Область техники

Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Созданы однодоменные антитела, а также их модификации, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вируснейтрализующей активностью, предложено применение таких антител для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

Предшествующий уровень техники.

31 декабря 2019 года во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) поступила информация о вспышке пневмонии неизвестной этиологии в городе Ухань (Китайская Народная Республика). Возбудителем заболевания оказался одноцепочечный РНК- содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae, к линии Beta- CoV В.

Коронавирус SARS-CoV-2 может передаваться воздушно-капельным, воздушно- пылевым, контактным, фекально-оральным способами, а также через контаминированные предметы и поверхности (фомиты), через кровь, от матери ребенку и от животных к человеку (Механизмы передачи вируса SARS-CoV-2 и их значение для выбора мер профилактики, Резюме научных исследований, 9 июля 2020 г. ВОЗ). За несколько месяцев вирус распространился по всему миру, и в январе 2020 года ВОЗ объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию.

Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме, и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 185 млн человек, а погибших- более 4 млн человек и эти числа продолжают расти. Очевидно, что во всем мире в настоящее время есть острая необходимость в разработке безопасных и эффективных средств профилактики и лечения. Одним из перспективных подходов к терапии коронавирусной инфекции является применение антител против определенных антигенных детерминант вируса. Это обусловлено двумя основными причинами: высокой специфичностью антител и технологичностью их промышленного производства. (В. С. Смирнов, Арег А. Тотолян. Некоторые возможности иммунотерапии при коронавирусной инфекции. Инфекция и иммунитет 2020, Т. 10, М° 3, с. 446—458).

В настоящее время в мире проводится более 50 клинических исследований, связанных с моноклональными антителами (Deb Р, Molla ММА, Saif-Ur-Rahman КМ. Ап update to monoclonal antibody as therapeutic option against COVID-19. Biosaf Health. 2021 Apr;3(2):87-91. doi: 10.1016/j.bsheal.2021.02.001. Epub 2021 Feb 10. PMID: 33585808; PMCID: PMC7872849).

(https://www.sciencedirect.eom/science/article/pii/S25900 53621000197#s0005).

В настоящий момент разрешено к экстренному использованию два препарата на основе моноклональных антител. 21 ноября 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование (EUA) препарата REGEN-COV (Regeneron Pharmaceuticals), для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени у людей в возрасте от двенадцати лет и старше с массой тела не менее 40 кг (88 фунтов) с положительными результатами прямого тестирования на вирус SARS-CoV-2 и которые имеют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19. Сюда входят лица в возрасте 65 лет и старше или лица, страдающие определенными хроническими заболеваниями. REGEN-COV состоит из двух моноклональных антител: казиривимаба (REGN10933) и имдевимаба (REGN 10987), которые связываются с неперекрывающимися эпитопами S белка SARS-CoV-2. Результаты клинических исследований данного препарата показали, что он способен снижать вирусную нагрузку, с большим эффектом у пациентов, у которых иммунный ответ еще не был инициирован или у которых исходно была высокая вирусная нагрузка (Weinreich DM, Sivapalasingam S, Norton T, Ali S, Gao H, Bhore R, Musser BJ, Soo Y, Rofail D, Im J, Perry C, Pan C, Hosain R, Mahmood A, Davis JD, Turner КС, Hooper AT, Hamilton JD, Baum A, Kyratsous CA, Kim Y, Cook A, Kampman W, Kohli A, Sachdeva Y, Graber X, Kowal B, DiCioccio T, Stahl N, Lipsich L, Braunstein N, Herman G, Yancopoulos GD; Trial Investigators. REGN-COV2, a Neutralizing Antibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):238-251. doi: 10.1056/NEJMoa2035002. Epub 2020 Dec 17. PMID: 33332778; PMCID: PMC7781102).

Другой препарат на основе моноклонального антитела - бамланивимаб (LY-CoV555, разработчик: Eli Lilly) получил разрешение FDA на экстренное применение для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести у негоспитализированных взрослых и детей. Однако результаты клинических исследований неоднозначны. Среди госпитализированных пациентов с COVID-19 одновременное применение бамланивимаба с ремдесивиром не было эффективно. (ACTIV-3/TICO LY-CoV555 Study Group, Lundgren JD, Grund B, Barkauskas CE, Holland TL, Gottlieb RL, Sandkovsky U, Brown SM, Knowlton KU, Self WH, Files DC, Jain MK, Benfield T, Bowdish ME, Leshnower BG, Baker JV, Jensen JU, Gardner EM, Ginde AA, Harris ES, Johansen IS, Markowitz N, Matthay MA, Ostergaard L, Chang CC, Davey VJ, Goodman A, Higgs ES, Murray DD, Murray ТА, Paredes R, Parmar MKB, Phillips AN, Reilly C, Sharma S, Dewar RL, Teitelbaum M, Wentworth D, Cao H, Klekotka P, Babiker AG, Gelijns AC, Kan VL, Polizzotto MN, Thompson ВТ, Lane HC, Neaton JD. A Neutralizing Monoclonal Antibody for Hospitalized Patients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Mar 11;384(10):905-914. doi: 10.1056/NEJMoa2033130. Epub 2020 Dec 22. PMID: 33356051; PMCID: PMC7781100). Клинические исследования на амбулаторных пациентах показали, что только одна из трех доз исследуемого препарата (2800 мг LY-CoV555) достоверно ускоряла естественное снижение вирусной нагрузки. (Chen Р, Nirula A, Heller В, Gottlieb RL, Boscia J, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Shen L, Durante M, Oakley G, Schade AE, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Skovronsky DM; BLAZE-1 Investigators. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody LY- CoV555 in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):229-237. doi:10.1056/NEJMoa2029849. Epub 2020 Oct 28. PMID: 33113295; PMCID: PMC7646625).

Наилучший эффект наблюдался при комбинированной терапии двумя моноклональными антителами: бамланивимаб и этесевимаб. (Gottlieb RL, Nirula A, Chen Р, Boscia J, Heller В, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Kumar P, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Durante M, Oakley G, Schade AE, Holzer TR, Ebert PJ, Higgs RE, Kallewaard NL, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Shen L, Skovronsky DM. Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID-19: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2021 Feb 16;325(7):632-644. doi: 10.1001/jama.2021.0202. PMID: 33475701; PMCID: PMC7821080).

В целом, препараты на основе классических антител имеют ряд недостатков, к которым относятся:

- трудоемкость генно-инженерных манипуляций;

- трудности, связанные с узнаванием некоторых «скрытых» эпитопов;

- необходимость внутривенного введения, что влечет за собой дополнительную нагрузку на систему здравоохранения; - дорогостоящее производство антител.

Решением проблемы может стать использование однодоменных антител (наноантител), которые в природе можно найти у представителей семейства верблюдовые. Благодаря относительно небольшому размеру однодоменные антитела обладают благоприятными биофизическими свойствами и дешевле в производстве, чем стандартные моноклональные антитела. Они могут быть получены с использованием прокариотических или эукариотических систем экспрессии. Их небольшой размер, а также длинные, определяющие комплементарность участки тяжелой цепи позволяют им нацеливаться на вогнутые эпитопы. Кроме того, наноантитела можно распылять и доставлять прямо в легкие пациента с Covid-19 с помощью ингалятора, что представляет собой лучшую альтернативу внутривенно вводимым классическим антителам (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid-19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021; 384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)

В настоящее время нет препаратов на основе однодоменных антител, разрешенных к применению для лечения COVID-19.

Известно решение (CN112500480А), в котором разработаны варианты однодоменного антитела против вируса SARS-CoV-2, соответствующий вектор экспрессии, а также линия клеток, способная экспрессировать вышеуказанные варианты однодоменного антитела, и способ получения вариантов данного антитела.

Известно решение CN111825762 А, в котором разработано несколько вариантов наноантитела к домену RBD S белка вируса SARS-COV-2, а также способ применения вариантов наноантитела для приготовления лекарственных средств для ингибирования вирусной инфекции SARS-COV-2 и приготовлении реагентов или наборов для тестирования вируса SARS-COV-2.

В патенте CN 112094342 А представлено биэпитопное специфическое антитело, происходящее из альпака, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с доменом RBD SARS-CoV-2 с высоким сродством, что может использоваться для профилактики, лечения и / или диагностики инфекции SARS-CoV-2.

Известно решение CN112062839А, в котором описано создание наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронарирусом SARS-CoV-2.

Также известно решение CN112062840 А, предусматривающее разработку наноантитела к S белку SARS-CoV-2 , а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронарирусом SARS-CoV-2. В патенте CN111303279A описано создание гуманизированного однодоменного антитела против коронавируса SARS-CoV-2, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей однодоменное антитело, а также создание кассеты экспрессии, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток, содержащей вышеописанную молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, разработан способ применения однодоменного антитела или созданной молекулы нуклеиновой кислоты или созданной экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток при производстве продукта, который может применяться для предотвращения и / или лечение заболеваний, вызванных инфицированием новым коронавирусом SARS-CoV-2; а также для подавления заражения новым коронавирусом SARS-CoV-2. При этом продукт может: связываться с новым коронавирусом SARS-CoV-2; обнаруживать связывание нового коронавируса SARS-CoV- 2; связываться с белком S нового коронавируса SARS-CoV-2; обнаруживать белок S нового коронавируса SARS-CoV-2. Также разработана фармацевтическая композиция, содержащая созданное однодоменное антитело и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.

Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому, было выбрано авторами патента за прототип. Однако, недостатком прототипа является то, что однодоменные антитела быстро выводятся из организма в следствии низкой молекулярной массы и, таким образом, требуют многократного введения.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании нового антитела, специфически связывающегося с S белком вируса SARS-CoV-2, для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, лишенного указанного недостатка.

Раскрытие сущности изобретения

Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала антител для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

Технический результат заключается в создании однодоменного антитела и его модификаций, которые эффективно связывают рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2, нейтрализуют вирус SARS-CoV-2 и могут быть использованы для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. Кроме того, технический результат заключается в том, что разработано антитело, которое обладает улучшенной фармакокинетикой, по сравнению с однодоменными антителами. Указанный технический результат достигается тем, что создано однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3.

Также технический результат достигается тем, что создано олигомеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV- 2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант созданного однодоменного антитела.

Кроме того, создано фьюжн антитело, представляющее собой однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9.

Также создано олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью.

Кроме того, создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую однодоменное антитело. Создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую олигомеризованное однодоменное антитело. Также создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую фьюжн антитело. Создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую олигомеризованное фьюжн антитело.

Кроме того, создана клетка-продуцент, содержащая нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность любого из созданных антител, и экспрессирующая данное антитело.

А также разработан способ терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного антитела.

Краткое описание чертежей.

На фиг. 1 представлены данные по определению титра специфических антител к RBD в сыворотке крови альпака после иммунизации рекомбинантным RBD. Ось ординат - оптическая плотность раствора при длине волны 450 нм Ось абсцисс - разведения сыворотки крови альпака ф - Уровень сигнала сыворотки альпака на BSA (отрицательный контроль)

· - Уровень специфического сигнала сыворотки альпака на рекомбинантный RBD

На фиг. 2 представлена электрофореграмма анализа результатов очистки однодоменных антител аффинной хроматографией, где

1 - препарат однодоменных антител p2h5 ;

2- препарат однодоменных антител p2h2;

3- препарат одно доменных антител p2gl ;

4- препарат однодоменных антител p3d3;

5 - препарат о днод оменных антител р 1 d3 ;

6- препарат однодоменных антител pld5;

7- препарат однодоменных антител р2с5;

8- препарат однодоменных антител p5f8.

На фиг. 3 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности однодоменных антител, где

1 - N-конец;

2 - последовательность однодоменного антитела;

3 - His-tag (гистидиновая метка);

4 - С-конец.

На фиг. 4 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных однодоменных антител, где

1 - N-конец;

2 — последовательность однодоменного антитела;

3 - глицин-сериновый линкер;

4 - последовательность однодоменного антитела;

5 - His-tag (гистидиновая метка);

6 - С-конец. На фиг. 5 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности однодоменных антител, модифицированных Fc-фрагментом IgGl человека,

1 - глицин-сериновый линкер;

2 - последовательность однодоменного антитела;

2 - шарнирный регион;

3 - Fc-фрагмент IgGl человека.

На фиг. 6 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных однодоменных антител, модифицированных Fc- фрагментом IgGl человека, где

1 - глицин-сериновый линкер;

2 - димеризованное через серин-глициновый линкер однодоменное антитело;

2 - шарнирный регион;

3 - Fc-фрагмент IgGl человека.

На фиг. 7 представлены результаты анализа изменения веса животных, которым вводили созданные антитела, и животных из группы плацебо в течение 14 суток после заражения SARS-CoV-2. В каждой временной точке для каждой группы животных вес представлен в виде арифметического среднего и 95% доверительного интервала. Также на рисунке пунктирной линией отмечена область 95% веса.

Ось ординат - изменение веса животных от начального, %

Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни В - животные, которым вводили препарат антител; - группа плацебо.

На фиг. 8 представлены результаты анализа изменения веса животных, которым вводили созданные антитела, и животных из группы плацебо в течение 30 суток после заражения SARS-CoV-2. В каждой временной точке для каждой группы животных вес представлен в виде арифметического среднего. Также на рисунке пунктирной линией отмечена область 95% веса.

Ось ординат - изменение веса животных от начального, %

Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни

Ф - животные, которым внутрибрюшинно вводили p2c5-fc (10 мг/кг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2;

В - животные, которым внутрибрюшинно вводили p2c5-fc (5 мг/кг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2;

А - животные, которым интраназально вводили p2c5-fc (200нг), одновременно с заражением SARS-CoV-2;

- животные, которым интраназально вводили p2c5-fc (ЮООнг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2; - группа плацебо.

Осуществление изобретения.

Вариантом данного изобретения является однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3.

Для получения данного антитела осуществляли иммунизацию альпаки рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBD антител в сыворотке крови животного. Далее у животных выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, из которых получали РНК. На основе РНК синтезировали кДНК. На матрице полученной кДНК ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Таким образом была получена библиотека ампликонов последовательностей однодоменных антител.

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только мононуклеарных клеток, а также цельной крови, лимфатических узлов, селезенки, тимуса или других клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих однодоменные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей одно доменных антител.

Селекцию антител проводили методом фагового дисплея с использованием паннинга на антигене (RBD). Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование других подходов селекции, таких как паннинг на вирусных частицах, паннинг в растворе биотинилированного антигена, паннинг с использованием конкурентного связывания и элюции. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование других методов селекции, таких как рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей. В результате селекции были отобраны однодоменные антитела, специфически связывающиеся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3). В последующих экспериментах было показано, что данные антитела обладают вируснейтрализующей активностью.

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре однодоменных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов, попадает под объем настоящего изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями .

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут быть модифицированы путем присоединения различных белков, белковых доменов и тэгов, таких, например, как НА-тэг, Flag-тэг, GST-тэг, GFP белок, RFP белок, биотин и другие. Нуклеотидную последовательность однодоменных антител определяли методом секвенирования. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденное™ генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности однодоменных антител SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15.

С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность однодоменного антитела и экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ГО NO:3. Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:1; клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:2, клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:3. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.

Другим вариантом данного изобретения является олигомеризованное однодоменное антитело специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант однодоменного антитела, выбранный из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Частными случаями данного варианта изобретения являются: димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин- сериновым линкером SEQ ID NO 4, димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 5, димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 6. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, олигомеризацию однодоменных антител можно осуществлять при помощи других линкеров. Олигомеризованное однодоменное антитело было получено путем экспрессии соответствующей нуклеотидной последовательности в клетках-продуцентах. В последующих экспериментах было показано, что данные антитела обладают вируснейтрализующей активностью.

Нуклеотидная последовательность олигомеризованного однодоменного антитела была получена генно-инженерным методом. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденное™ генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности олигомеризованных однодоменных антител, в которых мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3). Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18.

С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность олигомеризованного однодоменного антитела, в котором мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3) и экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3). Таким образом, например, были получены: клетка- продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ГО NO:1; клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:2, клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное одно доменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:3. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.

Кроме того, вариантом изобретения является фьюжн антитело, представляющее собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина G1 человека, специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9. Данное антитело было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности фьюжн антитела в клетках-про дуцентах .

Нуклеотидные последовательности фьюжн антител были созданы генно- инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности однодоменных антител и нуклеотидной последовательности Fc-фрагмента иммуноглобуллина G1 человека. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие фьюжн антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности фьюжн антител (SEQ ГО NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9). Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21.

С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность фьюжн антитела и экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9. Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:7; клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:8, клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:9. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.

Также вариантом изобретения является олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант однодоменного антитела, выбранный из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина G1 человека, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью. Частными случаями данного варианта изобретения являются: димеризованное фьюжн антитело SEQ ID NO 10, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером; димеризованное однодоменное антитело SEQ ID NO 11, в котором мономеры соединены глицин- сериновым линкером; димеризованное однодоменное антитело SEQ ID NO 12, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, олигомеризацию однодоменных антител можно осуществлять при помощи других линкеров.

Нуклеотидная последовательность олигомеризованного фьюжн антитела была получена генно-инженерным методом. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденное™ генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности олигомеризованных фьюжн антител SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9. Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24.

С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность олигомеризованного фьюжн антитела, в котором мономерами являются фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9) и экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ГО NO:9). Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:7; клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:8, клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:9. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.

Изучена фармакокинетика однодоменных антител и их модификаций. Продемонстрировано что модификация о дно доменных антител и их олигомеров Fc- фрагментом IgGl человека, позволяет увеличить время их циркуляции в организме с нескольких часов до нескольких недель.

Таким образом, авторами патента были получены варианты антител, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и обладающие улучшенной фармакокинетикой по сравнению с однодоменными антителами. Кроме того, авторами патента разработан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого из разработанных вариантов антител.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Получение иммунной библиотеки кДНК однодоменных антител альпака.

На первом этапе работы был получен иммуноген - рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2. Для этого аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного Spike-белка вируса SARS-CoV-2 (а.о. 319 - 541, UniProtKB: locus SPIKE SARS2, accession P0DTC2) модифицировали с N- конца сигнальным пептидом щелочной фосфатазы SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI) и с С-конца последовательностью глицин-серинового линкера и гистидиновой метки (GSHHHHHHHHH). На основе аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность, которая была синтезирована ЗАО «Евроген». После этого нуклеотидную последовательность полученного полипептида клонировали в плазмиду для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих. Далее, культуру клеток СНО тарифицировали полученной плазмидой с помощью набора СНО Gro (Minis Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. По истечении этого срока культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Рецептор-связывающий домен (RBD) очищали металл-аффинной хроматографией на системе АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), используя колонки HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера на 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ натрия хлорид (рН=7,2) проводили на колонке ХК 26/100 («GE Healthcare Life Sciences», США), упакованной сорбентом Superdex 200 pg («GE Healthcare Life Sciences», США). Таким образом, в результате проведенной работы был получен очищенный рекомбинантный RBD S белка вируса SARS-CoV-2.

На следующем этапе работы альпака (Lama pacos - представитель семейства Cameliedae) иммунизировали полученным RBD (ЮОмкг на иммунизацию) 5 раз с промежутками в 10-14 дней. Через неделю после последней иммунизации определили титр антител в сыворотке крови альпака, который составил 1/1638400 (фигура 1).

Через 7 дней после последней иммунизации у альпака отбирали 50,0 мл периферической крови и выделяли мононуклеарные клетки на градиенте фиколла 1,077 (Панэко, Россия). Изолированные мононуклеарные клетки использовали для выделения тотальной РНК реагентом Trizol (Invitrogene, США) согласно протоколу фирмы- производителя. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК со случайными праймерами и ревертазой SuperScriptlll (Invitrogene, США). На матрице, полученной кДНК, ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Для этой процедуры использовали высокоточную полимеразу Q5 (NEB, Великобритания) и специфические праймеры, содержащие на концах сайты рестрикции.

Таким образом, в результате проведенной работы были получены ампликоны, которые являются иммунной библиотекой кДНК однодоменных антител альпака.

Пример 2. Получение библиотеки рекомбинантных бактерифагов.

Ампликоны, полученные в примере 1 гидролизовали рестриктазами и клонировали в фагмидный вектор, гидролизованный по тем же сайтам. Затем трансформировали клетки Е.соН (штамм TG1) фагмидными векторами, полученными в результате клонирования.

Суспензию бактериальных клонов-трансформантов клеток Е.соН (штамм TG1) использовали для продукции рекомбинантных бактериофагов с использованием бактериофага-помощника М13К07 (NEB, Великобритания) согласно протоколу фирмы- производителя. Рекомбинантные бактериофаги осаждали путем преципитации полиэтиленгликолем (PEG/NaCl). Таким образом, получена библиотека рекомбинантных бактерифагов с титром 10 ¹² трансдуцирующих единиц/мл суспензии.

Пример 3. Селекция и определение последовательности специфических однодоменных антител

Селекцию специфических рекомбинантных бактериофагов осуществляли путем паннинга на антигене исходной библиотеки бактериофагов. Для этого рекомбинантный RBD (пример 1) иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли суспензию 10 ¹¹ рекомбинантных бактерифагов и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Не связавшиеся бактерифаги отмывали коллоидным 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Связавшиеся бактериофаги элюировали при помощи раствора трипсина (0,1 мг/мл). Элюированные бактериофаги использовали для трансдукции клеток Е.соН TG1, которые затем высевали на агаризованные чашки в разведении, позволяющем изолировать индивидуальные колонии. Полученные колонии использовали для наращивания бактериальной массы и выделения плазмидной ДНК. Плазмиды секвенировали для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. Было определено 8 индивидуальных последовательностей .

Пример 4. Продукция и очистка о дно доменных антител

Для продукции однодоменных антител к интенсивно делящимся клеткам E.coli TG1, полученных из колоний на предыдущем этапе, добавляли 1,0 мкМ изопропил тиогалактопиранозид (IPTG) (Хеликон, Россия), спустя 4 часа бактериальную массу использовали для выделения рекомбинантных белков на колонке HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) с использованием хроматографической системы АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя. Результаты хроматографической очистки однодоменных антител представлены на фигуре 2 . Данный пример демонстрирует простоту и эффективность продукции и очистки о дно доменных антител в бактериальной системе экспрессии. Таким образом были получены очищенные препараты однодоменных антител. Одинаковые результаты были получены для всех 8 однодоменных антител. Схематичное изображение аминокислотных последовательностей однодоменных антител представлено на фигуре 3.

Пример 5. Определение вируснейтрализующей активности о дно доменных антител.

Целью данной работы являлась оценка способности полученных однодоменных антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. Реакцию нейтрализации вируса SARS-CoV-2 ставили в варианте постоянная доза вируса - разведения образца однодоменных антител. Готовили образцы однодоменных антител в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой, далее смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Исходные концентрации препаратов однодоменных антител составляла 0,5-1 мг/мл. Конечные разведения однодоменных антител составили 1/20-1/1280. Клетки инкубировали при 37°С в 5% С02. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. Данные по вируснейтрализующей активности выбранных антител представлены в таблице 1.

Таблица 1. Вируснейтрализующая активность полученных однодоменных антител.

Как видно из представленных данных все 8 образцов обладали выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от 1 до 12,5 мкг/мл), из которых 3 образца обладали наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от менее 1 мкг/мл). Три образца однодоменных антител, обладающих наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью, были выбраны для дальнейших исследований.

Таким образом, в результате проведенной работы было получено три однодоменных антитела (SEQ ID NOT, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3), обладающих высокой вируснейтрализующей активностью.

Пример 6. Определение констант взаимодействия о дно доменных антител Константы взаимодействия (KD) однодоменных антител р2с5, p5f8 и p2gl определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBD ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученных однодоменных антител. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation (General Electric, Швеция). Полученные данные представлены в таблице 2

Таблица 2. Константа равновесной диссоциации полученных о дно доменных антител с рекомбинантным RBD.

Полученные данные демонстрируют высокие значения констант равновесных диссоциаций отобранных однодоменных антител с рекомбинантным RBD, что свидетельствует о высокой аффинности связывания однодоменных антител с RBD вируса SARS-CoV-2.

Пример 7. Получение, продукция и очистка олигомеризованных однодоменных антител

Данный пример иллюстрирует получение олигомеризованных однодоменных антител, в частности димеризованных однодоменных антител p2gl -dimer (SEQ ID NO:4), p2c5-dimer (SEQ ID NO:5), p5f8-dimer (SEQ ID NO:6). На первом этапе разработали дизайн нуклеотидной последовательности димеризованных антител, которые представляют собой две аминокислотные последовательности однодоменного антитела ((SEQ ID NO:1 или (SEQ ID NO:2 или (SEQ ID NO:3), соединенные через глицин-сериновый линкер (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS). Нуклеотидные последовательности димеризованных антител были синтезированы компанией ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в экспрессионный вектор рЕТЗОа, получая таким образом плазмидные векторы рЕТ30а-р2с5 -dimer, pET30a-p5f8-dimer и pET30a-p2gl- dimer. Полученными экспрессионными векторами были трансформированы клетки E.coli штамма BL21, экспрессия была индуцирована путем добавления 1,0 мкМ IPTG (Хеликон, Россия). Спустя 4 часа из бактериальной массы выделяли димеризованные однодоменные антитела на колонке HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) с использованием хроматографической системы АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя. Так были получены препараты димеризованных однодоменных антител p2gl -dimer (SEQ ID NO:4), p2c5-dimer (SEQ ID NO:5), p5f8-dimer (SEQ ID NO:6). Схематичное изображение аминокислотных последовательностей димеризованных однодоменных антител представлено на фигуре 4.

Таким образом, в результате проведенной работы были получены олигомеризованные однодоменные антитела, мономерами которых являются разработанные однодоменные антитела (SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3).

Пример 8. Определение вируснейтрализующей активности димеризованных о дно доменных антител.

Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных димеризованных однодоменных антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2.

На первом этапе работы подготовили образцы димеризованных однодоменных антител (SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% С02. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализуюгций титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации антител: p2gl -dimer (SEQ ID NO:4) = 238 нг/мл, p2c5-dimer(SEQ ID NO:5) = 17 нг/мл, p5f8-dimer (SEQ ID NO:6) = 59 нг/мл. Как видно из представленных данных все полученные димеризованные однодоменные антитела способны нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. При этом, вируснейтрализующая активность димеризованных однодоменных антител (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6) выше, чем однодоменных антител (SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NOG).

Пример 9. Получение, продукция и очистка фьюжн антител.

Фьюжн антитело представляет собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина человека.

Данная модификация однодоменных антител позволит улучшить их фармакокинетические свойства за счет добавления Fc-фрагмента IgGl человека и его правильного гликозилирования в эукариотических клетках-продуцентах. Кроме того, модификация Fc-фрагментом позволит антителам активировать систему комплимента и связываться с Fc-рецепторами на поверхности иммунокомпитентных клеток.

На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9), которое представляет собой однодоменное антитело (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3), модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности фьюжн антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы СНО Gro (Minis Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе АКТА start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученных препаратов фьюжн антител p2gl- fc (SEQ ID NO:7), p2c5-fc (SEQ ID NO:8), p5f8-fc (SEQ ID NO:9), определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях. Схематичное изображение аминокислотной последовательности фьюжн антител представлено на фигуре. 5.

Таким образом, в результате проведенной работы было получено фьюжн антитело, представляющее собой разработанное однодоменное антитело, модифицированное Fc- фрагментом иммуноглобулина G1 человека, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9.

Пример 10. Определение вируснейтрализующей активности фьюжн антител.

Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных фьюжн антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. На первом этапе работы подготовили образцы фьюжн антител (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% С02. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации фьюжн антител: p2gl-fc (SEQ ID NO:7) - 1750 нг/мл, p2c5-fc (SEQ ID NO:8) - 5 нг/мл, p5f8-fc (SEQ ID NO:9) - 860 нг/мл,

Как видно из представленных данных все полученные фьюжн антитела обладают вируснейтрализующей активностью против коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 11. Получение, продукция и очистка олигомеризованного фьюжн антитела.

Олигомеризованное фьюжн антитело представляет собой олигомеризованное однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина человека.

Данная модификация содержит два антиген связывающих сайта антитела, что может потенциально увеличить вируснейтрализующую активность антител за счет увеличения авидности.

В данном примере проиллюстрировано создание димеризованного фьюжн антитела. Специалисту среднего уровня понятно, что аналогичным образом может быть сделано и тримеризованное фьюжн антитело. На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности димеризованного фьюжн антитела (SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO: 12), которое представляет собой димеризованное однодоменное антитело (SEQ Ш NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, соответственно), модифицированное Fc- фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности димеризованного фьюжн антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы СНО Gro (Mims Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе АКТА start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученных препаратов антител p2gl- dimer-fc (SEQ ID NO: 10), p2c5- dimer-fc (SEQ ID NO: 11), p5f8- dimer-fc (SEQ ID NO: 12), определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих и не денатурирующих условиях. Схематичное изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных фьюжн антител представлено на фигуре. 6.

Таким образом, в результате проведенной работы было получено олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой разработанное олигомеризованное однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина G1 человека, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NOT 1, или SEQ ID NO: 12.

Пример 12. Определение вируснейтрализующей активности олигомеризованных фьюжн антител.

Целью данного эксперимента являлась оценка способности полученных олигомеризованных фьюжн антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. На первом этапе работы подготовили образцы димеризованные фьюжн антител (SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% С02. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации фьюжн антител: p2gl-dimer-fc (SEQ ID NO:10) - 4125 нг/мл, p2c5-dimer-fc (SEQ ID NO:l l) - 60 нг/мл, p5f8-dimer-fc (SEQ ID NO:12) - 390 нг/мл.

Как видно из представленных данных все полученные олигомеризованные фьюжн антитела обладают вируснейтрализующей активностью против коронавируса SARS-CoV- 2. Таким образом, продемонстрировано, что, как и мономеры, димеризованные формы фьюжн антител обладают вируснейтрализующей активностью. Следовательно, любые олигомеризованные фьюжн антитела (мономеры, димеры, тримеры и т.д) могут обладать вируснейтрализующей активностью.

Пример 13. Изучение фармакокинетических свойств однодоменных антител и их модификаций.

Целью данной работы являлось изучение фармакокинетических свойств полученных однодоменных антител и их модификаций.

Для этого самкам мышей линии Balb/c весом 20 г. (6 животных/группе) вводили внутривенно препараты полученных однодоменных антител и их модификаций в дозе 10 мг/кг однократно. Таким образом были получены следующие группы животных:

1) p2gl (SEQ ID NO:l);

2) р2с5 (SEQ ID NO:2);

3) p5f8 (SEQ ID NO:3);

4) p2gl -dimer (SEQ ID NO:4);

5) p2c5-dimer (SEQ ID NO: 5);

6) p5f8-dimer (SEQ ID NO:6); 7) p2gl-fc (SEQ ID NO:7);

8) p2c5-fc (SEQ ID NO:8);

9) p5f8-fc (SEQ ID NO:9);

10) p2gl-dimer-fc (SEQ ID NO: 10);

11)p2c5-dimer-fc (SEQ ID NO: 11);

12)p5f8-dimer-fc (SEQ ID NO: 12).

Далее у мышей отбирали сыворотку крови спустя 30 мин, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 168, 240, 336 часов после введения препарата. В образцах сыворотки крови животных определяли концентрацию вводимого препарата антител в непрямом ИФА. Для этого в лунки 96-луночного планшета сорбировали рекомбинантный RBD (100 нг/лунку). Концентрацию антител в различные временные интервалы рассчитывали исходя из оптической плотности специфического сигнала испытуемых образцов относительно стандартов (образцы препарата в заданных концентрациях). Параметры фармакокинетики вычисляли использую программу РК solver 2.0. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Фармакокинетические свойства разработанных однодоменных антител и их модификаций tl/2 - период полувыведения, час

Tmax - период до достижения максимальной концентрации, час Стах- максимальная концентрация, мг/мл Т выведения - время выведения, час

Как видно из представленных данных, модификация однодоменных антител Fc- фрагментом IgGl человека приводит к увеличению циркуляции антител в организме с нескольких часов до 14 дней.

Таким образом в результате проведенной работы было получено модифицированное однодоменное антитело, которое обладает улучшенной фармакокинетикой (по сравнению с о дно доменными антителами).

Пример 13 Способ терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.

Известно, что переливание плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 с высоким титром вируснейтрализующих антител пациентам COVID-19 на ранних стадиях приводит к значительному снижению их смертности (Salazar Е, Christensen РА, Graviss ЕА, Nguyen DT, Castillo В, Chen J, Lopez BV, Eagar TN, Yi X, Zhao P, Rogers J, Shehabeldin A, Joseph D, Masud F, Leveque C, Olsen RJ, Bernard DW, Gollihar J, Musser JM. Significantly Decreased Mortality in a Large Cohort of Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Patients Transfiised Early with Convalescent Plasma Containing High-Titer Anti-Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Spike Protein IgG. Am J Pathol. 2021 Jan;191(l):90-107. doi: 10.1016/j.ajpath.2020.10.008. Epub 2020 Nov 4. PMID: 33157066; PMCID: PMC7609241).

Было показано, что все созданные однодоменные антитела и их модификации обладают вируснейтрализующей активностью против SARS-CoV-2. Специалисту среднего уровня очевидно, что данные антитела могут быть использованы для терапии заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. При этом антитела могут вводиться подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно. Однодоменные антитела и олигомеризованные однодоменные антитела также могут вводиться интраназально, внутривенно и внутримышечно.

Экспериментальные данные показывают, антитела могут вводиться человеку в концентрации от 1 до 100 мг/мл. Пример 14 Разработка способа экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

Целью данной работы являлась разработка способа экстренной профилактики заболеваний, вызываемый вирусом SARS-CoV-2.

В экспериментах использовали модель летальной инфекции сирийских хомячков по схеме представленной в таблице 4. Сирийские хомячки, выбраны в качестве модели, так как их рецепторы АСЕ2 обладают высоким сродством к SARS-CoV-2.

Таблица 4. Дизайн эксперимента по исследованию протективности фьюжн антитела

2 в профилактическом режиме применения на сирийских хомячках (летальная модель)

Для изучения протективной активности было выбрано фьюжн антитело p2c5-fc (SEQ ID NO: 8). Для исследования был выбран внутрибрюшинный путь введения препарата, однако препарат также может вводиться внутривенно, внутримышечно или подкожно. О дно доменные антитела могут вводиться интраназально.

В исследовании было использовано 20 сирийских хомячков, массой 35-45 грамм, по 10 животных в опытной (препарат антител) и контрольной (плацебо) группах. В исследовании использовали вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-l/2020), изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 10 ⁷ ТСГО50/мл и 3,5х10 ⁷ БОЕ/мл. В экспериментах использовали постоянную культуру клеток почки африканской зеленой мартышки - Vero Е6. В качестве ростовой и поддерживающей использовали среду DMEM, содержащую соответственно 10% и 2 % фетальной телячьей сыворотки.

Животным вводили фьюжн антитело p2c5-fc (SEQ ID NO:8) однократно за 24 часа до заражения в дозе 10 мг/кг, контрольные животные получали инъекцию фосфатно- солевого буфера (плацебо). Через 24 часа после введения препарата или плацебо животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 5x10 ⁵ TCID50 на животное (таблица 2). Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. Наиболее выраженным клиническим проявлением инфекции, вызванной вирусом SARS- CoV-2, у золотистых хомяков является снижение веса в первые дни после заражения. Оценку веса у зараженных животных проводили ежедневно на протяжении всего исследования.

На фигуре 7 представлены данные динамики веса животных после заражения. По результатам исследования было показано, что однократное введение препарата антител p2c5-fc (SEQ ID NO:8) в дозе 10 мг/кг животным за сутки до заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. В контрольной группе животных после заражения наблюдается снижение массы тела, которое достигает максимума к 4 суткам после заражения. В то же время у животных, получавших созданное антитело p2c5-fc (SEQ ID NO:8), масса тела после заражения не снижается, а постепенно возрастает, что свидетельствует об отсутствии проявления клинических признаков инфекции.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение препарата фьюжн антитела p2c5-fc (SEQ ID NO:8) позволяет защитить млекопитающих от клинических проявлений инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 (5х10 ⁵ TCID50). Специалисту среднего уровня очевидно, что другие созданные антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью, также могут защищать млекопитающих от клинических проявлений инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов был разработан способ экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного однодоменного антитела или его модификаций.

Пример 15. Разработка способа терапии заболевания, вызванного вирусом SARS- CoV-2.

Терапевтическую эффективность препарата фьюжн антитела p2c5-fc (SEQ ID NO: 8) оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2 -трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высоко чувствительны к инфекции SARS-CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.

В работе использовали вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL- 1/2020), изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 10 ⁷ ТСГО50/мл и 3,5х10 ⁷ БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 10 ⁵ ТСГО ₅ о на животное, далее вводили препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 5.

Таблица 5. Дизайн экспериментального изучения эффективности фьюжн антитела p2c5-fc

В течение 30 суток после заражения оценивали вес и выживаемость животных.

На фиг. 8 представлены данные динамики веса животных после заражения. По результатам исследования было показано, что однократное системное (внутрибрюшинное) введение препарата фьюжн антитела 2 в дозе 10 и 5 мг/кг животным через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Также было показано, что введение препарата в дозе 5 мкг/кг интраназально одновременно с заражением и введение препарата в доз 25 мкг/кг интраназально через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Специалисту среднего уровня очевидно, что препарат антитела также может вводиться внутримышечно, внутривенного или подкожно.

У всех животных, получивших препарат, не было зафиксировано снижения веса более 5%. Гибель зараженных животных, получивших препарат, отсутствовала. Тогда как в контрольной группе животных после заражения наблюдается снижение массы тела, к 8 суткам все животные из группы контроля погибли. Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные одно доменные антитела и их производные могут быть использованы для терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают эффективность созданных однодоменных антител и их модификаций, обладающих вируснейтрализующей активностью, и обладающих терапевтическими и протективными свойствами против вируса SARS-CoV-2 и их промышленную применимость.