BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Y GRAM POSITIVAS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece a los campos de química orgánica, química farmacéutica y medicina, en particular, a lipopéptidos cortos sintetizados mediante síntesis en fase sólida Fmoc, con actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Enfermedades infecciosas y resistencia a los antimicrobianos

Las enfermedades infecciosas son causadas por microorganismos patógenos como bacterias, virus, hongos o parásitos, que se multiplican en los tejidos del huésped causando diversos síntomas (Brugueras MC y García MM. 1998. Antibacterianos de acción sistémica. Parte I. Antibióticos betalactámicos. Revista Cubana de Medicina Integral; 14:347-361). Enfermedades como la tuberculosis, la neumonía, el paludismo, el VIH, entre otras, han generado un aumento en el índice de mortalidad provocando consecuencias sociales, económicas y amenazando la salud pública mundial (Sugden R, et al. 2016. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology;l: l-2).

La Organización Mundial de la Salud (OMS - WHO, del inglés World Health Organization ) como autoridad directiva y coordinadora de la acción sanitaria en el sistema de las Naciones Unidas, ha reportado una alta resistencia a los antibióticos que se utilizan convencionalmente, de bacterias patógenas como Klebsiella pneumoniae, Escherichia cotí, Staphlylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, entre otras. Aunque la resistencia a los antimicrobianos se ha presentado desde que los primeros antibióticos salieron al mercado en la década de 1930, como lo muestran diversos estudios (O’Neill J. 2016. Tackling drug- resistant infections globally: final report and recommendations. The Review on Antimicrobial Resistance: 1-80; Sugden et al. 2016. Op cit), el manejo inadecuado que se le da a estos, como el uso excesivo o empírico, es una de las razones que ha llevado al mayor desarrollo de resistencia por parte de los microorganismos (Singh S, et al. 2017. Understanding the mechanism of bacterial biofilms resistance to antimicrobial agents. The Open Microbiology Journal; 11:53-62). Adicionalmente el uso excesivo de antibióticos en la agricultura y en animales de granjas como cerdos y aves, contribuye al aumento de la resistencia a los antimicrobianos, tal como ha sido reportado por ejemplo en países de la Unión Europea (Carattoli A, et al. 2017. Novel plasmid-mediated colistin resistance mcr-4 gene in Salmonella and Escherichia coli, Italy 2013, Spain and Belgium, 2015 to 2016. Euro Surveillance;22:30589; Kinross P, et al. 2017. Livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) among human MRSA isolates, European Union/European Economic Area countries, 2013. Euro Surveillance;22:l-l3).

Esta problemática de la resistencia a los antimicrobianos afecta principalmente a los pacientes con compromiso de su sistema inmune, con enfermedades de base crónicas y en los procedimientos quirúrgicos de rutina o de mayor complejidad, que reciben tratamientos como la quimioterapia contra el cáncer, donde el uso de antibióticos es indispensable para evitar infecciones (Ma Q, et al. 2017. Antimicrobial resistance of Lactobacillus spp. from fermented foods and human gut. LWT - Food Science and Technology;86:20l-208; O’Neill J 2016. Op cit).

La resistencia se manifiesta cuando un microorganismo patógeno no es afectado por la exposición a un medicamento antimicrobiano natural o sintético que usualmente inhibiría su crecimiento. El microorganismo logra evitar la acción del antimicrobiano por medio de mecanismos de resistencia adquiridos como la producción de enzimas que inactivan o destruyen el medicamento, generando modificaciones a nivel molecular, cambiando el objetivo del compuesto antimicrobiano o alterando la permeabilidad de la membrana celular (Holmes A, et al. 2016. Understanding the mechanisms and drivers of antimicrobial resistance. The Lancet;387:l76-l87; Vignoli R y Seija V. 2000. Principales mecanismos de resistencia antibiótica. En: Temas de bacteriología y virología médica p. 649-662).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención corresponde a lipopéptidos sintéticos de fórmula

C„-XI-X ₂ -X3-NH ₂

en donde:

C _n es un ácido graso seleccionado del grupo que consiste de Ci ₂ a C _IÓ ; Xi es al menos una molécula de glicina;

X ₂ es al menos dos aminoácidos naturales con carga neta positiva y/o no proteinogénicos; y,

X ₃ puede estar presente o ausente y cuando está presente es al menos un aminoácido alif ático.

La longitud de la secuencia peptídica es de 3 a 5 residuos de aminoácidos, conjugados con un ácido graso entre 12 y 16 átomos de carbono, obtenidos mediante síntesis por la metodología en fase sólida Fmoc (9-Fluorenilmetoxicarbonil), con un rendimiento de la reacción de síntesis superior al 90% para todos los lipopéptidos.

Las nuevas moléculas llamadas LIP 1, LIP 2, LIP 3, LIP 4, LIP 5, LIP 6, LIP 11 y LIP 12, se caracterizan por una pureza mayor al 90%, una estructura secundaria de espiral al azar (random coil), determinadas mediante técnicas de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), espectrometría de masas (MS) y dicroísmo circular (CD) respectivamente. La masa molecular de los lipopéptidos determinada por medio de la masa protonada (M+H) es de: LIP 1= 485,4 Da, LIP 2=542,4 Da, LIP 3=613,5 Da, LIP 4=711,5 Da, LIP 5=513,4 Da, LIP 6=570,5 Da, LIP 11=641,5 Da, LIP 12=739,6 Da.

Los lipopéptidos presentan actividad antibacteriana contra bacterias patógenas (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Serratia marcescens, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus salivarius ) a concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) entre 8 a 50 mM y comprobada mediante micrografías obtenidas por microscopía electrónica de barrido (SEM). Adicionalmente, no presentan toxicidad en eritrocitos humanos a concentraciones entre 3,13 y 50,0 mM., ni en las larvas de mosquitos de la especie Aedes aegypti, a una concentración evaluada de 100 pM y presentan estabilidad frente a proteasas presentes en el suero sanguíneo humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1 Estructura de un lipopéptido sintético. Los lipopéptidos tienen secuencias peptídicas con un determinado número de aminoácidos (n), donde cada uno contiene una cadena lateral especifica (Ri o R ₂ ) y esta secuencia tiene conjugado un ácido graso al extremo N-terminal que está dado por cierta cantidad de átomos de carbono (x). El grupo carboxilo terminal del péptido aparece amidado, debido al proceso de síntesis y el desanclaje de la resina.

FIG. 2 Esquema de síntesis de lipopéptidos en fase sólida. Se indican los pasos de síntesis: desprotección de la resina, acoplamiento y desprotección de aminoácidos para la formación de la secuencia peptídica, la conjugación del ácido graso y el desanclaje del lipopéptido de la resina polimérica.

FIG. 3 Estructuras moleculares de los ocho lipopéptidos diseñados. Cada lipopéptido presenta su secuencia y su carga neta.

FIG. 4 Cromatogramas de los lipopéptidos sintetizados por RP-HPLC. Los cromatogramas muestran un tiempo muerto aproximadamente de 1,5 min y se observa que los lipopéptidos LIP 1 a LIP 4 presentan un tiempo de retención entre 8,4 y 11,9 min y los lipopéptidos LIP 5 a LIP 6 y LIP 11 a LIP 12 presentan un tiempo de retención entre 10,6 y 14,2 min.

FIG. 5 Espectros de masas de los lipopéptidos sintetizados por LC-MS. Los espectros muestran el ion molecular de cada uno de los lipopéptidos y otras señales correspondientes a la formación de aductos.

FIG. 6 Espectros de CD de los lipopéptidos sintetizados a 5,0 mM en 30% de TLE obtenidos en un espectropolarímetro. Los espectros muestran un máximo y un mínimo de absorción, cercanos a los 200 nm y 220 nm, respectivamente.

FIG. 7Actividad hemolítica de LIP 4 y LIP 12. Los lipopéptidos fueron evaluados en un rango de concentración de 3,13 a 50,0 pM en eritrocitos humanos que fueron incubados en solución salina al 0,9%. La hemoglobina liberada por la lisis celular fue analizada en un lector de microplacas a una longitud de onda de 545 nm.

FIG. 8 Micrografías SEM de células de P. aeruginosa tratadas con LIP 4. (A) Control de crecimiento por 20 h, (B) tratamiento por 30 min, (C) tratamiento por 2 h y (D) tratamiento por 20 h.

FIG. 9 Micrografías SEM de células de P. aeruginosa tratadas con LIP 12. (A) Control de crecimiento por 20 h, (B) tratamiento por 30 min, (C) tratamiento por 2 h y (D) tratamiento por 20 h.

FIG. 10 Micrografías SEM de células de S. aureus tratadas con LIP 12. (A) Control de crecimiento por 20 h, (B) tratamiento por 30 min, (C) tratamiento por 2 h y (D) tratamiento por 20 h. FIG. 11 Micrografías SEM de células de E. faecalis tratadas con LIP 12. (A) Control de crecimiento por 20 h, (B) tratamiento por 30 min, (C) tratamiento por 2 h y (D) tratamiento por 20 h.

FIG. 12 Micrografías SEM de células de E. coli tratadas con LIP 12. (A) Control de crecimiento por 20 h, (B) tratamiento por 30 min, (C) tratamiento por 2 h y (D) tratamiento por 20 h.

FIG. 13 Estabilidad de LIP 12 a proteasas del suero sanguíneo. Los cromatogramas obtenidos por RP-HPLC de cada muestra analizada en diferentes horas, están sobrepuestos, con el fin de apreciar que no hay aparición de nuevas especies causadas por la degradación proteolítica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones

Para propósitos de interpretar esta descripción, se aplicarán las siguientes definiciones y cuando sea apropiado, los términos utilizados en forma singular también incluirán la forma plural.

Los términos utilizados en la descripción tienen los siguientes significados a menos que el contexto indique claramente lo contrario:

Ácido graso: molécula de naturaleza lipídica formada por una cadena hidrocarbonada larga lineal, de diferente número de átomos de carbono con un grupo carboxilo en uno de los extremos.

ACN: Acetonitrilo

Agente terapéutico: compuesto químico que es usado para el tratamiento de una enfermedad.

Aminoácido: molécula orgánica con un grupo amino y uno carboxilo unidos a un carbono central y una cadena lateral variable unida al carbono central.

Aminoácido alifático: aminoácido con cadena lateral hidrocarbonada como alanina, valina, leucina e isoleucina.

Aminoácido no proteinogénico: aminoácidos naturales con función biológica que no forman parte de proteínas. Anfipático: una molécula o compuesto que posee la propiedad de ser a la vez hidrofílica e hidrofóbica.

Aniónico: compuesto que posee carga negativa.

Catiónico: compuesto que posee carga positiva.

Concentración mínima inhibitoria (CMI): concentración mínima de un compuesto que inhibe totalmente el crecimiento de microorganismos.

DCC: N, N’-diciclohexilcarbodiimida

DCM: Diclorometano

DMF: Dimetilformamida

Fmoc: 9-Fluorenilmetoxicarbonil

Hidrofílico: compuesto que tiene afinidad por el agua y le permite entrar fácilmente en solución.

Hidrofóbico: compuesto que no se puede mezclar con el agua.

HOBT: l-Hidroxibenzotriazol

Inhibición proteolítica: inhibición de la actividad de un compuesto por su degradación por medio de enzimas.

IPA: Alcohol isopropflico

Lipopéptido: molécula compuesta de una fracción de ácido graso y una fracción peptídica.

Péptido: oligómero compuesto por 2 a 50 aminoácidos unidos entre sí por enlaces amida conocidos como enlaces peptídicos.

RPMI: Roswell Park Memorial Institute (Medio celular)

t-Boc: Terbutoxicarbonil

TFA: Ácido trifluoroacético

TFE: 2,2,2-Trifluoroetanol

TIS: Triisopropilsilano

Péptidos antimicrobianos (AMPs)

La respuesta inmune innata o la inmunidad no adaptativa, es la forma de defensa natural de los organismos vivos frente a un amplio espectro de microorganismos patógenos. Esta respuesta involucra la producción de diversas moléculas, dentro de las cuales se encuentran los péptidos antimicrobianos (AMPs, del inglés Antimicrobial Peptides) o también conocidos como péptidos de defensa del huésped (HDPs, del inglés Host Defense Peptides) (Boman HG. 1995. Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annual Review of Immunology;l3:6l-92). Los AMPs presentan actividades biológicas como antimicrobiana, antiviral, anticancerígena, inmunomoduladora, entre otras, por lo cual han sido ampliamente estudiados (Marcellini L, et al. 2010. Fluorescence and electrón microscopy methods for exploring antimicrobial peptides mode(s) of action. En: Antimicrobial peptides: methods and protocols p.249-266).

Los AMPs contienen entre 2 y 50 residuos de aminoácidos, son de naturaleza catiónica (carga neta positiva que varía generalmente entre +1 a +6 a pH fisiológico), y exhiben entre un 40% y un 70% de hidrofobicidad en la secuencia de aminoácidos, lo que les proporciona un carácter anfipático (Laverty G, et al. 2010. Antimicrobial activity of short, synthetic cationic lipopeptides. Chemical Biology and Drug Design;75:563-569; Conlon JM, et al. 2014. Potential therapeutic applications of multifunctional host-defense peptides from frog skin as anti-cancer, anti-viral, immunomodulatory, and anti-diabetic agents. Peptides ; 57 : 67-77 ) .

Los AMPs presentan estructuras moleculares lineales o cíclicas, con estructuras secundarias definidas, que se dan por el plegamiento entre los aminoácidos de la secuencia, por medio de la formación de enlaces intermoleculares (puentes de hidrogeno), entre el grupo carbonilo (C=0), el grupo amino (N-H) y grupos hidroxilo (O-H) de las cadenas laterales. Los tipos de estructuras secundarias son, a-hélices, b-hojas, mixtas o estructuras extendidas en los ambientes membranosos (De La Luente-Núñez C, et al. 2014. Synthetic antibiofilm peptides. Biochimica et Biophysica Acta;l858: l06l-l069).

Las técnicas para identificar las estructuras de los AMPs pueden ser de alta resolución como Resonancia Magnética Nuclear (RMN), difracción de rayos X o de baja resolución como el Dicroísmo Circular (DC), que es de las más utilizadas para confirmar la estructura de péptidos y proteínas, por su fácil acceso y por ser una técnica no destructiva (Marcellini L, et al. 2010. Fluorescence and electrón microscopy methods for exploring antimicrobial peptides mode(s) of action. En: Antimicrobial peptides, Op cit. p. 249-266; Kelly SM, el al. 2005. How to study proteins by circular dichroism. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics;l751: 119-139). El identificar la estructura secundaria de los AMPs es importante, porque esta es fundamental para el mecanismo de acción, el cual se basa en el daño de la membrana celular del microorganismo, ocasionado por una distribución en las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de la estructura secundaria del péptido que produce como consecuencia un aumento en la permeabilidad de la membrana (Ong ZY, el al. 2014. Strategies employed in the design and optimization of synthetic antimicrobial peptide amphiphiles with enhanced therapeutic potentials. Advanced Drug Delivery Reviews;78:28-45).

Los AMPs interactúan electrostáticamente entre la región hidrofílica cargada y los grupos fosfatos de la superficie de la membrana bacteriana, seguido por la interacción hidrofóbica con la bicapa lipídica, formando poros y ocasionando la penetración o disrupción en la membrana celular lo que lleva a la pérdida del potencial de membrana, al escape de material citoplasmático y finalmente la muerte celular. Este mecanismo se diferencia de otros compuestos antimicrobianos que tienen actividad en blancos intracelulares (Ageitos JM, el al. 2017. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represen t novel weapons in thefight against bacteria. Biochemical Pharmacology; 133: 117-138).

Los AMPs presentan múltiples ventajas, como alta selectividad, buena eficacia y protocolos de síntesis estandarizados. Sin embargo, en comparación con otros antimicrobianos que se comercializan en el mercado, son propensos a hidrólisis u oxidaciones, presentan inestabilidad física y química y usualmente no están disponibles para el uso por vía oral. Por esto, se plantean mecanismos para obtener nuevos péptidos, como por ejemplo: la fragmentación de proteínas, diseños in silico y/o diseños racionales, sustituyendo aminoácidos de la secuencia de un péptido precursor o conjugación con otras macromoléculas ( Fosgerau K y Hoffmann T. 2015. Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discovery Today ;20: 122-128).

Algunas de las modificaciones más destacadas con el fin de incrementar la actividad antimicrobiana y la selectividad hacia la célula blanco son: la conjugación de antibióticos, unión de nanopartículas y polímeros, formación de complejos organometálicos y conjugación de lípidos con los AMPs. En particular la conjugación de lípidos con péptidos conlleva a la formación de lipopéptidos, los cuales han demostrado tener mayor interacción con la superficie de la membrana bacteriana (Fosgerau K. 2015. Op cit Reinhardt A y Neundorf I. 2016. Design and application of antimicrobial peptide conjugates. International Journal of Molecular Sciences;l7: l-2l).

Lipopéptidos

Los lipopéptidos son moléculas naturales o sintéticas que tienen conjugado un ácido graso al extremo N terminal de una secuencia peptídica cíclica o lineal, por medio de un enlace covalente. Los lipopéptidos naturales tienen un ácido graso en su estructura molecular, que les confiere características hidrofóbicas, unido a una secuencia peptídica cíclica de carácter hidrófilico que presenta entre 7 y 10 residuos de aminoácidos. Son sintetizados por la vía no ribosomal en algunas bacterias y hongos (Nasompag S, et al. 2015. Effect of acyl chain length on therapeutic activity and mode of action of the CX-KYR-NH2 antimicrobial lipopeptide. Biochimica et Biophysica Acta;l848:235l-2364).

Los lipopéptidos naturales son resistentes a la degradación por enzimas, dado que en su estructura contienen aminoácidos no nativos y la secuencia peptídica es cíclica. Hay tres familias reportadas de lipopéptidos naturales: surfactinas, iturinas y fengicinas.

Algunos lipopéptidos se utilizan como antibióticos de último recurso aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, del inglés Food and Drug Administration ) para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias altamente resistentes a los medicamentos. Ejemplos son la daptomicina, (lipopéptido aniónico activo contra bacterias Gram-positivas) y la polimixina B, un lipopéptido catiónico contra bacterias Gram- negativas.

Sin embargo, los lipopéptidos naturales presentan efectos secundarios perjudiciales, como la baja selectividad y alta toxicidad en células de mamíferos, como la nefrotoxicidad, en el caso de la polimixina B (Jerala R. 2007. Synthetic lipopeptides: a novel class of anti- infectives. Expert Opinión on Investigational Drugs; 16: 1159-1169; Osorio J, et al. 2017. Factores asociados a nefrotoxicidad por Polimixina B en un hospital universitario de Neiva, Colombia. 2011-2015. Rev Chilena Infectol;34:7-l3). Por lo tanto, los lipopéptidos sintéticos generan altas expectativas como alternativa a los AMPs y a los lipopéptidos de origen natural, ya que reportes indican que presentan baja citotoxicidad, alta retención in vivo, mayor estabilidad a proteasas y menores costos en la fabricación (Nasompag S et al, 2015. Op cit).

Lipopéptidos sintéticos

Los lipopéptidos sintéticos cortos son moléculas que presentan una secuencia de aminoácidos entre 3 y 5 residuos (Figura 1), pueden contener aminoácidos no naturales o no proteinogénicos, una carga neta positiva y un ácido graso con una longitud de cadena de 8 a 16 unidades de carbono, unido al extremo N-terminal de la secuencia peptídica a través de un enlace amida (Makovitzki A, et al. 2006. Ultrashort antibacterial and antifungal lipopeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 103: 15997- 16002; Nasompag S et al., 2015. Op cit).

Varios estudios demuestran que se requiere de un umbral de hidrofobicidad que es determinado por la longitud del ácido graso, en menor medida por aminoácidos hidrofóbicos y una secuencia peptídica hidrofílica definida en casi todos los casos por aminoácidos catiónicos, para que el lipopéptido presente actividad antimicrobiana. Cabe destacar que a pesar de que la secuencia peptídica es muy corta comparada con los AMPs tradicionales, su modo de acción es muy similar, y consiste en las interacciones electrostáticas entre los fosfolípidos y la carga neta positiva del lipopéptido, la penetración de la membrana, la formación de agregados y la despolarización y/o desestabilización de la membrana celular, causando la muerte del microorganismo (Laverty G, et al. 2010. Antimicrobial activity of short, synthetic cationic lipopeptides. Chemical Biology and Drug Design;75: 563-569; Makovitzki A, et al. 2006. Op cit; Nasompag S, et al. 2015. Op cit; Straus SK y Hancock REW. 2006. Mode ofaction ofthe new antibiotic for Gram-positive pathogens daptomycin : Comparison with cationic antimicrobial peptides and lipopeptides. Biochimica et Biophysica Acta;l758:l2l5-l223).

Otros estudios buscan una opción para mejorar la actividad antimicrobiana, los rendimientos de reacción y disminuir los altos costos de la síntesis de AMPs, mediante un enfoque minimalista y un diseño de novo de lipopéptidos (Dawgul M, et al. 2017. In vitro evaluation of cytotoxicity and permeation study on lysine- and arginine-based lipopeptides with proven antimicrobial activity. Molecules;22:2l73; Jerala R. 2007. Op cit.; Koh JJ, et al. 2017. Recent advances in synthetic lipopeptides as anti-microbial agents: designs and synthetic approaches. Amino Acids;49: 1653-1677; Konai MM, et al. 2017. Design and solution phase synthesis of membrane targeting lipopeptides with selective antibacterial activity. Chemistry - A European Journal;23: 12853-12860).

Síntesis de lipopéptidos en fase sólida por la metodología Fmoc

Los aminoácidos son moléculas que presentan dos grupos funcionales muy reactivos, un grupo carboxilo (R-COOH) y un grupo amino (R-NH ₂ ). La síntesis de la secuencia peptídica se da por la formación de enlaces amida, entre el grupo carboxilo y el grupo amino de dos aminoácidos que se encuentren adyacentes. La repetición de esta reacción da origen a una secuencia polimérica conocida como péptido (Etchegaray A y Machini MT. 2013. Antimicrobial lipopeptides: in vivo and in vitro synthesis. Microbial Pathogens and Strategies for Combating Them. Science, Technology and Education;2: 951-959). Para que la reacción de formación de péptidos sea selectiva solo con uno de los grupos donde se va a formar el enlace amida es necesario el empleo de grupos protectores. Adicionalmente algunos aminoácidos también presentan cadenas laterales con grupos amino o carboxilo, que deben estar protegidos, pero con un grupo protector diferente al de la cadena principal. Los grupos protectores más comunes son el 9-fluorenilmetoxi-carbonil (Lmoc) y el terc- butoxicarbonilo (t-Boc) (Etchegaray A y Machini MT. 2013. Op cit).

Las metodologías más usadas para la SPPS son la t-Boc y la Lmoc. La primera requiere de lavados con ácido trifluoroacetico (TEA) para eliminar los protectores de los grupos amino y de un ácido fuerte como el ácido fluorhídrico (HE) para el desanclaje o el clivaje, lo que puede provocar pérdidas en la secuencia y degradación de algunos aminoácidos. Por el contrario, la metodología Lmoc, emplea bases débiles como la piridina para retirar el grupo protector y de TLA para el desanclaje de la resina sin presentar efectos adversos (Lields GB. y Noble RL. 1990. So lid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids. International Journal of Peptide and Protein Research;35: 161-214, Kimmerlin T y Seebach D. 2005. “100 years of peptide synthesis”: ligation methods for peptide and protein synthesis with applications to beta-peptide assemblies. Journal of Peptide Research;65:229-260).

Los lipopéptidos se obtienen por la metodología estandarizada Lmoc, sobre una resina o soporte sólido polimérico con un enlazador (linker), el cual es un grupo funcionalizado que permite acoplar el primer aminoácido por medio de un enlace peptídico, y a partir de éste se acoplan los demás aminoácidos necesarios para la formación de la secuencia; finalmente se conjuga un ácido graso al extremo N- terminal de la secuencia sintetizada. Por medio de un enlace amida. El desprendimiento o clivaje de los lipopéptidos del soporte sólido se realiza con TFA al 95%. Con este tratamiento se desprotegen todos los grupos protectores de las cadenas laterales como los t-Boc (Amblard M, el al. 2006. Methods and protocols ofmodern solid phase peptide synthesis. Molecular Biotechnology;33:239-254, Mende F y Seitz O. 2011. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-based solid-phase synthesis of Peptide a-Thioesters. Angewandte Chemie - International Edition;50: 1232-1240. El procedimiento para la síntesis de lipopéptidos por esta metodología se puede observar en la Figura 2.

La presente invención ofrece lipopéptidos cortos con actividad antimicrobiana, mejor retención in vivo y que no sufren degradación proteolítica.

Los criterios relevantes en el diseño fueron:

• Una distribución de anfipaticidad en las moléculas, a través de la conjugación de un ácido graso de 12 a 16 átomos de carbono (extremo hidrofóbico) a una secuencia peptídica con carga neta positiva (extremo hidrofílico).

• Un incremento en la hidrofobicidad de la molécula por medio de la adición de aminoácidos alifáticos como la leucina.

• Un incremento en la hidrofilicidad de la molécula por medio de la adición de aminoácidos con carga positiva como la lisina u omitina.

• El uso de aminoácidos no esenciales o no proteinogénicos con características hidrofílicas en la secuencia peptídica, para disminuir la susceptibilidad a la degradación proteolítica de la molécula.

• Flexibilidad de los lipopéptidos entre el ácido graso (región hidrofóbica) y la secuencia peptídica (región hidrofílica) a través del aminoácido glicina.

Diseño de los lipopéptidos

Las secuencias de los lipopéptidos se diseñaron por medio de un modelo que se basa en mejorar o simular las principales características de los AMPs como la cationicidad, anfipaticidad y/o formación de estructuras secundarias. El diseño de novo se realizó con base en los reportes de lipopéptidos sintéticos y mediante el siguiente patrón estructural: C„-X _I -X ₂ -X3-NH ₂ (Figura 1).

Los criterios empleados en la construcción del diseño de novo de los lipopéptidos cortos se resumen en la Tabla 1:

Tabla 1. Criterios empleados para el diseño de novo de los lipopéptidos cortos mediante el patrón estructural C _n -Xi-X ₂ -X3-NH ₂ .

Patrón

Criterio empleado Molécula utilizada

Estructural

Ácido láurico

C„ Hidrofobicidad

Ácido mirístico

X i ^. Flexibilidad Glicina

Omitina

Carga neta positiva

X ₂ Lisina

Aminoácidos no proteinogénicos Omitina

x ₃ Incremento en la hidrofobicidad Leucina

Los criterios utilizados para el patrón estructural del diseño de novo se definen a continuación:

• C _n es un ácido graso con una longitud de 12 a 16 átomos de carbono (láurico, tridecanoico, mirístico, pentadecanoico, palmítico). El ácido graso le proporciona a cada molécula el carácter hidrofóbico, mediante la conjugación a la secuencia peptídica X _I -X ₂ -X ₃ -NH ₂ a través de un enlace amida. La longitud de la cadena carbonada entre 12 y 16 átomos de carbono proporciona la mejor actividad antimicrobiana.

• Xi corresponde al menos a una molécula de glicina (Gly), como conector entre el ácido graso y los aminoácidos adyacentes a este. El uso del aminoácido Gly le da mayor flexibilidad a cada molécula, ya que al ser el único aminoácido que en su cadena lateral presenta un átomo de hidrogeno le proporciona mayor libertad de movimiento. • X ₂ corresponde al menos a dos aminoácidos naturales con carga neta positiva y/o no proteinogénicos, que le proporcionan a la molécula el carácter hidrofílico y con carga positiva. Convencionalmente, los AMPs contienen exclusivamente residuos de arginina (Arg) o lisina (Lys) en las secuencias de aminoácidos, con carga positiva en condiciones fisiológicas. Para el diseño de novo de los lipopéptidos cortos se descartó el uso de Arg, debido a que aumenta la actividad hemolítica comparada con los residuos de Lys.

La incorporación de aminoácidos no naturales o no proteinogénicos en las secuencias peptídicas, es una herramienta para mejorar la estabilidad a las proteasas. Un ejemplo, es el aminoácido omitina (Om), el cual es un análogo estructural de la Lys y no es reconocido fácilmente por los sitios de unión de las proteasas humanas, por lo tanto, se espera que su incorporación en los diseños de los lipopéptidos cortos reduzca o detenga la degradación proteolítica.

• X ₃ representa, cuando está presente, al menos un aminoácido alifático, residuos de aminoácidos hidrofóbicos, con el fin de incrementar la interacción de la molécula con la membrana del microorganismo patógeno. Los más usados en los diseños de AMPs son los aminoácidos aromáticos, como el triptófano (Trp), la tirosina (Tyr) y la fenilananina (Phe), pero fueron descartados debido a que generan mayor toxicidad en las células mamíferas y adicionalmente, se conoce que son susceptibles a la degradación por la enzima quimotripsina, presente en el intestino humano. Por lo tanto, se utilizaron aminoácidos hidrofóbicos con cadenas alifáticas como la leucina (Leu), el cual ha demostrado buenos resultados antimicrobianos y estabilidad frente a la tripsina, quimotripsina y a la aureolisina.

Se diseñaron cuatro secuencias peptídicas y a cada una se le conjugaron los ácidos grasos empleados en el diseño de novo, para un total de ocho lipopéptidos cortos, de acuerdo con el patrón estructural propuesto: C ₁₁ -X1-X2-X3-NH2.

Las moléculas LIP 1, LIP 2, LIP 3 y LIP 4 contienen ácido láurico y las moléculas LIP 5, LIP 6, LIP 11 y LIP 12 contienen ácido mirístico en su estructura. La primera secuencia peptídica diseñada es GOO-NH ₂ , contiene en su estructura una glicina y dos omitinas, es flexible y con carga neta +2, esta secuencia está incorporada a LIP 1 y LIP 5.

La segunda secuencia peptídica es GGOO-NH2 _, incorporada a los lipopéptidos LIP 2 y LIP 6 _, a diferencia de la secuencia anterior, hay una molécula adicional de glicina, con el fin de evaluar diferencias en los resultados de la actividad antimicrobiana, atribuidos a un incremento en la flexibilidad de la molécula.

La tercera secuencia peptídica es GKOO-NH2 _, contiene el aminoácido lisina con el fin de incrementar la carga neta de la molécula a +3 y determinar si al aumentar la interacción eléctrica con la membrana del microorganismo, también aumenta la actividad, esta secuencia la contienen los lipopéptidos LIP 3 y LIP 11.

La cuarta secuencia peptídica es GOOLL-NH2 y los lipopéptidos que la contienen son LIP 4 y LIP 12, comparada con la secuencia inicial, tiene dos moléculas adicionales del aminoácido leucina, incrementado la hidrofobicidad de los lipopéptidos, con carga neta +2.

Las estructuras de los lipopéptidos diseñados se pueden observar en la Figura 3.

Otras modalidades de la presente invención incluyen, sin limitarse a, péptidos de fórmulas GOOA, GOOV y GOOI.

Los lipopéptidos de la presente invención pueden presentarse en forma de sales farmacéuticamente aceptables. La expresión“ sal farmacéuticamente aceptable” se refiere una sal que posee la eficacia del lipopéptido parental y que no es biológicamente o de otra manera indeseable (por ejemplo, no es ni tóxica ni perjudicial de ninguna otra manera para el receptor de la misma). Las sales adecuadas incluyen sales de adición de ácidos que pueden formarse, por ejemplo, mezclando una solución de un lipopéptido de la presente invención con una solución de un ácido farmacéuticamente aceptable tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido trifluoroacético o ácido benzoico.

Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen acetatos, ascorbatos, benzoatos, bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, canforatos, canforsulfonatos, fumaratos, clorhidratos, bromhidratos, yodhidratos, lactatos, maleatos, metanosulfonatos (“mesilatos”), naftalenosulfonatos, nitratos, oxalatos, fosfatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatas, tartratos, tiocianatos, tolueno sultanatos (también conocidos como tosilatos) y similares.

Los grupos básicos que contienen nitrógeno se pueden cuaternizar con agentes tales como haluros de alquilos inferiores (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo), sulfatas de dialquilo (por ejemplo, sulfatas de dimetilo, dietilo y dibutilo), haluros de cadena larga (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo y estearilo), haluros de aralquilo (por ejemplo, bromuros de bencilo y fenetilo) y otros.

La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas, en particular con medicamentos, que comprenden por lo menos un lipopéptido de acuerdo con la invención, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente adecuados, y con su uso para el tratamiento de infecciones causadas por microorganismos Gram-positivos y Gram- negativos.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, pero no se limitan a: rellenos como celulosa, celulosa microcristalina, lactosa, manitol, almidón, etc.; bases de ungüentos como jalea de petróleo, parafinas, triglicéridos, ceras, cera de lana, alcoholes de cera de lana, lanolina, ungüentos hidrofílicos, polietilenglicoles, etc.;

bases para supositorios como polietilenglicoles, manteca de cacao, grasas duras, etc.; solventes como agua, etanol, isopropanol, glicerol, propilenglicol, aceites grasos de triglicéridos de longitud de cadena mediana, polietilenglicoles líquidos, parafinas, etc.;

agentes tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o humectantes como dodecilsulfato de sodio, lecitina, fosfolípidos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, polioxietilenésteres de ácidos grasos de sorbitán, polioxietilenglicéridos de ácidos grasos, polioxietilenésteres de ácidos grasos, polioxietilenéteres de alcoholes grasos, glicerol ésteres de ácidos grasos, poloxámeros, etc.; soluciones amortiguadoras y también ácidos y bases como fosfatos, carbonatas, ácido cítrico, ácido acético, ácido clorhídrico, solución de hidróxido de sodio, carbonato de amonio, trometamol, trietanolamina, etc.;

agentes de isotonicidad como glucosa, cloruro de sodio, etc.;

adsorbentes como silicios altamente dispersos;

agentes para aumentar la viscosidad, formadores de geles, espesantes y/o aglutinantes como polivinilpirrolidona, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, almidón, carbómeros, ácidos poliacrílicos, alginatos, gelatina, etc.;

desintegrantes como almidón modificado, carboximetilcelulosa de sodio, almidón glicolado de sodio, polivinilpirrolidona entrecruzada, croscarmelosa de sodio, etc.; reguladores de flujo, lubricantes, deslizantes y agentes desmoldeantes como estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, silicios altamente dispersos, etc.; materiales de recubrimiento como azúcar, goma laca y formadores de películas para membranas de películas o de difusión que se disuelven rápidamente o de una manera modificada como polivinilpirrolidonas, alcohol polivinílico, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, etilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, poliacrilatos, polimetacrilatos, etc.;

materiales para cápsulas como gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa, etc.;

polímeros sintéticos como poliláctidos, poliglicólidos, poliacrilatos, polimetacrilatos, polivinilpirrolidonas, alcoholes polivinílico s, acetatos de polivinilo, óxidos de polietileno, polietilenglicoles y sus copolímeros y copolímeros de bloques;

plastificadores como polietilenglicoles, propilenglicol, glicerol, triacetina, citrato de triacetilo, ftalato de dibutilo, etc.;

mejoradores de la penetración;

estabilizantes, antioxidantes como ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, ascorbato de sodio, butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno, galato de propilo, etc.;

conservantes como parabenos, ácido sórbico, tiomersal, cloruro de benzalconio, acetato de clorhexidina, benzoato de sodio, etc.;

colorantes como pigmentos inorgánicos: óxidos de hierro, dióxido de titanio, etc.; saborizantes, endulzantes, enmascaradores de sabores y/u olores. Los lipopéptidos de la invención pueden ser formulados para su uso en agricultura. Las composiciones para uso en agricultura que comprenden por lo menos un lipopéptido de acuerdo con la invención, pueden ser aplicadas de diversas formas en diversas formulaciones, seleccionando en cada caso los vehículos aceptables más apropiados para la forma de aplicación.

Los coadyuvantes aceptables para agricultura incluyen pero no se limitan a: diluentes, polímeros de recubrimiento, tensioactivos, reguladores de pH, pigmentos, colorantes, arcillas, almidones, derivados de la celulosa, estearatos, polímeros naturales, polímeros sintéticos, poliésteres, etc.

Las composiciones de la invención pueden ser sólidas en forma de polvos, granulados, tabletas o pellets, o pueden ser líquidas en forma de suspensión o emulsión y pueden ser de aplicación foliar, aplicación al suelo, por espolvoreo, por irrigación y/o por aspersión y pueden ser mezcladas con otros bioinsumos, extractos vegetales y agroquímicos.

EJEMPLOS

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, los cuales no debe interpretarse como limitantes.

Ejemplo 1. Síntesis de lipopéptidos

La síntesis se realizó de acuerdo a los lipopéptidos diseñados con base en los criterios descritos en la Tabla 1 y se llevó a cabo mediante la adaptación de la metodología de síntesis en fase solida Fmoc de AMPs. Las etapas de la síntesis se describen a continuación.

Ejemplo 1.1. Activación y desprotección de la resina

Se utilizó una resina Rink Amida AM (4-(2',4'-Dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)- fenoxiacetamido-aminometil) 100-200 mesh, con un grado de sustitución de 0,74 mmol/g, en un reactor con una frita porosa. Para su activación se realizaron lavados con diclorometano (DCM) durante 5 minutos, y posteriormente con N,N-dimetil-formamida (DMF) durante 2 horas, con agitación constante en un agitador orbital. El paso de desprotección de la resina se realizó mediante la remoción del grupo protector (Fmoc), por medio de dos lavados sucesivos con una solución de 4-metil-piperidina al 25% (v/v) en DMF, en agitación durante 15 minutos cada uno. Se realizaron lavados con DMF, isopropanol (IPA) y DCM para eliminar los residuos de la 4-metil-piperidina. Se verificó que la resina tuviera los grupos amino disponibles mediante la prueba positiva de ninhidrina, donde la obtención del color azul confirma la desprotección del grupo amino.

En la etapa inicial del mecanismo de reacción de la desprotección del grupo Fmoc, el par de electrones libres de la 4-metil-piperidina ataca al protón del grupo Fmoc, lo que genera que se rompa el enlace amida, y posteriormente el grupo amino de la resina o del aminoácido queda libre en la segunda etapa, y finalmente, en las últimas etapas se detalla la formación del aducto de dibenzofulveno de 4-metil-piperidina que es soluble en DMF removiéndolo fácilmente por medio de lavados.

Ejemplo 1.2. Acople de aminoácidos

Para la reacción de acople se calculó la masa necesaria de aminoácidos y los activadores diciclohexilcarbodiimida (DCC) y O-hidroxibenzotriazol (HOBt) con una proporción de 5 a 1 con respecto a la resina polimérica, para garantizar un exceso que reaccionara con todos los sitios activos de la resina, los cuales se disolvieron en DMF y la solución se adicionó mediante succión al reactor asegurando que toda la resina quedara sumergida. Se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente y luego se realizaron lavados con DMF, IPA y DCM. Se verificó que los acoples se llevaran a cabo mediante la prueba de ninhidrina, donde la obtención del color amarillo claro confirma la reacción del grupo amino.

Se repitieron los pasos de desprotección del grupo Fmoc y los pasos de acople hasta tener la secuencia de aminoácidos completa.

Ejemplo 1.3. Acople del ácido graso

Después de asegurar la desprotección, la reacción de acople se da por medio del grupo carboxílico del aminoácido que tiene protegido el amino con el grupo protector Fmoc y la DCC para formar el éster Oacilsoúrea que lentamente forma el compuesto A-acilúrea, el cual es insoluble y no es reactivo; para evitar dicho subproducto se adicionó el nucleófilo HOBt generando el éster activo de benzotriazol que reacciona específicamente con el grupo amino libre de la resina para formar el enlace amida.

Se realizó la desprotección del extremo N-terminal de la secuencia peptídica y se procedió a realizar el acople del ácido graso por seis horas. Se realizaron lavados sucesivos con DMF, IPA, DCM y se dejó secar la resina con la secuencia durante 24 horas en un desecador. Se verificó el acople mediante la prueba de ninhidrina (color amarillo claro).

Ejemplo 1.4. Desanclaje

Se adicionó una mezcla compuesta por ácido trifluoroacético (TFA) / Triisopropilsilano (TIS) / agua (H ₂ 0) en una proporción de volumen (95:2,5:2,5) al reactor que contiene la resina-lipopéptido, durante dos horas en agitación constante. Se expulsó la mezcla del reactor en un tubo falcon y se realizaron lavados con éter etílico frió (aproximadamente a - 4 °C) para que el lipopéptido precipitara. Se centrifugó a 4500 rpm y - 4°C y se lavó nuevamente con éter para eliminar las impurezas. Finalmente, se disolvieron en agua y se congelaron a -20 °C para secarlos por liofilización.

Los lipopéptidos secos se pesaron para calcular el porcentaje de rendimiento de reacción de síntesis, por medio de la siguiente ecuación y se almacenaron en un desecador hasta realizar los respectivos ensayos de caracterización y actividad biológica.

Rendimiento obtenido ( g )

% Rendimiento de reacción =— - -— : - —— ^x 100

Rendimiento teórico ( g )

Los rendimientos obtenidos en la reacción de síntesis para cada lipopéptido se muestran en la Tabla 2, con su respectiva masa y secuencia.

Tabla 2. Secuencia de los lipopéptidos sintetizados, masa obtenida y porcentaje de rendimiento de reacción.

Masa obtenida del

Lipopéptido Secuencia Rendimiento (%)

lipopéptido (g)

LIP 1 C12-GOO-NH2 0,1013 93,1

LIP 2 C12-GGOO-NH2 0,1176 97,6

LIP 3 C12-GKOO-NH2 0,1298 93,1 LIP 4 C12-GOOLL-NH2 0,1551 97,0

LIP 5 C14-GOO-NH2 0,1111 97,1

LIP 6 C14-GGOO-NH2 0,1292 99,4

LIP 11 C14-GKOO-NH2 0,1428 97,6

LIP 12 C14-GOOLL-NH2 0,1522 92,2

Ejemplo 1.5. Purificación de lipopéptidos

La pureza de los lipopéptidos sintetizados se verificó mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia en Fase Reversa (RP-HPLC) en un cromatógrafo Agilent Technologies Serie 1200, con un detector UV-VIS a una longitud de onda de 220 nm y se empleó una columna de fase reversa, Zorbax Eclipse RP-18 XDBC18 analítica con dimensiones de 4,6 x 150 mm y un diámetro de poro de 5 pm.

La elución de los lipopéptidos se realizó mediante un gradiente lineal de ACN:TFA (0,1%) y H2O : TFA (0,1%) con un flujo de 1 mL/min y un volumen de inyección de 20 pL.

Ejemplo 2. Caracterización estructural

Ejemplo 2.1. Cromatografía líquida de alta eficiencia

Los lipopéptidos liofilizados se reconstituyeron en agua para determinar la pureza por cromatografía líquida de alta eficiencia con un detector UV/VIS a una longitud de onda de 220 nm, debido a que a esta longitud se encuentra el máximo de absorción del enlace peptídico.

En todos los cromatogramas (Figura 4) se observa un pico mayoritario correspondiente a cada lipopéptido con una pureza mayor al 90% y pequeños picos atribuidos posiblemente a impurezas procedentes de la síntesis.

Los tiempos de retención están relacionados con la hidrofobicidad de cada molécula, en la que los lipopéptidos que contienen ácido láurico presentan un tiempo de retención entre 8,4 y 11,9 minutos y los que contienen el ácido mirístico presentan un tiempo de retención entre 10,6 y 14,2 minutos, debido a la longitud de la cadena alquílica, la cual tiene mayores interacciones hidrofóbicas con la fase estacionaria de la columna. Adicionalmente, se puede hacer una relación entre los tiempos de retención de los cromatogramas de cada lipopéptido y la escala de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle (valores de hidrofobicidad de los residuos de aminoácidos) de las secuencias peptídicas, en el cual, las secuencias GKOO (LIP 3 y LIP 11) se observan con el menor tiempo de retención debido una mayor hidrofilicidad por la presencia de 3 aminoácidos cargados positivamente; en las secuencias GOO y GGOO presentan tiempos muy similares entre LIP 1 con LIP 2 y LIP 5 con LIP 6, debido a que difieren solo por una glicina que presenta un bajo valor de hidrofobicidad. Finalmente, las secuencias GOOLL (LIP 4 y LIP 12) son las que presentan mayor tiempo de retención debido a la hidrofobicidad adicional que les proporciona el par de leucinas (ver Tabla 3).

Ejemplo 2.2. Espectroscopia de masas

La masa de los lipopéptidos se confirmó mediante la determinación de los pesos moleculares generados por una fuente de ionización por electrospray (ESI, del inglés Electrospray ionization ) en modo positivo. La caracterización se llevó a cabo en un equipo de cromatografía líquida de alta eficiencia acoplado a un espectrómetro de masas marca Shimadzu modelo 2020, utilizando un gradiente lineal de 5 a 100% (v/v) de acetonitrilo y una inyección de 10 pL.

Los resultados de los espectros de cada lipopéptido (Figura 5) muestran que los valores del ión molecular corresponden a la masa esperada o calculada teóricamente.

La ionización por ESI en modo positivo es una técnica de ionización suave, la cual ioniza los grupos funcionales susceptibles a protonación.

En los espectros de masa se observa que la mayoría de los lipopéptidos tienden a formar un aducto con el acetonitrilo (masa molecular 41,05 g/mol) debido a que es el solvente utilizado en la elución, presentado un pico de ion molecular M+41+2H con un z=+2, también se puede ver que los lipopéptidos LIP 1, LIP 2, LIP 5 y LIP 6 forman dímeros con z=+l, los cuales son subunidades o monómeros del lipopéptido, formados generalmente por fuerzas intermoleculares como los puentes de hidrogeno, lo cual es muy probable que se dé la formación de estas especies en los péptidos. El análisis de los espectros para cada lipopéptido se detalla en la Tabla 4.

Tabla 4. Asignación de señales en los espectros de masas de los lipopéptidos sintetizados.

Ejemplo 2.3. Dicroísmo circular

El análisis de dicroísmo circular se realizó diluyendo los lipopéptidos en una solución de H ₂ 0:TFE en un espectropolarímetro marca Jasco, modelo J-810, con una celda de cuarzo y longitud óptica de 1,0 mm. Los lipopéptidos se prepararon a una concentración de 5,0 mM en una solución al 30% (v/v) de 2,2,2-trifluoroetanol (TFE), en un rango de lectura de 190 a 260 nm a temperatura ambiente, con un ancho de banda de 0,5 nm y una velocidad de barrido de 50 nm/min. El alcohol fluorado (TFE) se emplea con el fin de estabilizar la formación de las estructuras secundarias como hélices, hojas-b o giros, debido a que presenta una constante dieléctrica baja y un momento dipolar alto, favoreciendo la formación de puentes de hidrógeno intramoleculares con el enlace amida y por lo tanto promoviendo el plegamiento de la secuencia peptídica. Los espectros de dicroísmo circular se observan en la Figura 6.

Teniendo en cuenta la corta longitud de la secuencia de los lipopéptidos se espera que estos presenten una estructura desordenada o llamada también random coil, que se caracteriza teóricamente por tener una intensa banda negativa alrededor de 195-200 nm (p~^p*) y otra positiva, pero de menor intensidad en 220 nm (h- p*).

Se observa que en los ocho espectros de dicroísmo circular (CD) de los lipopéptidos sintetizados hay dos bandas negativas, una de mayor intensidad cercana a los 200 nm y otra menor intensidad alrededor de 220 nm. La banda de baja intensidad correspondiente a las transiciones h- p*, es negativa, pero para que sea característica de una estructura desordenada deber ser positiva.

Este análisis cualitativo llevó a predecir que las estructuras secundarias de los ocho lipopéptidos sintetizados son desordenadas o random coil, presentando comportamientos similares en los espectros de CD con otros lipopéptidos reportados.

Ejemplo 2.3. índice de hidrofobicidad

La hidrofobicidad de los péptidos se puede expresar como un índice de hidrofobicidad (IH) correspondiente al porcentaje de acetonitrilo en el que eluyó la molécula por RP-HPLC, debido a que es el solvente de uso común para la cromatografía de péptidos. En la Tabla 5 se muestran los valores calculados del índice de hidrofobicidad (IH) de cada lipopéptido de acuerdo con los cromatogramas de la Figura 6, con un valor en el rango de hidrofobicidad de los AMPs entre 40 y 60%.

Los lipopéptidos LIP 4 y LIP 12 tienen un peso molecular de 710,5 Da y 738,5 respectivamente, siendo más pequeños que los lipopéptidos naturales polimixina B con 1301,5 Da y daptomicina con 1619,7 Da, pero de tamaño similar a los lipopéptidos sintéticos reportados como C ₁₂ -OOWW-NH ₂ con 799,5 Da (Laverty et al. 2010. Op cit), C ₁₄ -KYR- NH ₂ con 674,9 Da y otros diseñados y sintetizados por Lohan el al., que tienen un peso molecular alrededor de 700 Da (Lohan et al. 2014. Op cit).

Tabla 5. índice de hidrofobicidad de los lipopéptidos diseñados y sintetizados en este estudio. _

Lipopéptido tu ¹ (min) IH ² (% ACN)

LIP 1 9,427 43,6

LIP 2 9,489 43,7

LIP 3 8,353 40,9

LIP 4 11,872 49,7

LIP 5 11,851 49,6

LIP 6 11,959 49,9

LIP 11 10,648 46,6

LIP 12 14,220 55,6

¹ tiempo de retención determinado por RP-HPLC.

² índice de hidrofobicidad calculado con el porcentaje de ACN.

Ejemplo 3. Actividad biológica

Ejemplo 3.1. Actividad antimicrobiana

Se tomaron como modelos bacterianos de bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S. salivarius, Bacillus cereus y Enterococcus faecalis y como bacterias Gram negativas Escherichia coli, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa. Adicionalmente se evaluó Candida albicans como levadura, siendo todas las especies patógenas de humanos y que generan graves problemas en los sistemas de salud a nivel mundial. Las cepas útil izadas se encuentran en la Tabla 6.

Tabla 6. Microorganismos evaluados en la actividad antimicrobiana. Las especies bacterianas y la levadura son cepas de referencia ATCC (del inglés, American Type Culture Collection ) con características genotípicas y fenotípicas definidas para cada especie.

Como primera medida, se realizó la curva de crecimiento bacteriano de cada una de las cepas evaluadas, solas y en presencia de los lipopéptidos desarrollados, a diferentes concentraciones.

Las cepas microbianas utilizadas (Tabla 6) se activaron en caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) para bacterias, en caldo Sabouraud para levaduras a 37°C durante 18 horas cada una, para sembrar 10 pL de suspensión en el respectivo medio de cultivo y obtener colonias individuales. Se preparó una suspensión ajustada a un estándar 0,5 en la escala de McFarland midiendo a una longitud de onda de 600 nm, la cual debe estar entre 0,08-0,13 correspondiente a lxlO ⁸ UFC/mL. Se preparó una dilución de 10 mL equivalente a una concentración de lxlO ⁶ UFC/mL.

Se determinó si el efecto es bactericida o bacteriostático a la concentración de < 50 mM. Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 7.

Según los resultados de la Tabla 7, se puede observar que LIP 12 presenta un efecto bactericida a concentraciones menores a 12,5 mM en las bacterias Gram positivas y Gram negativas ensayadas en este estudio, con excepción de K. pneumoniae y A. baumannii, comparando su acción de amplio espectro con el lipopéptido bactericida modificado C ₁₄ KKC ₁₂ K y a diferencia de los lipopéptidos naturales que son selectivos como la Polimixina B y la Daptomicina, utilizados para tratar bacterias Gram negativas y Gram positivas respectivamente. Todos los lipopéptidos que inhibieron el crecimiento de S. aureus y de E. cotí en este estudio tienen un efecto bactericida, mientras que en P. aeruginosa la mayoría de lipopéptidos presentaron un efecto bacteriostático, a excepción de LIP 12. Los resultados de las pruebas antimicrobianas en E. faecalis mostraron que LIP 1 y LIP 6 tienen un efecto bacteriostático y LIP 4, LIP 5, LIP 11 y LIP 12 tienen un efecto bactericida.

Tabla 7. Efecto bactericida o bacteriostático de los lipopéptidos diseñados en este estudio y que fueron activos contra los microorganismos evaluados.

Ejemplo 3.2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

De acuerdo con los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antimicrobiana, los lipopéptidos que inhibieron el crecimiento de los microorganismos a una concentración menor o igual a 25,0 mM se evaluaron nuevamente y utilizando otras cepas de referencia, para determinar la CMI. Los resultados obtenidos se registraron en la Tabla 8 (Anexo 1).

Se observa claramente que la inhibición del crecimiento microbiano es un factor dependiente de la hidrofobicidad, dado que el primer grupo de lipopéptidos que contiene ácido láurico (LIP 1, LIP 2, LIP 3 y LIP 4) presentan, CMIs más altas que el grupo que contiene ácido mirístico (LIP 5, LIP 6, LIP 11 y LIP 12), que es más hidrofóbico que el ácido láurico. Cabe resaltar que los lipopéptidos LIP 4, LIP 5, LIP 6, LIP 11 y LIP 12 fueron todos activos contra bacterias Gram positivas, posiblemente al ser más hidrofóbicos que LIP 1, LIP 2 y LIP 3, dicha selectividad es similar al del lipopéptido natural daptomicina y al glucopéptido vancomicina, los cuales son péptidos conjugados con macromoléculas y selectivos para bacterias Gram positivas.

Al aumentar la flexibilidad de los lipopéptido s adicionando dos moléculas de glicina en la secuencia, los resultados no fueron significativamente diferentes entre LIP 1 y LIP 2 y entre LIP 5 y LIP 6, pero los lipopéptidos a los que se les incrementó la hidrofobicidad agregando el par de leucinas en la secuencia peptídica (LIP 4 y LIP 12) mostraron resultados bactericidas a concentraciones bajas dado que LIP 4 y LIP 12 inhiben tanto bacterias Gram positivas como Gram negativas, por lo que se podrían considerar como moléculas biológicamente activas de amplio espectro.

En el presente estudio se demostró que algunos de los lipopéptidos diseñados y sintetizados inhiben el crecimiento bacteriano y que ésta actividad depende de un balance sutil entre la hidrofobicidad de la molécula proporcionada por el ácido graso y las leucinas y los aminoácidos cargados positivamente, aunque presenten una estructura desordenada en la solución H ₂ 0 : TFE (70:30).

Ejemplo 3.3. Actividad hemolítica

La actividad hemolítica se analizó sobre una muestra de sangre humana de un donante voluntario sano en ayunas. La muestra de sangre se centrifugó a 1000 x g, a temperatura ambiente durante 7 minutos, para separar los eritrocitos humanos. El pellet que se formó fue lavado tres veces con solución salina estéril al 0,9% (m/v) de NaCl, centrifugando a 1000 x g y desechando los sobrenadantes por cada lavado. Se preparó una suspensión 1: 10 de eritrocitos en solución salina y luego se adicionaron 90 pL de la suspensión diluida de eritrocitos y 10 pL de una solución de cada lipopéptido a tubos eppendorf para una concentración final de 50,0 pM, 25,0 pM, 12,5 pM, 6,25 pM y 3,13 pM.

Se incubaron las suspensiones a 37°C durante 3 horas a 90 rpm y se centrifugaron a 1000 x g a temperatura ambiente por 5 minutos. Se tomaron 50 pL del sobrenadante y se adicionaron en una placa de 96 pozos y se realizó lectura de la absorbancia a 545 nm. Se empleó como control positivo una solución al 0,1 % (v/v) de Tritón X-100 en la suspensión de eritrocitos, lo cual corresponde 100 % de hemolisis y como control negativo solución salina estéril al 0,9% de NaCl en la suspensión de eritrocitos (Evans et al., 2013). Los ensayos se realizaron por triplicado para cada lipopéptido.

El porcentaje de hemolisis se calculó por medio de la siguiente ecuación: 100

En la Figura 7 se presentan los resultados de la actividad hemolítica de los lipopéptidos en diferentes concentraciones.

Los lipopéptidos LIP 4 y LIP 12 mostraron un bajo porcentaje de hemolisis (<5%) en un rango de concentración entre 3, 13 mM y 50 pM en comparación al control positivo utilizado para el ensayo (Tritón X-100 al 0,1 %) el cual produjo el 100% de hemolisis, indicando que LIP 4 y LIP 12 tienen una selectividad hacia las células procariotas (modelos bacterianos) pero no hacia las células eucariotas evaluadas en este estudio (levaduras y eritrocitos humanos).

La selectividad de los lipopéptidos se puede medir en términos del índice terapéutico (IT), el cual se determinó en la Tabla 9 mediante la relación de la concentración que causa un 10% de hemolisis (CHio) con los valores de la CMI de las 4 cepas bacterianas ensayadas. Debido a que los 2 lipopéptidos presentan un porcentaje de hemolisis inferior al 10% a la máxima concentración evaluada (50,0 pM), se tomó este valor como la CHio. Los resultados del índice terapéutico indican que LIP 4 es selectivo para P. aeruginosa y que LIP 12 tiene una actividad antimicrobiana de mayor espectro con respecto a LIP 4, aunque ambos presentan baja actividad hemolítica, de lo que se puede concluir que LIP 12 puede tener un alto potencial para su uso en el desarrollo de fármacos antimicrobianos.

Tabla 9. índice terapéutico de LIP 4 y LIP 12. El índice terapéutico indica la selectividad de los lipopéptidos hacia los eritrocitos humanos. Entre mayor índice terapéutico tenga una molécula, mayor será la posibilidad de desarrollo un agente antimicrobiano. índice Terapéutico ^b

Lipopéptido CHio ^a (mM)

S. aureus E. faecalis P. aeruginosa E. coli

LIP 4 >50 1,7 1,0 5,3 0,5

LIP 12 >50 5,0 5,3 5,9 5,9

Concentración del lipopéptido que induce un 10% de hemolisis en eritrocitos humanos

índice terapéutico calculado como CHio/CMI.

Ejemplo 3.4. Efecto de los lipopéptidos sobre la morfología bacteriana

De acuerdo con los resultados de la CMI se evaluó el efecto de LIP4 y LIP 12 sobre la morfología bacteriana a 2 veces la CMI (2xCMI), mediante la técnica de microscopía electrónica de barrido (SEM). De esta manera evidencia el daño que le causan a las bacterias en corto tiempo, de 30 minutos a 2 horas.

Las muestras para SEM se prepararon del siguiente modo: se preparó una suspensión bacteriana a una concentración de lxlO ⁶ UFC/mL y se adicionaron 400 pL de la suspensión a una placa de 24 pozos, a la cual se le adicionaron 400 pL de la solución de cada lipopéptido para que quedara a una concentración final de 2 veces la MIC. Las suspensiones con el tratamiento se incubaron a 37°C con una agitación constante de 90 rpm.

Se filtró a través de una membrana de celulosa de 1,3 mm de diámetro y 0,2 pm de tamaño de poro a los 30 min, 120 min y 20 horas después de haber adicionado cada lipopéptido. Se utilizó una suspensión bacteriana sin tratamiento como control de crecimiento y se filtró a las 20 horas. Se adicionó una solución de glutaraldehído al 2,5% (v/v) en buffer fosfato 0,1 mM en otra placa de 24 pozos para fijar la muestra y las membranas a las que se les filtró la suspensión bacteriana se dejaron incubando por 12 horas a 4 °C.

Las membranas se retiraron de la solución de glutaraldehído y se lavaron 3 veces con solución buffer de fosfato y se deshidrataron 2 veces con soluciones de etanol de concentración creciente al 30, 50, 70, 80, 96 y 100 % (v/v), y dejando actuar por 2 minutos. Finalmente, las membranas se secaron por 1 día a temperatura ambiente. Para la observación por SEM las muestras se recubrieron con oro formando una capa alrededor de 6 a 9 nm, con un recubridor marca Quorum Technologies, modelo Q150. Las micrografías tienen un nivel de tensión del haz de electrones de 15 kV. Los detalles relevantes del daño ocasionado por los lipopéptidos sobre la membrana bacteriana que se observan en las micrografías (Figuras 8 a 12) se señalan en óvalos de color blanco.

El lipopéptido LIP 4 mostró ser selectivo a bajas concentraciones para P. aeruginosa, por lo tanto, se observó el cambio morfológico de la membrana bacteriana a una concentración de 19 mM; el control de crecimiento se mantuvo en incubación a 37°C durante 20 horas sin tratamiento, en el cual se observa abundante número de células y las superficies de las membranas se encuentran integras, lisas, brillantes y las células turgentes (Figura 8A); al exponer el cultivo bacteriano durante 30 minutos a LIP 4 no hay proliferación del microorganismo y en la superficie de la membrana se observa una leve deformación (Figura 8B), finalmente en el cultivo bacteriano tratado durante 2 y 20 horas de incubación no se aprecian células definidas, indicando que hubo lisis celular y se observa material citoplasmático sobre la membrana de celulosa (Figuras 8C y D), por lo tanto se puede inferir que LIP 4 tiene un efecto bactericida a 2 veces la CMI (19 uM) entre 2 y 20 horas de tratamiento.

El lipopéptido LIP 12 causó efectos morfológicos en la membrana de las 4 bacterias ensayadas, en CMIs menores o iguales a 20 pM. El control de crecimiento celular de cada cepa bacteriana indica que se encuentra en fase estacionaria después de 20 horas de crecimiento y se observa que la superficie de las células está definida y lisa en P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis, y E. coli (Figuras 9A, 10A, 11A y 12A respectivamente). La membrana celular de P. aeruginosa presenta rugosidad sobre la superficie entre los 30 minutos y 2 horas de tratamiento con LIP 12, observando formación de vesículas de entre 100 y 200 nm de diámetro aproximadamente y también se observa material citoplasmático sobre las membranas de celulosa, indicando que hubo lisis celular (Figuras 9B y C) a una concentración de 17 pM; y a las 20 horas de incubación no se observan células, pero si residuos de material citoplasmático (Figura 9D); confirmando un efecto bactericida.

El efecto sobre la membrana de S. aureus tratado con LIP 12 a una concentración de 20 pM mostró que durante los primeros 30 minutos se da la formación de pequeñas ampollas o vesículas sobre la superficie celular, que son de entre 100 y 120 nm (Figura 10B); a las 2 horas de exposición al lipopéptido las ampollas se vuelven más abundantes y se observan restos de material citoplasmático y dispersión de las vesículas (Figura 10C). A las 20 horas no se observa ninguna célula completa (Figuras 10D), indicando que después de 2 horas de exposición a LIP 12 la membrana bacteriana se ha desintegrado, confirmando el efecto bactericida.

El daño en la membrana de E. faecalis tratadas con LIP 12 a una concentración de 19 mM fue similar al que se observó en S. aureus con el tratamiento con el lipopéptido LIP 12. Durante los primeros 30 minutos se aprecia la formación de vesículas y deformación de la superficie celular (Figura 11B), a las 2 horas de exposición a LIP 12 se observa la membrana con un incremento en la formación de vesículas (Figura 11C) y finalmente después de 20 horas se aprecia material citoplasmático, indicando que hubo lisis celular (Figura 11D), confirmando el efecto bactericida.

Se evidencia daño en la membrana celular de E. cotí tras el tratamiento con LIP 12 a una concentración de 17 mM en los primeros 30 minutos, ya que hay formación de ampollas sobre la célula y gran cantidad de agregados de vesículas de aproximadamente 100 nm de diámetro, posiblemente derivados del daño de la membrana celular (Figura 12B), daños que progresan a las 2 horas de exposición, tiempo en el que se observa que la superficie de las células se vuelve rugosa y con depresiones y, además, se observa una gran cantidad de residuos correspondientes a material citoplasmático (Figura 12C) y finalmente a las 20 horas de incubación se observa algunas células con gran cantidad de vesículas y depresiones (circulo pequeño), perdida de la membrana extema y formación de vesículas (Figura 12D), confirmando que el efecto que tiene el lipopéptido LIP 12 sobre E. cotí es bactericida.

De acuerdo con las micrografías obtenidas por SEM de las 4 cepas bacterianas evaluadas en la actividad antimicrobiana, se pudo observar que los lipopéptidos diseñados tienen un alto potencial biológico y presentan un efecto surfactante o también llamado modelo micelar como mecanismo de acción.

Como se observa en todas las micrografías, los cambios morfológicos de las bacterias con respecto al control de crecimiento muestran la presencia de vesículas o ampollas producidas a diferentes tiempos de exposición a los lipopéptidos. El daño en la membrana celular en bacterias Gram negativas se debe posiblemente a la interacción electrostática con los fosfolípidos y en las bacterias Gram positivas se puede atribuir a interacciones electrostáticas del lipopéptido con los peptidoglucanos de la pared, que están formados por polímeros alternantes de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico unidos por enlace b-1,4.

En conclusión se puede inferir que los lipopéptidos diseñados y sintetizados producen daños en la membrana bacteriana con un tiempo de acción entre 30 y 120 minutos, ocasionado por el daño y posteriormente la disrupción estructural causando la muerte celular, lo que confirma el modo de acción de los lipopéptidos de acuerdo a sus propiedades anfifílicas.

Ejemplo 3.5. Evaluación de la estabilidad in vitro a proteasas

Para determinar la estabilidad de los lipopéptidos, atribuida a la presencia del aminoácido ornitina en la secuencia de LIP 12, el lipopéptido con mayor actividad antibacteriana, se trató con suero sanguíneo humano.

Se adicionó 1,5 mg de lipopéptido a una solución de 1000 pL de RPMI suplementada al 25% (v/v) con suero sanguíneo y estabilizada a 37 °C por 15 minutos. Se tomó una alícuota de 100 pL de la solución y se pasaron a tubos eppendorf a los tiempos 0, 1, 2, 3, 4, 8 y 24 horas y se adicionaron 200 pL de etanol al 96%. Se dejó enfriar a 4°C por 15 minutos y se centrifugó a 18000 x g por 2 minutos. El sobrenadante fue analizado por RP-HPLC.

Se observó que LIP 12 no presenta indicios de degradación en su estructura, a una temperatura de 37°C durante 24 horas, en presencia de las proteasas del plasma sanguíneo, ya que las áreas del pico correspondiente al lipopéptido en los cromatogramas (t _R :l5,9 minutos aproximadamente), no tienen cambios significativos durante el ensayo, ni se observa la formación de nuevos picos correspondientes a otras especies, como se ilustra en la Figura 13.

ANEXO 1

Tabla 8. Concentración mínima inhibitoria de los lipopéptidos diseñados y sintetizados en este estudio (mM).