Die Erfindung betrifft Epothilone der folgenden allgemeinen Formel:

worin R ¹ Wasserstoff, C-,-C ₄ -Alkyl, C _r C ₄ -Alkanoyl, ü ⁺ , K ⁺ , Na ⁺ , 1/2 Mg ²⁺ oder 1/2 Ca ²⁺ bedeutet und R ² Wasserstoff oder eine Methylgruppe darstellt.

Ferner betrifft die Erfindung ein Epothilon, gekennzeichnet durch einen oder mehrere der folgenden Parameter:

¹ H-NMR-Daten ¹³ C-NMR-Daten

Atom Atom

2a dd 1 170,5

2b dd 2 39,1

3 dd 3 73,2

6 m 4 53,0

7 dd 5 219,9

8 Ό 43,5

9a m 7 74,7

9b m 8 36,4

10a m 9 30,7

10b m 10 23,6

11a m 11 27,6

11b m 12 57,4

12 ddd 13 54,6

13 ddd 14 31,7

14a ddd 15 76,8

14b ddd 16 137,4

15 dd 17 120,1

17 s 18 152,1

19 s 19 116,3 1 ^* s 20 165,0 2 ^* s 2~ ^~ 20,4 3 d 22 ^* 21,6 4 d 23 14,1 5 s 24 - - 6 s 25 15,6

26

Zuordnung vertauschbar

C ₂₆ H39N0 ₆ S [493]

FAB-MS (neg. Ionen): 492.25 für (M - H)~

UV (MeOH) λ _max (log ε) = 210 (4.17); 249 (3.97)

IR Film auf Irtran: v: 3429:2966; 2937; 1737; 1691; 1463; 1374; 1295; 1257; 1185; 1150; 1087; 1029; 1014; 979 cnr ¹

DC: R _F = 0,75

DC-Alufolie 60 F ₂ 5 _4l Merck; Laufmittel: Dichlormethan/Methanol = 90 : 10 Detektion: 1. UV-Löschung bei 254 nm

2. Ansprühen mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz und erhitzen auf 120 ^° C, braune Anfärbung

HPLC: R _t = 5,4 min

Säule: 4 x 250 mm Lichrosorb RP-187 μm, Merck; Fluß: 1 ,5 ml/min; Laufmittel: Methanol/Wasser = 65 : 35 Detektor: UV 254 nm

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Epothilon, gekennzeichnet durch einen oder mehrere der folgenden Parameter:

Zuordnung vertauschbar

C ₂₇ H ₄₁ NO ₆ S [507]

FAB-MS (neg. Ionen): 506.25 für (M - H) ^"

UV (MeOH) λ _max (log ε) = 210 (4.17); 249 (3.97)

IR Film auf Irtran:

V = 3400; 2958; 2931; 2875; 1735; 1689: 1629; 1609; 1463; 1378; 1250; 1149; 1049; 977 crτr ¹

DC: R _F = 0,75

DC-Alufolie 60 F ₂ 5 ₄ , Merck; Laufmittel: Dichiormethan/Methanol = 90 : 10 Detektion: 1. UV-Löschung bei 254 nm

2. Ansprühen mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz und erhitzt auf 120 ^* C, braune Anfärbung

HPLC: R _t = 6,3 min

Säule: 4 x 250 mm Lichrosorb RP-187 μm, Merck; Fluß: 1 ,5 ml/min; Laufmittel: MethanolAΛ asser = 65 : 35 Detektor: UV 254 nm

Besonders bevorzugt sind Epothilone mit der folgenden Strukturformel:

worin R ² Wasserstoff oder Methyl bedeutet. (Das Kohlenstoffatom der Methyigruppe wird als C27 bezeichnet). Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Gewinnen von Epothiionen, insbesondere der vorstehend charakterisierten Epothilone, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Stamm So ce90 DSM 6773

in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden Medium kultiviert,

entweder während der Kultivierung des Stammes oder anschließend ein Adsorberharz zusetzt,

die Fermenterbrühe abtrennt,

die Epothilone aus dem Adsorberharz efuiert und

die Eluate direkt oder über weitere Reinigungsschritte von dem/den Lösungsmittel (n) befreit,

und gegebenenfalls über Hochdruck/Niederdruckchromatographie und/oder Umkristaliisation die verschiedenen Epothilone aufreinigt und voneinander trennt.

Gegebenenfalls können die so gewonnenen Epothilone mit gängigen chemischen Verfahren weiter umgesetzt werden, z.B. mit Basen in die Alkali- und Erdalkalisalze überführt und gegebenenfalls weiter zu Ethem umgesetzt werden, oder sie können mit organischen Säuren in die entsprechenden Ester überführt werden.

Ferner betrifft die Erfindung ein Mittel für den Pflanzenschutz in Landwirtschaft, Forstwirtschaft und/oder Gartenbau, bestehend aus einem oder mehreren der vorstehend aufgeführten Epothilone oder eines oder mehrere dieser Epothilone enthaltend, gegebenenfalls neben einem oder mehreren üblichen Träger(n) und/oder Verdünnungsmittel(n).

Schließlich betrifft die Erfindung ein therapeutisches Mittel, das insbesondere cytotoxische Aktivitäten entwickeln und/oder Immunsuppression bewirken kann, bestehend aus einem oder mehreren der vorstehend aufgeführten Epothilone oder eines oder mehrere dieser Epothilone enthaltend, gegebenenfalls neben einem oder mehreren üblichen Träger(n) und/oder Verdünnungsmittel(n).

- Administrationsform: oral

- Dosis 0.5 bis 200 mg für einen Menschen mit 70 kg Normalgewicht

- Verwendungszweck: Antitumor

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und experimentellen Daten näher erläutert.

Produktionsstamm

Stamm So ce90 wurde im Juli 1985 an der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF) aus einer Bodenprobe von den Ufern des Zambesi, im südlichen Afrika, isoliert. Der Stamm ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) unter Nr. 6773 hinterlegt.

Stammkultur und morphologische Beschreibung: Der Stamm wächst auf Cellulose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle mit KN0 ₃ als einzige Stickstoffquelle, z.B. auf Filterpapier über ST21 Mineralsalzagar (0.1 % KN0 ₃ ; 0.1 % MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0; 0.1 % CaCI ₂ x 2 H ₂ 0; 0.1% K ₂ HP0 ₄ ; 0.01 % MnS0 ₄ x 7 H ₂ 0; 0.02% FeCI ₃ ; 0.002% Hefeextrakt; Standard-Spurenelementlösung; 1% Agar). Auf diesem Medium werden dunkelrotbraune bis schwarzbraune Fruchtkörper gebildet, bestehend aus kleinen Sporangiolen (etwa 15 bis 30 μm Durchmesser) in mehr oder weniger großen dichten Haufen und Paketen.

Der Stamm wächst sehr gut mit Glucose und KN0 ₃ , z.B. auf CA2-Agar (Grundmedium: 1.5 g Agar in 92 ml Aqua dest.; Stammlösung 1 : 7.5% KN0 ₃ , 7.5% K ₂ HP0 ₄ in Aqua dest; Stammiösung 2: 1.5% MgS0 x 7 H ₂ 0 in Aqua dest; Stammlösung 3: 0.2% .CaCI ₂ x 2 H ₂ 0, 0.15% FeCI ₃ in Aqua dest.; Stammlösung 4: 20% Glucose in Aqua dest. Die Stammiösungen werden durch Autoklavieren sterilisiert. Je 1 ml der Lösungen 1 bis 3, sowie 5 ml der Lösung 4 werden dem Grundmedium zugegeben, ebenso eine geeignete Menge einer Spurenelementlösung).

Die vegetativen Stäbchen haben die für Soraπgium typische Form (relativ derbe, im Phasenkontrastmikroskop dunkle, zylindrische Stäbchen mit breit abgerundeten Enden, im Mittel 3 - 6 μm lang und 1 μm dick). Nach längerer Adaptation an das Wachstum in Flüssigmedien wächst der Stamm in homogener Zeilsuspension.

Der Stamm So ce90 produziert chemisch nahe verwandte Verbindungen, die antibiotische Aktivität besitzen- Insbesondere sind diese Verbindungen cytotoxisch sowie antifungal wirksam. Hervorzuheben ist z.B. die Hemmung von Mucor hiemalis.

Produktion der biologisch aktiven Verbindungen:

Die Verbindungen werden während der iogarithmischen bis hin zur stationären Wachstumsphase produziert. Eine typische Fermentation verläuft folgendermaßen: Ein 100 l-Fermenter wird mit 60 I Medium (0.8% Stärke; 0.2% Glucose; 0.2% Soyamehl; 0.2% Hefeextrakt; 0.1% CaCI ₂ x 2 H ₂ 0; 0.1% MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0; 8 mg/l Fe-EDTA; pH 7.4) gefüllt. Beimpft wird mit 10 I einer im gleichen Medium jedoch zusätzlich mit 50 mM HEPES-Puffer pH 7.4 in Schüttelkolben angezogenen Vorkultur (160 upm, 30 ^* C). Fermentiert wird bei 32 'C mit einer Rührgeschwindigkeit von 500 upm und einer Belüftung von 0.2. NL pro m ³ und Std, der pH Wert wird durch Zugabe von KOH bei 7.4 gehalten. Die Fermentation dauert 7 - 10 Tage. Die gebildeten aktiven Verbindungen befinden sich teils im Überstand und teils in den Zellen.

Alternativ dazu kaπa in Gegenwart von Adsorberharzen (z.B. XAD-1180, Rohm und Haas, 2 - 5 %) fermentiert werden-

Isolierung von Epothilon A und B

Während der Fermentation von Soraπgium cellulosum So ce90 (z.B. 70 I Fermentationsvolumen) in Gegenwart eines Adsorberharzes (z.B.: XAD-1180, Röhm und Haas, 2 % v/v) werden die gebildeten Antibiotika Epothilon A (Abb. 1 ) und B (Abb. 2) vollständig an das Harz gebunden. Nach Abtrennung der Kulturbrühe (z.B. durch Absieben in einem Prozeßfilter) wird das Harz mit 3 Bettvolumen Wasser gewaschen und mit 4 Bettvolumen Methanol eluiert. Die vereinigten Eluate werden im Vakuum bis auf den Wassergehalt eingeengt und dreimal mit je 0.2 1 Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden zur Trockne eingeengt (ca. 40 g Trockengewicht).

Der Rohextrakt wird in 50 ml Methanoi aufgenommen und an Lichroprep RP-18 25-40 μm (Säule: 400 x 100 mm; Fluß: 200 ml/min; Merck Prepbar) isokratisch mit Methanol/Wasser 6/4 chromatographiert. Die Epothilone enthaltenden Fraktionen (F^ ca. 95 - 125 min) werden durch RP-18 Niederdruckchromatographie aufgereinigt. (Säule 400 x 60; HD-Sil-18-20-60, Labomatic; Laufmittel: Methanol/Wasser 65/35; Fluß 25 ml/min; R _t Epothilon A: 140 - 165 min; R, Epothilon B: 170 - 195 min).

Die Feinreinigung der Epothilone erfolgt durch Kristallisation aus

1. Epothilon A: Toluol/Ethyiacetat = 3 : 2

2. Epothilon B: Ethylacetat

Epothilon A

C ₂₆ H ₃₉ N0 ₆ S [493]

FAB-MS (neg. Ionen): 492.25 für (M - H) ^"

1H-NMR-Daten s. Tab. 1

¹ 3C-NMR-Daten s. Tab. 2

UV (MeOH) λ _max (log ε) = 210 (4.17); 249 (3.97)

IR Film auf Irtran:

VI 3429:2966:2937; 1737; 1691; 1463: 1374; 1295; 1257; 1185; 1150; 1087; 1029: 1014:979 CITT ¹

DC: R _F = 0,75

DC-Alufolie 60 F ₂₅₄ , Merck; Laufmittel: Dichlormethan/Methanol = 90 : 10 Detektion: 1. UV-Löschung bei 254 nm

2. Ansprühen mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz und erhitzen auf 120 ^* C, braune Anfärbung

HPLC: R _t = 5,4 min

Säule: 4 x 250 mm Lichrosorb RP-18 7 μm, Merck; Fluß: 1 ,5 ml/min; Laufmittel: Methanol/Wasser = 65 : 35 Detektor: UV 254 nm

Epothilon B

C ₂₇ H ₄₁ 0 ₆ S [507]

FAB-MS (neg. Ionen): 506.25 für (M - H) ^{~ 1} H-NMR-Daten s. Tab. 1 13G-NMR-Daten s. Tab. 2

UV (MeOH) λ - _jχ (log ε) = 210 (4.17); 249 (3.97)

IR Film auf lrtran:

V=3400:2958:2931:2875:1735:1689:1629:1609:1463:1378:1250; 1149: 1049;977cm"

DC: R _F = 0,75

DC-Alufolie 60 F ₂₅₄ , Merck; Laufmittel: Dichiormethan/Methanol = 90 : 10 Detektioπ: 1. UV-Löschung bei 254 nm

2. Ansprühen mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz und erhitzt auf 120 ^* C, braune Anfärbung

HPLC: R _t = 6,3 min

Säule: 4 x 250 mm Lichrosorb RP-187 μm, Merck; Fluß: 1,5 mi/min; Laufmittel: Methanol Wasser = 65 : 35 Detektor: UV 254 nm

Tabelle 1

^') Zuordnung vertauschbar

Tabelle 2

" ⁾ Zuordnung vertauschbar

Anwendungsbeispiel

Nach bekannten Methoden (T. Meyer, U. Renegass, D. Fabbro, E. Alten, J. Rösel, M. Müller, G. Caravatti & A. Matter: A derivative of staurosporine (CGP 41 251 ) shows selectivity for protein kinase C inhibition and in vitro anti-prol iterative as well as in vivo anti-tumor activity. Int. J. Cancer 1989, 43, 851-6) wird Epothilon A auf die Hemmung der T-24 Zelliniβ untersucht. Es wird ein IC ₅₀ Wert von < 0.05 μM ermittelt.