用いて0.1mmolスケール(200mgのFmoc-β-アラニ� �-CLEAR酸レジン、0.50meq/g、Peptide Institute、Inc.) で実施した。自動固相合成はDMF洗浄、Fmoc基� �20%ピペリジン/DMFによる除去、メタノール洗� ��、HATU及びDIEA(それぞれ4当量)の存在下での� �ノマーとの60分間のカップリング、メタノー ル洗浄、必要に応じて無水酢酸/ピリジンに� �る保護、及び最終的なDMF洗浄からなってい� �。Py-Imポリアミドは一般に中程度の収率(10-30 %)で得られた。

 FITCカップリング:4倍過剰のフルオレセイン( 0.40mmol)及びDIEA(HATUなし)をDMFに溶解したもの� �カラムを通して60分間フラッシュした。
 一般的手順:Fmoc-β-アラニン-Wang樹脂のFmoc基� ��除去した後、樹脂をメタノールで連続的に� ��浄した。カップリング工程をFmocアミノ酸で 実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った 。これらの工程を全配列が導入されるまで何 度も繰返した。カップリング工程を終えた後 、必要に応じてN末端アミノ基を保護するか� �はFITCでカップリングし、DMFで洗浄し、反応� ��器を取りはずした。

 カルボン酸としての分解:合成ポリアミドを 冷エチルエーテル沈澱により分解工程(91%TFA-3 %/TIS-3%DMS-3%水の混合物5ml/樹脂0.1mmol)の後に単� ��した。
 アミンとしての分解:合成ポリアミドを冷エ チルエーテル沈澱により分解工程(N、N-ジメ� �ルアミノプロピルアミン5mL/樹脂0.1mmol、50℃� ��一晩)の後に単離した。
 精製:最終精製は、10mL/minの流速の分析用RP-H PLCで、緩衝液A(0.1%TFA/水又は0.1%AcOH/水)中B(ア� �トニトリル)の直線勾配を用いて、350nmのUV検 出により行った。PIP-A:No.47及びPIP-B:No.48のRP-HP LCのチャートを図6及び7にそれぞれ示す。

2.PIP-A及びPIP-BのIn vitroでの生物学的機能解 析

(1)ゲルシフトアッセイ(Electromobility Shift Assay  (EMSA))
I.材料及び方法
 オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリン� ��して、hAURKA及びhAURKBプロモーターの塩基対� ��対応する4種の二本鎖オリゴヌクレオチドと した。一方の一本鎖オリゴヌクレオチドをFIT Cで標識し、相補的配列の一本鎖オリゴヌク� �オチドとハイブリダイゼーションして二本� �DNA作成した。具体的な二本鎖ヌクレオチド� �塩基配列は、AURKAオリゴDNA(マッチ)のセンス� ��ライマー(5’-FITC-GTTGGCTCCACCACTTCCGGGT-3’)(配列 番号9)及びアンチセンスプライマー(5’-ACCCGGA AGTGGTGGAGCCAAC-3’)(配列番号10)、2塩基変異を有� ��るAURKAオリゴDNA(ミスマッチ-1)のセンスプラ� ��マー(5’-FITC-GTTGGCTCCACCGATTCCGGGT-3’)(配列番号 11)及びアンチセンスプライマー(5’-ACCCGGAATCGG TGGAGCCAAC-3’)(配列番号12)、AURKBオリゴDNA(マッ� ��)のセンスプライマー(5’-FITC-GGCGGGAGATTTGAAAAGT CCT-3’)(配列番号13)及びアンチセンスプライ� �ー(5’-AGGACTTTTCAAATCTCCCGCC-3’)(配列番号14)、2� �基変異を有するAURKBオリゴDNA(ミスマッチ-1)� �センスプライマー(5’-FITC-GGCGGGAGACCTGAAAAGTCCT-3 ’)(配列番号15)及びアンチセンスプライマー( 5’-AGGACTTTTCAGGTCTCCCGCC-3’)(配列番号16)を作成� �た。また、AURKAオリゴDNA(ミスマッチ-2)とし� �は、AURKBオリゴDNAである配列番号13及び配列� ��号14のオリゴDNAを使用し、AURKBオリゴDNA(ミ� �マッチ-2)としては、AURKAオリゴDNAである配列 番号9及び配列番号13を使用した。37℃で15分� �、結合緩衝液(40mM Tris、pH7。9、250mM NaCl、25m M EDTA、25mM DTT、100mM KCl)中でポリアミド又は ミスマッチポリアミドとともにインキュベー トした。得られた複合体を20%ポリアクリルア ミドゲルにより電気泳動し、蛍光標識二本鎖 オリゴヌクレオチドの移動度を蛍光イメージ 解析機(Fuji LAS 3000等)で解析した。

II.結果
 合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチ� ��への結合
 ゲルシフトアッセイによりPIP-A:No.47及びPIP-B :No.48の標的配列への結合を検討した。それぞ れのピロールイミダゾールポリアミドの標的 配列を含む22塩基のセンス、アンチセンスの� ��リゴヌクレオチドを作成し、これをアニー� ��ングさせて標的部位の二本鎖DNAを作成し、� ��れとそれぞれのピロールイミダゾールポリ� ��ミドとをインキュベートした。これらをポ� ��アクリルアミドゲルで電気泳動してピロー� ��イミダゾールと標的配列との結合性を検討� ��た。PIP-A及びPIP-Bとともに二本鎖DNA(DS)にピ� �ールイミダゾールポリアミド(Py-Im)を加える� ��、DSのみのレーンと比べ泳動度が低下し、� �分子化したことが示唆され、DSとPy-Imとの結� ��が証明された。結果を図8及び9に示す。

(2)ビアコアアッセイ
I.材料及び方法
 Biacore2000(GEヘルスケア)は、表面プラズモン� ��鳴(Surface Plasmon Resonance、SPR)を測定原理と� �ており、生体内でのタンパク質、核酸、糖� �など分子間の相互作用を、ラジオアイソト� �プや蛍光物質などによる標識無しにin vitro� �再構成し、リアルタイムで観察できる装置� �あり、本装置を用いて分子間の相互作用を� �値化して評価することが可能である。

 ストレプトアビジンを予め固定化したセ� ��サーチップ(Sensor Chip SA,BR-1000-31)を使用し� �ヘアピンビオチン化DNAプローブ(1本鎖DNAが相 補配列を含み、ハイブリダイゼーションする ことで2本鎖部分を含むパリンドロームDNAを� �成)1μMを固定した後、ピロールイミダゾール ポリアミド(Py-Im)を添加して、2本鎖DNAとの結� ��性の変化を2分子間の結合・解離に伴うセン サーチップ表面での微量な質量変化をSPRシグ ナルとして検出し、経時的に測定した。なお 、具体的なヘアピンビオチン化DNAプローブの 塩基配列は、AURKAオリゴDNA(マッチ)(5’-Biotin-G TTGGCTCCACCACTTCCGGGT-TTTT-ACCCGGAAGTGGTGGAGCCAAC-3’)(配� ��番号17)、2塩基変異を有するAURKAオリゴDNA(ミ スマッチ-1)(5’-Biotin-GTTGGCTCCACCGATTCCGGGT-TTTT-ACCC GGAATCGGTGGAGCCAAC-3’)(配列番号18)である。また� �AURKBオリゴDNA(マッチ)(5’-Biotin-GTTGGCTCCACCGATTCC GGGT-TTTT-ACCCGGAATCGGTGGAGCCAAC-3’)(配列番号19)、2� �基変異を有するAURKBオリゴDNA(ミスマッチ-1)5� ��-Biotin-GGCGGGAGACCTGAAAAGTCCT-TTTT-AGGACTTTTCAGGTCTCCCGCC -3’)(配列番号20)である。AURKAオリゴDNA(ミス� �ッチ-2)は、AURKBオリゴDNA(マッチ)(配列番号19) を、AURKBオリゴDNA(ミスマッチ-2)は、AURKAオリ� ��DNA(マッチ)(配列番号17)を用いた。0nMから1μM の濃度のPy-Imを添加し、20μl/secの流量でセン� ��ーグラムと呼ぶグラフとして表示し、レス� ��ンス(RU)値を経時的に測定することで、平衡 状態における2分子間の親和性(解離定数:KDあ� ��いは親和定数:KA)および結合・解離反応の速 さに関する情報、すなわち結合速度定数(ka)� �および解離速度定数(kd)を測定し分子間結合� ��解析した。得られた濃度依存性センサーグ� ��ムをLangmuir double molecular interaction model wit h mass transportを使用して、解析しセンサーチ ップに固定されたDNAプローブと添加したピロ ールイミダゾールポリアミドの結合能、乖離 能をKD、KA、kd、ka値として算定した。

II.結果
 本発明のPIP-A:No.47は、AURKAオリゴDNA(マッチ)� ��結合速度定数ka(1/Ms)3.84E+05、解離速度定数kd( 1/s)5.11E-04、親和定数KA(1/M)7.51E+08解離定数KD(M)1 .33E-09、2塩基変異を有するAURKAオリゴDNA(ミス� ��ッチ-1)と結合速度定数ka(1/Ms)4.42E+03、解離速 度定数kd(1/s)3.17E-03、親和定数KA(1/M)1.39E+06解離 定数KD(M)7.17E-07が得られ結合特異性に539倍の� �を認めた。PIP-B:No.48は、AURKBオリゴDNA(マッチ )と結合速度定数ka(1/Ms)5.47E+05、解離速度定数k d(1/s)2.68E-04、親和定数KA(1/M)2.04E+09解離定数KD(M )4.90E-10、2塩基変異を有するAURKBオリゴDNA(ミ� �マッチ-1)と結合速度定数ka(1/Ms)5.41E+03、解離� ��度定数kd(1/s)2.19E-03、親和定数KA(1・M)2.47E+06� �離定数KD(M)4.05E-07が得られ結合特異性に826倍� ��差を認めた。以上よりPIP-AおよびPIP-Bは、結 合部位と同様の配列を有するオリゴDNAに特異 的に結合することが分かった。また、本発明 のPIP-A:No.47は、AURKAオリゴDNA(ミスマッチ-2)と� ��合速度定数ka(1/Ms)1.72E+03、解離速度定数kd(1/s )3.59E-03、親和定数KA(1/M)4.79E+05解離定数KD(M)2.09 E-06であった。PIP-B:No.48は、AURKBオリゴDNA(ミス マッチ-2)と結合速度定数ka(1/Ms)3.40E+03、解離� �度定数kd(1/s)4.64E-03、親和定数KA(1/M)7.33E+05解� �定数KD(M)1.36E-06であった。結果を図10~15に示� �。

3.In vitroにおけるFITC-標識PIPの分布

I.材料及び方法
 イ)外来刺激に対する細胞死の誘導が遅いア ポトーシス低感受性のHeLa細胞(ヒト子宮頸が� ��細胞)を、6ウェルプレートの各ウェルに30000 細胞となるよう播種し、2mlの10%子牛血清(Invit rogen)及び1%PSGを含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)に て培養した。
 ロ)培養HeLaにおけるFITC-標識ポリアミド類の インキュベーション
 HeLa細胞を24時間培養後、FITC標識PIP(PIP-A 及� �� PIP-B)を10μMの濃度で培地に直接添加した。 経時的に観察し、6時間、12時間、24時間で核� ��FITC及びHoechst33342によって30分間染色し、HeLa 細胞を蛍光顕微鏡を用いて、×200の倍率で観� ��した。

II.結果
 FITC標識をしたPIPは、HeLa細胞の核に特異的� �取り込まれた。FITC標識をしたPIP添加後6時間 でほぼ全ての細胞の核が、蛍光強度は不均一 であるがFITCの蛍光を示し、細胞質での蛍光� �、培地同様でバックグランドレベルであっ� �。添加後6時間でFITCの蛍光強度はほぼ全ての 細胞で均一化していた。また、添加後12時間� ��、全ての細胞の核内にFITCの蛍光が認められ 、その強度の濃縮が認められた。さらに、24� ��間でFITCの蛍光強度が減弱しない事より、PIP -A及びPIP-Bが細胞核内で非常に安定であるこ� �が示唆された。結果を図16~24に示す。

4.PIP-A及びPIP-Bによるプロモーターに対する ノックダウン効果の同定及びランダム培養細 胞におけるmRNA発現とAURKA及びAURKBタンパク質� ��発現の同定

(1)リアルタイムPCRアッセイ(mRNA発現の測定)
I.材料及び方法
 HeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を、100000細胞� ��なるよう播種し、10%子牛血清(Invitrogen)下で1 %PSGを含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)にて6時間培 養後、培地を交換し、10μMのPIP-A、PIP-Bおよび 5μMずつのPIP-AとPIP-B両方を含む10%子牛血清添� ��培地もしくはPIPを含まない同様の培地で6時 間培養し、細胞を回収し、RNAをRNeasy Mini Kit( Quiagen)を使用し抽出、リアルタイムPCRアッセ� ��に供した。
 リアルタイムPCRアッセイは、TAKARA DICE real� �time systemを利用し、PrimeScript ^TM  RT Enzyme Mix Iにより逆転写反応を行い、SYBR  Premix Ex Taqを使用し、TAKARA Perfect Real Time� �Primerより購入したAURKA、AURKBおよびGAPDHプラ� �マーを利用し、(初期変性)95℃、10秒(PCR反応: 40サイクル)95℃、5秒 60℃、30秒(融解曲線分� �)の反応系によって行った。具体的なプライ� ��ーの塩基配列は、AURKAセンスプライマー(5’ -GGATCTCTGGAGCCTTGGAGTTC-3’)(配列番号21;タカラバ� �オ、HA038310-F)、AURKAアンチセンスプライマー( 5’-TGGCTGGGATTATGCTTCAACA-3’)(配列番号22;タカラ� �イオ、HA038310-R)、AURKBセンスプライマー(5’-T CATGAGCCGCTCCAATGTC-3’)(配列番号23;タカラバイオ� ��HA089596-F)、AURKBアンチセンスプライマー(5’- AAGATGTCGGGTGTCCCACTG-3’)(配列番号24;タカラバイ� �、HA089596-R)、GAPDHセンスプライマー(5’-GCACCGT CAAGGCTGAGAAC-3)(配列番号25;HA067812-F)及びGAPDHアン チセンスプライマー(5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’)(� ��列番号26;HA06812-R)を用いた。増幅産物の生成 量モニターは、インターカレーター法により 蛍光強度として検出され、指数関数的にシグ ナルが上昇する閾値と増幅曲線が交わる点Ct� ��を算出した。AURKAとAURKBのCt値をGAPDHのCt値と 比較することで相対的なAURKA及びAURKBのmRNAの� ��現量を算定した。

II.結果
 相対的AURKAmRNA発現量は、通常の12時間の培� �では1.9であったが、PIP-A10μM添加で0.9に低下� ��、PIP-AとPIP-Bをそれぞれ5μM添加すると0.8、� �スマッチとしてのPIP-B10μM添加では1.7であっ� ��。相対的AURKBmRNA発現量は、通常の12時間の� �養で2.1であったが、PIP-B10μM添加で1.0に低下� ��、PIP-AとPIP-Bをそれぞれ5μM添加すると1.1、� �スマッチとしてのPIP-A10μM添加では1.9であっ� ��。このことより、PIP-Aは単独でもPIP-Bと同時 に投与してもAURKA遺伝子のmRNA発現量を抑制し たが、PIP-BはAURKA遺伝子のmRNA発現量に影響を� ��ぼさなかった。同様にPIP-Bは単独でもPIP-Aと 同時に投与してもAURKB遺伝子のmRNA発現量を抑 制したが、PIP-AはAURKB遺伝子のmRNA発現量に影� ��を及ぼさなかった。PIP-AとPIP-BがそれぞれAUR KAとAURKBのmRNA発現量を特異的に且つ独立して� ��制することが示された。また、PIP-AとPIP-Bの 併用投与によっても発現抑制効果が保たれる 事が示された。各群においてTurkey-Kramer法に� �る多重比較検定の結果は、危険率P<0.05で� �意差ありと判定した。結果を図25及び26に示� ��。

(2)ルシフェラーゼアッセイ(プロモーター活� �の測定)
I.材料及び方法

 ヒトAURKA遺伝子上流のプロモータ領域1.8Kb(� �列番号27)とヒトAURKB遺伝子上流のプロモータ 領域約2.4Kb(配列番号28)を含むDNAフラグメント をpGL3ベクター(プロメガ)にそれぞれ挿入した 。それぞれのpGL3挿入ベクターをHeLa細胞にト� ��ンスフェクションし、プロモータアクティ� ��ティを相対的ルシフェラーゼによる発光強� ��として検出した、測定はTK vectorとのデュア ルルシフェラーゼアッセイシステム(プロメ� �)を利用し、データの補正を行った。それぞ� ��のアッセイを6回測定し、平均値とSD値で示� ��た。通常の培養系での発光とPIP-A、PIP-Bを10� �m 1μM添加後の発光強度を比較した。各群に� ��いてTurkey-Kramer法による多重比較検定を行っ た。
II.結果
 ヒトAURKA遺伝子上流のプロモータ領域1.8Kb(� �列番号27)を含むDNAフラグメントを挿入したpG L3ベクターによるHeLa細胞での発光活性は、PIP -Aの添加により濃度依存性に有意に低下した� ��このことによりPIP-Aの添加により、AURKAプロ モーターの調整下での発現ベクターからのル シフェラーゼ発現が抑制され、発光強度の低 下が起こったと確認された。
ヒトAURKAB遺伝子上流のプロモータ領域2.4Kb(配 列番号28)を含むDNAフラグメントを挿入したpGL 3ベクターによるHeLa細胞での発光活性は、PIP- Bの添加により濃度依存性に有意に低下した� �このことによりPIP-Bの添加により、AURKBプロ� ��ーターの調整下での発現ベクターからのル� ��フェラーゼ発現が抑制され、発光強度の低� ��が起こったと確認された。
 各群においてTurkey-Kramer法による多重比較検 定の結果は、危険率P<0.05で有意差ありと判 定した。結果を図27及び28に示す。

(3)ウエスタンブロッティング(タンパク質の� �定)
I.材料及び方法
 HeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を、100000細胞� ��なるよう播種し、10%子牛血清(Invitrogen)下で1 %PSGを含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)にて6時間培 養後、培地を交換し、10μMのPIP-A、PIP-Bおよび 5μMずつのPIP-AとPIP-B両方を含む10%子牛血清添� ��培地もしくはPIPを含まない同様の培地(1%DMSO 含有)で12時間培養し、細胞を蛋白分解酵素阻 害剤を含む、細胞溶解液内に回収した。SDS-PA GE法により、質量で分離後、通常のウェスタ� ��ブロットを行った。抗AURKA、抗AURKBマウスモ ノクローナル抗体(ABCAM社)を使用した。
コントロールとしてAnti beta-Actin(Rabbit)ELISA/WB( Rockland,Inc.)ベータアクチンに対する抗体を用� ��た。ウェスタン・ブロッティングでのバン� ��の濃淡をLAS4000にて測定し、各Polyamideのノッ クダウン効果を評価した。

II.結果
 AURKA及びAURKBの蛋白合成を、トータル12時間� ��ランダム(非同調)培養にて検討した。PIP-A及 びPIP-Bで処理した細胞群では、PIP化合物で非� ��理の対照細胞群(1% DMSO含有)に比べて、PIP化 合物の濃度依存性に、AURKA或いはAURKBの蛋白� �成が有意に低下している事が示された。ま� �、両PIP化合物のAURKA或いはAURKBの蛋白合成に� ��するノックダウン効果は、特に(終濃度で)10 μMのPIP化合物で処理した際に最も著しい事が 示された。加えて、PIP-AとPIP-Bを合計10μMで併 用処理(各5μM)した際には、何れもAURKA及びAURK Bの蛋白合成の有意な低下を認めた。一方、� �スマッチとしてのPIP-B及びPIP-Aは、それぞれA URKA或いはAURKBの蛋白合成量に何らの影響を及 ぼさなかった。
 また、コントロールとして用いたbeta-Actinの 蛋白合成量は、PIP非処理群/処理群で変化が� �く、常に一定していた。これらの結果は、� �量的real-time PCR assayによるmRNAの発現量解析� ��結果と完全に一致している。また、以上の� ��果は、両PIP化合物が、AURKA或いはAURKBのプロ モーター活性を抑制し、その結果、それぞれ のmRNAの発現量と蛋白合成量を、特異的に且� �互いに独立して抑制する事を示している。� �果を図29に示す。

5.細胞増殖阻害アッセイ

(1)HeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を用いた増殖 阻害アッセイ
I.材料及び方法
 細胞を用いて細胞増殖抑制試験を行った。H eLa細胞を、3000細胞となるよう96穴マイクロタ イタープレートに播種し、100μlの培地、10%子 牛血清(Invitrogen)下で1%PSGを含むDulbecco変性Eagle 培地(DMEM)にて6時間培養後、培地を交換し、0� �Mから20μM(0μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μ M、20μM)のPIP-A、PIP-Bおよび等量のPIP-AとPIP-B混 合物を含む10%子牛血清添加培地で48時間培養� ��、生細胞数測定試薬SF(Nacalai Tesque,Inc.)を10μ lずつ添加し、1時間呈色反応を行い、ARVOマイ クロタイタープレートリーダーで450nmの吸光� ��を測定した。なお、当該実験は水溶性ホル� ��ザンを用いたmodified MTT assay(WST-8 ^TM :Nacalai Tesque,Inc.)で施行した。

II.結果
 PIP-A単独では、濃度依存性に生細胞数の減� �が見られた。20μMではIC-50に達しなかったが� ��生細胞数は60%以下であった。PIP-B単独では� �濃度依存性に生細胞数の減少が見られ、そ� �IC-50値は12.41μMであった。PIP-AとPIP-Bの等量混 合物でも、同様に濃度依存性の生細胞数の減 少が認められ、そのIC-50値は6.45μMであった。 このことより、PIP-AとPIP-Bの等量混合物、PIP-B 単独、PIP-A単独の順に細胞増殖抑制が強く、P IP-AとPIP-Bの両方を同時に発現抑制することが 相乗的に腫瘍細胞増殖を抑制することが示唆 された。結果を図30に示す。
 PIP-A及びPIP-Bを単独もしくは併用で用いた際 の細胞増殖抑制効果については、両PIPを併用 した際に相乗効果が見られるかをMedian-effect  algorithm(CalcuSynversion 2.0 software(Biosoft,Ferguson,MO ))を用いて解析した。両PIPの等量(1:1)併用に� �有意な相乗効果[CI(ED50)=0.256]を認めた。

(2)種々の細胞を用いた細胞増殖アッセイ
I.材料及び方法

 上記5.(1)HeLa細胞(ヒト子宮頸がん細胞)を� �いた増殖阻害アッセイに記載されている実� �方法によって、HeLa、T98G、A549、A2780、HCT116、 MCF7、T47D、MRC5、HUVEC細胞を用いて、増殖抑制� ��果が最も高かったPIP-AとPIP-Bの等量混合物、 0μMから100μM(0μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、1 0μM、20μM、100μM)を用いて実施した。

II.結果
 全ての細胞でPIP-AとPIP-Bの等量混合物の添加 により、濃度依存性に増殖抑制効果が得られ た。A2780、HeLa、A549、T98G、HCT116、MCF7、T47D、MR C5、HUVECの順で、増殖抑制効果が高くみとめ� �れ、IC-50値は、A2780、HeLa、A549では5~10μMの間� ��T98G、HCT116、MCF7では10~20μMの間、T47D、MRC5は� ��20~100μMの間、HUVECは100μM以上であった。こ� �ことより、癌細胞由来の腫瘍細胞株A2780、HeL a、A549、T98G、HCT116、MCF7、T47Dで強い増殖抑制� ��認められ、正常細胞由来のMRC5、HUVECでは増� ��抑制が弱い傾向が認められた。結果を図31� �示す。

6.アポトーシス検出アッセイ

 アポトーシスの初期段階では、細胞膜の完� ��性は保たれているが、膜のリン脂質の非対� ��性が失われる。それに伴い、細胞膜の内側� ��局在する陰性荷電リン脂質のフォスファチ� ��ルセリン(PS)が細胞表面に露出し、Ca ²⁺ 依存性のリン脂質結合タンパクであるAnnexinV� ��PSに選択的に結合する。このことより、蛍� �標識したAnnexinVを用いることでアポトーシス に陥った細胞を検出することができる。この 際、細胞をヨウ化プロピジウム(PI)または7-ア ミノ-アクチノマイシンD(7-AAD)などのDNA特異的 な細胞生死判定用の色素で染色すると、細胞 膜構造が破壊される後期のアポトーシス細胞 に取り込まれ、この色素がDNAと結合すること より、前期および後期のアポトーシスを区別 して検出することが出来る。PIP-AとPIP-B、PIP-A とPIP-Bの等量混合物を培地に添加し、HeLa細胞 を用いてアポトーシスの誘導の有無をAnnexinV- FITCおよびPIによるアポトーシスの検出キット (Calbiochem)を用い確認した。AnnexinV-FITCによる� �ポトーシスの検出は蛍光顕微鏡による形態� �評価とフローサイトメトリー(FACScan(登録商� �):Becton-Dickinson(BD))を用いた定量的評価の両方 を行った.

I.材料及び方法
(1)AnnexinV-FITC
 HeLa細胞を用い、非処理群として1%DMSO、PIP-A( 10μM)、PIP-B(10μM)およびPIP-A(5μM)とPIP-B(5μM)の� �量混合物を添加後48時間の培養細胞をAnnexinV- FITCおよびPIで処理し、蛍光顕微鏡で観察した 。
(2)フローサイトメトリーによるアポトーシス 検出アッセイ投与後
 HeLa細胞を用い、非処理群として1%DMSO、PIP-A( 10μM)、PIP-B(10μM)およびPIP-A(5μM)とPIP-B(5μM)の� �量混合物を添加後48時間の培養細胞をAnnexinV- FITCおよびPIで処理し、40000個の細胞をフロー� ��イトメトリーにより解析した。

II.結果
(1)AnnexinV-FITC
 視野中に、非処理群では、FITCおよびPIの蛍� ��色を発する細胞はほとんど認められなかっ� ��。PIP-A(10μM)、PIP-B(10μM)およびPIP-A(5μM)とPIP-B (5μM)の等量混合物でFITCおよびPIの発色が認め られたことより、PIP-AとPIP-Bの等量混合物、PI P-B、PIP-Aの順でアポトーシスが強く誘導され� ��と考えられた。(2)にフローサイトメトリー� ��よる定量的解析を示す。
(2)フローサイトメトリーによるアポトーシス 検出アッセイ投与後
 非処理群では前期アポトーシス1.40%、後期� �ポトーシス4.76%が認められた。PIP-Aでは、前� ��アポトーシス3.83%、後期アポトーシス4.91%が 認められた。PIP-Bでは、前期アポトーシス14.3 2%、後期アポトーシス9.07%が認められた。PIP-A とPIP-Bの等量混合物(5μM)では、前期アポトー� ��ス33.66%、後期アポトーシス5.65%が認められ� �。前記アポトーシスの誘導は、PIP-AとPIP-Bの� ��量混合物、PIP-B、PIP-Aの順で強く誘導された 。前記アポトーシスの誘導は、PIP-B、PIP-AとPI P-Bの等量混合物、PIP-Aの順で強く誘導された� ��、PIP-A、PIP-AとPIP-Bの等量混合物と非処理群� ��差は認めず、PIP-Bで誘導が亢進する傾向が� �られた。
 このことより、PIP-Bによるものに比べPIP-A単 独でのアポトーシス誘導は顕著でなかった。 このことは、AURKAの阻害ではアポトーシスの� ��導は見られずAURKB阻害では強くアポトーシ� �が認められるとする複数の報告と合致した� �また、PIP-AとPIP-Bの等量混合物でアポトーシ� ��の誘導が、AURKB単独より、より強く誘導さ� �たことより、AURKAの阻害によるアポトーシス の誘導増強の現象と同様の所見が得られた。 つまり、本発明のAURKAおよびAURKBの併用によ� �抗癌効果の増強および本発明の化合物を使� �することで他の薬剤との併用による抗腫瘍� �果の増強、もしくはその判定に使用できる� �のと考えられた。結果を図32に示す。

7.統計解析
 結果は平均値±標準偏差(SD)で表現した。平� ��値間の差の有意性は、ANOVA 及びTurkey-Kramer� �による多重比較検定により評価した。少な� �とも0.05未満のp値を有意であると判定した。